The main goal of this research was to develop an easy to prepare and sensitive biosensor that would be able to detect glutamate in solution using ionic self-assembly methods. This was accomplished by preparing an ionically-self-assembled monolayer that included an electron transport mediator and an enzyme that would generate a current proportional to the concentration of analytes in solution. Biosensors were produced for the detection of glucose and glutamate. Ferrocene poly(allylamine) (FePAA) was assembled on negatively charged self-assembled monolayer and shown to be electrostatically bound by cyclic voltammetry. Model films were made of FePAA and poly(styrenesulfonate) to determine if multilayer films could be assembled using electrostatic assembly. These experiments demonstrated that 7 bilayers is the maximum number of bilayers oxidizable by the heterogeneous reaction at the electrode surface. ISAMs were then assembled on a 2 mm gold electrode and on a gold fiber microelectrode using FePAA and glucose oxidase. Using cyclic voltammetry, these ISAMs were shown to be able to oxidize glucose in solution. The LOD was determined to be lower for the microelectrode than for the 2 mm gold electrode, which was expected, while both compared well to the literature. The Km? were found to be smaller than other glucose biosensors while the Icat increased with increasing number of bilayers. This demonstrated that the GluOx is making good electrical contact with the layer below. These glucose oxidase ISAMs, however, do not exhibit structural stability in flow-injection experiments. As a solution to the ISAM modified electrodes degrading in the flowing system, a covalently modified surface was developed. Using cyclic voltammetry, these covalently modified surfaces were shown to be able to oxidize glucose in solution. The LOD of the covalently modified 2 mm gold electrode was calculated to be lower than the 2 mm ISAM modified gold electrode, due to the fast heterogeneous kinetics on the covalently modified electrode surface. The Km? and Icat for the covalently modified 2 mm gold electrode were found to be the similar to the 2 mm ISAM modified gold electrode indicating that the covalently modified electrodes will be a suitable replacement. The covalently modified surfaces exhibit excellent structural stability and detect much lower glucose amounts in flow-injection experiments. ISAMs were subsequently assembled on gold fiber microelectrodes using FePAA and glutamate oxidase. Glutamate was able to be detected in solution at biologically significantly quantities using cyclic voltammetry. The Km? was shown to be comparable to literature values and Icat was shown to increase with increasing number of bilayers. These results demonstrate that an ISAM constructed using FePAA/GlutOx is a feasible way to detect glutamate in a system. / Ph. D.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La production hépatique de glucose dérive du glucose-6-phosphate (G6P) produit par la glycogénolyse et la néoglucogénèse et son hydrolyse subséquente par la glucose-6-phosphatase (G6Pase). C'est pourquoi la G6Pase joue un rôle crucial dans le maintien de la glycémie. La G6Pase est un système enzymatique à plusieurs composantes, situé dans le réticulum endoplasmique (RE) et est exprimé dans les deux organes néoglucogéniques, foie et rein, ainsi que dans l'intestin. Jusqu'à maintenant, deux composantes du système ont été clonées, l'unité catalytique qui est une protéine de 36 kDa (p36) et un transporteur putatif de G6P de masse moléculaire de 46 kDa (p46). Depuis le clonage du gène et de l' ADNc de p36, la régulation de l'expression de p36 a été étudiée en détail. Des effecteurs positifs qui augmentent l' ARNm de p36 comprennent le glucose, l' AMP cyclique, les glucocorticoïdes et les acides gras, tandis que l'insuline diminue l'abondance de l' ARNm de p36. Le glucose, l' AMP cyclique et les glucocorticoïdes ont également un effet positif sur l' ARN m de p46, tandis que l'insuline contrecarre ces effets. Deux modèles ont été proposés pour expliquer le mécanisme fonctionnel du système G6Pase : le modèle de transport du substrat et le modèle conformationnel. Le premier propose que la G6Pase est un système à plusieurs composantes, comprenant une unité catalytique dont le site actif est orienté vers la lumière du RE, un transporteur de G6P appelé Tl, un transporteur de phosphate inorganique (Pi) appelé T2 et un transporteur de glucose appelé T3. Tl serait l'étape limitante de la conversion de G6P en glucose et Pi. Il a été proposé que des mutations dans les gènes de ces quatres composantes causent des glycogènoses de type la, lb, le, and Id, respectivement. Le modèle conformationnel propose que la G6Pase est une protéine formant un canal dans la membrane du RE, où le site actif est enfoui dans une poche hydrophile. Le substrat a accès au