Au cours de cette étude, l expression des gènes codants de quatre sous types de récepteurs centraux (GABAA, 5-HT1A, m-opioïdes et a1-adrénergiques) impliqués dans la modulation de l anxiété a été évaluée. L impact de l anxiété trait sur les réponses immunitaires cellulaire et humorale et sur le niveau du statut oxydatif au niveau du SNC (neurones et cellules gliales) et au niveau périphérique (lymphocytes, granulocytes et monocytes) a été mis en évidence. En même temps, l effet de l anxiété trait couplée au modèle de stress expérimental anxiogène par contention, sur les réponses immunitaires cellulaire et humorale a été évalué. En effet, le niveau élevé d anxiété induit d une part, un effet dépressif significatif sur l immunité cellulaire (lymphocytes totaux, TCD4+ et TCD8+) et humorale (IgA et IgE) et d autre part, une augmentation significative du niveau intracellulaire des espèces réactives de l oxygène (ERO) des neurones et des cellules gliales au niveau du cortex cérébral, du cervelet et de l hippocampe et des granulocytes, des lymphocytes et des monocytes au niveau périphérique. De la même manière, l anxiété trait couplée au stress aigu et chronique par contention a provoqué une dépression de certains paramètres de l immunité cellulaire (lymphocytes totaux, TCD4+, TCD8+ et NK) et humorale (IgA, E et G) et une stimulation des autres paramètres (granulocytes et monocytes). Ces travaux ont permis ainsi de valider scientifiquement le caractère anxiogène du modèle du stress par contention, d établir de manière valide et reproductible le lien et la corrélation entre le niveau élevé d anxiété chez des animaux et leur statut oxydatif inducteur d une cytotoxicité ainsi que le rôle de l expression des gènes codants de 4 sous types de récepteurs dans l expression de cette anxiété élevée et d un statut oxydatif important au niveau des cellules périphériques du système immunitaire et des neurones et cellules gliales au niveau central. / In this study, genes expression from four central receptors (GABAA, 5-HT1A, m-opioïdes and a1-adrenergic) involved in the modulation of anxiety was assessed. The impact of anxiety on the cellular and humoral immunity and on the oxidative status at the SNC (neurons and glial cells) and peripheral (lymphocytes, granulocytes and monocytes) level was highlighted. At the same time, the effect of anxiety coupled with an anxiogenic restraint stress, on the cellular and humoral immunity was also evaluated. Indeed, the high level of anxiety induced firstly, a significant depressive effect on cellular (total lymphocytes, TCD4+ and TCD8+) and humoral (IgA and IgE) immunity, and secondly, a significant increase of the level of intracellular reactive oxygen species (ROS) of neurons and glial cells in the cerebral cortex, the cerebellum and the hippocampus and in the peripheral blood granulocytes, monocytes and lymphocytes. In the same way, the anxiety coupled to acute and chronic restraint stress provoked, a depression of some parameters of cellular (total lymphocytes, TCD4+, TCD8+ and NK) and humoral (IgA, E and G) immunity, and a stimulation of others (granulocytes and monocytes). These works thus made it possible to validate scientifically the anxiogenic character of the model of restraint stress, to establish in a valid and reproducible way the bond and the correlation between the high level of anxiety in animals and their oxidative status inductive of a cytotoxicity as well as the role of the expression of coding genes of 4 receptors in the expression of this high anxiety and of a significant oxidative status at the level of the peripheral cells of the immune system and the neurons and glial cells at the central level

Chez les mammifères, la neurogénèse adulte est limitée, au contraire, chez les poissons téléostéens, elle est intense et a lieu dans tout le cerveau. Chez les poissons, l’aromatase cérébrale (aroB), l’enzyme de synthèse de l’œstradiol (E2) est régulée par l’E2 dans les cellules gliales radiaires (CGR). Ces CGR dont le rôle est inconnu chez les poissons sont des cellules progénitrices chez les mammifères lors de l’embryogénèse. L’objectif de ce travail était d’étudier l’hypothèse d’un lien entre l’E2 et la forte activité neurogénique chez les poissons. Nous montrons que les CGR sont des cellules progénitrices chez le poisson zèbre adulte. Nous avons caractérisé une lignée de poisson zèbre transgénique aroB/GFP. Nous mettons en évidence que des androgènes peuvent réguler l’aroB, via les récepteurs aux œstrogènes (ERs). Enfin, nous montrons que les ARNm des ERs et de l’aroB apparaissent très tôt pendant le développement et que la signalisation œstrogénique se met en place entre 24h et 48h. / Whilst adult neurogenesis is a limited process in mammals, it is, in contrast, intense in teleost fish and occurs in the whole brain. Fish exhibit specific features concerning the aromatase, the enzyme that synthesises estradiol (E2). Indeed, brain aromatase (aroB) is up-regulated by E2 in radial glial cells (RGC). These RGC are known progenitor cells in mammals, during embryonic neurogenesis. In contrast, their role is unknown in fish. The aim of this work was to study the potential link between E2 and the strong neurogenic activity of fish. We show that RGC are progenitor cells in the adult brain of zebrafish (Danio rerio). Moreover, we characterized and validated a transgenic zebrafish line aroB/GFP. We also found that aromatizable and non aromatizable androgens can induce aroB through estrogen receptors. We also show that the onset of the estrogen regulation of aroB appears between 24 and 48h.

