Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les Rotavirus appartiennent à la famille des Reoviridae, famille du groupe III des virus à ARN double brin. Identifiés en 1973 par Ruth Bishop, ces virus non enveloppés sont la première cause de diarrhée aiguë sévère du jeune enfant dans le monde. La capside virale icosaédrique est constituée de 3 couches protéiques de structure : la couche externe formée par la glycoprotéine VP7 d’où émergent les spicules de protéine VP4, la couche intermédiaire constituée par la protéine VP6 représentant près de 50 % du poids du virus et enfin, la couche interne appelée core, résultant de l’assemblage des protéines VP2, d’où émergent vers l’intérieur les protéines VP1 et VP3. Cette capside renferme un génome divisé en 11 segments d’ARN bicaténaires. A ces 6 protéines structurales s’ajoutent les protéines non structurales qui interviennent lors de la réplication du virus. Les deux protéines structurales, VP4 et VP7 sont essentielles pour la fixation de la particule triple couche (TLP) aux membranes des cellules hôtes, par interaction aux récepteurs intégrines, elle sont également impliqués dans la déstabilisation des membranes endosomales, indispensable à la libération de la particule double couche (DLP) infectieuse dans le cytoplasme. Actuellement, contrairement au mécanisme d’action de la protéine VP5*, celui de la glycoprotéine VP7 est inconnu. L’objectif de cette thèse, a été de comprendre le mécanisme moléculaire de déstabilisation des membranes par les peptides dérivés de VP7. Dans un premier temps nous avons montré, par des études in silico, l’existence d’un domaine prédit en hélice membranaire bordé de résidus arginine et lysine hautement conservés, situé à l’extrémité C-terminale de la glycoprotéine VP7. Ces résultats ont conduit à la synthèse de quatre peptides avec lesquels des tests de perméabilisation de membranes modèles de larges vésicules unilamellaires (LUVs) ont été menés. Ceux-ci ont permis d’identifier le domaine minimum le plus actif, VP723, parmi les peptides sélectionnés. Dans un second temps nous avons déterminé la structure de ces peptides par RMN, dans des conditions mimant l’environnement hydrophobe de la membrane. Le peptide minimal VP723 s’organise en hélice α-amphipathique, structure souvent impliquée dans la déstabilisation des membranes cellulaires. La comparaison de sa structure obtenue par RMN à celle du domaine correspondant dans la structure cristallographique de la protéine native montre le réarrangement conformationnel de ce segment après maturation par la trypsine. Ces résultats ont été confirmés par deux mutants de synthèse, dont l’un est inactif pour la perméabilisation des membranes modèles. Ces travaux ont été complétés par des expériences de Résonance Plasmonique aux Ondes guidée (PWR). Des études par RMN du solide sont en cours afin de déterminer l’orientation du peptide dans les membranes modèles. En conclusion, nos résultats mettent en évidence l’importance du domaine C-terminal VP723 de la protéine VP7 dans la déstabilisation des membranes, permettant d’assurer la translocation de la particule virale infectieuse (DLP) de l’endosome vers le cytoplasme. Un modèle du mécanisme d’entrée du virus, médié par les peptides dérivés de la maturation par la trypsine de la glycoprotéine VP7 est proposé. / Rotaviruses belong to the Reoviridae family, belonging to the group III of dsRNA viruses. Identified in 1973 by Ruth Bishop, these non-enveloped viruses are the leading cause of severe diarrhea in young children worldwide. The icosahedral capsid is composed of three structural protein layers: the outer one, formed by the glycoprotein VP7, emerges spicules protein VP4, the intermediate one consists of VP6 protein representing nearly 50% of the weight of the virus and finally, the inner one called core, results from the assembly of proteins VP2, emerges towards the inside of proteins VP1 and VP3. The capsid contains a genome divided into 11 segments of dsRNA. To these six structural proteins are added nonstructural proteins involved in virus replication. The two structural proteins, VP4 and VP7, are involved in the interaction of the triple layer particle (TLP) to integrin receptors, necessary for the release of the infectious double layer particle (DLP) into the cytoplasm following the permeabilization of the