A descoberta do papel essencial do selênio no centro ativo da enzima antioxidante glutationa peroxidase despertou o interesse científico por este elemento, que até então tinha sua toxicidade como o único alvo de estudos biológicos. Muitas propriedades farmacológicas foram descobertas a partir de então, e isto motivou a síntese de compostos orgânicos de selênio que apresentassem menor toxicidade e maior potencial terapêutico. Nesta busca, o disseleneto de difenila, (PhSe)2, tem merecido destaque desde a década de 80 principalmente por ser um mimético da enzima glutationa peroxidase. Estudos têm revelado que além de antioxidante, este composto possui propriedades neuroprotetoras, antiinflamatórias e antiúlcera. No entanto, sua habilidade em oxidar proteínas sulfidrílicas lhe confere características tóxicas. Alterações importantes causadas por este composto sobre o sistema glutamatérgico vêm sendo relatadas. Entretanto, estudos que avaliem mecanismos moleculares da ação do (PhSe)2 sobre o sistema nervoso central ainda estão sendo investigados. Neste trabalho, a administração aguda de (PhSe)2 pela via oral causou uma inibição na captação de glutamato em fatias de hipocampo. Mecanismos moleculares foram avaliados na tentativa de compreender como este composto atua sobre a neurotransmissão glutamatérgica. O efeito do (PhSe)2 sobre o imunoconteúdo de todos os transportadores de glutamato mostrou, de um modo geral, que este composto orgânico de selênio pode afetar a neurotransmissão glutamatérgica por alterar o imunoconteúdo dos transportadores de glutamato. Seus efeitos sobre a captação de glutamato foram atribuídos a uma redução no imunoconteúdo de GFAP e do transportador vesicular de glutamato 1 (VGLUT1), associados a uma redução no imunoconteúdo da SNAP-25. Estes resultados demonstram que os efeitos do (PhSe)2 atingem tanto os terminais nervosos quanto as células gliais, ambos responsáveis pela remoção do glutamato extracelular. O transportador neuronal EAAC1 e o glial GLAST tiveram seus imunoconteúdos aumentados, o que nos leva a sugerir um mecanismo compensatório condicionado por estes transportadores com o objetivo de reduzir os níveis de glutamato extracelulares. O possível envolvimento das espécies reativas de oxigênio no efeito inibitório da captação de glutamato também foi testado. Entretanto, como nenhuma alteração foi encontrada a influência do estresse oxidativo sobre a inibição da captação poderia ser descartada pelo menos nas doses e via de administração testadas neste trabalho. / The essential role of selenium was firstly described as the active center of the antixiodant enzyme glutathione peroxidase. Since then, the biological research have been increased specially concerning the pharmacological properties, which lead to the synthesis of new organo seleno compounds that present lower toxicity and higher therapeutic potential. In this way, diphenyl diselenide (PhSe)2 has deserved attention since the 80’s, mainly because it is a glutathione peroxidase-mimetic. Besides the antioxidant activity, some studies have shown that this compound has neuroprotector, anti-inflammatory and anti-ulcer properties. Its ability to oxidize sulphydryl proteins has been shown to be the major mechanismo for toxicity. Recently, it was reported that (PhSe)2 administered in rodents was able to modify some parameters of glutamatergic system. However, studies that evaluate molecular mechanisms of (PhSe)2 action on central nervous system were not quite elucidated. In this work, oral acute administration of (PhSe)2 caused an inhibition on glutamate uptake in hippocampal slices. Molecular mechanisms were evaluated for understanding how this compound acts on glutamatergic neurotransmission. Altogether, the effect of (PhSe)2 on immunocontent of all glutamate transporters showed that this organo seleno compound altered the immunocontent of glutamate transporters. Its effects on glutamate uptake were attributed by a reduction on glial fibrilar acid protein (GFAP) and vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1) immunocontent, associated with a reduction on SNAP-25 immnunocontent. These results demonstrate that (PhSe)2 affect terminal nerves and also glial cells, both responsible by removing extracellular glutamate. On the other hand, the neuronal (EAAC1) and glial (GLAST) transporters presented and increase in their immunocontent by the treatment with (PhSe)2, which may suggest a compensatory mechanism conditioned by these transporters in order to reduce the extracellular glutamate levels. The possible involvement of oxygen reactive species in inhibitory effect of glutamate uptake was also tested. Because no alterations were found, the influence of oxidative stress on inhibition glutamate uptake could be discarded, at least in doses and administration route tested in this work.