La cianotoxina β-N-metil-amino-L-alanina (BMAA) es un aminoácido no proteico producido por cianobacterias, capaz de biomagnificarse en las cadenas tróficas de ecosistemas marinos y terrestres. Dada su capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica, su ingesta progresiva se asocia con el desarrollo de ciertas retinopatías, así como también de enfermedades neurodegenerativas, tales como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), la Enfermedad de Parkinson (EP) y la Enfermedad de Alzheimer (EA). Los daños causados por la BMAA son múltiples y originados en mecanismos diversos. Así, la BMAA, en presencia de iones bicarbonato (HCO3 - ), puede formar un compuesto denominado carbamato, cuya estructura química es similar al glutamato (Glut), uno de los neurotransmisores más importantes del sistema nervioso. A su vez, el carbamato se une y activa receptores de Glut, ya sean ionotrópicos (como el receptor de N-metil-D- aspartato) o metabotrópicos. La sobreexcitación de estos receptores ocasionada por la BMAA, promueve mecanismos de excitotoxicidad que conducen a alteraciones neuronales. Por otro lado, la BMAA puede ingresar a las células a través del sistema xc, un sistema de transporte sodio-independiente común para cistina y Glut. Una vez en el interior celular, la toxina puede incorporarse erróneamente en las cadenas polipeptídicas en reemplazo de Serina (Ser). Así, unida a componentes proteicos, puede generar un reservorio endógeno de lenta liberación que expone a las neuronas a una baja pero continua dosis de esta toxina. Entre sus varios efectos subcelulares, la BMAA puede afectar la permeabilidad de las membranas mitocondriales comprometiendo su actividad. Además, puede inducir modificaciones en los niveles de Ca 2+, generar estrés oxidativo, promover fallas en la producción de ATP e inducir estrés en el retículo endoplasmático, lo cual conduce a alteraciones en la síntesis y/o distribución de proteínas. Asociado a esto, se originan alteraciones en el transporte axonal y la fragmentación de estas estructuras. Pese a su trascendencia para la salud, aún son desconocidos los efectos directos que genera la exposición a la BMAA de las neuronas y células gliales de la retina (como las células gliales de Müller –CGM-), o del epitelio pigmentario de la retina (EPR). Además, todavía son mayormente desconocidos aquellos factores o moléculas capaces de modular las vías de señalización involucradas en los efectos deletéreos inducidos por la BMAA. Al respecto, recientemente se ha propuesto que la activación de los receptores X retinoides (RXR) protegerían a las neuronas y modularían la respuesta inflamatoria durante las enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central, y también en retinopatías. Aún se desconoce si estos receptores ejercen un rol protector contra los daños inducidos por la BMAA. En esta Tesis se estudiaron los mecanismos involucrados en los cambios degenerativos inducidos por la BMAA en células de la retina, así como también en células PC12 diferenciadas a neuronas. Asimismo, se evaluó el valor protector de agonistas de los RXRs frente a los efectos deletéreos inducidos por la BMAA en células de la retina. Para estos estudios, se obtuvieron cultivos puros de neuronas amacrinas y fotorreceptores (FRs), de CGM puros, y cultivos neuro-gliales a partir de retinas de ratas neonatas. Además, se utilizaron cultivos de líneas celulares PC12 y epiteliales ARPE- 19. Todos los cuales fueron tratados con la BMAA para evaluar sus efectos sobre estas células y el posible rol protector de los RXRs. Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que aún bajas concentraciones de la BMAA (de 0,4 μM) alteraron la viabilidad no sólo de las neuronas amacrinas y FRs, sino también de las células PC12 diferenciadas a neuronas, de las CGM e incluso de las células del EPR. La BMAA también, indujo alteraciones en la permeabilidad mitocondrial y en la producción de ROS en las células neuronales, gliales y epiteliales, mientras que en las CGM indujo cambios en la morfología nuclear. Por su parte, en neuronas amacrinas, promovió el crecimiento axonal, aunque generando el colapso de sus conos de crecimiento. Estas alteraciones fueron mediadas por la activación de los receptores NMDA en presencia de iones HCO3 - . Además, en estas células, la BMAA se incorporaría erróneamente en las cadenas polipeptídicas en reemplazo de la Ser, dado que la suplementación del medio de cultivo con este aminoácido previno la toxicidad inducida por la BMAA. En cuanto a la acción protectora de los RXRs, nuestros resultados demostraron que su activación bloqueó los efectos tóxicos que produjo la BMAA sobre las neuronas amacrinas y los FRs, así como también sobre las células del EPR. En resumen, en esta Tesis presentamos evidencias de que la BMAA afecta múltiples estructuras subcelulares en las células que conforman la retina, así como también a células PC12 diferenciadas. Estos resultados sugieren que los daños inducidos por la BMAA representan un potencial riesgo para la salud, y podrían contribuir al desarrollo de retinopatías, así como de varias enfermedades neurodegenerativas. Además, este trabajo indicaría que la activación de los RXRs puede presentar un papel protector al ejercer un rol relevante en la supervivencia de las neuronas amacrinas y FRs, así como también de las células del EPR. En su conjunto, estos hallazgos aportan nuevos conocimientos en relación a los mecanismos deletéreos inducidos por la BMAA y podrían ser de utilidad para el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas. / The cyanotoxin β–N-methylamino-L-alanine (BMAA) is a non-proteinogenic amino acid produced by cyanobacteria. It is biomagnified along the food chains in both, marine and terrestrial ecosystems. Due to its ability to cross the brain blood barrier, its ingestion may contribute to the onset of retinopathies, as well as neurodegenerative diseases, like Amyotrophic Lateral Sclerosis, Parkinson (PD) and Alzheimer disease (AD). Damages induced by BMAA are multiple and originated by different mechanisms. In the presence of bicarbonate ions (HCO3 - ), BMAA can produce carbamate, whose chemical structure is similar to that of glutamate (Glut), one of the most important neurotransmitters in the nervous system. In turn, carbamate can bind and activate both ionotropic (like N-Methyl-D-aspartate -NMDA-) and metabotropic Glut receptors. Overactivation of these receptors by BMAA promotes excitotoxicity, which leads to nuclear alterations. On the other hand, BMAA crosses the cell membranes by using the cystine/glutamate antiporter (xc- system), a sodium-independent