site actif via le canal. Le processus hydrolytique a lieu dans la poche hydrophile et les produits sont délivrés dans la lumière et exportés dans le cytoplasme par l'intermédiaire du canal. Les cinétiques rapides d'hydrolyse du G6P indiquent une transition hystérétique dans le processus catalytique qui réduit la vitesse de la réaction au profit d'une spécifité accrue pour le G6P. Le phosphate inorganique (Pi) est une composante fondamentale de l'organisme par son implication dans de nombreuses fonctions physiologiques. L'homéostasie du Pi est règlée au niveau du rein par sa réabsorption par un co-transporteur de sodium et de phosphate (NaPi), essentiellement }'isoforme NaPi-2. Le contenu en Pi dans la diète, qui est important pour le maintien de la phosphatémie normale; affecte l'expression de la NaPi-2, de l'hormone parathyroïdienne, du Pi et du calcium sérique. L'hypophosphatémie liée au chromosome X est causée par une mutation dans le gène PHEX (pour : Phosphate-regulating gene with Homologies to Endopeptidase located on the X chromosome). Des travaux établissant que des perturbations dans l'homéostasie du phosphate pouvaient causer une intolérance au glucose et une résistance à l'insuline suggèrent une association entre l'homéostasie du glucose et du phosphate. La nature même de cette association est néanmoins encore inconnue. Nous avons donc investigué le métabolisme du glucose hépatique lors d'une diète déficiente en phosphate ainsi que chez un modèle animal d'hypophosphatémie liée au chromosome X, la souris Hyp. Les résultats montrent que le phosphate plasmatique était diminué chez des rats nourris pendant 48h avec une diète déficiente en Pi (-Pi) comparés à une diète contrôle (+Pi). Dans le groupe (-Pi), l'activité de la G6Pase hépatique était augmentée lorsque mesurée dans des microsomes intacts ou perméabilisés au moyen de détergent, à des concentrations de substrat physiologiques ou saturantes. Cette activité accrue était due à une stimulation de l'expression de l'unité catalytique, comme en témoigne l'augmentation de l'abondance de l' ARN m et de l'immunoréactivité de p36. L' ARNm de p46 était également augmentée dans le groupe (-Pi), mais sans changement dans la quantité de protéine. Nos études subséquentes montrèrent que dans le foie des animaux du groupe (-Pi), la pyruvate kinase était inactivée et le phosphoenolpyruvate augmenté, et que le fiuctose-2,6- bisphosphate, un inhibiteur de la néoglucogénèse, était réduit de moitié. L'activité de la glucokinase n'était pas modifiée et celle de la phosphoenolpyruvate kinase était marginalement augmentée par la diète (-Pi), L'ensemble de ces résultats peuvent s'expliquer par l'augmentation de la concentration de l' AMP cyclique observée dans le foie des rats nourris avec la diète (-Pï). Ces résultats suggèrent que la néoglucogénèse hépatique pourrait être stimulée dans des conditions d'hypophosphatémie et qu'une production accrue de glucose pourrait contribuer à une altération du métabolisme du glucose. Cette possibilité est renforcée par l'observation que la glycémie des rats nourris avec la diète (-Pi) était nettement augmentée, tandis que la concentration de l'insuline plasmatique était diminuée. Un test de tolérance intravéneuse au glucose n'a pas permis d'observer de différence au niveau de la normalisation de la glycémie, mais a cependant indiqué une légère intolérance au glucose dans la mesure ou le pic de glucose atteint après le test était plus élevé dans le groupe (-Pi). Par ailleurs, la production endogène de glucose était nettement moins inhibée après un bolus de glucose au cours du test de tolérance intravéneuse au glucose. Afin d'élucider d'avantage la relation entre homéostasie du glucose et du :?i, le système G6Pase de foie et de rein furent examinés chez la souris Hyp. Les résultats montrent que l'activité de la G6Pase était augmentée dans ces organes des souris Hyp, semblablement à l'augmentation observée chez les rats nourris avec la diète (­Pi). Cette activité accrue de la G6Pase chez la souris Hyp s'explique par une plus grande quantité d' ARNm et de protéine p36, aussi bien dans le foie que dans le rein. Contrairement au modèle diététique d'hypophosphatémie, chez la souris Hyp l'abondance de l' ARNm et l'immunoréactivité du p46 hépatique et rénal sont nettement diminués. Globalement, l'hypophosphatémie résultant soit d'une carence alimentaire ou due à un défaut génétique a pour effet d'augmenter de façon consistante l'activité de la G6Pase, elle-même causée par une stimulation de l'expression de son unité catalytique, p36. L'expression de p46 est différemment règlée par la diète déficiente en Pi ou dans le modèle génétique, indicant que d'autres facteurs que l'hypophosphatémie affectent ce gène dans ces conditions. Il apparaît que la régulation de l'expression de p3 6 et de p46 est distincte. Bien que le système G6Pase