Chez le mammifère la fonction de reproduction est sous le contrôle des neurones hypothalamiques à GnRH-I. Au cours du développement embryonnaire ces neurones migrent de la fosse nasale vers le cerveau. De nombreuses études s’intéressent aux facteurs impliqués dans leur migration, mais l’influence de leur environnement cellulaire est très peu étudiée. Nous avons émis l’hypothèse que les neurones à GnRH-I d’origine extra-cérébrale possèdent un environnement gliale nécessaire à leur migration, connaissant le rôle de ces cellules dans l’ontogenèse neuronale du cerveau. Nos résultats montrent que 1) les neurones à GnRH-I sont associés à des cellules gliales au cours de leurs migrations nasale et télencéphalique 2) ces cellules gliales sont des progéniteurs des cellules gliales olfactives engainantes qui se différencient dans les régions rostrales au cours de la migration neuronale. 3) ces cellules expriment des gènes codant pour des facteurs impliqués dans la migration de ces neurones. 4) le transcriptome de ces cellules gliales est perturbé en présence d’un perturbateur endocrinien œstrogèno-mimétique, et touche des familles de gènes impliquées dans les molécules d’adhésions cellulaires nécessaire à la migration et à la régulation de l’activité des neurones à GnRH-I. / GnRH-I cells control reproduction functions in mammals. These cells are extra cerebral since they come from the nasal pit and migrate to the forebrain during embryonic development. Numerous studies have described the influence of different molecules on the migration of GnRH-1 neurons, however, the role of microenvironment cells remains poorly understood. Considering the role of glial cells in the forebrain’s neuronal migration, we had hypothesized that extra-cerebral GnRH-I neurons possess a glial environment necessary for their migration from the nose to the brain. Our results demonstrated that 1) GnRH-I neurons are associated with glial cells during their migration in the nasal septum and forebrain 2) These glial cells are progenitors of olfactory ensheathing cells, and differentiated within the rostral regions during neuronal migration. 3) These cells express genes encoding factors involved in GnRH-I neurons migration 4) Glial cells transcriptome are disrupted with estrogen-mimicking endocrine disruptor, and affects gene families involved in cell adhesion molecules necessary for migration and activity regulation of GnRH-I neurons

Notre approche biomimétique permet de régénérer une dent entière. Un protocole en deux étapes à partir de réassociations de cellules dentaires embryonnaires permet le développement de la couronne in vitro et, après implantation, la différenciation fonctionnelle des cellules, l’initiation du développement radiculaire et la vascularisation dentaire. Cependant, l’absence d’innervation a nécessité des expériences complémentaires :- La co-implantation de réassociations cellulaires avec un ganglion trigéminal permet la croissance d’axones autour de la dent formée, mais pas dans le mésenchyme dentaire.- Pour tenter de résoudre ce problème, la régénération axonale a été testée dans un contexte immunodéprimé en utilisant la cyclosporine A (CsA). Dans ces conditions, des fibres nerveuses entrent dans la pulpe dentaire, jusqu’aux odontoblastes. Cependant, la CsA a aussi un effet direct sur la croissance axonale.- Des co-implantations chez des souris immunodéprimées (Nude) montrent que l’immunomodulation seule suffit pour l’innervation de la dent.- Dans la dent, les axones assurent différentes fonctions en interagissant avec les cellules voisines. Les relations entre axones et autres cellules (odontoblastes, cellules endothéliales, péricytes et cellules gliales) ont été analysées dans les mésenchymes dentaire et péri-dentaire de réassociations implantées et comparées à ce que l’on observe pour une molaire physiologique à un stade similaire.Ce travail décrit les conditions permettant l’innervation des dents régénérées. Des expériences préliminaires encourageantes ont été réalisées avec des cellules souches pour remplacer la CsA. / Our biomimetic approach allowed the regeneration of a whole tooth. Using embryonic dental cells, a two-steps protocol allowed crown formation in vitro and, after implantation, functional cells differentiation, initiation of root formation and tooth vascularization. However, the teeth were not innervated, which led to complementary experiments:- The co-implantation of cell re-associations with a trigeminal ganglion allowed axonal growth around the forming teeth, but not in the dental mesenchyme. - To try to solve this point, axonal regeneration was tested in immunodepressed conditions, using cyclosporin A (CsA). In these conditions, nerve fibers entered the dental pulp and reached odontoblasts. However, CsA shows multiple effects, including direct ones on nerve growth. - Co-implantations were performed in immunocompromised Nude mice allowed axons to reach the odontoblast layer, thus showing that immunomodulation is sufficient.- Axons in the dental mesenchyme interfere with several functions by interacting with neighbor cells. Relationships between axons and other cells (odontoblasts, endothelial cells, pericytes and glial cells) were analyzed in the peridental and dental mesenchymes of implanted reassociations and compared to the physiological situation in developing molars at similar stage. This work describes conditions allowing the innervation of engineered teeth. Preliminary encouraging attempts have been made to replace CsA by using stem cells.