membrane of the endosome compartments. Currently, unlike the mechanism of action of the protein VP5*, the glycoprotein VP7 remains unknown. The objective of this work was to understand the molecular mechanism involved in the destabilization of membranes by peptides derived from VP7. In a first step, we have shown, by in silico studies, the existence of a helical trans-membrane domain predicted containing a highly conserved arginine and lysine residues, located at the C-terminus of the VP7 glycoprotein. These results led to the synthesis of four peptides with which permeabilizing tests of model membranes were conducted. We have identified the minimum of the most active domain, named VP723, among the selected peptides. In a second step, we determined the structure of these peptides by NMR under conditions mimicking the hydrophobic environment of the membrane. The VP723 peptide is organized like an α-helical amphipathic structure often involved in the destabilization of cell membranes. The comparison of the structure obtained by NMR to that of the corresponding domain in the crystallographic structure of the native protein shows a conformational rearrangement of the segment after trypsin maturation. These results were confirmed by two synthetic mutants, one of which is inactive for the permeabilization of model membranes. These studies were complemented by experiments Plasmon Resonance guided the Waves (PWR). Studies by solid state NMR are in progress to determine the orientation of the peptide in model of membranes. In conclusion, our results highlight the importance of the C-terminal domain of the VP7 protein, named VP723, in the destabilization of membranes, to ensure the translocation of the infectious viral particle (DLP) from the endosome into the cytoplasm compartments. A mechanism of virus entry mediated by peptides derived from trypsin maturation of the VP7 glycoprotein is proposed in this study.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La glycoprotéine M (gM) est une protéine virale transmembranaire qui est conservée dans la famille des Herpesviridae. Malgré son rôle non essentiel in vitro chez la plupart des virus de la sous-famille des Alphaherpesvirinae, dont l’herpès simplex de type 1 (VHS-1), gM est impliquée à plusieurs étapes de leur cycle viral et sa déplétion entraine une diminution de la production virale. Pour effectuer ses diverses fonctions, gM est ciblée dynamiquement à plusieurs compartiments cellulaires au cours de l’infection, dont le noyau, le réseau trans-Golgi et la membrane plasmique. Chez le VHS-1, gM est la première glycoprotéine détectée aux membranes nucléaires, et ce, dès 4 heures après le début de l’infection. Des expériences effectuées précédemment dans notre laboratoire ont démontré que la localisation de gM au noyau à 4hpi est un processus actif, viral-dépendant et spécifique qui succède sa traduction au réticulum endoplasmique. Or, sa fonction au noyau n’est toujours pas élucidée, ni le mécanisme lui permettant d’atteindre ce compartiment tôt durant l’infection. D’ailleurs, aucun des partenaires d’interaction connus de gM n’a été identifié comme participant à ce ciblage, soulevant des questions quant au mécanisme utilisé par la glycoprotéine virale pour atteindre le noyau. Notre hypothèse est que gM emprunte le transport nucléocytoplasmique de la cellule pour être activement ciblée à la membrane nucléaire interne par l’intermédiaire des importines. Afin d’étudier le rôle des importines dans la localisation de gM tôt dans l’infection, chaque importine a été déplétée par ARN interférent dans des cellules 143B. À la suite d’une infection de 4h, la localisation de gM a été déterminée par microscopie confocale suivie d’analyses qualitatives en 2D et en 3D. Les résultats obtenus suggèrent que les importines ne participent pas significativement au ciblage de gM aux membranes nucléaires à cette étape de l’infection. Ces observations ouvrent la porte à d’autres mécanismes de transport qui devront être étudiés afin de mieux comprendre le ciblage de gM à ce compartiment et, éventuellement, y déterminer son ou ses rôles dans le cycle viral de l’herpès. / Glycoprotein M (gM) is a viral transmembrane protein that is conserved in the Herpesviridae family. Despite its non-essential role in vitro in most viruses of the Alphaherpesvirinae subfamily, including