A isquemia cerebral é a terceira maior causa de morte em países industrializados, sendo a maior causa de morbidade e mortalidade em indivíduos de meia idade e idosos. A redução do suprimento de glicose e oxigênio ao cérebro, o que ocorre na isquemia, leva a uma complexa cascata de eventos celulares, resultando em degeneração neuronal e, conseqüentemente, na perda das funções cerebrais. Altas concentrações extracelulares de glutamato ocorrem em decorrência a um episódio isquêmico devido ao bloqueio da captação de glutamato, assim como ao aumento na sua liberação e a uma reversão de seus transportadores. A manutenção de seus níveis abaixo dos neurotóxicos é realizada por transportadores de alta afinidade dependentes de sódio, principalmente nos astrócitos. Modelos de isquemia in vitro e in vivo foram utilizados nos trabalhos que compõem esta tese. No primeiro capítulo, usamos um modelo de privação de oxigênio e glicose (POG) em fatias de hipocampo de ratos jovens e adultos. A POG diminuiu a captação de glutamato em todos os tempos de reperfusão estudados em ambas as idades, sendo essa diminuição menos pronunciada em animais jovens. Fatias de hipocampo de animais adultos parecem ser mais resistentes ao insulto que as provenientes de animais jovens, visto que o dano celular se dá primeiramente nestes. A guanosina (GUO) foi capaz de evitar a queda da captação somente em animais jovens 3hs após a POG e também foi capaz de reduzir o dano celular em ambas as idades. A padronização da metodologia da captação de glutamato em cultura organotípica de fatias de hipocampo foi montada a fim de estudar alterações neste parâmetro após a POG. Nesse modelo, há um aumento da captação após 1h de reperfusão e uma queda após 24hs. A morte celular medida, pela incorporação de iodeto de propídio, foi significativa a partir das 13hs e há uma queda nos níveis de GLT-1 24hs pós-POG. A GUO protegeu parcialmente a morte induzida pela POG, mas não foi capaz de reverter a queda da captação de glutamato 24hs pós-insulto. O modelo in vivo de isquemia utilizado foi a hipóxia-isquemia (HI) neonatal. Houve um aumento da captação de glutamato 24hs pós-insulto no hemisfério ipsilateral e uma queda significativa 72hs após nos dois hemisférios. Alterações de GFAP e S100B foram analisadas. Houve um aumento dos níveis de GFAP dependente de idade nos três tempos estudados e nas duas estruturas. Nos animais submetidos à HI, o aumento de GFAP foi significativamente maior no hemisfério ipsilateral e esse foi diferente de seu respectivo controle 48 e 72hs após o insulto. Houve um aumento nos níveis de S100B dependente de idade no córtex, sem diferença entre o grupo controle e o HI. No hipocampo ipsilateral, observamos um aumento de S100B dependente de tempo no grupo HI e HI-GUO, mas somente o grupo HI-GUO foi diferente de seu controle 48 e 72hs após o insulto. A GUO não teve nenhum efeito sobre a captação de glutamato em córtex, sobre os níveis de GFAP em ambas as estruturas e sobre a S100B em córtex. O APDC, um potente agonista de receptor metabotrópico de grupo II, foi testado no modelo in vitro de POG com fatias de hipocampo. Ele foi capaz de evitar, parcialmente, a queda da captação de glutamato e esse efeito foi inibido por APICA, um antagonista de grupo II. Esses dados são preliminares e necessitam de maiores estudos. Podemos concluir que quando se usam diferentes modelos experimentais, tanto in vitro quanto in vivo, estes podem nos fornecer dados distintos sobre um mesmo parâmetro ou uma mesma droga em estudo e, mesmo assim, são