Thesis (Doctoral)--Universität Hamburg, 1982.

The number of newly detected autoantibodies (AB) targeting synaptic proteins in neurological disorders of the central nervous system (CNS) is steadily increasing. Direct interactions of AB with their target antigens have been shown in first studies but the exact pathomecha-nisms for most of the already discovered AB are still unclear. The present study investigates pathophysiological mechanisms of AB-fractions that are associated with the enigmatic CNS disease Stiff person syndrome (SPS) and target the synaptically located proteins amphiphysin or glutamate decarboxylase 65 (GAD65). In the first part of the project, effects of AB to the presynaptic endocytic protein amphiphysin were investigated. Ultrastructural investigations of spinal cord presynaptic boutons in an es-tablished in-vivo passive-transfer model after intrathecal application of human anti-amphiphysin AB showed a defect of endocytosis. This defect was apparent at high synaptic activity and was characterized by reduction of the synaptic vesicle pool, clathrin coated vesi-cles (CCVs), and endosome like structures (ELS) in comparison to controls. Molecular inves-tigation of presynaptic boutons in cultured murine hippocampal neurons with dSTORM microscopy after pretreatment with AB to amphiphysin revealed that marker proteins involved in vesicle exocytosis (synaptobrevin 2 and synaptobrevin 7) had an altered expression in GA-BAergic presynapses. Endophilin, a direct binding partner of amphiphysin also displayed a disturbed expression pattern. Together, these results point towards an anti-amphiphysin AB-induced defective organization in GABAergic synapses and a presumably compensatory rearrangement of proteins responsible for CME. In the second part, functional consequences of SPS patient derived IgG fractions containing AB to GAD65, the rate limiting enzyme for GABA synthesis, were investigated by patch clamp electrophysiology and immunohistology. GABAergic neurotransmission at low and high activity as well as short term plasticity appeared normal but miniature synaptic potentials showed an enhanced frequency with constant amplitudes. SPS patient IgG after preabsorption of GAD65-AB using recombinant GAD65 still showed specific synaptic binding to neu-rons and brain slices supporting the hypothesis that additional, not yet characterized AB are present in patient IgG responsible for the exclusive effect on frequency of miniature potentials. In conclusion, the present thesis uncovered basal pathophysiological mechanisms underlying paraneoplastic SPS induced by AB to amphiphysin leading to disturbed presynaptic architec-ture. In idiopathic SPS, the hypothesis of a direct pathophysiological role of AB to GAD65 was not supported and additional IgG AB are suspected to induce distinct synaptic malfunction. / Die Anzahl neu charakterisierter Autoantikörper (AAK) gegen synaptische Proteine bei Er-krankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) ist stetig wachsend. Direkte Interaktionen der AAK mit ihren Zielantigenen konnten in ersten Studien belegt werden, jedoch besteht weiterhin Unklarheit über die exakten zugrunde liegenden Pathomechanismen. In der vorliegenden Arbeit wurden pathophysiologische Mechanismen von AAK gegen die synaptisch lokalisierten Proteine Amphiphysin und Glutamatdecarboxylase 65 (GAD65) untersucht, die mit der ZNS Erkrankung Stiff Person Syndrom (SPS) assoziiert sind. Im ersten Projektteil wurden die Effekte von AAK gegen das Endozytoseprotein Amphiphysin analysiert: in einem etablierten in-vivo Tiermodell konnten nach intrathekalem passiven Transfer von AAK gegen Amphiphysin ultrastrukturelle Untersuchungen von präsynaptischen Terminalen im Rückenmark eine Störung der Endozytose aufzeigen. Dieser Defekt, der bei hoher synaptischer Aktivität eintrat, war durch eine Verminderung synaptischen Vesikelpools, Clathrin-ummantelter Vesikel und endosomähnlicher Strukturen charakterisiert. Molekulare Untersuchungen präsynaptischer Terminale kultivierter hippokampaler Zellkulturen mit dSTORM Mikroskopie zeigten, dass an der Exozytose beteiligte synaptische Vesikelproteine (Synaptobrevin 2 