amino acid transporter. Once inside the cells, the toxin can mistakenly replace the amino acid Serine (Ser) in polypeptide chains, thus generating an endogenous reservoir of BMAA, whose slow- release exposes neurons to a low, but continuous amount of this toxin. Among its various subcellular effects, BMAA can alter mitochondrial membrane permeability compromising mitochondrial activity. Besides, it can alter Ca2+ levels, generate oxidative stress, promote failures in the ATP production and induce endoplasmic reticulum (RE) stress, leading to alterations in the protein synthesis and/or distribution. In this context, BMAA promotes alterations in axonal transport along with fragmentation of these structures. Despite its importance to health, the direct effects of BMAA exposure on retinal neurons and glial cells (such as Müller glial cells –CGM-), or retinal pigment epithelium (RPE) cells, are virtually unknown and the factors or molecules, which could modulate the signaling pathways involved in the deleterious effects induced by BMAA have not been established. In this regard, it has recently been proposed that the activation of Retinoid X Receptors (RXR) can protect neurons and modulate the inflammatory responses during neurodegenerative diseases of the central nervous system, including retinopathies. However, the possible protective roles of RXRs in BMAA-induced damages are still unknown. In this Thesis, we have studied the mechanisms involved in the degenerative changes induced by BMAA into retinal cells, and in neuron-like, differentiated rat pheochromocytoma cells (PC12 cells), as well. We also evaluated the protection of RXR agonists against the deleterious effects of BMAA in retinal cells. For these purposes, we obtained pure neuronal cultures of amacrine neurons and photoreceptors (PHRs); pure MGC cultures, and mixed neuro-glial cultures from newborn rats. In addition, we used PC12 cells and ARPE-19 epithelial cell lines. We treated them with BMAA to evaluate its effects on these cells and the possible protective roles of RXRs. Our results showed that low concentrations of BMAA (0.4 μM) altered, not only the viability of amacrine neurons and PHRs, but also that of neuronally differentiated PC12 cells, MGC and even that of the RPE cells. Also, the cyanotoxin induced alterations in mitochondrial membrane permeability and in ROS production, while in MGC, BMAA induced changes in the nuclear morphology. On the other hand, in amacrine neurons, this toxin promoted axonal growth, although simultaneously generating the collapse of their growth cones. We established that all these alterations were induced by activation of NMDA receptors in the presence of HCO3 - ions. Besides, in all these cell types, BMAA appeared to incorporate into polypeptide chains replacing Ser, since supplementation of the culture media with this amino acid prevented toxicity damages. Regarding the protective roles of RXRs, our results showed that their activation blocked the toxic effects induced by BMAA in amacrine neurons, PHRs, and RPE cells. In summary, in this Thesis we present evidences that BMAA affected multiple subcellular structures in retina cells and in PC12 cells differentiated into neurons. These results suggest that the damaging effects induced by BMAA represent a potential health risk, which could contribute to the development of retinopathies, along with other neurodegenerative diseases. In addition, this work would indicate that RXR activation can promote survival of amacrine PHRs and RPE cells. Taken together, these findings provide new knowledge regarding the deleterious mechanisms induced by BMAA, which could be useful for the development of future effective therapies.

La Retinitis Pigmentaria (RP) y la Degeneración Macular Asociada a la Edad (AMD) son enfermedades neurodegenerativas de la retina que se caracterizan por la pérdida progresiva e irreversible de las neuronas fotorreceptoras (FR). Ambas enfermedades son incurables, conducen a la pérdida de visión y no cuentan con tratamientos efectivos. Una estrategia para lograr desarrollar una terapia más adecuada para estas enfermedades es la utilización de células madre que puedan restaurar los tejidos dañados. Sin embargo, regenerar la retina requiere resolver varios problemas poco explorados: uno de ellos es la escasa actividad regenerativa de las células gliales de Müller (CGM) de la retina que, si bien han sido propuestas como células madre, poseen una efectividad muy limitada en mamíferos y son ineficientes para recuperar los FR perdidos. Otro problema es la respuesta reactiva de las CGM, la cual ocurre luego de daños en la retina y genera una inflamación crónica local que afecta la supervivencia de las neuronas regeneradas. Al respecto, recientemente se ha propuesto que los receptores X para retinoideos (RXR) son moduladores de la respuesta inflamatoria que protegerían a las neuronas durante las enfermedades neurodegenerativas del SNC. Sin embargo, aún se conoce muy poco sobre su rol en la retina. El estudio de estas enfermedades enfrenta dificultades éticas y prácticas, por lo que el uso de ratones rd1, un modelo animal de RP que presenta una mutación específica que causa la muerte por apoptosis de los FR, resulta extremadamente útil para investigar las causas de la escasa capacidad regenerativa de la retina. Con este objetivo utilizamos retinas enteras y cultivos primarios neuronales y de CGM de ratones control y rd1. También investigamos y comparamos la actividad proliferativa de las CGM y la expresión de diversos marcadores de células madre, así como la expresión de los RXR y su efectos sobre la supervivencia neuronal y reactividad glial ante el tratamiento con un agonista sintético de estos receptores. Los resultados indicaron una disminución de los marcadores de célula madre de las CGM rd1. Notablemente, la expresión de uno de ellos, Nestina, pudo ser revertida al co-cultivar las CGM rd1 con neuronas control (wt), lo que sugiere una alteración en la comunicación neuro-glial. Además, el agonista sintético de los RXR, PA024, retrasó la muerte de los FR y disminuyó la reactividad glial en cultivos de retinas rd1. En resumen, en esta tesis presentamos evidencia de que en las retinas rd1 existe una alteración en la comunicación neuro-glial que afectaría el potencial regenerativo y dispararía una respuesta reactiva en las CGM. Asimismo, hallamos que la reactividad de las CGM y la muerte de los FR en las retinas rd1 pudo ser disminuida mediante la utilización de un agonista de los RXR. Estos resultados sugieren que el potencial regenerativo de las CGM dependería de su interacción con neuronas