a été étudié depuis vo1c1 cinquante ans, son organisation et son mécanisme fonctionnel restent à être définis. Les propriétés cinétiques de transport du substrat, le G6P, et des produits, le glucose et le Pï, ne sont pas encore élucidés. Ces propriétés ont été investiguées au moyen d'un appareil à collection et filtration rapide (FSRF A). Le transport microsomal du Pi montre des valeurs identiques de T v. à différentes concentrations de KH2P04. Le HgCh et des inhibiteurs potentiels de la G6Pase n'affectent pas les propriétés cinétiques du transport de Pi. On n'a également pas trouvé d'échange accéléré de Pi ou de saturation du transport de celui-ci. Ces résultats ne sont pas compatibles avec l'existence d'un transporteur spécifique pour le Pi dans la membrane du RE. Des conclusions similaires ont été tirées d'études du transport microsomal du glucose. L'accumulation intramicrosomale de radioactivité à partir de [U-14C]G6P ou de [32P]G6P correspond à des paramètres cinétiques différents, indicant que les substances accumulées dans les microsomes à partir de G6P sont les produits de la réaction de la G6Pase plutôt que le substrat. Cette observation suggère que l'étape de transport du G6P, si tant est qu'elle existe, n'est pas l'étape limitante au cours de la conversion du G6P en glucose et Pï, Les paramètres cinétiques d'accumulation de radioactivité à partir de [32P]G6P et les effets des inhibiteurs de la G6Pase démontrent que cette accumulation est étroitement couplée à l'activité hydrolytique de la G6Pase. De plus, nous n'avons pas observé d'échange de transport entre le G6P et le Pi ou le glucose, en accord avec l'absence présumée de transporteur spécifique pour le Pi ou le glucose. Globalement, ces données sont compatibles avec le modèle conformationnel de la G6Pase. Une nouvelle version de ce modèle, intégrant les résultats concernant le transport de Pï et de glucose, propose qu'un pore dans la membrane du RE puisse remplir la fonction d'influx/efllux des produits de la G6Pase. / Glucose-6-phosphatase (G6Pase), a multicomponent enzyme, plays a crucial role in glucose metabolism by hydrolyzing glucose-6-phosphate (G6P) into glucose and inorganic phosphate (Pi). G6Pase is located in the endoplasmic reticulum membrane and highly expressed in liver and kidneys. Two components of G6Pase have been cloned, the catalytic subunit (p36) and the putative G6P translocase (p46). Despite the great progress in G6Pase field, the hydrolytic mechanism of G6Pase is still in debate. Meanwhile, evidence also indicates that Pi deficiency is related to impaired glucose metabolism with an unclear mechanism. In this thesis, the effects of Pi deficiency on G6Pase and other glucoregulatory factors were investigated. Meanwhile, the hydrolytic mechanism of G6Pase was also studied in terms of its transport properties. Results showed that compared to the rats fed with a control diet ( +Pi), in the rats fed with a phosphate deficient diet (-Pi) for 48h, plasma phosphate concentration was decreased. Liver G6Pase was upregulated, gluconeogenesis key steps ;vere stimulated, liver glycogen content was decreased and plasma glucose concentration was increased in the fed (-Pi) group. These changes could be accounted for by increased liver cAMP content and decreased plasma insulin concentration in the fed (-Pi) group. During an intravenous glucose tolerance test, although similar glucose fall rates and insulin responses were observed in overnight fasted (+Pi) and (-Pi) group, a tendency to hyperglycemia and less suppressed endogenous glucose production were obtained in the (-Pi) group. Ali of these results demonstrated that under the phosphate deficient condition, G6Pase was upregulated and glucose production was enhanced. The enhanced glucose production, potentially caused by the altered insulin/glucagon ratio, may contribute to the impaired glucose metabolism. To further elucidate the relationship between glucose homeostasis and phosphate homeostasis, liver and kidney G6Pase system were investigated in X-linked hypophosphatemic mice, Hyp mice. Results showed G6Pase activity was increased in Hyp mouse liver and kidney. Consistently, the protein amount and mRNA abundance of the catalytic subunit, p36, were increased in Hyp mouse liver and kidney. In contrast, the mRNA abundance and protein amount of p46 were decreased in Hyp mouse liver and kidney. These results further dernonstrated that G6Pase activity was stimulated by Pi deficiency. The increased G6pase activity may enhance glucose production, probably contributing to impaired glucose metabolisrn. The hydrolytic mechanism of G6Pase was investigated via transport studies. Inorganic phosphate (KH2P04) transport across rnicrosornes showed identical T 112 values around 23 s at different KH2P04 concentrations, which were unaffected by potential inhibitors of G6Pase. Neither accelerated