und Synaptobrevin 7) ein verändertes Expressionsmuster innerhalb GA-BAerger Synapsen aufweisen. Die Expression von Endophilin, einem direkten Bindungs-partner von Amphiphysin, war ebenso verändert. Zusammengefasst weisen diese Ergebnis-se auf einen Organisationsdefekt GABAerger Synapsen hin, die durch anti-Amphiphysin AAK induziert sind und eine kompensatorische Umverteilung von Endozytoseproteinen vermuten lassen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die funktionellen Effekte von SPS AAK gegen GAD65, dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der GABA-Synthese, mittels Patch-Clamp Mes-sungen und Immunhistologie untersucht. Die GABAerge synaptische Übertragung bei niedri-ger als auch hoher synaptischer Aktivität sowie die synaptische Kurzzeitplastizität wurden durch die IgG Fraktionen mit GAD65-AAK nicht beeinträchtigt. Die Frequenz von GABAergen Miniaturpotentialen war jedoch bei ansonsten gleichbleibender Amplitude erhöht. SPS-Patienten-IgG zeigte allerdings auch nach Präabsorbtion von GAD65-AAK mit Hilfe von rekombinanten GAD65 eine spezifische Anfärbung neuronaler Synapsen, was die Hypothese von weiteren, funktionell wirksamen, aber noch nicht identifizierten AAK im Patienten-IgG unterstützt. Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit grundlegende pathophysiologische Mechanismen aufgezeigt werden, wie pathogene Antikörper gegen Amphiphysin die Struktur präsynaptischer Boutons beeinträchtigen können. Im Falle des idiopathischen SPS konnte keine unterstützenden Befunde für die Hypothese einer direkten pathophysiologischen Rolle von GAD65 AAK erhoben werden. Nach den vorliegenden Ergebnissen wird das Vorhandensein weiterer, derzeit noch nicht beschriebener IgG AAK postuliert, die die synaptische Fehlfunktion erklären können.

Ulm, Univ., Diss., 2008.

Würzburg, Univ., Diss., 2008. / Zsfassung in engl. Sprache.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte geprüft werden ob durch Reduktion der Glutamatdecarboxylase (GAD) Expression eine Reduktion des autoimmunogenen Potenzials in insulinproduzierenden Beta-Zellen des endokrinen Pankreas erreicht werden kann. Aus der Literatur ist bekannt, dass GAD als Autoantigen eine zentrale Stellung bei der Induktion der T-Zell vermittelten Insulitis einnimmt. Der Prozess, welcher zur Beta-Zell-Apoptose des Typ 1 Diabetes führt, ist ein bislang wenig verstandener komplexer Vorgang. Ein besseres Verständnis dieses Prozesses könnte zur Prävention der Beta-Zell-Zerstörung in der frühen Phase des Typ 1 Diabetes beitragen. In den für die Untersuchungen verwendeten INS-1 Zellen werden die beiden Isoformen der GAD exprimiert. Durch einen antisense Ansatz sollte in INS-1 Zellen die GAD Expression beider Isoformen supprimiert werden. In dieser Arbeit wurden zwei Methoden zur gezielten Suppression der Expression des Autoantigens GAD65 etabliert. Es konnte ein antisense Klon identifiziert werden, bei dem die endogene GAD65 mRNA fast nicht mehr detektierbar war. Auf Protein Ebene, im Westernblot konnte dieses Ergebnis jedoch nicht bestätigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Funktion der INS-1 Zellen mit supprimierter GAD65 Expression charakterisiert. Dieser Punkt beinhaltet die Analyse der Expression von Genen, welche die Beta-Zell-Funktion definieren, die Glukose-abhängige Insulinsekretion sowie die Regulation der Zytokin-induzierten Apoptose. Dabei zeigte sich aus Daten der RT-PCR, dass die mRNAs von anderen Beta-Zell-spezifischen Genen wie GLUT2, Glukokinase, Proinsulin, IDX1 und Nkx6.1 in unveränderter Menge nachweisbar sind. Also bleibt die Funktion der INS-1 Beta-Zellen erhalten, da selbst durch forcierte Reduktion der Expression des Autoantigens GAD65 die Glukose-induzierte Insulinsekretionskapazität im Wesentlichen nicht beeinträchtigt wird. In vitro Untersuchungen zeigten eine unveränderte Sensitivität der Zytokin-induzierten Apoptose nach GAD65 Suppression in INS-1 Zellen. Die zuvor genannten Resultate und die Tatsache, dass die GAD wohl eines der wichtigsten Autoantigene im Rahmen der Immunpathogenese des Typ 1 Diabetes ist, stellen die Grundlage für die Generierung GAD-supprimierter transplantierbarer Beta-Zellen