La dystrophine Dp71, issue du gène DMD impliqué dans la dystrophie musculaire de Duchenne intervient dans le maintien de l'homéostasie rétinienne et de la barrière hémato-rétinienne. Nous avons mis en évidence une localisation rétinienne jusque-là méconnue de la Dp71 au sein des astrocytes rétiniens. Nous avons également étudié l'effet in vivo de l'absence de Dp71, sur le développement vasculaire et observé une plus faible densité et une morphologie astrocytaire différente comparativement aux souris contrôles, à l'origine d'un développement vasculaire retardé. Compte tenu de la spécificité du réseau vasculaire rétinien dont l'étanchéité des parois est maintenue en partie par les pieds des CGM et des astrocytes, nous avons émis l'hypothèse, étant donné l'implication de la Dp71 dans la stabilisation de ces cellules, d'une altération de cette protéine dans les phénomènes de rupture de la BHR. Ainsi dans un modèle transitoire de rupture de la BHR in vivo relativement " pur ", sans ischémie ni injection de VEGF, nous avons observé une diminution de l'expression de la dystrophine Dp71 ainsi que du canal aqueux AQP4 et une délocalisation du canal potassique Kir4.1 dans les CGM. L'injection intra-vitréenne de Dexaméthasone dans ce modèle a permis de prévenir les modifications d'expression et de localisation de ces protéines. / Dp71, a dystrophin produced from DMD gene, is involved in retinal homeostasis and maintenance of blood retinal barrier. We have previously shown that Dp71, part of a complex called Dystrophin associated protein, is involved in the localization of aqueous and potassic channels in Muller glial cell (MGC), particularly around blood vessels, allowing maintenance of retinal homeostasis. Based on the knowledge that growing retinal vessels migrate on an astrocyte template during development, we highlighted the expression of Dp71 in retinal astrocytes. In absence of Dp71, in vivo, we observed a lower density and a different morphology of retinal astrocytes compared to control retina in mice, responsible for a delayed vascular development. Due to the role of barrier of the retinal vascular network, insured also by astrocytes, we studied a model of post surgical BRB breakdown and found a decreased of Dp71 protein expression associated with Kir4.1 delocalization and AQP4 decrease in MGC. Intravitreal Dexamethasone prevents these protein expression changes. We suggest here that the membrane associated cytoskeletal protein, Dp71, expressed in astrocytes is involved in the maintenance of astrocytes density and morphology necessary as a template for retinal vascular development. This protein insure also a key role in retinal homeostasis by localizing and maintaining aqueous and potassic channels in MGC. Moreover when this protein is altered, Dexamethasone seems to be capable to promote Dp71 expression which could have wide clinical implications in retinal diseases treatment and the target for retinal neuroprotection under pathological conditions seems to be the macroglial cells.