herpes simplex virus type 1 (HSV-1), gM is involved at several stages of their viral cycle and its depletion leads to a decrease in viral production. To perform its various functions, gM is dynamically targeted to several cellular compartments during infection, including the nucleus, the trans-Golgi Network and the plasma membrane. In HSV-1, gM is the first glycoprotein detected at nuclear membranes as early as 4 hours after the onset of infection. Previous experiments conducted in our laboratory have shown that the localization of gM to the nucleus at 4hpi is an active, viral-dependent and specific process that follows its translation at the endoplasmic reticulum. However, its function at the nucleus is still not elucidated, nor is the mechanism by which it reaches this compartment early during infection. Moreover, none of gM's known interacting partners have been identified as participants in this targeting, raising questions about the mechanism used by the viral glycoprotein. Our hypothesis is that gM takes advantage of the nucleocytoplasmic transport of the cell to be actively targeted to the inner nuclear membrane via importins. In order to study the role of the importins in the localization of gM early in the infection, each importin was depleted by interfering RNA in 143B cells. After a 4-hour infection, gM localization was determined by confocal microscopy followed by 2D and 3D qualitative analysis. The results obtained from these experiments suggest that importins do not significantly participate in the targeting of gM to nuclear membranes at 4hpi. These observations open the door to other transport mechanisms that will need to be studied in order to better understand the targeting of gM to this compartment and to eventually determine its role(s) in the herpes viral cycle.

Les lactones macrocycliques (LM) sont des anthelminthiques (AH) à effet paralysant très utilisés chez les animaux et les humains contre les nématodes parasites. Cependant, leur succès thérapeutique est compromis par la résistance croissante aux LM, qui pourrait être en partie dû aux ABC transporteurs P-glycoprotéines (Pgps) sélectionnés et surexprimés chez les nématodes résistants aux LM. Dans ce travail, nous avons étudié plus précisément la P-glycoprotéine 13 du parasite de petits ruminants, Haemonchus contortus. Son orthologue chez le modèle nématode C. elegans, Cel-Pgp-13, est exprimé dans les amphides, structures qui ont été associées à la sensibilité aux AH chez C. elegans et H. contortus. Pour prédire la capacité des Pgps de nematode à transporter des drogues, incluant des LM et autres AH, nous avons développé un modèle de docking in silico. Nous avons utilisé la structure cristallographique de C. elegans Pgp-1 (Cel-Pgp-1), et nous avons montré la liaison avec une forte affinité de plusieurs ligands décrits comme activateurs de sa fonction ATPasique. Nous avons aussi décrit une forte affinité des LM, et un site spécifique de liaison de ces composés à Cel-Pgp-1. Cette approche représente un outil important pour prédire les interactions entre AH, et pour concevoir rationnellement de nouveaux inhibiteurs compétitifs des Pgps de nématode, dans le but d'améliorer les stratégies thérapeutiques. Sur la base de cette approche, nous avons prédit la structure 3D de Hco-Pgp-13 à partir du cristal de Cel-Pgp-1 afin d'étudier son intéraction avec des substrats potentiels, en particulier les LM. Nous avons trouvé des affinités similaires pour différents composés précédemment testés sur Cel-Pgp-1. In vitro, la mesure de l'activité ATPasique montre que l'actinomycine D est un substrat de Hco-Pgp-13. Nos données démontrent la présence possible d'un domaine de reconnaissance multispécifique sur ce transporteur de parasite. La détermination par immunofluorescence de l'expression de Hco-Pgp-13 a montré une distribution tissulaire large indiquant que Hco-Pgp-13 pourrait jouer un role important dans le transport de substrats endogènes et/ou exogènes. En conclusion, ce travail permet de mieux comprendre le rôle des Pgps de nématodes dans le transport de médicaments AH, tant au niveau de l'organisme modèle C. elegans que du nématode parasite H. contortus. Cette étude suggère la conservation de la fonction de tranporteur ABC multidrogue dans ces espèces. La localisation de Hco-Pgp-13 sur les structures amphidiales, et