mit guter Transplantatfunktion dar. Im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung bei der Behandlung dieser humanen Autoimmunerkrankung demonstrieren die vorliegenden Daten, dass im Rahmen einer Inselzelltransplantation die Verwendung von GAD-supprimierten Beta-Zellen bei der Transplantation in das endokrine Pankreas des Menschen zu einer Verminderung von Autoimmunreaktionen führen könnte. / In the present study we investigated genetic engineering approaches for the suppression of autoantigenic GAD expression in insulin producing pancreatic beta-cells. The enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) represents a major autoantigen in the early immunopathogenesis of T-cell-mediated destruction of pancreatic beta-cells in type 1 diabetes mellitus. The mechanisms which trigger the apoptotic destruction of insulin producing pancreatic beta-cells leading to autoimmune diabetes are incompletely understood. The exact mechanisms remain to be clarified. The enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD), is expressed in INS-1 pancreatic beta-cells in two distinct isoforms GAD65 and GAD67. Thus, strategies to suppress GAD expression in INS-1 cell lines were tested. Two methods for suppression of autoantigenic GAD65 expression were established. One clone overexpression of GAD65 antisense mRNA yielded an almost complete suppression of endogenous GAD65 mRNA expression. In the second part of this thesis the characterization of INS-1 cells with suppressed autoantigenic GAD65 mRNA expression including beta-cell specific gene expression, glucose-dependent insulin secretion, and cytokine induced-apoptosis was tested. Expression of glucose transporter type 2, glucokinase, preproinsulin, islet/duodenum homeo box 1 transcription factor (IDX), and NK homeodomain transcription factor (Nkx6.1) were characterized by reverse transcription polymerase chain reaction. No differences in the amount of these beta-cell specific genes could be detected between GAD65 suppressed INS-1 cell clones and controls. Moreover, reduced GAD65 expression does not affect insulin secretory capacity in INS-1 cells. Suppression of GAD65 expression in INS-1 cells does not alter sensitivity to cytokine-induced apoptosis. The data presented here suggest that suppression of GAD expression may thus provide a therapeutical approach to prevent recurrence of autoimmune beta-cell destruction in transplanted pancreatic beta-cells in type 1 diabetic patients.

Die Anzahl neurologischer Erkrankungen bei denen Autoantikörper gegen zentralnervöse An-tigene bekannt sind, hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Allerdings gibt es nur für wenige dieser Erkrankungen hinreichende experimentelle Belege für eine pathogene Wir-kung der Autoantikörper. Zwei dieser Erkrankungen wurden im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht: die Juvenile Neuronale Zeroid-Lipofuszinose (JNCL) mit Autoantikörpern gegen die 65 kD Isoform der Glutamatdecarboxylase und das Stiff Person Syndrom (SPS) mit Auto-antikörpern gegen Amphiphysin. Die phänotypische Charakterisierung der cln3 knockout-Maus, einem Mausmodell für die JNCL, zeigte eine progressive Verschlechterung der motorischen und koordinativen Fä-higkeiten, eingeschränktes reizbedingtes Lernen und gesteigertes angstähnliches Verhalten. Diese Symptome ähneln denen der humanen Erkrankung. Elektrophysiologisch konnte eine Antikörper-induzierte zerebelläre Dysfunktion identifiziert werden, die einer verminderten lokalen GABAergen Hemmung zugeordnet wird. Eine Reduktion der Antiköperproduktion im Tiermodell durch eine Depletion der Plasmazellen durch den Proteseinhibitor Bortezomib hatte einen positiven Effekt auf die Krankheitsentwicklung. Im zweiten experimentellen Teil der Arbeit wurde der Einfluss von Autoantikörpern gegen Amphiphysin von Patienten mit SPS auf die synaptische Transmission untersucht. Es zeigte sich hierbei in Patch-Clamp Experimenten eine Störung der GABAergen Übertragung v.a. bei hochfrequenter Stimulation, was im Einklang mit dem vermuteten Antikörper-induzierten Endozytosedefekt steht. Passiver Transfer von humanen Autoantikörpern gegen Amphiphysin induzierte