Dans la rétine, la protéine dystrophine Dp71 est principalement exprimée dans les cellules gliales de Müller (CGM), qui contribuent à la stabilisation de la barrière hémato-rétinienne (BHR). Les CGM sont aussi les principales sources de facteurs inflammatoires. Ainsi, nous avons étudié les effets de l’absence de Dp71 sur l’homéostasie potassique et aqueuse, ainsi que sur l’expression de médiateurs de l’inflammation et la perméabilité vasculaire rétinienne.L'absence de Dp71 diminue l'expression de la protéine AQP4 et induit la redistribution de Kir4.1 tout le long des CGM. Par ailleurs, nous avons également constaté que le décollement expérimental de la rétine chez les souris WT induit une diminution de Dp71 associée à une délocalisation de Kir4.1, une régulation à la baisse de la protéine AQP4 dans les CGM.Nos données montrent clairement que l'absence de la Dp71 entraîne une augmentation de l'expression du VEGF, d’ICAM-1, une augmentation du nombre de leucocytes adhérents rétiniens, une dégénérescence accrue des capillaires associée à une forte perméabilité vasculaire chez les souris Dp71-null.L’ensemble de nos résultats a mis en évidence le rôle de la Dp71 dans les mécanismes visant à réguler l'homéostasie rétinienne et à assurer la stabilisation de la BHR. Nous apportons la preuve que la perte de Dp71 favorise l'inflammation vasculaire rétinienne et la dégénérescence des capillaires associée à une perméabilité vasculaire. Ensemble, ces observations suggèrent que la souris Dp71-null serait un modèle approprié pour étudier les pathologies vasculaires rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique, l’uvéite rétinienne et l’occlusion veineuse rétinienne. / In the retina, the Dp71 dystrophin protein is mainly expressed in Müller glial cells (MGC), which contribute to the stabilization of the blood-retinal barrier (BRB). MGC are also the main sources of inflammatory factors. Thus, in our thesis project we studied the effects of the absence of the Dp71 protein on potassium and water homeostasis, as well as the expression of inflammatory mediators and retinal vascular permeability.The absence of the Dp71 protein decreased the expression of AQP4 protein and induces the redistribution of Kir4.1, initially restricted to the end-feet of MGC and around vessels, all along the cell membrane. Moreover, we have also shown that the experimental retinal detachment in WT mice induces a reduction of Dp71 which is associated with Kir4.1 mislocation, a down regulation of AQP4 protein in MGC.Our data clearly demonstrate that the absence of the Dp71 leads to increased retinal VEGF and ICAM-1 expression in Dp71-null mouse compared to WT mouse strain. There is also an increase of the number of retinal adherent leukocytes, capillary degeneration associated with high BRB permeability observed in Dp71-null mice.Our findings highlight Dp71 as an important component in the mechanisms leading to the regulation of retinal homeostasis; and to the maintaining of the BRB stabilization. We provide evidence that deficiency of Dp71 promotes retinal vascular inflammation and significantly exacerbated degeneration of capillaries and BRB breakdown. Together these results suggest that the Dp71-null mouse could be a good model to study retinal vascular diseases such as diabetic retinopathy, retinal uveitis and retinal vein occlusion.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La différenciation cellulaire implique des facteurs clés. Chez la drosophile, le facteur de transcription Glide/Gcm est impliqué dans la différenciation de deux types de cellules immunitaires : les macrophages circulants, qui ont une origine hématopoïétique, et les cellules gliales, macrophages résidents du système nerveux central, qui sont issues des précurseurs neuraux. J'ai d'abord entrepris la caractérisation du potentiel hématopoïétique de Gcm et l'identification de ses cibles dans les hémocytes. Ensuite, pour comprendre comment plusieurs types cellulaires peuvent être spécifiés par un même facteur de transcription, j'ai étudié comment s'effectue le choix entre le destin glial et le destin hémocytaire de la cellule. J'ai en particulier misen évidence le rôle clé des gènes agissant en aval de Gcm, ceux impliqués dans la consolidation et le maintien de l'identité cellulaire. Finalement, j'ai participé à la caractérisation du territoire d'expression de Gcm au niveau protéique et découvert un nouveau rôle de Gcm dans la différenciation de cellules neurosécrétrices, cellules indispensable pour initier le signal hormonal déclenchant le phénomène de mue chez les insectes. / Cell fate determination involves key transcription factors. ln Drosophila, the transcription factor Glide/Gcm is required for the differentiation of two immune cell types: circulating macrophages,which arise from hematopoietic precursors, and glial cells, resident macrophages of the central nervous system, which differentiate from neural precursors. ln first, 1 characterized Gcm hematopoietic potential and identified its target genes in hemocytes. Then, to get an insight intomolecular mechanisms underlying the acquisition of several identities with a single fate determinant, 1 investigated how the choice between the hemocyte and the glial fates is regulated.Being necessary to consolidate and to maintain a specific fate, 1 highlight the key role of genes acting downstream of a fate determinant. Finally, 1 contribute to characterize Gcm expression profile at the protein level and highlight a new role of Gcm in the differentiation of neurosecretory cells, cells absolutely required to initiate the hormonal signal triggering the molting process in insects.