importantes, pois cada modelo pode representar uma situação completamente diferente da outra. / Cerebral ischemia is the third leading cause of death in the industrialized countries being the major cause of morbidity and mortality in middle and later life. The reduction in the supply of glucose and oxygen to the brain that occurs in cerebral ischemia leads to a complex cascade of cellular events, resulting in neuronal degeneration and, consequently, in loss of brain functions. It has been shown that stroke and ischemia increase the extracellular glutamate levels due to impairment of glutamate uptake, as well as an increase in glutamate release and reversal of glutamate transporters. The maintenance of extracellular glutamate below neurotoxic levels is an essential role for glial cells and this is achieved through high affinity sodium-dependent glutamate transporters present mainly in astrocytes. Ischemic models in vitro and in vivo were used in this work. In the first chapter, we used a model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in hippocampal slices of young and adult rats. OGD decreased glutamate uptake in all reperfusion times and in both ages studied, being this decrease less pronounced in young rats. Hippocampal slices of adult animals seemed to be more resistant to OGD than youngs, since cell damage was first seen in young. Guanosine (GUO) was able to avoid the decrease in glutamate uptake only in young animals 3h after OGD e also to reduce cell damage in both ages. To study glutamate uptake alterations after OGD in organotypic culture of hippocampal slices, we first standardized this method. There is an increase in glutamate uptake after 1h of reperfusion and a decrease 24h later. Cell death was measured by propidium iodide incorporation and it was significative increased from 13h. There is a decrease in GLT1 levels 24h after OGD. GUO was able in partially protect cells from death, but not able in recovering glutamate uptake decrease 24h after the insult. Neonatal hypoxia-ischemia (HI) was the in vivo model used here. There was an increase in glutamate uptake 24h after the insult in the ipsilateral hemisphere and a decrease 72h later in both hemispheres. GFAP and S100B alterations were also analyzed. There was an increase in GFAP levels dependent of age in all times studied and in both structures. In the HI group, the increase of GFAP was significatively higher in the ipsilateral hemisphere and this was different from its control 48 and 72h after the insult. There was an increase in S100B levels dependent of age in cortex, without difference between control and HI group. In the ipsilateral hippocampus, there was an increase of S100B dependent of time in HI and HI-GUO group, but only HI-GUO was different from its control 48 and 72h after the insult. GUO had no effect over glutamate uptake in cortex, GFAP levels in both structures, and S100B in córtex. APDC, a potent agonist of methabotropic receptors of grup II, was tested in the same OGD model used in the first chapter. APDC was able in partially avoid glutamate decrease induced by OGD in hippocampal slices, and this effect was abolished by APICA, a group II antagonist. These results are preliminary and deserve more study. We could conclude that when different experimental models are used, as in vitro or in vivo, these could give us distinct date about the same parameter or about the same drug in study, and even that happens, they are very important since each model might represent a complete different situation.