son éventuelle implication dans la résistance aux médicaments et à la survie de H. contortus à l'exposition à des composés AH, restent à préciser. / Macrocyclic lactones (ML) are paralyzing anthelmintics used in animals and humans against parasite nematodes. However, their therapeutic success is compromised by the spread of ML resistance. This might be at least partly due to P-glycoproteins (Pgps) ABC transporters that are selected and overexpressed in ML-resistant nematodes. Deciphering the role of the 10 Pgps expressed in the parasite of small ruminants Haemonchus contortus is thus of major importance to guaranty anthelmintic (AH) efficacy of various drugs. Here we focused on Hco-Pgp-13 due to the expression in the amphids of its closest ortholog in the model nematode C. elegans. Indeed, the amphids represent a putative entry route of drugs to reach AH targets in the nervous system and have been linked to AH susceptibility in C. elegans and H. contortus. In order to predict the capacity of nematode Pgps to transport drugs, including ML and otherAH, we have developed an in silico drug docking model. We have used C. elegans Pgp-1 (Cel-Pgp-1) crystal structure and have showed a high affinity binding of several ligands that have been shown to be activators of its ATPase function. ML were also found to bind with high affinity to Cel-Pgp-1, on a specific binding site. This approach provides a valuable tool to predict drug-drug interactions and to rationally design new competitive inhibitors of nematode Pgps, in order to improve anthelmintic therapeutics. We then predicted a putative 3D structure of Hco-Pgp-13 based on the recently released crystal of Cel-Pgp-1, with which it presented a high homology. This allowed the study of the interaction of Hco-Pgp-13 with potential substrates, in particular ML. We found similar affinities for various drugs previously tested on Cel-Pgp-1, supporting the good homology of these two proteins. Together with in vitro ATPase assay experiments that confirmed the substrate status of actinomycin D, this indicates a possible multispecifc recognition capacity of this parasitic transporter. The determination of Hco-Pgp-13 localization using immunohistochemistry showed a wide tissue expression consistent with a critical role for Hco-Pgp-13 in endogenous and/or exogenous substrate transport. In conclusion, this work provides insights into the role of nematode Pgps in transporting AH drugs, both at the level of the model organism C. elegans and of the parasitic nematode H. contortus. This suggests a high homology of function conserved between ABC tranporters in these species. The localization of such protein on amphidial structures and its possible involvement in drug resistance and survival of H. contortus to exposure to AH compounds remain to be precised.

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La prédiction des paramètres pharmacocinétiques/toxicocinétiques (PK/TK), tels que la clairance intrinsèque (CLint) et la clairance hépatique (CLh) des médicaments, demeure un défi majeur en modélisation quantitative. Selon « l’hypothèse du médicament libre », seul le médicament libre peut traverser la membrane plasmique et la CLh de ce médicament est calculée en fonction de sa fraction libre (fup). Néanmoins, la captation hépatique facilitée par l’albumine (ALB) représente clairement une violation de « l’hypothèse du médicament libre ». Cette captation hépatique se base sur la possibilité que le complexe ALB-médicament puisse assurer un apport supplémentaire en médicament aux hépatocytes. Ainsi, cela pourrait expliquer en grande partie les sous-prédictions observées de CLh. Par ailleurs, certains médicaments peuvent se lier fortement à plusieurs protéines plasmatiques telles que l’ALB et l’alpha-1-glycoprotéine acide (AGP). Ainsi, la forte liaison d’un même médicament à l’ALB, à l’AGP, ou aux deux, pourrait avoir des répercussions bien distinctes sur la prédiction de ces paramètres PK/TK. Cependant, aucune étude n’a été faite pour simuler la différence entre leurs effets. L’objectif principal de cette thèse est donc d’évaluer (avec plus d’exactitude et de précision), pour une série de médicaments, en condition in vivo (ou in situ), ces répercussions en présence des deux protéines plasmatiques, conjointement ou séparément. En outre, il est indispensable