exchanging transport nor saturable effect was observed in this process. These results supported no specific inorganic phosphate transporter in the ER membrane. Similar phenomena were observed for the glucose transport process, which was characterized with T 112 values of 40 s. Tracer equilibration during [U-14C]- and [32P]G6P hydrolysis proceeded with T 112 values of 4 7 and 21 s, respectively. Steady state levels of tracer accumulation from [U-14C]­and [32P]G6P were also different frorn each other and had a similar ratio to that of their T 112 values. This result dernonstrated that the accumulated radiotracer was the product, Pi or glucose, rather than the substrate G6P. Effects of unlabelled G6P and inhibitors on [32P]G6P uptake dernonstrated that G6P uptake and hydrolysis were tightly coupled processes. Moreover, no exchanging transport between G6P and inorganic phosphate/glucose was observed. These results are not compatible with the substrate-transport rnodel of G6Pase. Based on these data, a new combined­conformational model is proposed to explain the G6Pase system. In this model, G6P transport/hydrolysis are tightly coupled processes whereas glucose and phosphate share with water and a variety of other organic and inorganic solutes a common pore­like structure accounting for their transport through the ER membrane. The p46 protein rnay be more like a G6P sensor than a G6P transporter. The binding of G6P to p46 may affect the conformation of p46 and p36 via their coupling interaction. The conformational change rnay account for the specificity and latency of G6Pase.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2004-2005 / L'insuline est une hormone sécrétée par les cellules ? du pancréas qui maintient l'homéostasie glucidique en stimulant, notamment, l'entrée du glucose dans le muscle squelettique et le tissu adipeux en situation postprandiale. Elle exerce ces effets en enclanchant une cascade de signaux intracellulaires médiés via son interaction avec le récepteur de l'insuline et culminant vers la translocation des transporteurs de glucose GLUT4 à la surface cellulaire. La régulation de l'action de l'insuline sur le transport du glucose peut être affectée de façon importante par les nutriments, tels que les glucides, lipides et protéines. Les diverses études présentées dans cette thèse montreront le rôle important des facteurs nutritionnels dans la modulation de la signalisation insulinique et de la translocation de GLUT4 dans le muscle squelettique de rats, ainsi que dans des cellules musculaires et adipeuses in vitro. La première étude fut réalisée chez des rats nourris avec une diète riche en lipides où nous avons montré, chez ces derniers, des défauts d'activation de la phophatidylinositol (PI) 3- kinase ainsi que de ses effecteurs proximaux, l'Akt et les protéines kinases C atypiques, par l'insuline. / Cette défectuosité de la signalisation insulinique s'accompagnait d'une diminution de la translocation de GLUT4 autant à la membrane plasmique qu'aux tubules transversaux (T) comparativement à celle observée chez des animaux nourris avec une diète de type chow. Lors de notre deuxième étude, nous nous sommes intéressés à élucider les mécanismes cellulaires par lesquels les protéines issues de la morue prévenaient le développement de la résistance à l'insuline chez des rats rendus obèses suite à l'ingestion d'une diète hyperlipidique. Nous avons en effet observé que ces protéines, comparativement à la caséine et à la protéine de soya, normalisaient l'action de l'insuline sur l'activation de la voie PI 3-kinase/Akt et rétablissaient presqu'entièrement la translocation de GLUT4 au niveau des tubules T. / Dans notre troisième étude, nous nous sommes intéressés au rôle des acides aminés sur l'action de l'insuline dans les cellules musculaires L6 en culture. Nous avons montré que l'ajout d'acides aminés au milieu d'incubation réduisait la stimulation du transport du glucose par l'insuline, un phénomène complètement bloqué par la rapamycine, un inhibiteur hautement spécifique de la mammalian target of rapamycin (mTOR). En effet, nous avons observé que les acides aminés potentialisaient l'activation de la voie mTOR, telle que mesurée par la phosphorylation de la p70 S6 kinase, par l'insuline. Finalement, le rôle de la voie mTOR fut étudié dans les adipocytes 3T3-L1 en culture lors de notre quatrième étude. Nous avons observé que l'activation de cette voie par l'insuline seule ou par les acides aminés en conjonction avec l'insuline menait à une diminution très rapide de l'action de l'insuline sur le transport du glucose en découplant l'activation de la PI 3-kinase à celle de l'Akt. L'ensemble de ces études montre le rôle important que jouent les nutriments, plus particulièrement les protéines et les acides aminés, sur l'action de l'insuline dans les cellules musculaires et adipeuses.