sanas; que durante los procesos neurodegenerativos de la retina este diálogo neuro-glial estaría afectado; y que los RXR regularían, en parte, los procesos inflamatorios y la supervivencia neuronal en la retina. Estos hallazgos podrían ser de utilidad para el desarrollo de una terapia efectiva de reemplazo celular. / Retinitis Pigmentosa (RP) and Age-related Macular Degeneration (AMD) are neurodegenerative diseases of the retina which are characterized by the progressive and irreversible loss of photoreceptor neurons (PRs). Both diseases are incurable, lead to loss of vision and lack effective treatment. A strategy to develop an adequate therapy involves the use of stem cells that are able to restore damaged tissue. However, retina regeneration requires solving many unexplored issues. One of them is poor regenerative activity of Müller glial cells (MGC) of the retina. Although these cells have been postulated as stem cells, they have limited effectiveness in mammals and are inefficient to recover lost PRs. Another issue is the reactive response of MGC, which occurs after damage to the retina and causes local chronic inflammation that affects the survival of regenerated neurons. In that regard, it has recently been claimed that retinoid X receptors (RXR) are inflammatory response modulators that could protect the neurons from neurodegenerative diseases of the central nervous system. However, little is known about the role they play in the retina. Research into these diseases faces many ethical and practical challenges. Therefore, using rd1 mice, an animal model of RP with a very specific mutation which causes death by apoptosis of PRs, is extremely useful to study the causes of poor regenerative capacity of the retina. For this purpose, we have used whole retinas and primary neural and MGC cultures from control and rd1 mice. We have also studied and compared the proliferative activity of MGC and the expression of several stem cell markers, as well as the expression of RXR and their effect on neuronal survival and glial reactivity upon treatment with a synthetic agonist. Results showed decreased rd1 MGC stem cell markers. Remarkably, the expression of one of these, Nestin, could be reverted by co-culturing of rd1 MGC with control neurons (wt), which suggests an alteration in neuroglial communication. Furthermore, using the RXR synthetic agonist PA024 delayed death of PRs and decreased glial reactivity in rd1 retina cultures. In sum, throughout this thesis we have presented evidence that in rd1 retinas there is an alteration in neuroglial communication which could affect the regenerative potential and trigger a reactive response of MGC. Additionally, we found that MGC reactivity and death of PRs in rd1 retinas could be reduced by means of a RXR agonist. These results suggest that regenerative potential of MGC could depend on their interaction with healthy neurons, that neuroglial communication could be affected when neurodegenerative processes of the retina take place, and that RXR could partially regulate inflammatory processes and neuronal survival in the retina. These findings could prove useful for the development of an effective cellular replacement therapy.

Le bon fonctionnement des réseaux neuronaux dépend des interactions entre les neurones et les cellules gliales. Alors que de nombreux efforts ont été faits pour comprendre les interactions entre les neurones, moins est connu sur la nature des interactions entre les cellules gliales ; ceci est due à la complexité du système nerveux des vertébrés, qui comprend plus de cellules gliales que de neurones. Cependant, le système nerveux de la drosophile à un rapport neurones-cellules gliales faible, ce qui fait de cet animal simple un modèle idéal pour évaluer ce concept. J’ai utilisé des approches génétiques à résolution cellulaire pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires de la migration collective des cellules gliales in vivo. En résumé, mes données révèlent les bases du mécanisme contrôlant la migration cellulaire collective : 1) les cellules du front de migration interagissent entre elles en amont et en aval et 2) N-cad est nécessaire pour une migration optimal de la glie. / The functionality of the complex neural network depends on the interactions between neurons and glia. While many efforts have been made to understand the neuron-neuron interactions, less is known about those amongst glial cells. Due to the complexity of the vertebrate nervous system, which comprises manifold more glia than neurons, it is hard to tackle the role of glia-glia interactions. The nervous system of Drosophila, however, has a lower glia-neuron ratio, which makes this simple animal an ideal model. I use genetic approaches at cellular resolution to dissect the cellular and molecular mechanisms of glial collective migration in vivo. In Sum, I have shown some basic mechanism controlling collective cell migration: 1) cells at the front of the collective interact with each other through anterograde and retrograde bidirectional interaction. 2) N-cad appears necessary for timely movement of glial community.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de disfunción visual en el mundo desarrollado. En ellas se produce la degeneración y muerte de las neuronas fotorreceptoras, originando una disminución o pérdida total de la visión, en los casos más severos. Las células gliales de Müller (CGM), el principal tipo de células gliales en la retina, y las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) desempeñan un papel clave tanto en la prevención como en el progreso de estas enfermedades. En condiciones fisiológicas las CGM y las células del EPR son las encargadas del mantenimiento estructural, fisiológico y funcional de la retina. Ante alteraciones fisiológicas o frente a daños de diferentes tipos, las CGM y las células del EPR modifican levemente sus funciones a fin de restablecer las condiciones normales o reparar los daños existentes. La proliferación y la migración se activan como parte de una respuesta inespecífica, pero cuando el daño persiste por mecanismos aún desconocidos estos procesos se descontrolan y exacerban, tornándose contraproducentes. A su vez, la localización de estas células en lugares inadecuados distorsiona severamente la estructura y función de la retina, contribuyendo al desarrollo de la disfunción visual, particularmente en las patologías retinoproliferativas. Dilucidar los mecanismos de regulación de la proliferación y la migración, como así también las moléculas que intervienen, es clave para lograr un tratamiento integral de estas enfermedades. Los esfingolípidos