angst-ähnliches Verhalten in Ratten, einem weiteren Kernsymptom des SPS. Aktive Immunisierung gegen Amphiphysin und anschließende Öffnung der Blut-Hirn-Schranke in Mäusen führte zu einer subklinischen Veränderung der Reflexverarbeitung von Ia Afferenzen auf Motoneurone im Rückenmark der Mäuse. Insgesamt konnten in zwei Erkrankungen des ZNS autoimmune Mechanismen identifi-ziert werden, die zu einer Antikörper-induzierten Fehlregulation der zentralen synaptischen Transmission führen. Diese Ergebnisse können wegweisend sein auch für die Erforschung der Pathophysiologie anderer Antikörper-assoziierte Erkrankungen des ZNS. / A growing number of neurological disorders are associated with autoantibodies targeting an-tigens within the central nervous system. Only in few cases experimental evidence corrobo-rates a pathogenic role of the autoantibodies. Two autoantibody associated diseases were investigated in detail in this work: the Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses (JNCL) with au-toantibodies against the 65kD isoform of the glutamate decarboxylase and the Stiff Person Syndrome (SPS) with autoantibodies against amphiphysin. The analysis of cln3 knockout mice, an animal model of the JNCL, revealed a phenotype resembling the human disorder, including progressive motor decline, limited cued learning and an increase in anxiety-related behavior. Electrophysiological analysis revealed an autoan-tibody mediated cerebellar dysfunction, which is best explained by diminished local GABAer-gic inhibition. A reduction of autoantibody production in the cln3 knockout mice by depletion of plasma cells after treatment with Bortezomib had a positive effect on the disease out-come. In the second experimental part, the effect of autoantibodies to amphiphysin from SPS patients on synaptic transmission was analysed. In patch-clamp experiments the GABAergic synaptic transmission was found to be disturbed primarily during high-frequent stimulation. This is in line with the hypothesized defect of synaptic vesicle endocytosis induced by autoan-tibodies. Passive transfer of human autoantibodies to rats induced anxiety-related behavior, a key symptom of SPS. The active immunization of mice against amphiphysin and subsequent opening of the blood brain barrier led to subclinical disturbances of the Ia afferent-motor neuron reflex pathway within the spinal cord. In conclusion, for two CNS disorders autoimmune mechanisms were identified leading to antibody-induced deregulations of central synaptic transmission. These findings may have implication for the research on pathomechanisms of other putative antibody mediated dis-orders.

Zur Zeit leiden ca. 24 Millionen Menschen auf der ganzen Welt unter Demenz, Alzheimer macht dabei 50-60% aller Demenzfälle aus. Da der Anteil der Bevölkerung, der an Demenz leidet, proportional zum Alter zunimmt und der Anteil älterer Menschen in der Gesellschaft von Jahr zu Jahr steigt, wird Alzheimer immer mehr zu einem ernstzunehmenden, gesellschaftlichen Problem. Zum Stand der heutigen Forschung ist es etabliert, dass die Aminosäure Glutamat - quantitativ einer der wichtigsten Neurotransmitter im Zentralen Nervensystem (ZNS) - toxische Konzentrationen erreichen kann wenn sie - im Zuge der Übertragung von Aktionspotentialen - nach ihrer Freisetzung nicht aus dem Synaptischen Spalt entfernt wird. Viele Studien haben gezeigt, dass in der Alzheimerschen Krankheit die Glutamataufnahme beeinträchtigt ist, was zu toxischen Konzentrationen von Glutamat und dem daraus folgenden Absterben von Neuronen führt. Der exitatorische Aminosäuretransporter 1 (EAAT1) gehört zu der Familie der Na+-abhängigen Glutamattransporter und stellt nach EAAT2 den quantitativ wichtigsten Glutamattransporter im ZNS dar. In diesem Projekt wurde eine bis dahin für den Menschen nicht bekannte EAAT1 Spleißvariante, in der Exon 3 ausgeschnitten wird, nachgewiesen. Diese Variante wurde EAAT1Δ3 genannt und stellt damit mit EAAT1Δ9 die zweite für EAAT1 nachgewiesene Spleißvariante dar. Eine auf real-time RT-PCR basierende Methode wurde entwickelt, um die Transkripte von EAAT1 wildtyp (EAAT1 wt), EAAT1Δ3 und EAAT1Δ9 zu quantifizieren. Proben