Objet : L'indice de masse corporelle (IMC), la circonférence de la taille (CT) et le ratio circonférence de la taille/circonférence des hanches (RTH) sont utilisés pour prédire la survenue du diabète de type 2 (DT2) et de l'intolérance au glucose (IG). Leurs résultats et leurs valeurs prédictives sont variables. La valeur prédictive du ratio circonférence de la taille/taille (RCTT) n'a pas été bien étudiée dans ce contexte. La valeur de cette mesure anthropométrique est comparée avec celle de l'IMC, de la CT et du RTH dans la prédiction de la survenue du DT2 et de l'IG. Méthode : Un total de 294 femmes et 219 hommes, tous caucasiens, sont inclus dans cette étude. Pour chaque participant, nous avons évalué les données suivantes : poids, grandeur, circonférence des hanches et de la taille, glycémie à jeun et après une hyperglycémie orale provoquée de 2h (HGOP) (75g de glucose) et triglycérides à jeun. L'IG est définie par un niveau de glucose dans le plasma (> ou =) 7,8 et < 11,1 mmol/L. Le diabète se définie par un niveau de glucose à jeun (> ou =) 7,0 et/ou (> ou =) 11,1 mmol/L après une HGOP. Nous avons procédé à l'analyse des données à l'aide de régressions logistiques afin d'évaluer la mesure anthropométrique qui prédit le mieux (séparément ou combinée) le DT2 et l'IG. Nous avons aussi documenté les associations entre les mesures anthropométriques et l'âge, le sexe, les triglycérides et le niveau de glucose à jeun. Le modèle a été ajusté pour les variables confondantes tels que l'âge et le sexe. Des courbes ± Receiver Operating Characteristic ¿ (ROC) ont été effectuées afin de déterminer la sensibilité et la spécificité du modèle prédictif sélectionné. Résultats : Les hommes et les femmes étaient âgés respectivement de 55 ± 10 et 52 ± 10 ans ; 53 avaient le DT2, 198 avaient une intolérance au glucose à jeun (IGJ) et 118 une IG post-HGOP. Les RCTT étaient 0,59 ± 0,07 chez les hommes et 0,55 ± 0,08 chez les femmes. Quatre-vingt-un pourcent des hommes et 74% des femmes étaient au-dessus de la valeur seuil de 0,5 (valeur utilisée dans d'autres études) du RCTT. Le RCTT était le meilleur prédicteur du DT2 et de IG (p=0,0022) relativement à l'IMC (p=0,0097), à la CT (p=0,0177), et au RTH (p=0,0802). Le RCTT était corrélé avec l'IMC (r=0,88), le CT (r=0,93) et le RTH (r=0,66). Le RCTT augmente lorsque l'âge, les triglycérides (TG) ou le glucose à jeun augmente. La spécificité et la sensibilité à prédire le DT2 étaient respectivement de 77,7% et 78,6%. Conclusion : Le RCTT est un paramètre simple qui peut être utilisé facilement par les médecins pour prédire le DT2 mais aussi l'intolérance au glucose. Nos résultats suggèrent que le RCTT est un meilleur prédicteur du DT2 et d'IG comparativement à l'IMC, à la CT et au RTH. Cela devrait être confirmé dans une étude avec un plus grand échantillonnage.

La voie de signalisation mTORCl/S6Kl est impliquée dans le développement de la résistance à l'insuline associée à l'obésité en exerçant une boucle de rétro-contrôle négative sur la voie de signalisation PI3K-Akt. Tandis que l'utilisation à court terme de la rapamycine, l'inhibiteur pharmacologique de la voie mTORCl, permet d'inhiber le rétro-contrôle négatif, les effets de l'inhibition chronique de la voie sur le métabolisme ne sont pas connus. L'objectif principal des études présentées dans cette thèse était d'investiguer les effets métaboliques de l'inhibition chronique de la voie de signalisation mTORCl/S6Kl in vitro et in vivo. Dans la première étude, nous avons montré que l'inhibition chronique de mTORCl/S6Kl découple l'activation d'Akt de la PI3K ce qui cause une résistance à l'insuline dans les cellules 3T3-L1. Dans une deuxième étude, nous avons découvert que l'utilisation chronique de la rapamycine in vivo cause une intolérance au glucose et une résistance à l'insuline de par une augmentation de la gluconéogénèse hépatique en plus d'affecter négativement le métabolisme des lipides. Dans une troisième étude, nous avons démontré que l'inhibition chronique de mTORCl/S6K1 dans les cellules hépatique FAO découple l'activation d'Akt de la PI3K ce qui augmente la production de glucose hépatique. Finalement, dans une quatrième étude, nous avons déterminé que l'inhibition chronique de mTORCl/S6K1 dans les cellules L6 ne permet pas de restaurer le transport du glucose stimulé par l'insuline en présence d'un excès de nutriments. L'ensemble de nos études démontre le rôle important joué par la voie de signalisation mTORCl/S6K1 sur le contrôle du métabolisme du glucose et des lipides et limite l'inhibition chronique de mTOR comme cible thérapeutique pour le traitement du diabète de type 2 et de l'obésité.