de vérifier si une approche générique en modélisation peut être appliquée. Cette thèse est répartie en trois objectifs spécifiques. Le premier est de proposer un arbre décisionnel pour faciliter la sélection des approches prédictives appropriées de CLhin vivo pour des médicaments ayant des caractéristiques différentes. Le second est d’évaluer les répercussions de fortes liaisons aux deux protéines plasmatiques ALB et AGP sur la CLh de deux xénobiotiques choisis (perampanel (PER) et fluoxétine (FLU)) ; ces médicaments ont de fortes affinités pour les deux protéines et un métabolisme exclusif (ou prédominant) dans le foie. Et, le dernier est de développer et valider un nouveau modèle prédictif de CLh pour les xénobiotiques ayant le potentiel de se lier fortement dans le plasma, à l’ALB ainsi qu’à l’AGP. Dans un premier temps, des données in vitro rapportées chez l’humain ont été colligées pour 19 médicaments (substrats des transporteurs OAT2 et OATP1B1), et ont été ensuite utilisées dans six modèles d’extrapolation in vitro-in vivo (IVIVE) pour prédire lesdits paramètres. Après une comparaison statistique, les résultats ont montré que l’approche 2 (c’est-à-dire « fup-adjusted model ») qui se base sur la captation hépatique facilitée par l’ALB, avait la meilleure performance prédictive. Cependant, l’approche 5 (c’est-à-dire « Extended Clearance Model ») qui se base sur le transport facilité, en était une très pertinente à appliquer pour les substrats de transporteurs membranaires. Lesdits substrats seraient potentiellement moins affectés par l’ALB. Ainsi, un arbre décisionnel a été proposé pour choisir rapidement et judicieusement la meilleure approche IVIVE servant à prédire la CLhin vivo pour chaque xénobiotique en présence de l’ALB. Dans un deuxième temps, les médicaments PER et FLU ont été sélectionnés à partir d’une collecte de données (N= 1907 médicaments) en fonction de certains critères (avoir un métabolisme exclusif ou prédominant dans le foie, pas de transport facilité par les transporteurs membranaires, une haute affinité pour les deux protéines ALB et AGP, et un ratio de liaison à l’AGP sur celle à l’ALB proche de l’unité). Cette sélection a été réalisée pour faire des expériences sur des foies isolés et perfusés de rats (IPRL), en présence et en absence des protéines ALB et AGP (c’est-à-dire quatre scénarios IPRL). Les résultats IPRL ont démontré que PER est faiblement à moyennement métabolisé (extraction hépatique= 0,2-0,7), tandis que FLU est fortement métabolisé (extraction hépatique= 0,8-0,99). Le modèle Michaelis-Menten a été ajusté aux cinétiques métaboliques, et différents paramètres Vmax, Km et Km, u ont été obtenus de ce modèle. À de faibles concentrations libres pour les deux médicaments (c’est-à-dire à des concentrations thérapeutiques) et en présence des protéines plasmatiques, les valeurs de CLint non liée ont augmenté pour PER (avec l’ALB et le mélange des deux protéines (MIX)) et FLU (avec l’ALB, l’AGP et le MIX) par rapport à celles obtenues du scénario sans protéine (sauf pour PER avec AGP, lesdites valeurs ont diminué). Par ailleurs, les calculs des ratios CLint (SANS versus AVEC protéine) ont permis d’indiquer l’occurrence d’une facilitation de la captation hépatique de médicaments par l’ALB ou l’AGP. Ces ratios ont aussi permis de vérifier si la cinétique métabolique pour PER et FLU suivait soit « l’hypothèse du médicament libre » soit celle de « la captation hépatique facilitée par les protéines plasmatiques ». Dans un dernier temps, une nouvelle approche prédictive de CLh (approche WO-to-MIX) est développée en se basant sur une nouvelle notion de liaison fractionnelle et en intégrant dans le « fup-adjusted model » de nouveaux paramètres tels que la fraction liée à l’ALB (fB-ALB) et celle liée à l’AGP (fB-AGP) à partir du scénario MIX. Ce modèle est basé sur la captation facilitée par l’ALB. Contrairement à l’approche WO-to-MIX, le « well-stirred model » (ou modèle conventionnel) est basé sur l’hypothèse du médicament libre. Ensuite, les paramètres Vmax et Km obtenus in situ pour PER et FLU lors des expériences IPRL sans protéines, ont été utilisés en combinaison avec le paramètre intrant de la fraction libre ajustée (fup-adjusted) pour le « fup-adjusted model » ou avec la fraction libre (fup) pour le « well-stirred model ». Une comparaison des performances