Submitted by Eduardo Barros de Almeida Silva (eduardo.philippe@ufpe.br) on 2015-04-17T12:05:27Z No. of bitstreams: 2 Tese Cassia Lima.pdf: 1709441 bytes, checksum: 79e850c499945a471a4030f151349708 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T12:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Cassia Lima.pdf: 1709441 bytes, checksum: 79e850c499945a471a4030f151349708 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / Facepe; CNPq; Capes / Glutamato monossódico (MSG) é um aminoácido neuroexcitatório utilizado como reforçador do sabor dos alimentos (“agente flavorizante”). Em altas doses, pode ser prejudicial ao sistema nervoso central, às células neuronais e gliais, podendo esse efeito ser mais severo durante o cérebro em desenvolvimento. Em ratos, o MSG no período neonatal pode induzir neurotoxicidade, afetando a organização morfológica e eletrofisiológica do encéfalo. Por outo lado, o exercício físico induz efeitos positivos no sistema nervoso de mamíferos. Neste trabalho, investigamos, em ratos tratados com MSG e/ou exercício físico em esteira, efeitos eletrofisiológicos (mudanças relacionadas ao fenômeno designado como depressão alastrante cortical [DAC]) e morfológicos (reação microglial expressa pela imuno-marcação com anticorpos anti-Iba1 no cortex motor). Ratos Wistar receberam MSG (2 ou 4g/kg, n=22 e 24, respectivamente; grupos MSG-2 e MSG-4), ou solução salina (n=23), ou nenhum tratamento (grupo ingênuo, n=11) a cada dois dias, nos primeiros 14 dias de vida pós-natal. Após o desmame, os três grupos foram subdivididos em exercitados (esteira motorizada, 3 semanas, 5 dias/semana, durante 30 minutos, n=47), ou sedentários (n=33). Dois dias após o final do exercício, sob anestesia, a DAC foi induzida por KCl em um ponto da superfície cortical, e o registro da atividade elétrica cortical foi realizado durante 4h. Um grupo adicional foi utilizado para estudo imunohistológico de células microgliais. O grupo MSG-4 apresentou velocidade média (em mm/min) significativamente mais elevada (4,59±0,34), em comparação com os outros grupos (salina: 3,84±0,20; ingênuo: 3,71±0,8: MSG-2: 3,75±0,10). Em comparação com os sedentários, o exercício físico reduziu a velocidade da DAC em todos os grupos (salina: 3,31±0,19; Ingênuo: 3,25±0,17; MSG-2: 3,49±0,19; MSG-4: 4,05±0,18 mm/min, P <0,05). Nós concluimos que o tratamento neonatal com MSG facilita a propagação da DAC, enquanto que o exercício desacelera a sua propagação. Ambos os tratamentos (MSG e Exercício físico) exercem influência na imunoreatividade da microglia, aumentando-a. Os dados sugerem cuidado na utilização de MSG como reforçador do sabor dos alimentos, principalmente no organismo em desenvolvimento (crianças) e indicam que o exercício físico pode exercer influência no desenvolvimento e função cerebrais.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El destete en la producción porcina intensiva es una fase crítica causada por diversos factores estresantes, entre ellos el nutricional, debido a esto se han buscado estrategias para aumentar el consumo voluntario de alimento en este período. En este trabajo se evaluó la influencia de la incorporación de glutamato monosódico (MSG) en la dieta de las cerdas durante la gestación y lactancia sobre los umbrales de preferencia de sus crías durante la recría. Se utilizaron dos grupos experimentales, grupo Control y grupo MSG de 11 cerdas cada uno, que se diferenciaron por la incorporación en el grupo MSG de 50 g/kg de MSG sobre las dietas estándar (balanceadas) de gestación y lactancia. Posteriormente, se realizaron pruebas de preferencia de doble elección de corta duración (2 minutos) con soluciones de MSG y sacarosa, contando con un entrenamiento previo de 2 días. Las concentraciones de MSG evaluadas fueron 0,1; 0,5; 1; 3; 9 y 27 mM. En cambio, para sacarosa fueron 0,03; 0,1; 1; 6; 12 y 18 mM. El umbral de preferencia (o sensibilidad) se determinó como la solución de MSG o sacarosa de menor concentración que alcanzó una preferencia significativamente mayor que 50% (P < 0,05). Se estableció el umbral de preferencia para MSG en 1 mM (P < 0,01) para el grupo Control y 0,1 mM (P = 0,04) para el grupo MSG. El umbral de preferencia para sacarosa fue 12 mM (P < 0,01) para el grupo Control y 1 mM (P = 0,03) para el grupo MSG. Además, se determinó que el MSG incorporado en la dieta de madres no influyó en el número y/o peso de los lechones al destete (P > 0,05), así como tampoco hubo diferencias en estos parámetros debido al número ordinal de parto de las hembras (P > 0,05). Se