La prévalence du diabète ne cesse d’augmenter et la détection de sujets à risque de développer cette maladie reste une préoccupation importante afin qu’un programme de prévention leur soit proposé. Le dosage de l’HbA1c est utilisé pour l’évaluation de l’efficacité du traitement pris par les diabétiques. Il n’était pas utilisé pour le diagnostic des dysglycémies car les méthodes de ce dosage n’étaient pas standardisées. Actuellement l’IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) propose une nouvelle méthode de référence pour cette mesure, et l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé) a intégré ce paramètre dans les critères diagnostiques du diabète. but Evaluer la capacité de l’HbA1c à prédire un diabète incident, chercher des seuils, d’HbA1c, de GAJ et de glycémie deux heures (G2H) après un test d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO), au delà desquels les sujets sont plus à risque de développer un diabète incident et, enfin, étudier l’influence du tabac sur les variations de ces mesures. Méthodes Pour l’évaluation de la prédiction du diabète et la recherche de seuils, nous avons utilisé les données de l’étude australienne AusDiab, de l’étude danoise Inter99 et de l’étude française D.E.S.I.R. avec plus de 5500, 4500 et 3550 sujets, respectivement. Dans la troisième partie, nous avons utilisé les données du projet DETECT-2 (12 études, 26 000 sujets), ainsi que celles des études françaises D.E.S.I.R. et TELECOM (3700 sujets). Les distributions de l’HbA1c dans les trois premières études étaient différentes, nous avons donc, dans les deux premières parties d’analyses, ajusté les moyennes d’HbA1c à l’inclusion et après le suivi. Nous avons utilisé un modèle logistique pour la comparaison du pouvoir prédictif de l’HbA1c et de GAJ ; l’intervalle de confiance des Odds Ratios (ORs) à été obtenu par bootstrap. Pour rechercher les seuils de prédiction du diabète, nous avons comparé le modèle logistique (avec la variable glycémique) sans seuil au modèle avec seuil. Enfin, nous avons utilisé un modèle linéaire mixte pour évaluer la différence entre les moyennes d’HbA1c, de GAJ et de G2H en fonction du tabagisme, en attribuant un effet aléatoire à la variable ‘centre’. Résultats Avant ajustement des moyennes d’HbA1c, l’incidence du diabète (défini par la prise de traitement antidiabétique, une HbA1c≥6.5% ou une GAJ≥7mmol/l) était de 3.1% dans AusDiab, 2.7% dans Inter99 et 2.5% dans D.E.S.I.R. Les sujets dépistés comme étant diabétiques par l’HbA1c et par la GAJ n’étaient pas toujours les mêmes. L’incidence estimée du diabète augmente bien avec l’augmentation du taux de l’HbA1c et de la GAJ à l’inclusion. Pour chaque critère, l’aire sous la courbe de ROC (Receiver Operating Characteristic) était supérieure à 0.80 témoignant d’une bonne discrimination des deux tests entre les diabétiques incidents et les non diabétiques et le test de Hosmer-Lemeshow témoigne d’une bonne adéquation des modèles utilisés (p>0.05). Dans les trois populations, les ORs qui mesurent l’association entre les taux d’HbA1c et de GAJ et la survenue du diabète étaient presque toujours supérieurs pour l’HbA1c. Les seuils d’HbA1c et de GAJ au-delà desquels les sujets étaient plus à risque de développer un diabète variaient en fonction de la définition du diabète incident sauf pour l’HbA1c dans l’étude D.E.S.I.R. (5.3%) et la GAJ dans l’étude AusDiab (5.5mmol/l). Enfin, la moyenne d’HbA1c chez les fumeurs actuels était 0.10%(0.08,0.12) plus élevée que chez ceux qui n’ont jamais fumé ; la moyenne de G2H était -0.44(-0.51,-0.36) moins élevée chez les fumeurs actuels que chez ceux qui n’ont jamais fumé.Conclusion Ces résultats soulignent : 1) l’importance de l’utilisation de l’HbA1c comme critère diagnostique de dysglycémies, 2) la nécessité de mieux explorer les limites inférieures des stades intermédiaires qui précèdent la survenue du diabète, 3) l’importance de prendre en considération