bioactivos son moléculas señal que regulan una gran cantidad de procesos biológicos como la supervivencia, proliferación, migración e inflamación. Entre éstos, la ceramida-1-fosfato (C1P) es un esfingolípido que regula numerosas funciones biológicas en diferentes tipos de células. La C1P es generada por la acción de la ceramida quinasa (CerK), enzima encargada de sintetizar C1P a través de la fosforilación de la ceramida (Cer). La actividad de CerK es clave para la señalización celular mediada por C1P y está regulada por niveles bajos de Ca+2, fosforilación y diversos estímulos. La C1P promueve la proliferación través de la activación de diferentes vías de señalización intracelular y la inflamación mediante la unión y activación de la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2), que interviene en la síntesis de prostaglandinas. Para promover la migración, se ha propuesto que la C1P activa un receptor extracelular específico (parcialmente identificado). Trabajos previos de nuestro laboratorio demuestran que la esfingosina-1-fosfato (S1P), un esfingolípido bioactivo muy relacionado a la C1P, promueve la migración de las CGM (Simón et al. 2015). Dada la estrecha interacción metabólica y funcional entre los esfingolípidos, es de gran interés establecer si la C1P, cuyas funciones son semejantes a las de S1P, interviene en la regulación de los procesos que contribuyen a las patologías retinoproliferativas. El objetivo de esta Tesis es investigar si la C1P y la CerK participan en la migración y en la proliferación de las CGM y las células del EPR. Mediante el ensayo de la herida y utilizando cultivos gliales puros de retina de rata y la línea celular humana de EPR, ARPE-19 investigamos los posibles efectos de C1P/CerK en la migración de estos dos tipos celulares. En estos ensayos de motilidad celular, consideramos la reducción del ancho de la herida como un indicador de la migración. Al evaluar el efecto de C1P sobre la migración de las CGM, determinamos que la C1P aumentó la migración a través de la reorganización del citoesqueleto de actina y la formación de filopodios y lamelipodios. Mediante ensayos de incorporación del nucleótido Bromo-deoxiuridina (BrdU) establecimos que la migración no contribuyó al cierre de la herida. Luego investigamos las vías de señalización involucradas en el efecto de C1P. La inhibición de las vías PI3K/Akt y JNK con LY294002 y SP600125, respectivamente, disminuyó la migración glial, tanto en los controles como en los cultivos tratados con C1P. Mediante ensayos de Western blot comprobamos que el agregado de C1P aumentó los niveles de p-Akt, forma activa de la Akt, respecto a los controles, confirmando la activación de la vía de la PI3K. Al inhibir la vía de ERK / MAPK con el inhibidor U0126 disminuyó la migración promovida por la C1P, pero no se alteró la migración en los controles. A continuación, evaluamos el papel de la cPLA2, mediador de C1P en la inflamación, que es activada por su unión a C1P. El tratamiento con ATK, un inhibidor de cPLA2, redujo notablemente la migración glial en cultivos tratados con C1P, mientras que en los cultivos controles la migración no fue alterada. Demostramos así que la C1P promueve la migración de las CGM mediante la activación de cPLA2 y JNK, PI3K y ERK / MAPK. Además, el agregado conjunto de C1P y S1P, evidenció que estos esfingolípidos tuvieron juntos el mismo efecto promotor de la migración glial que cuando fueron suplementados por separado, evidenciando una interrelación entre ellos en la regulación de los mecanismos que activan río abajo. Como la realización de la herida activó la migración celular, decidimos evaluar si la síntesis endógena de C1P estaba involucrada en dicha migración. Para ello, establecimos en primer término, mediante RT-PCR que las CGM expresaban CerK. Incubando los cultivos gliales con NVP231, un inhibidor de la CerK, demostramos que la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración glial en los controles y para la estimulación de la migración por C1P. Para descartar que la inhibición de la motilidad reflejara una pérdida de viabilidad celular, evaluamos dicha viabilidad por ensayo de MTT. Determinamos que el tratamiento de los cultivos gliales con NVP231 no alteró la viabilidad celular. En las células del EPR el tratamiento con C1P aumentó la migración, mediante la reorganización del citoesqueleto de actina y el desarrollo de extensos lamelipodios. Al evaluar el rol de la síntesis endógena en la migración del EPR, comprobamos que el tratamiento de los cultivos con NVP231 inhibió la formación de lamelipodios y bloqueó la migración de las células epiteliales. Determinamos, mediante el ensayo de MTT, que el tratamiento con NVP231 no alteró la viabilidad de las células del EPR. La C1P y la S1P promovieron la migración de las células del EPR, pero cuando los cultivos fueron tratados con NVP231 antes del agregado de estos esfingolípidos, el aumento de la migración que promovían fue bloqueado. Estos resultados demuestran que la síntesis endógena de C1P fue necesaria para la migración promovida por C1P y S1P, evidenciando que la síntesis de C1P es clave en la estimulación de la migración por estos dos esfingolípidos. A continuación evaluamos el rol de C1P en la proliferación. Ensayos de incorporación del nucleótido BrdU en cultivos no confluentes demostraron que el agregado de C1P no alteró la proliferación ni en los cultivos gliales ni en los epiteliales. La inhibición de la síntesis de C1P redujo la proliferación en las CGM, mientras que no alteró la tasa de proliferación de los cultivos epiteliales, lo que sugiere que la C1P sería un mediador necesario para la proliferación glial en el período activo de mitogénesis de estas células. En conclusión, en este trabajo evidenciamos por primera vez que la C1P agregada exógenamente como así también aquella sintetizada por CerK en el interior celular, potenciaron la migración de las CGM y de las células del EPR. Demostramos también que la síntesis de C1P fue necesaria para la proliferación glial. Considerando la importancia del proceso de migración y proliferación en los dos tipos celulares de la retina decisivos en la mayoría de las enfermedades retinianas, proponemos a C1P/CerK como clave en el desarrollo y avance de las retinopatías proliferativas. / Retinal neurodegenerative diseases are the main cause of visual dysfunction in the developed world. Their common feature is the degeneration and eventual death of photoreceptors, which leads to visual impairment and eventual blindness in the most severe cases. Müller Glial Cells (MGC) are the main type of retinal glia and along with the Retinal Pigmented