concluye que la inclusión de MSG en las dietas de gestación y lactancia de las cerdas aumentó la sensibilidad de los cerdos destetados por soluciones de MSG y sacarosa. Por otra parte, al destete no se observó ningún efecto sobre los parámetros productivos de estos lechones. Es interesante evaluar para futuras investigaciones si el efecto del MSG es transmitido hacia el alimento sólido, para así determinar una posible estrategia para aumentar el consumo alimentario en el destete. / In intensive pig production systems, weaning is a critical phase caused by various stressors, including nutritional. For this reason, strategies have been sought to increase voluntary feed intake in this period. In this work, the influence of a monosodium glutamate (MSG) inclusion in sows´ diets during gestation and lactation periods on preference thresholds of piglets after weaning was evaluated. Two experimental groups were used, a Control group and a MSG group of 11 sows each, which were differentiated by the incorporation in the MSG group of 50 g/kg of MSG within the standard (balanced) gestating and lactating diets. Subsequently, short-term (2-minute) preference tests with MSG and sucrose solutions were performed, with a previous training period of 2 days. MSG concentrations evaluated were 0.1, 0.5, 1, 3, 9 and 27 mM. On the other hand, sucrose concentrations were 0.03, 0.1, 1, 6, 12 and 18 mM. The preference threshold (sensitivity) was then determined as the lowest concentration of MSG or sucrose that achieved a preference value significantly greater than 50% (P < 0.05). The preference threshold for MSG was determined at 1 mM (P < 0.01) for the Control group and 0.1 mM (P = 0.04) for the MSG group. The preference threshold for sucrose was 12 mM (P < 0.01) for the Control group and 1 mM (P = 0.03) for the MSG group. In addition, it was determined that MSG inclusion into sows´ diets did not influence the number and/or weight of piglets at weaning (P > 0.05), as well as no differences in these parameters were determined due to the sows’ parity number (P > 0.05). It is concluded that the inclusion of MSG in the gestation and lactation diets of sows increased the sensitivity of post-weaned pigs for MSG and sucrose solutions. On the other hand, no effect was observed on the productive parameters of these animals at weaning. It could be interesting to evaluate for future research whether the effect of MSG is transmitted to solid feed, in order to determine a possible strategy to increase feed consumption at weaning. / Proyecto Fondecyt N° 3170293

Introdução: existe evidencia de que o sabor umami detecta os alimentos ricos em proteínas e aminoácidos, o que presumivelmente interfere na ingestão destes alimentos. Há experimentos publicados que relacionam quadros de desnutrição ou alimentação deficiente de determinados aminoácidos, com o consumo voluntário de soluções ou ração contendo tais aminoácidos. Objetivos: os objetivos deste trabalho foram: a caracterização das preferências gustativas para diferentes aminoácidos no rato normal e o efeito da desnutrição protéica sobre essas preferências. Metodologia: o estudo compreendeu duas fases distintas: na primeira foram feitas comparações de consumo de soluções de aminoácidos isolados (10 gramas por litro de água) em um período curto (5 dias). As comparações foram realizadas em 4 grupos distintos, e cada grupo foi composto de 20 animais: 10 controles e 10 desnutridos. A desnutrição foi induzida pelo oferecimento de ração hipoprotéica (5% de caseína na primeira fase e 7,5% de caseína na segunda fase). As soluções de aminoácidos comparadas em cada grupo foram: glutamato e glicina, glutamato e valina, triptofano e glicina e triptofano e valina, todas na concentração de 10g/ L. Na segunda fase foram realizadas comparações de consumo de soluções contendo glutamato mais um aminoácido não essencial (glicina) e glutamato mais um aminoácido essencial (lisina ou triptofano) por um período de 42 dias. Esta segunda fase foi composta de 3 grupos de animais, sendo um formado por 10 animais controles e 10 desnutridos que não receberam soluções, outro grupo com a mesma divisão de animais, mas que receberam soluções de glutamato mais glicina e glutamato mais lisina, e o último grupo recebeu soluções de glutamato mais glicina e glutamato mais triptofano. Resultados, discussão e conclusão: observou-se, tanto na fase 1 como na fase 2, que: a glicina e o glutamato em solução são muito atrativos; a de lisina é atrativa 4 mas em menor intensidade do que as anteriores; a de valina é