Les eIF2B-pathies représentent un groupe de leucodystrophies de transmission autosomique récessive du à des mutations du facteur ubiquitaire eIF2B. Celui-ci intervient dans l'initiation de la traduction et ses régulations, particulièrement en cas de stress cellulaires, grâce à son activité d'échange de guanine (GEF). Un large spectre clinique et mutationnel a été décrit pour cette pathologie.La diminution de l'activité GEF a pu être validée comme marqueur diagnostique spécifique des eIF2B-pathies dans les lymphoblastes de patients atteints avec un seuil d'activité à 77,5% pour une spécificité de 100% et une sensibilité de 89%.La compréhension des mécanismes moléculaires en cause a ensuite été recherchée selon trois approches :- une première focalisée sur l'étude de la réponse au stress du réticulum endoplasmique (RE) dans les lymphoblastes de patients eIF2B-mutés. L'hyper-activation transcriptionnelle et traductionnelle des gènes de la réponse au stress du RE, observée dans d'autres études et sur d'autres types cellulaires n'a pas été retrouvée dans cette étude.- une approche globale d'étude transcriptomique différentielle dans des fibroblastes primaires de patients eIF2B-mutés soumis ou non à un stress cellulaire. La comparaison du transcriptome avec celui de contrôles sains et de patients porteurs d'une autre leucodystrophie n'a pas permis de mettre en évidence un effet spécifique du stress dans les fibroblastes eIF2B-mutés. En revanche, il a pu être montré une dérégulation de l'expression de 70 gènes spécifiquement dans ces fibroblastes ainsi que l'implication de voies métaboliques telles que l'épissage et la stabilité des ARNm, importantes au cours du développement du système nerveux central. Ces gènes trouvés dérégulés dans les fibroblastes, appartenant notamment à la famille des hnRNP, ont été ensuite validés dans les cerveaux de patients eIF2B-mutés et une anomalie d'épissage de certains transcrits importants pour les cellules gliales a également été identifiée.- enfin, pour valider l'hypothèse d'une anomalie développementale des cellules gliales, le modèle des cellules souches embryonnaires (ESC) a été utilisé et un défaut génétique a été introduit dans ces cellules afin de mimer les mutations eIF2B. Une anomalie de différentiation de ces ESC en cellules gliales a pu être mise en évidence dans ce modèle qui pourrait alors constituer un outil de choix pour tester des molécules pouvant potentiellement améliorer la différenciation de ces cellules, principales en cause dans cette pathologie.

Les eIF2B-pathies représentent un groupe de leucodystrophies de transmission autosomique récessive du à des mutations du facteur ubiquitaire eIF2B. Celui-ci intervient dans l’initiation de la traduction et ses régulations, particulièrement en cas de stress cellulaires, grâce à son activité d’échange de guanine (GEF). Un large spectre clinique et mutationnel a été décrit pour cette pathologie.La diminution de l’activité GEF a pu être validée comme marqueur diagnostique spécifique des eIF2B-pathies dans les lymphoblastes de patients atteints avec un seuil d’activité à 77,5% pour une spécificité de 100% et une sensibilité de 89%.La compréhension des mécanismes moléculaires en cause a ensuite été recherchée selon trois approches :- une première focalisée sur l’étude de la réponse au stress du réticulum endoplasmique (RE) dans les lymphoblastes de patients eIF2B-mutés. L’hyper-activation transcriptionnelle et traductionnelle des gènes de la réponse au stress du RE, observée dans d’autres études et sur d’autres types cellulaires n’a pas été retrouvée dans cette étude.- une approche globale d’étude transcriptomique différentielle dans des fibroblastes primaires de patients eIF2B-mutés soumis ou non à un stress cellulaire. La comparaison du transcriptome avec celui de contrôles sains et de patients porteurs d’une autre leucodystrophie n’a pas permis de mettre en évidence un effet spécifique du stress dans les fibroblastes eIF2B-mutés. En revanche, il a pu être montré une dérégulation de l’expression de 70 gènes spécifiquement dans ces fibroblastes ainsi que l’implication de voies métaboliques telles que l’épissage et la stabilité des ARNm, importantes au cours du développement du système nerveux central. Ces gènes trouvés dérégulés dans les fibroblastes, appartenant notamment à la famille des hnRNP, ont été ensuite validés dans les cerveaux de patients eIF2B-mutés et une anomalie d’épissage de certains transcrits importants pour les cellules gliales a également été identifiée.