les facteurs qui peuvent influencer les taux d’HbA1c / The increasing prevalence of diabetes worldwide makes the detection of people at risk of developing diabetes a major concern, so that they can benefit from diabetes prevention programs. HbA1c is used to evaluate the effectiveness of treatment taken by diabetic patients. HbA1c had not been used to diagnose dysglycemia because the assay methods were not standardized. The International Federation of Clinical Chemistry has proposed a reference method, and in 2011 the World Health Organization included HbA1c as one of the criteria for the diagnosis of diabetes. aims: 1) To evaluate the ability of HbA1c to predict incident diabetes compared with fasting plasma glucose (FPG); 2) to find thresholds for HbA1c, FPG and two hour plasma glucose (G2H) after an oral glucose tolerance test (OGTT) beyond which subjects are more at risk for developing incident diabetes and finally; 3) to study the influence of smoking on HbA1c, FPG and G2H.Methods: Several populations were studied. To evaluate the prediction of diabetes and the search for thresholds, we used data from the Australian study (AusDiab), a Danish study (Inter99) and a French study (D.E.S.I.R.) with respectively more then 5500, 4500 and 3550 participants. In the third part, we used data from the DETECT-2 consortium (12 studies with more than 26 000 men and women) and from two French studies: D.E.S.I.R. and TELECOM (with more than 3700 participants). The distribution of HbA1c in AusDiab, Inter99 and D.E.S.I.R. differed, so in the first two parts of this thesis, we adjusted HbA1c so that all three studies had the same mean HbA1c at baseline and the same mean HbA1c at follow-up. We used a logistic model to quantify the predictive ability of HbA1c and FPG for diabetes, and then derived confidence intervals for the difference in Odds Ratios (ORs) by bootstrap. To search for thresholds to predict incident diabetes, based on HbA1c, FPG and G2H at inclusion, we compared logistic regression models that were linear in the glycaemic variable, without a threshold, with a spline model with a threshold. Linear mixed models with ‘centre’ as a random variable, were used to assess the difference between the means of HbA1c, FPG and G2H in current-, ex- and never-smokers.Results: With unadjusted HbA1c data, the incidence of diabetes (defined by treatment, HbA1c≥6.5% or FPG≥7 mmol/l) was 3.1% in AusDiab, 2.7% in Inter99 and 2.5% in D.E.S.I.R.. Subjects detected as having diabetes by HbA1c and FPG were not always the same. The incidence of diabetes increased with increasing HbA1c and FPG at baseline. For each test, the area under the Receiver Operating Characteristic curve was greater than 0.80, indicating good discrimination for these two measures between those with and without incident diabetes, and the Hosmer-Lemeshow test indicated that the models fitted well (p>0.05). In all three populations, the ORs measuring the association between HbA1c and FPG and the development of diabetes were almost always higher for HbA1c than for FPG. The thresholds of HbA1c and FPG above which the incidence of diabetes were higher, varied according to the definition of incident diabetes - except for HbA1c in D.E.S.I.R. (always 5.3%) and for FPG in AusDiab (always 5.5mmol/l). Finally, in current-smokers, the mean HbA1c was 0.10%(0.08,0.12) higher than in never-smokers; the mean G2H was 0.44( 0.51,-0.36) lower in current-smokers than in never-smokers. Conclusion: The results that we found emphasize: 1) the importance of using HbA1c as a diagnostic criterion for dysglycemia, as those diagnosed diabetic by HbA1c did not have always an FPG ≥ 7 mmol/l, 2) the need to better explore the lower limits of the “pre-diabetic” stage as the thresholds of HbA1c, FPG and 2H-PG that we found were lower than those used in clinical practice, 3) the importance to consider factors that may influence HbA1c and G2H, such as smoking.