prédictives globales des deux modèles a été faite. Les performances prédictives du nouveau modèle étaient prometteuses, en particulier pour FLU qui montrait le plus haut degré de captation hépatique médiée par l’ALB, par rapport au modèle conventionnel. L’approche WO-to-MIX est une première validation d’un nouveau modèle d’extrapolation proposé pour les médicaments comme FLU qui se lient à l’ALB et à l’AGP. Néanmoins, le modèle conventionnel reste utile à utiliser pour les médicaments comme PER. L’exactitude de prédiction était inférieure pour ce dernier médicament probablement parce que la captation hépatique par l’ALB ne semble pas être maximale, et, par conséquent, l’utilisation de fup-adjusted a surestimé la CLhin vivo. Par conséquent, plus de travail est nécessaire en particulier pour PER. Cette thèse démontre qu’une seule approche générique pour prédire la CLh n’existe pas. Néanmoins, le choix d’une approche IVIVE ayant une performance prédictive satisfaisante est maintenant possible. Les résultats de cette thèse contribuent à : 1) mieux comprendre les répercussions sur les paramètres PK/TK de la forte liaison des médicaments à l’ALB et à l’AGP ; 2) choisir la meilleure approche prédictive de CLh sur la base de l’affinité du xénobiotique (médicament ou contaminant) pour chacune des protéines plasmatiques et des mécanismes impliqués dans le foie ; et 3) prédire la CLh avec précision et exactitude des xénobiotiques qui se lient aux deux protéines plasmatiques. Ces approches IVIVE pour la CLh pourront assurément être intégrées dans des modèles PK/TK à base physiologique pour les xénobiotiques afin d’améliorer la prédiction de leur pharmacocinétique et d’accélérer le processus de développement de médicaments. / The prediction of pharmacokinetic/toxicokinetic (PK/TK) parameters such as intrinsic clearance (CLint) and hepatic clearance (CLh) for highly bound drugs is a major challenge in quantitative modeling. According to the ‘free drug hypothesis’, only the free drug can pass through the plasma membrane and the CLh of this drug is calculated according to its free fraction (fup). Nevertheless, the hepatic uptake facilitated by albumin (ALB) is a violation of the ‘free drug hypothesis’. This facilitated hepatic uptake is based on the possibility that the ALB-drug complex may provide additional drug intake to the hepatocytes. Thus, this could largely explain the underpredictions of CLh. In addition, some drugs can bind extensively in plasma, and to several plasma proteins such as ALB and alpha-1-glycoprotein acid (AGP). Thus, the high binding of the same drug to either ALB or AGP, or to both, could have distinct impacts on the prediction of these PK/TK parameters. However, no study has yet explored how to simulate the difference between these impacts. The main objective of this thesis is therefore to evaluate (with accuracy and precision) for a series of drugs, in the in vivo (or in situ) condition, these impacts in the presence of the two plasma proteins, jointly or separately. Also, it is important to verify if a generic model can be applied. This thesis is divided into three specific objectives. The first is to propose a decision tree to facilitate the selection of appropriate predictive approaches of CLhin vivo for drugs with different characteristics. The second is to assess the impacts of extensive binding to the two plasma proteins ALB and AGP on the CLh of two selected xenobiotics (perampanel (PER) and fluoxetine (FLU)); these drugs have strong affinities to both proteins and an exclusive (or predominant) metabolism in the liver. And the last objective is to develop and validate a new predictive model of CLh for xenobiotics with the potential to bind extensively to ALB as well as to AGP. Firstly, in vitro data obtained in humans were collected for 19 drugs (i.e. substrates of OAT2 and OATP1B1 transporters) and were then used in six in vitro-to-in vivo (IVIVE) extrapolation models to predict these PK/TK parameters. After a statistical comparison, the results showed that the approach 2 (i.e. ‘fup-adjusted model’) that is based on the ALB-facilitated hepatic uptake, had the best predictive performance. However, the approach 5 (i.e. ‘Extended Clearance Model’) that is based on the membrane transporter-mediated uptake, was very relevant to apply for the substrates of membrane