pouco atraente; o consumo da solução de triptofano foi tão pequena que esta é possivelmente aversiva. Os resultados da fase 1 indicaram que o consumo de soluções de glutamato e de valina de animais desnutridos foi significativamente maior do que o de animais controles. Entretanto, no subgrupo de ratos desnutridos, o consumo da solução de glutamato correlacionou-se positivamente com o peso do animal. Na fase 2 os animais desnutridos, nas duas últimas semanas experimentais, mas não nas anteriores, apresentaram consumo significativamente maior de lisina e triptofano; a comparação do consumo de solução de glicina foi impossibilitada pelo consumo excessivo e esgotamento dos frascos. Também se constatou que os animais da segunda fase apresentaram esteatose hepática. Entre os desnutridos, o consumo de solução de lisina foi inversamente correlacionado com o peso corporal / Umami is the taste quality associated with several amino acids, especially the amino acid L-glutamate, and evidence exists that umami indicates the presence of amino acids, peptides and related structures in foodstuffs, which may bear relevant nutritional implications. The objectives of the study were to establish the normal rat preferences among a set of amino acids (glycine, glutamate, lysine, valine and tryptophan), and determine wether the rat protein malnutrition modifies the preferences and/or the avidity for these amino acids. In a initial set of experiments, bottles containing 50 ml of the amino acid solutions whose palatability were to be compared were presented to each animal for a 5-day period, and volumes consumed during the last 3 days were measured, and the bottles were refilled to their original levels. The left-right positions of the bottles were reversed every day. At the termination of the testing periods, the volumes of test solutions remaining in each bottle were measured, and the consumed volumes calculated. In a second set of experiments, solutions of glutamate plus glycine, glutamate plus lysine or glutamate plus tryptophan were presented to the animals for 8 weeks; after that , for 2 weeks, the glutamate was removed so that solutions of glycine, lysine or tryptophan only were presented to the animals. The volumes remaining in the bottles were measured and the volumes consumed calculated at termination of each testing period. On the basis of the ratios of volume of solutions consumed/ body weight the avidity for the amino acid were inferred. Protein malnutrition was induced by a diet with 5% -7.5 % casein as the only protein source; malnutrition was consistently induced as demonstrated by severe reduction in weight gain and increase in liver fat content. Normal rats demonstrated great avidities for glycine and glutamate, moderate avidity for lysine, low avidity for valine and no avidity for tryptophan. Rats with protein malnutrition a similar profile of avidities, however they significantly grater avidities for 6 glutamate, lysine, valine, and tryptophan, but not for glycine than normal rats. Among the rats with with protein malnutrition, greater the body weight, the greater the glutamate solution comsumed/body weight and the lower the body weight, the greater the lysine solution consumed /body weight. Conclusions: Avidity for amino acid solutions is widely variable, and protein malnutrition enhances the avidity for glutamate, valine, lysine, and tryptophan solutions but not for glycine solution

O sistema circadiano das aves é composto pela retina, a região homóloga aos núcleos supraquiasmáticos de mamíferos (NSQ) e a glândula pineal. A retina apresenta muitos eventos fisiológicos rítmicos, como por exemplo os movimentos das células fotorreceptoras em vertebrados não mamíferos, a expressão de opsinas, regeneração do cromóforo visual e produção e liberação de melatonina e dopamina. Todos estes eventos rítmicos são coordenados para prever alterações nas condições luminosas que ocorrem durante o dia, otimizando a função retiniana. Neste trabalho foi investigada a expressão de componentes chave de um sistema circadiano, incluindo os dois genes de melanopsina, Opn4x e Opn4m, os genes de relógio Clock e Per2, e os genes das enzimas chave da síntese de melatonina, N-Acetiltransferase, e de dopamina, Tirosina Hidroxilase, em células da retina de embriões de galinha. Culturas primárias de retina de embriões de galinha com 8 dias foram preparadas no ZT0 (quando as luz é acesa) e semeadas na densidade de 107 células por frasco de 25 cm2 . As células foram mantidas em ambiente úmido, com 5% CO2, a 40o C, em