aus verschiedenen Hirnarealen wurden aus einem Set von Kontrollen und Alzheimerfällen bei der Quantifizierung verwendet. Die gewählten Areale sind von der Alzheimerschen Krankheit unterschiedlich stark betroffen. Dies diente als interne Kontrolle für die durchgeführten Experimente und ermöglichte so die Differenzierung zwischen beobachteten Effekten: Nur Effekte die alleinig in von Alzheimer betroffenen Gehirnarealen auftreten, können als spezifisch für die Krankheit angesehen werden. Die Resultate diese Projektes zeigen, dass EAAT1Δ3 in sehr geringer Anzahl transkribiert wird, die nur 0.15% der EAAT1 wt Transkription entspricht. Dahingegen entspricht das EAAT1 Δ9 Transkript im Durchschnitt 26.6% des EAAT1 wt Transkripts. Es wurde nachgewiesen, dass die Transkriptionsrate aller EAAT1 Varianten in Alzheimerfällen signifikant reduziert ist (P<0.0001). Dies unterstützt die Theorie, dass bei Alzheimerfällen die EAAT1 Proteinexpression stark reduziert und der Glutamattransport, der normalerweise durch diesen Transporter gewährleistet wird, stark eingeschränkt ist. Dies wiederum resultiert in toxisch hohen Glutamatkonzentrationen und damit dem Absterben von Neuronen. Die gefundene Reduktion der EAAT1Transkription ist nicht spezifisch für Gehirnareale die von Alzheimer betroffen sind, sondern tritt in selbem Maße in nicht von Alzheimer betroffenen Gehirnarealen auf. Daraus lässt sich schließen, dass die Reduktion der EAAT1 Transkription eher ein Resultat eines in der Alzheimerschen Krankheit präsenten, grundlegenden Krankheitsmechanismus ist als deren Ursache. / Today about 24 Million people worldwide suffer from dementia, Alzheimer’s Disease accounts for approximately 50-60% of all dementia cases. As the prevalence of dementia grows with increasing age Alzheimer’s Disease becomes more and more of an issue for society as the proportion of elderly people increases from year to year. It is well established, that the amino acid glutamate - quantitatively being the most important neurotransmitter in the central nervous system (CNS) - may reach toxic concentrations if not cleared from the synaptic cleft into which it is released during transmittance of action potentials. In Alzheimer’s Disease there is strong evidence for a generally impaired glutamate uptake system which in turn is thought to result in toxic levels of the amino acid with the potential to kill off neurons. The excitatory amino acid transporter 1 (EAAT1) belongs to the family of Na+-dependent glutamate transporter and accounts together with EAAT2 for most of the glutamate uptake in the CNS. In this project a new splice variant of EAAT1, skipping exon 3 was detected in human brain samples and subsequently called EAAT1Δ3, this being the second splice variant found after the recent detection of EAAT1Δ9. A method was developed to quantify the transcript of EAAT1 wt, EAAT1Δ3 and EAAT1Δ9 by means of real-time PCR. Samples were taken from different brain areas of a set of control and AD cases. The areas chosen for examination are affected differently in Alzheimer’s Disease, this was used an internal control for the experiments done in this project as to determine whether any effect observed is specific for AD, i.e. AD affected areas or is generally seen in all areas examined. The results of this project show that EAAT1Δ3 is transcribed in very low copy numbers making up a proportion of 0.15% of EAAT1 wt whereas EAAT1Δ9 is transcribed in a considerably large proportion of EAAT1 wt of 26.6%. It was moreover found that all EAAT1 variants are transcribed at significantly lower rates (P<0.0001) in AD cases, supporting the theory that EAAT1 protein expression is reduced to a point where glutamate uptake normally mediated by this transporter is impaired. This in turn is thought to result in toxic levels glutamate accounting for neuronal loss in the disease. No area-dependent effects were found, suggesting that the reduction of EAAT1 transcription is rather a result of an underlying general mechanism present in AD. Further research will have to be done to assess the degree of EAAT1 expression in AD and whether those future findings match with the result of this project.