transporters. These substrates would potentially be less affected by ALB. Thus, a decision tree has been proposed to quickly and judiciously select the best IVIVE approach to predict CLhin vivo for each xenobiotic in the presence of ALB. Secondly, the PER and FLU drugs were selected from a data collection of 1907 drugs depending on certain criteria (exclusive or predominant metabolism in the liver, no transport facilitated by membrane transporters, high affinity for the two proteins ALB and AGP, and having a binding ratio between AGP and ALB close to the unity). This selection was made to conduct experiments using the isolated and perfused rat liver (IPRL) apparatus, in the presence, and in the absence of the ALB and AGP proteins (i.e. four IPRL scenarios). The IPRL results showed that PER is low to moderately metabolized (hepatic extraction= 0.2-0.7), while FLU is highly metabolized (hepatic extraction= 0.8-0.99). The Michaelis-Menten model was fitted to the obtained metabolic kinetics, and different parameters Vmax, Km and Km, u were obtained from the model. At low free concentrations for both drugs (i.e. therapeutic concentrations) and in the presence of plasma proteins, the values of unbound CLint increased for PER (with ALB and the mixture of the two proteins (MIX)) and FLU (with ALB, AGP and MIX); when compared to those obtained from the protein-free scenario (except for PER with AGP, the unbound CLint values decreased). In addition, the calculations of CLint ratios (WITHOUT versus WITH protein) indicated the occurrence of a hepatic uptake facilitated by ALB or AGP. These ratios also helped in verifying whether the metabolic kinetics for PER and FLU followed either ‘the free drug hypothesis’ or that of ‘plasma protein-facilitated hepatic uptake’. Finally, a new predictive approach of CLh (WO-to-MIX approach) was developed based on a new notion of fractional binding and incorporating new parameters such as the ALB bound fraction (fB-ALB) and the AGP bound fraction (fB-AGP) from the MIX scenario into the ‘fup-adjusted model’. This model is based on the ‘ALB-facilitated hepatic uptake’. Unlike the WO-to-MIX approach, the ‘well-stirred model’ is based on ‘the free drug hypothesis’. Then, the Vmax and Km parameters that were obtained in situ for PER and FLU from the protein-free IPRL experiments, were used in combination with the fup-adjusted input parameter for the ‘fup-adjusted model’ or with the free fraction (fup) for the ‘well-stirred model’. A comparison of the two models’ overall predictive performances was made. The predictive performances of the new model were promising for FLU, which showed the highest degree of ‘ALB-mediated hepatic uptake’, compared to the conventional model. This WO-to-MIX approach is a first validation of a novel extrapolation model suggested for drugs such as FLU that bind to both ALB and AGP. The well-stirred model remains however a useful tool to predict the clearance for drugs such as PER. The prediction accuracy was lower for the latter drug probably because the ALB-mediated hepatic uptake does not seem to be maximal, and, hence, the use of fup-adjusted has overestimated its CLhin vivo. Therefore, more work is needed particularly for PER. This thesis shows that a generic approach to predict the CLh in vivo does not exist. Nevertheless, the choice of an IVIVE approach with satisfactory predictive performances is now possible. The results of this thesis contribute to: 1) better understand the impacts on the PK/TK parameters of extensive drug binding to ALB and AGP; 2) choose the best predictive approach to CLh based on the affinity of xenobiotic (drug or contaminant) to each of the plasma proteins and the mechanisms involved in the liver; and 3) predict accurately and with precision the output CLh of xenobiotics that bind to the two plasma proteins. These IVIVE approaches for CLh can certainly be integrated into physiologically based PK/TK models for xenobiotics to improve the prediction of their pharmacokinetics and to accelerate the drug development process.