Epithelium (RPE) these cell types are two key factors in both the prevention and progression of these diseases. Under physiological conditions, MGCs and the RPE are in charge of the structural, physiological and functional maintenance of the retina. When faced with physiological changes or different damages, they alter their regular functions in order to either reestablish a proper environment or repair the existing damages; however, if the damage persists, the long-term changes of their aforementioned functions can be counterproductive and contribute to the development of retinal neurodegenerative pathologies. Proliferation and migration are activated as an unspecific response upon different damages in order to repair them but, due to unknown mechanisms, these processes finally provoke retina structural and functional loss, thus contributing to the progression of the visual dysfunction. The elucidation of the regulatory mechanisms involved in controlling migration and proliferation, including the molecules involved, is crucial for developing an integral treatment of these diseases. Bioactive sphingolipids are signaling molecules that regulate a wide array of biological processes, such as survival, proliferation, migration and inflammation. Among them, ceramide-1-phospate (C1P) is a sphingolipid generated by ceramide kinase (CerK), the enzyme responsible of phosphorylating ceramide (Cer) molecules. CerK activity has a central role in C1P-mediated cellular signaling, and is regulated by low levels of Ca2+, phosphorylation and many other stimuli. C1P promotes proliferation by activating several intracellular signaling pathways, as well as promoting inflammation by coupling with and activating the cytosolic phospholipase A2 (cPLA2), which participates in prostaglandin synthesis. Both for proliferation and migration, it has been proposed that C1P activates a (partially identified) specific extracellular receptor. Previous work from our group has shown that sphingosine-1-phospate (S1P), which is metabolically closely related to C1P, promotes MGC migration (Simón et al. 2015). Due to the close interconversions and functions of sphingolipids, uncovering the role of C1P in the processes involved in proliferative retinopathies is highly relevant. The purpose of this thesis is to investigate whether C1P and CerK participate in the regulation of migration and proliferation of MGC and RPE. By using the scratch wound assay in pure rat glial cultures and the RPE cell line ARPE-19, we assessed the effects of C1P/CerK in the migration of these two cell types. In these cellular motility assays we considered the reduction on the wound width as a positive indicator of cell migration. When evaluating the effect of C1P on migration, we determined that C1P enhanced migration by reorganizing the actin cytoskeleton and the formation of filopodia and lamellipodia. By quantifying the uptake of Bromide-deoxyuridine (BrdU) by MGC we determined that proliferation did not contribute to the reduction in the scratch width. We also investigated the signaling pathways involved in this process. Inhibition of PI3K/Akt and JNK pathways with the selective inhibitors LY294002 and SP600125, respectively, showed a decrease in glial migration in both control and C1Ptreated cultures. Western Blot assays showed that the addition of C1P increased the levels of p-Akt (the active form of Akt) when compared to controls, therefore confirming the activation of this pathway. Selective inhibition of the ERK/MAPK pathway with U0126 showed a decrease in C1P-induced migration, but did not alter it in control conditions. We also evaluated the role of cPLA2, a mediator of C1P in inflammation, which is activated by C1P binding. Treatment with ATK, a selective inhibitor of cPLA2, showed a substantial decrease in migration on C1P-treated cultures, while there was no alteration of the migrating capabilities in control conditions. We therefore showed that C1P is a promotor of MGC migration by activating cPLA2 as well as the JNK, PI3K and ERK/MAPK pathways. In addition, the combined addition of C1P and S1P showed that these sphingolipids had the same effect together than when they were added separately, suggesting either a direct relation between them or with the downstream mechanisms they trigger. Since we determined a basal reduction in the scratch width in control conditions, we evaluated whether the endogenous synthesis of C1P was involved in this migration. Initially, we established by RT-PCR assays that CGM expressed CerK. By incubating glial cultures with NVP231, a selective inhibitor of CerK, we showed that endogenous C1P synthesis was necessary for glial migration under control conditions, and that when this synthesis was inhibited addition of C1P did not restore cell migration. In order to verify that NVP231 did not affect cell viability, we evaluated viability by the MTT assay. We determined that treatment of glial cultures with NVP231 did not alter cell viability. On RPE cells, treatment with C1P increased cell migration by inducing actin cytoskeleton reorganization and extensive development of lamellipodia. When evaluating the role of the endogenous synthesis on RPE migration, we concluded that treating cultures with NVP231 inhibited lamellipodia formation and blocked RPE migration. We also determined that the viability of NVP231-treated RPE cells was not altered. Both C1P and S1P promoted RPE cell migration, but treating the cultures with NVP231 beforehand, abolished the migratory stimulus. These results show that endogenous C1P synthesis is essential for C1P and S1P-promoted migration, establishing that C1P synthesis is crucial to promote the migration of these two sphingolipids. Furthermore, we evaluated the possible role of C1P on cell proliferation. BrdU uptake assays on non-confluent cultures showed that the addition of C1P did not alter the proliferating capabilities on either MGC or RPE cultures. The inhibition of C1P synthesis impaired proliferation of MGCs, but did not affect that of RPE cells, suggesting that C1P might be a necessary mediator for glial proliferation in the active mitogenic stage of these cells. In this work we showed for the first time that both addition of C1P as well as the endogenous C1P produced by CerK promote migration of MGC and RPE cells. We also demonstrated that C1P synthesis is required for glial proliferation. Taking into consideration the relevance of migration and proliferation of both cell types in the development of most retinal diseases, we propose that C1P/CerK is instrumental in the development and progression of proliferative retinopathies.