escuro constante, fotoperíodo 12C:12E, fotoperíodo 12C:12E seguido de escuro constante, ou em escuro constante na presença e na ausência de glutamato 100 &#956;M por 12 h. A extração de RNA total foi feita ao longo de 24 horas com intervalo de três horas tendo início no ZT0 do sexto dia. As amostras foram submetidas a RT-PCR seguido de PCR quantitativo para a quantificação de RNAm. Para confirmar a expressão da proteína OPN4x foi realizado ensaio imunohistoquímico com anticorpos anti-melanopsina de galinha desenvolvidos em coelho. Também foi feita a quantificação da concentração das proteínas OPN4x, CLOCK e TIROSINA HIDROXILASE através da técnica de Western Blot. A quantificação do RNAm em escuro constante não apresentou ritmos de transcrição para nenhum gene. Já as células mantidas em fotoperíodo 12C:12E apresentaram padrões rítmicos de transcrição para Clock, Per2, Opn4m, N-Acetiltransferase e Tirosina Hidroxilase. Glutamato 100 &#956;M foi eficaz em induzir ritmo em Clock, e inibiu drasticamente a expressão de Tirosina Hidroxilase e, apenas mais pontualmente, de Opn4x e Opn4m. Ensaios de viabilidade celular e fragmentação de DNA por citometria de fluxo demonstraram que essa inibição não foi resultante de ação tóxica ou apoptótica do glutamato. O neurotransmissor não teve qualquer efeito sobre a transcrição de Per2 e de N-Acetiltransferase. A quantificação protéica não indicou a presença de ritmo para CLOCK, OPN4x ou TIROSINA HIDROXILASE. A grande variabilidade inter-ensaios nos resultados de quantificação protéica sugere uma menor sensibilidade e precisão para esse método, quando comparado a PCR quantitativo. Nossos resultados indicam que as células de retina de embrião de 8 dias de galinha em cultura já contêm um relógio funcional, porém, este necessita do ciclo claro-escuro ou glutamato para sua sincronização. / The avian circadian system is composed by the retina, the mammalian homolog region of the supra-chiasmatic nucleus (SNC) and the pineal gland. The retina itself shows many rhythmic physiological events, such as movements of photoreceptor cells, opsin expression, retinaldehyde re-isomerization, melatonin and dopamine production and release. Altogether these rhythmic events are coordinated to predict environmental changes in light conditions during the day, optimizing retina function. In this work we investigated the expression of key components of a circadian system, including the two melanopsin genes, Opn4x, Opn4m, as well as the Clock, Per2, N-Acetyltransferase and Tyrosine Hidroxylase genes in chick embryo retinal cells. Primary cultures of chicken retina from 8-day-old embryos were prepared at ZT0 (lights on) and seeded at the density of 107 cells per 25 cm2 culture flask. The cells were kept in a humidified incubator in a 5% CO2 atmosphere at 40o C in constant dark, in 12L:12D, in 12L:12D followed by constant dark, or in constant dark in the absence or presence of 100 &#956;M glutamate for 12 h starting at ZT0 of the fifth day in vitro. Total RNA extraction was performed along 24 hours every three hours starting at ZT0 of the sixth day. The samples were submitted to RT-PCR followed by quantitative PCR for mRNA quantification. To analyze the Opn4x expression in these cells we performed an immunocytochemistry analysis with antibodies anti-chicken melanopsin developed in rabbit. We also quantified the protein levels of OPN4x, CLOCK AND TYROSINE HYDROXYLASE by Western Blot. The mRNA quantification showed no rhythm of transcription for any gene in cells kept in constant dark. However under a light-dark cycle, Clock, Per2, Opn4m, N-Acetyltransferase and Tyrosine Hydroxylase presented rhythm patterns of transcription. 100 &#956;M glutamate was able to induce rhythmic expression of Clock, and strongly inhibited the expression of Tyrosine Hydroxylase and, just punctually, of Opn4x and Opn4m. Assays of cell viability and DNA fragmentation using flow cytometry demonstrated that the inhibition did not result of glutamate toxic or apoptotic actions. The neurotransmitter had no effect on Per2 and N-Acetyltransferase transcription. Protein quantification by Western Blot showed no rhythmic oscillation of CLOCK, OPN4x or TYROSINE HYDROXYLASE. The great variability inter-assays seen in the results of protein quantification suggests that this method is less precise and sensitive than quantitative PCR. The present data show evidences that chicken embryonic retinal cells contain a functional circadian Clock. However light-dark cycle or glutamate stimuli are needed to its synchronization.