<p>Photosynthesis captures light from the sun and converts it into carbohydrates, which are utilised by almost all living organisms. The conversion between the different forms of carbohydrates is the basis to form almost all biological molecules.</p><p>The main intention of this thesis has been to study the role of UDP-glucose in carbohydrate synthesis and metabolism, and in particular the genes that encode UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) and UDP-glucose dehydrogenase (UGDH) in plants and their regulation. UGPase converts glucose-1-phosphate to UDP-glucose, which can be utilised for sucrose synthesis, or cell wall polysaccharides among others. UGDH converts UDP-glucose to UDP-glucuronate, which is a precursor for hemicellulose and pectin. As model species I have been working with both Arabidopsis thaliana and poplar.</p><p>Sequences for two full-length EST clones of Ugp were obtained from both Arabidopsis and poplar, the cDNAs in Arabidopsis correlate with two genes in the Arabidopsis genomic database.</p><p>The derived protein sequences are 90-93% identical within each plants species and 80-83% identical between the two species.</p><p>Studies on Ugp showed that the expression is up-regulated by Pi-deficiency, sucrose-feeding and by light exposure in Arabidopsis. Studies with Arabidopsis plants with mutations in sugar/ starch- and Pi-content suggested that the Ugp expression is modulated by an interaction of signals derived from Pi-deficiency, sugar content and light/ dark conditions, where the signals act independently or inhibiting each other, depending on conditions. Okadaic acid, a known inhibitor of certain classes of protein phosphatases, prevented the up-regulation of Ugp by Pi-deficiency and sucrose-feeding. In poplar, sucrose also up-regulated the expression of Ugp. When poplar and Arabidopsis were exposed to cold, an increase of Ugp transcript content was detected as well as an increase in UGPase protein and activity. In poplar, Ugp was found to be expressed in all tissues that were examined (differentiating xylem, phloem, apical leaves and young and mature leaves).</p><p>By using antisense strategy, Arabidopsis plants that had a decrease in UGPase activity of up to 30% were obtained. In the antisense plants, the soluble carbohydrate content was reduced in the leaves by at least 50%; in addition the starch content decreased. Despite the changes in carbohydrate content, the growth rate of the antisense plants was not changed compared to wild type plants under normal growth conditions. However, in the antisense lines the UGPase activity and protein content in sliliques and roots increased, perhaps reflecting compensatory up-regulation of second Ugp gene. This correlates with a slightly larger molecular mass of UGPase protein in roots and siliques when compared to that in leaves. Maximal photosynthesis rates were similar for both wild type and antisense plants, but the latter had up to 40% lower dark respiration and slightly lower quantum yield than wild type plants.</p><p>Two Ugdh cDNAs from poplar and one from Arabidopsis were sequenced. The highest Ugdh expression was found in xylem and younger leaves. Expression data from sugar and osmoticum feeding experiment in poplar suggested that the Ugdh expression is regulated via an osmoticumdependent pathway.</p>

Photosynthesis captures light from the sun and converts it into carbohydrates, which are utilised by almost all living organisms. The conversion between the different forms of carbohydrates is the basis to form almost all biological molecules. The main intention of this thesis has been to study the role of UDP-glucose in carbohydrate synthesis and metabolism, and in particular the genes that encode UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) and UDP-glucose dehydrogenase (UGDH) in plants and their regulation. UGPase converts glucose-1-phosphate to UDP-glucose, which can be utilised for sucrose synthesis, or cell wall polysaccharides among others. UGDH converts UDP-glucose to UDP-glucuronate, which is a precursor for hemicellulose and pectin. As model species I have been working with both Arabidopsis thaliana and poplar. Sequences for two full-length EST clones of Ugp were obtained from both Arabidopsis and poplar, the cDNAs in Arabidopsis correlate with two genes in the Arabidopsis genomic database. The derived protein sequences are 90-93% identical within each plants species and 80-83% identical between the two species. Studies on Ugp showed that the expression is up-regulated by Pi-deficiency, sucrose-feeding and by light exposure in Arabidopsis. Studies with Arabidopsis plants with mutations in sugar/ starch- and Pi-content suggested that the Ugp expression is modulated by an interaction of signals derived from Pi-deficiency, sugar content and light/ dark conditions, where the signals act independently or inhibiting each other, depending on conditions. Okadaic acid, a known inhibitor of certain classes of protein phosphatases, prevented the up-regulation of Ugp by Pi-deficiency and sucrose-feeding. In poplar, sucrose also up-regulated the expression of Ugp. When poplar and Arabidopsis were exposed to cold, an increase of Ugp transcript content was detected as well as an increase in UGPase protein and activity. In poplar, Ugp was found to be expressed in all tissues that were examined (differentiating xylem, phloem, apical leaves and young and mature leaves). By using antisense strategy, Arabidopsis plants that had a decrease in UGPase activity of up to 30% were obtained. In the antisense plants, the soluble carbohydrate content was reduced in the leaves by at least 50%; in addition the starch content decreased. Despite the changes in carbohydrate content, the growth rate of the antisense plants was not changed compared to wild type plants under normal growth conditions. However, in the antisense lines the UGPase activity and protein content in sliliques and roots increased, perhaps reflecting compensatory up-regulation of second Ugp gene. This correlates with a slightly larger molecular mass of UGPase protein in roots and siliques when compared to that in leaves. Maximal photosynthesis rates were similar for both wild type and antisense plants, but the latter had up to 40% lower dark respiration and slightly lower quantum yield than wild type plants. Two Ugdh cDNAs from poplar and one from Arabidopsis were sequenced. The highest Ugdh expression was found in xylem and younger leaves. Expression data from sugar and osmoticum feeding experiment in poplar suggested that the Ugdh expression is regulated via an osmoticumdependent pathway.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19892号 / 医博第4141号 / 新制||医||1016(附属図書館) / 32969 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 川村 孝, 教授 横出 正之, 教授 妹尾 浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Call number: LD2668 .T4 1985 A32 / Master of Science