Les mécanismes développementaux qui spécifient le nombre et le phénotype laminaire des neurones du cortex cérébral jouent un rôle essentiel dans l’établissement de la cytoarchitecture corticale. Le nombre de neurones dans chaque couche d'une aire donnée est déterminé par le taux de production neuronale, qui dépend étroitement de l'équilibre entre les divisions prolifératives et différenciatives. Des observations clés suggèrent que la durée de la phase G1 (TG1) ferait partie intégrante d'un mécanisme cellulaire régulant le mode de division des précurseurs du cortex. Nous avons testé cette hypothèse par l'accélération expérimentale de la progression dans la phase G1 de précurseurs corticaux de souris in vivo, via la surexpression des cyclines E1 et D1. A E15, la réduction de TG1 promeut la rentrée dans le cycle cellulaire aux dépens de la différenciation neuronale, résultant en une modification de la cytoarchitecture du cortex adulte. Des données de modélisation confirment que les effets induits par la réduction de TG1 sont médiés par des changements du mode de division. Les effets de la surexpression des cyclines E1 et D2 à E13 sont plus modérés qu'à E15, indiquant des différences intrinsèques entre les précurseurs corticaux précoces et tardifs. La mesure des phases du cycle cellulaire des populations de précurseurs corticaux à l’aide de différentes techniques révèle un niveau important d’hétérogénéité et souligne la nécessité de prendre en compte la diversité des précurseurs co‐existant dans les zones germinales du télencéphale. / In the cerebral cortex, area‐specific differences in neuron number and phenotype are distinguishing features both within and across species. The developmental mechanisms that specify the number of neurons and their laminar fate are instrumental in specifying cortical cytoarchitecture. Neuron number in layers and areas correlate with changes in the rate of neuron production, largely determined by the balance between proliferative and differentiative divisions in cortical precursors. Key observations suggest a concerted regulation between the duration of the G1 phase (TG1) and mode of division and have led to the hypothesis that TG1 could be an integral part of a cellular mechanism regulating the mode of division of cortical precursors. To test this hypothesis we experimentally accelerated TG1 in mouse cortical precursors in vivo, via the forced expression of cyclinE1 and cyclinD1. At E15, TG1 reduction promoted cell‐cycle re‐entry at the expense of differentiation and led to cytoarchitectural modifications. Modeling confirms that the TG1‐induced changes in neuron production and laminar fate are mediated via the changes in the mode of division. Forced expression of G1 cyclins was also applied to early cortical precursors. The effects of cyclinD1 and cyclinE1 up‐regulation at E13 were milder than those observed at E15, pointing to intrinsic differences between early and late cortical precursors. The used of various techniques to measure cell‐cycle kinetics in distinct precursor populations underlined the necessity of taking the full diversity of neural precursors co‐existing in the GZ of the telencephalon into account when performing cellcycle kinetics analysis.

Dans les pays industrialisés, les pathologies oculaires à composante vasculaires, que ce soit la rétinopathie du prématuré (ROP), la rétinopathie du diabétique ou la dégénérescence lié à l’âge, représentent la première cause de cécité respectivement chez l’enfant, l’adulte et la personne âgée. Plusieurs études sur l’homme ou sur des modèles animaux ont souligné le rôle crucial joué des acides gras polyinsaturés (AGPI) au cours de ces rétinopathies et notamment l’action préventive des acides gras polyinsaturés oméga 3 (AGPI n-3) sur l’angiogenèse pathologique. Ces AGPI sont estérifiés dans les glycérophospholipides constituant les membranes cellulaires. On les retrouve également dans une classe particulière de glycérophospholipides, les plasmalogènes. La particularité des plasmalogènes réside dans leur liaison vinyl-éther en position sn-1 au lieu d’une liaison ester dans les autres glycérophospholipides. Les AGPI sont libérés des plasmalogènes par une phospholipase indépendante au calcium, la iPLA2, pour devenir des métabolites actifs. Les plasmalogènes via la libération des AGPI joueraient un rôle dans la mise en place et la maturation du réseau vasculaire rétinien et ce, notamment grâce à la bonne mise en place du réseau astrocytaire. Les astrocytes et les cellules de Müller sont les cellules macrogliales qui servent de soutien physique et métabolique à la rétine. De plus, les cellules de Müller participent au métabolisme des lipides. L’objectif de ce travail de thèse a été d’évaluer l’implication des plasmalogènes dans le métabolisme des cellules de Müller et des astrocytes mais aussi dans la communication entre ces cellules macrogliales. Nous avons également étudié le profil lipidique d’enfants prématurés pour mettre en évidence de potentielles altérations du métabolisme des plasmalogènes chez des nouveau-nés développant une rétinopathie à composante vasculaire, la rétinopathie du prématuré (ROP). Pour ce faire nous avons étudié les effets d’une diminution en plasmalogènes et/ou en iPLA2 sur des cellules de Müller en culture primaire après avoir préalablement vérifié l’expression de l’enzyme clef de la biosynthèse des plasmalogènes. Nous avons ensuite étudié les effets d’une diminution des teneurs en plasmalogènes sur la communication calcique entre les cellules de Müller et les astrocytes. Nos résultats ont montré que les cellules de Müller expriment l’enzyme-clé de synthèse des plasmalogènes et