- enfin, pour valider l’hypothèse d’une anomalie développementale des cellules gliales, le modèle des cellules souches embryonnaires (ESC) a été utilisé et un défaut génétique a été introduit dans ces cellules afin de mimer les mutations eIF2B. Une anomalie de différentiation de ces ESC en cellules gliales a pu être mise en évidence dans ce modèle qui pourrait alors constituer un outil de choix pour tester des molécules pouvant potentiellement améliorer la différenciation de ces cellules, principales en cause dans cette pathologie. / EIF2B-related disorders are an autosomal recessive leukodystrophy caused by mutations in the ubiquitary eIF2B factor. This one is involved in the translation initiation step and its regulation, particularly upon cellular stresses, thanks to its guanine nucleotide exchange factor (GEF) activity. A wide continuum clinical and mutational spectrum has been described for this pathology.The decrease of eIF2B GEF activity has been validated as an eIF2B-pathies specific biomarker in affected patients’ lymphoblasts with 100% specificity and 89% sensibility using a threshold at 77.5%.Functional molecular mechanisms involved in the physiopathology of eIF2B-related disorders have been searched by three approaches:- the first one focalized on the study of the endoplasmic reticulum stress response in lymphoblasts from eIF2B-mutated patients. The translational hyper-induction of specific genes involved in the unfolded protein response, identified in other cell types, was not observed in this study.- a global approach using a differential transcriptomic study of primary fibroblasts from eIF2B-mutated patients submitted or not to a cellular stress. The comparison with the transcriptomic profile of fibroblasts from healthy controls and patients presenting with other types of leukodystrophies not allowed us to identify a specific stress effect in eIF2B-mutated fibroblasts. On the other hand, it has been shown 70 genes specifically differentially deregulated in eIF2B-mutated fibroblasts as well as metabolic pathways implication, like splicing and mRNA stability, that are critical during the central nervous system development. We then validated that these genes, belonging the the hnRNP family, were also deregulated in brains from eIF2B-mutated patients and a splice abnormality of genes implicated in glial cells network has also been identified.- finally, in order to validate the hypothesis of an abnormal glial cell development, the embryonic stem cells (ESC) model has been used and a genetic default has been introduced in these cells to mimic eIF2B mutations. We identified an abnormal differentiation of these ESC into glial cells. Therefore, this model would provide a unique tool to search therapeutic agents that would improve glial cell differentiation, the major cells implicated in this pathology.

La rupture de la barrière hémato-rétinienne interne (iBRB) se produit dans de nombreux troubles de la rétine et peut provoquer un œdème rétinien souvent responsable de la perte de vision. Le but de cette étude était de caractériser l'impact d'une rupture de l’iBRB sur les changements homéostatiques rétiniens de la dystrophine Dp71, AQP4 et Kir4.1 provoqués par les altérations les cellules gliales de Müller CGM. L'effet protecteur de la Dex a été étudié dans ce modèle. Par ailleurs, les explants rétiniens ont été utilisé pour étudier la formation et la résolution de l'œdème de CGM sans l'influence de l'inflammation du cristallin ainsi que l’effet de différentes doses de glucocorticoïdes (Dex, triamcinolone et fluocinolone) et des inhibiteurs de la voie de l'acide arachidonique. Nous avons observé que la chirurgie partielle du cristallin induit une rupture de l'iBRB et des changements moléculaires dans le CGM, une diminution de l’expression de la Dp71 et d’AQP4 et la délocalisation de Kir4.1. La Dex semble protéger la rétine par l’augmentation de l’expression du HSF1. Nous avons également observé que même si les glucocorticoides étudié ont des effets différents sur l’expression de la Dp71, AQP4 et Kir4.1 les trois sont capables de prévenir la formation de l’œdème de CGM. Nos résultats suggèrent que la formations d'œdème semblent être régulée par la voie des leucotriènes. Nous avons étudié le rôle des isoformes de la dystrophine Dp71 dans les processus d'adhésion intercellulaire des cellules PC12. Nos résultats suggèrent l’existence