DE LA TESIS:Una de las consecuencias de los avances científicos y tecnológicos del ultimo siglo es el aumento de esperanza de vida en las sociedades modernas lo que, en términos demográficos, se traduce en un incremento en la media de edad de la población. Sin embargo, este envejecimiento progresivo comporta una mayor incidencia en la sociedad de enfermedades que se manifiestan a edades avanzadas, destacando las que afectan al sistema nervioso central como la enfermedad de Alzheimer o la de Parkinson. El dramático incremento en la incidencia de este tipo de enfermedades se ha traducido en una sensibilización social frente a ellas, así como en un creciente interés en el estudio de los procesos neurodegenerativos asociados a la edad y en su posible tratamiento.La etiología de la muerte neuronal en los procesos de neurodegeneración continúa siendo un enigma por descifrar pero cada vez se sabe más acerca de las causas y trastornos que la envuelven. Un factor que parece estar implicado directamente en estos procesos es el glutamato, el neurotransmisor excitador mayoritario del sistema nervioso central. La paradoja de ésta molécula estriba en que a pesar de estar implicada en procesos fisiológicos normales como el aprendizaje, la memoria o la construcción de conexiones sinápticas durante el desarrollo, también puede ser tóxica para las neuronas. El glutamato juega un papel central en muchos procesos neurodegenerativos y está implicado en patologías tan diversas como la corea de Huntington, la epilepsia, el daño cerebral isquémico o la enfermedad de Alzheimer. El modo mediante el que el glutamato ejerce su función tóxica consiste en la sobreactivación de sus receptores sinápticos, provocando una serie de fenómenos patológicos que llevan a la muerte de la neurona y que son conocidos con el nombre de excitotoxicidad. El mecanismo por el que todo esto sucede es todavía objeto de estudio.Dentro de este marco, los objetivosprincipales sobre los que se fundamenta el trabajo aquí expuesto eran:- Caracterizar en términos histológicos, bioquímicos y funcionales la lesión excitotóxica de la rata creada en la vía septohipocampal por la microinyección en el septo medio de un agonista de los receptores del glutamato (el ácido a-amino-3-hidroxi-5-metilsoxazol-4-propiónico, o AMPA) y comparar los efectos provocados en función de la dosis administrada con los que aparecen en función del tiempo postlesión transcurrido.- Bajo las condiciones de neurodegeneración seleccionadas, estudiar in vivo las respuestas adaptativas de los sistemas de activación e inhibición hipocampales controlados por los núcleos de la región septal para así establecer la relevancia de cada sistema en este modelo animal.- De forma paralela y en otro modelo animal de aprendizaje y memoria en el que previamente se habían caracterizado variaciones de los receptores hipocampales del glutamato, nos propusimos estudiar el origen celular del aumento de receptores AMPA asociados al deterioro cognoscitivo provocado por el envejecimiento.- Investigar la posible relación entre la vulnerabilidad humana a la hipoxiaisquemia durante el periodo perinatal, la calcificación cerebral en el mismo periodo y su evolución, con el fin de establecer posibles paralelismos con la lesión excitotóxica inducida en nuestro modelo en diferentes condiciones de dosis y tiempo.- Analizar los mecanismos moleculares que puedan estar interrelacionados para dar lugar tanto a la formación de precipitados intracelulares de calcio como a la progresividad del proceso neurodegenerativo.

Universiẗat, Diss., 2006--Frankfurt (Main). / Zsfassung in dt. und engl. Sprache.

Heidelberg, Univ., Diss., 2007. / Online publiziert: 2008.