que ces cellules sont plus riches en plasmalogènes que la rétine entière. Les plasmalogènes seraient impliqués dans le contrôle de la migration des cellules de Müller par l’action de la voie ERK1/2 MAPK. Ces effets ne semblent pas passer par la libération des AGPI. De plus nos résultats suggèrent une dégradation de la communication entre les astrocytes et les cellules de Müller en cas de diminution des teneurs en plasmalogènes dans les cellules de Müller. Enfin chez l’homme nous avons mis en évidence une accumulation des AGPI n-6 au détriment des AGPI n-3 dans les érythrocytes des enfants développant une rétinopathie du prématuré et inversement dans le groupe d’enfants prématuré contrôle. L’ensemble de ces travaux confirme l’importance du métabolisme lipidique, et plus particulièrement celui des plasmalogènes, sur le fonctionnement de la rétine. / Retinal vascular disorders such as retinopathy of prematurity (ROP), diabetic retinopathy or age-related macular degeneration represent the first cause of vision loss at all ages in industrialized countries. Many epidemiological or animal studies have shown the involvement of polyunsaturated fatty acids (PUFA) in the regulation of vascular development and more specifically the beneficial properties of omega 3 PUFA (n-3 PUFA) against pathological vascularization. Those PUFA are esterified on glycerophospholipids (GP). GP are the primary constituents of the lipid bilayer of cell membranes. PUFA can be also esterified on a specific class of GP, called plasmalogens. Plasmalogens are characterized by the presence of a vinyl ether linkage at the sn-1 position of glycerol instead of an ester linkage as seen in other GP. PUFA are released from plasmalogens by a calcium-independent phospholipase (iPLA2). Free PUFA can be converted into biologically active metabolites. Plasmalogens may have an impact on the development and the maturation of retinal vascular network through the PUFA they release through the control of astrocyte template formation prior to vessel formation. Astrocytes and Müller cells are macroglials cells providing physical and metabolic supports to the retina. Müller cells are key actors of the retinal lipid metabolism. The aim of this work was to evaluate the involvement of plasmalogens in Müller cells and astrocytes metabolism as well as in the ability of these cells to communicate. On one hand, we have studied the effects of a decrease in plasmalogen biosynthesis and/or in iPLA2 activity on Müller cell physiology. Müller cells express a biosynthesis key enzyme of plasmalogen and reducing the biosynthesis of plasmalogens affects Müller cell ability to migrate through the ERK1/2 MAPK signalling. In a second series of studies, we studied the repercussions of such modifications on Müller cell physiology on their ability to communicate with retinal astrocytes through calcium signalling. Our results suggest that affecting plasmalogen metabolism in Müller cells alters the communication between astrocytes and Müller cells. Finally, and in order to investigate whether plasmalogen metabolism may be modified in a human disease displaying abnormal retinal vascular development, we performed a lipidomic study of circulating lipids in infants affected by retinopathy of prematurity. ROP was characterized by the accumulation of n-6 PUFA at the expense of n-3 PUFA, these changes being associated to plasmalogens. All these experiments confirm the importance of lipid metabolism, and especially plasmalogens, on the retina functioning.

La stimulation haute fréquence (SHF) du noyau sous-thalamique (NST) est un traitement efficace dans l'abolition des symptômes moteurs de la maladie de Parkinson. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent ces effets sont encore loin d'être élucidés. Le laboratoire avait précédemment montré que la SHF du NST entraîne une augmentation des taux extra cellulaires de glutamate et de GABA chez les animaux éveillés ou anesthésiés dans une des principales structures cibles du NST, la substance noire réticulée (SNr). Au niveau de la SNr, les données suggèrent que la régulation de l'activité des neurones nigraux est due à la mise en œuvre conjointe d'une excitation des neurones glutamatergiques du NST et une implication des fibres de passages GABAergiques provenant du GPe et passant au voisinage de la zone sous-thalamique stimulée. L'objectif de ce travail de thèse est d'étudier l'implication des cellules gliales dans les réponses cellulaires de la SNr, sous stimulation du NST, et repose sur la mise en place d'une technique d'imagerie sur tranches de cerveau de rat adultes. Les tranches horizontales de cerveau contiennent à la fois le NST et la SNr, avec un maintien des connexions glutamatergiques subthalamonigrales.<br />Dans un premier temps, nous avons montré par immunohistochimie que la SNr contient 32% de neurones pour 68% de cellules gliales. Par la suite, nous avons montré que la SHF du NST induit une réponse calcique dans environ 12% des cellules gliales de la SNr. Ces réponses calciques enregistrées dans les cellules gliales impliquent à la fois du glutamate, du GABA et de l'ATP libérés dans la SNr lors de la SHF du NST. Cette étude a donc permis de montrer que les transmetteurs libérés dans la SNr sous l'effet de la SHF du NST, comme le glutamate et le GABA, peuvent activer les cellules gliales de cette structure. Elle a également permis de mettre en évidence la libération au sein de la SNr, d'un des principaux gliotransmetteurs, l'ATP. Ainsi, les cellules gliales de la SNr répondent à la SHF du NST, et il est probable qu'elles soient impliquées dans la modulation de l'activité neuronale de cette structure.