d’au moins deux mécanismes différents seraient impliqués dans l'adhésion intercellulaire associée à la Dp71, l'une impliquant Dp71dΔ71 et Cx43. / The breakdown of the internal blood-retinal barrier (iBRB) occurs in many retinal disorders and may cause retinal edema, often responsible for vision loss. The aim of this study was to characterize the impact of iBRB disruption on retinal homeostatic changes in Dp71 dystrophin, AQP4 and Kir4.1 caused by Müller glial cells (MGC) alterations. The protective effect of Dex has been studied in this model. In addition, retinal explants were used to study the formation and resolution of CGM edema without the influence of lens inflammation and the effect of different doses of glucocorticoids (Dex, triamcinolone and fluocinolone) and inhibitors of the arachidonic acid pathway. We observed that partial lens surgery induced iBRB breakdown and molecular changes in MGC, decreased expression of Dp71 and AQP4, and miss localization of Kir4.1. Dex seems to protect the retina by increasing the expression of HSF1. We also observed that although the glucocorticoids studied have different effects on the expression of Dp71, AQP4 and Kir4.1 all three can prevent the formation of MGC edema. Our results suggest that edema formation appears to be regulated by leukotrienes. We have studied the role of isoforms of dystrophin Dp71 in intercellular adhesion processes of PC12 cells. Our results suggest the existence of at least two different mechanisms involved in intercellular adhesion associated with Dp71, one involving Dp71dΔ71 and Cx43.

Ces dernières années, alors qu’aucun agent neuroprotecteur n’a été efficace en clinique pour parer les dommages de l’ischémie cérébrale, le concept d’unité neurovasculaire (UNV) est apparu comme un nouveau paradigme pour l’investigation et le traitement des accidents vasculaires cérébraux ischémiques. La rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) localisée au niveau des capillaires cérébraux, et ses corollaires l’œdème vasogénique et l’hémorragie intracérébrale, constituent des événements critiques de la maladie, et restreignent considérablement l’éligibilité des patients à la thrombolyse au rtPA, seul traitement de phase aiguë disponible actuellement en clinique. La complexité des intercommunications qui s’exercent au sein de l’UNV rend difficile l’appréhension de la dysfonction microvasculaire in vivo, soulignant l’importance des études in vitro pour compléter les connaissances dans ce domaine. C’est par cette approche combinée que les travaux effectués au cours de ce doctorat démontrent l’impact de la nécrose cérébrale sur la cinétique de la perte d’intégrité de la BHE au décours de la reperfusion. Cependant, même si l’endothélium microvasculaire demeure fonctionnel après un épisode ischémique dans un contexte non lésionel, il devient vulnérable à certaines molécules comme le rtPA dans une situation de thrombolyse. Ces résultats illustrent le rôle déterminant de l’environnement moléculaire périvasculaire sur la dysfonction de la BHE lors de l’ischémie cérébrale, et orientent les nouvelles stratégies thérapeutiques vers des approches ciblant la protection de l’ensemble de l’UNV. / In the recent years, while no neuroprotective agent was clinically effective in reducing brain ischemic damage, the neurovascular unit (NVU) concept emerged as a new paradigm for stroke investigation and treatment. The breakdown of the blood-brain barrier (BBB), localized in brain capillaries, with ensuing vasogenic edema and intracerebral hemorrhage, appears as a critical event of this disease, and severely restricts the eligibility of patients for rtPA thrombolysis, the only acute-phase treatment currently available. The complex intercommunications occurring within the NVU makes the microvascular dysfunction difficult to study in vivo, highlighting the importance of in vitro approaches to complete the knowledge in this field. In this context, the work done in this PhD demonstrates that brain tissue necrosis influences the kinetics of the loss of BBB integrity during reperfusion. However, even when the BBB remains functional in a non-lesional ischemic context, it becomes vulnerable to certain molecules such as rtPA in a thrombolysis situation. These results illustrate the key role of molecular perivascular environment on the BBB dysfunction during cerebral ischemia, and orientate new therapeutic strategies towards the protection of the entire NVU.