Encontramos no bulbo diversos núcleos, assim como diversos neurotransmissores, relacionados com a manutenção da pressão arterial. Dentre os núcleos, o núcleo do trato solitário se destaca por ser um dos principais moduladores do sistema nervoso autônomo, sendo o primeiro a receber aferências dos barorreceptores e encaminhá-los para diversos outros núcleos. Dentre estes neurotransmissores, encontramos o glutamato e as catecolaminas, sendo ambos essenciais para a manutenção da pressão arterial. É sabido que a atuação de transmissores em células do sistema nervoso pode levar a alterações em outras vias de neurotransmissão, alterando assim a resposta das células a estímulos. Levando em consideração a importância do glutamato e das catecolaminas na modulação da pressão arterial, e que tanto os receptores glutamatérgicos quanto catecolaminérgicos podem interferir no metabolismo celular e gerar mudanças estruturais nos neurônios, cogitamos que a atuação do sistema glutamatérgico poderia modular o sistema catecolaminérgico. Neste trabalho, avaliamos se o sistema glutamatérgico e catecolaminérgico podem interagir em culturas de células do bulbo de ratos neonatos, a partir de tratamentos das culturas com glutamato ou noradrenalina. Observamos que o tratamento destas culturas com glutamato leva a uma redução nos níveis de proteína e de mRNA da enzima tirosina hidroxilase e do receptor _2 adrenérgico. A modulação do sistema glutamatérgico a partir de tratamentos com noradrenalina não mostrou variações significativas. Concluímos que o sistema glutamatérgico pode modular o sistema catecolaminérgico em células do bulbo de ratos neonatos, e que esta modulação pode ser importante na regulação da pressão arterial pelos núcleos bulbares. / It is found in the medulla oblongata several nuclei, as well as several neurotransmitters, related with the maintenance of the arterial pressure. Among these nuclei, the nucleus of the solitary tract stands aside for being one of the main modulators of the autonomic nervous system, being the first to receive afferences from baroreceptors and to send their stimuli to other nuclei. Among these neurotransmitters, glutamate and the catecholamines are both essentials to the maintenance of the arterial pressure. It is known that the stimulation of brain cells by neurotransmitters can result in changes in other neurotransmitter pathways, changing the cell response to certain stimuli. Taking in consideration the importance of glutamate and the catecholamines in the modulation of the arterial pressure, and that both of them can interfere in the cellular metabolism and create structural changes in neurons, we have speculated that the stimulation of the glutamatergic system could modulate the catecholaminergic system. In this work, it was evaluated if the glutamatergic and catecholaminergic systems could interact in cell cultures of the medulla oblongata of newborn rats, from treatments of the cultures with glutamate or noradrenaline. It was found that the treatment of these cultures with glutamate leads to a reduction in the protein and mRNA levels of the enzyme tyrosine hydroxylase and the receptor _2 adrenergic. The modulation of the glutamatergic system from treatments with noradrenaline did not show significative variation. We concluded that the glutamatergic system can modulate the catecholaminergic system in medulla oblongata cell cultures, and that this modulation can be important in the regulation of the arterial pressure by nuclei present in the medulla oblongata.

D.L. A 454-2007

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Generalitat Valenciana (GV-1170793); CICYT (PB95-0695)