Les syndromes démyélinisants acquis (SDA) pédiatriques sont un groupe de maladies qui affectent la substance blanche (SB) et la substance grise (SG) du système nerveux central (SNC) chez les enfants, et qui partagent certaines caractéristiques et mécanismes pathologiques. Les SDA peuvent être monophasiques ou récurrents. Les SDA comprennent des maladies telles que l'encéphalomyélite aiguë disséminée (EMDA), les troubles du spectre de la neuromyélite optique (TS-NMO), la sclérose en plaques (SEP) et le syndrome démyélinisant récurrent avec anticorps contre la glycoprotéine oligodendrocytique de myéline (anticorps anti-MOG). Ce dernier syndrome, appelé aussi maladie MOG+, a été reconnu récemment comme une entité distincte faisant partie des maladies démyélinisantes récurrentes chez les enfants. La maladie MOG+ présente des caractéristiques semblables à celles de la SEP; en effet, certains cas ont été déjà considérés comme une forme « atypique » de SEP. La maladie MOG+ et la SEP partagent des lésions dans la SB du SNC, mais la SEP est caractérisée aussi par des lésions corticales (LCs) cérébrales, insuffisamment étudiées dans la maladie MOG+. Par conséquent, le but de cette recherche a été de comparer les caractéristiques démographiques et des lésions cérébrales visibles sur des études d’imagerie par résonance magnétique (IRM) chez les enfants atteints de SEP et ceux atteints de la maladie MOG+. Pour atteindre cet objectif, nous avons utilisé des scans IRM 3T, incluant les contrastes pondérés T1, FLAIR et des images de transfert de magnétisation (ITM) de 14 enfants atteints de SEP et 13 enfants atteints de la maladie MOG+. Nous avons mesuré le nombre des LCs, le volume des lésions dans la SB et les valeurs normalisées d’ITM dans les LCs et les lésions de la SB. Nos résultats ont montré que les enfants atteints de la maladie MOG+ étaient plus jeunes au début de la maladie et que celle-ci présentait une durée plus longue que la maladie du groupe SEP. Quant aux lésions cérébrales, les LCs étaient présentes dans la maladie MOG+, mais leur nombre était significativement plus élevé dans le groupe SEP. Cependant, les valeurs normalisées d’ITM dans ces lésions (valeurs qui sont sensibles à la quantité de myéline) n'étaient pas significativement différentes entre les deux groupes. En plus, le volume des lésions de la SB était significativement plus élevé dans le groupe SEP et les valeurs normalisées d’ITM dans ces lésions, significativement inférieures comparativement à la maladie MOG+, témoignant ainsi d’une démyélinisation plus sévère et des différences potentielles dans les mécanismes de démyélinisation. / Pediatric Acquired Demyelinating Syndromes (ADS) are a group of diseases that affect the white matter (WM) and gray matter (GM) of the central nervous system (CNS) in children and that share similar pathological characteristics and mechanisms. ADS can be monophasic or recurrent. The ADS include diseases like acute disseminated encephalomyelitis (ADEM), neuromyelitis optic spectrum disorders (NMO-SD), multiple sclerosis (MS) and Relapsing Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) syndrome or MOG+ disease, which has been recently recognised as a distinct pathology and is part of the relapsing ADS in children. MOG+ disease shares features with MS; indeed, some MOG+ cases have been considered as an “atypical” form of MS until recently. Both MOG+ disease and MS present lesions in the WM of the CNS. MS is also characterized by focal brain cortical lesions (CL), which have not been extensively studied in MOG+ disease yet. For this reason, the aim of this research project was to compare the demographic and brain magnetic resonance imaging (MRI) characteristics of children with MS and children with MOG+ disease. To achieve our goal, we used 3T MRI including T1-weighted, FLAIR and magnetization transfer ratio (MTR) contrasts of 14 MS participants, and 13 relapsing MOG+ participants. CL counts, WM lesion volumes, normalized MTR values in CLs, and WM lesions were compared across groups. Our results show that children with MOG+ disease were younger at disease onset and had a longer disease duration compared to the MS group. CL were present in MOG+ participants, but counts were significantly higher in the MS group. However, their normalized-MTR values, which are sensitive to myelin, were not significantly different between both groups. WM lesion volumes were significantly higher in the MS group, but their normalized MTR values were significantly lower than in MOG+ WM lesions, likely reflecting more severe demyelination and potential differences in the demyelinating mechanism.