Monotopic proteins represent a specialized group of membrane proteins in that they are engaged in biochemical events taking place at the membrane interface. In particular, the monotopic lipid-synthesizing enzymes are able to synthesize amphiphilic lipid products by catalyzing two biochemically distinct molecules (substrates) at the membrane interface. Thus, from an evolutionary point of view, anchoring into the membrane interface enables monotopic enzymes to confer sensitivity to a changing environment by regulating their activities in the lipid biosynthetic pathways in order to maintain a certain membrane homeostasis. We are focused on a plant lipid-synthesizing enzyme DGD2 involved in phosphate shortage stress, and analyzed the potentially important lipid anchoring segments of it, by a set of biochemical and biophysical approaches. A mechanism was proposed to explain how DGD2 adjusts its activity to maintain a proper membrane. In addition, a multivariate-based bioinformatics approach was used to predict the lipid-binding segments for GT-B fold monotopic enzymes. In contrast, a soluble protein Myr1 from yeast, implicated in vesicular traffic, was also proposed to be a membrane stress sensor as it is able to exert different binding properties to stressed membranes, which is probably due to the presence of strongly plus-charged clusters in the protein. Moreover, a bacterial monotopic enzyme MGS was found to be able to induce massive amounts of intracellular vesicles in Escherichia coli cells. The mechanisms involve several steps: binding, bilayer lateral expansion, stimulation of lipid synthesis, and membrane bending. Proteolytic and mutant studies indicate that plus-charged residues and the scaffold-like structure of MGS are crucial for the vesiculation process. Hence, a number of features are involved governing the behaviour of monotopic membrane proteins at the lipid bilayer interface. / At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 3: Manuscript. Paper 5: Manuscript.

Diss. (sammanfattning) Göteborg : Univ., 2009. / Härtill 4 uppsatser.

A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é a única enzima capaz de catalisar a reação de ciclização a partir do amido e, assim, formar oligossacarídeos cíclicos conhecidos como ciclodextrinas (CDs). Através desta reação é produzida uma mistura de α-, β- e γ-CD que, respectivamente, contém 6, 7 e 8 resíduos de glicose. As CDs têm atraído enorme atenção devido ao seu grande potencial de aplicação em diversas áreas da indústria. Potencial este proporcionado por sua estrutura cônica, com interior hidrofóbico, capaz de encapsular sólidos, líquidos e gases, conferindo propriedades importantes e protegendo-os. Neste trabalho foi estudada a imobilização de uma CGTase em sílica mesoporosa de forma direcionada às cisteínas presentes em sua superfície, alterando a exposição do sítio ativo. A ligação via cisteínas nativas da proteína aumentou em quatro vezes a eficiência da imobilização, quando comparada a ligação via grupamento amino. Esta, no entanto, apresentou maior atividade enzimática em faixas mais amplas de temperatura e pH, além de maior estabilidade operacional, mantendo 100 % de sua atividade após 200 h de reação contínua a 60 °C e pH 4. Ainda que apresentando menor estabilidade da ligação, o derivado obtido por ligação dissulfeto manteve 40 % da atividade inicial durante 200 h e então, o suporte pôde ser recarregado e reutilizado por igual período. Os suportes desenvolvidos apresentaram estabilidade satisfatória, possibilitando o uso do derivado imobilizado em reator de leito fixo operado de forma contínua. Quando avaliado em relação a produção das três ciclodextrinas principais, o derivado cuja imobilização da enzima ocorreu via grupamento amino, evidenciou a possibilidade de modulação da produção apenas variando as condições de reação. α- e β-CD foram produzidas preferencialmente em pH 8,0 e 2 min (3,44 mg mL-1 e 3,51 mg mL-1, respectivamente), enquanto que pH mais ácido (4,0) e maior tempo de reação (141 min) favoreceram a formação de γ-CD (3,35 mg mL-1), com baixa formação α-CD (0,75 mg mL-1). Por fim, os resultados deste estudo evidenciam a importância da imobilização da CGTase para a estabilização de sua estrutura a fim de aplicá-la em sistemas contínuos de produção de CDs onde é possível modular o perfil dos produtos gerados em função das condições de reação, aumentando assim a produtividade do biocatalisador. / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is the only enzyme capable of catalyzing the cyclization reaction from the starch and thus forming cyclic oligosaccharides known as cyclodextrins (CDs). Through this reaction, is produced a mixture of α-, β- and γ-CD containing, 6, 7 and 8 glucose residues respectively. Cyclodextrins (CD) have been attracting considerable attention because of its great potential for application in various areas of industry. This potential is provided by its conical structure with hydrophobic interior, capable of encapsulating solids, liquids and gases, changing important features and protecting them. In this work, the immobilization of CGTase in mesoporous silica was studied in a way directed to cysteines present on its surface, altering the exposure of the active site. The connection via native cysteine of the protein increased by four times the efficiency of immobilization compared to amino groups connection. The binding of amino groups, however, showed greater enzymatic activity in wider ranges of temperature and pH, and higher operational stability, while maintaining 100 % of its activity after 200 h of continuous reaction at 60 °C and pH 4. Although showing less stable connection, the derivative obtained by disulfide bond retained 40 % of the initial activity for 200 h and then, the support could be reloaded and reused for the same period. Developed supports showed satisfactory stability, enabling the use of the derivative assets in a packed bed reactor and operated continuously. It was demonstrated the possibility of modulating the CDs production just varying the reaction conditions, using the derivative of which the enzyme immobilization occurred via amino group, to evaluate the production of three main cyclodextrins. α- and β-CD were produced preferentially at pH 8.0 and 2 min (3.44 mg mL-1 and 3.51 mg mL-1, respectively), whereas the more acid pH (4.0) and longer reaction (141 min) favored the formation of γ-CD (3.35 mg mL-1 and 0.75 mg mL-1 of α-CD). Finally, the results of this study show the importance of the immobilization of CGTase to the stabilization of its structure in order to apply it in continuous CD production systems, where it is possible to modulate the profile of the products generated as a function of the reaction conditions, thus increasing the productivity of the biocatalyst.

Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é a enzima capaz de converter o amido e seus açúcares relacionados em ciclodextrinas (CDs) através da reação de ciclização. As CDs têm inúmeras aplicações na indústria farmacêutica, cosmética e de alimentos, devido à sua capacidade de encapsular moléculas hidrofóbicas dentro de sua cavidade. A CGTase de Thermoanaerobacter sp. é capaz de converter o amido em CDs sob condições de processo industrial, em temperaturas elevadas. A produção de CDs em escala industrial é feita, geralmente, em processos de batelada, nos quais é utilizada a enzima livre diretamente. No entanto, a imobilização da CGTase tem sido testada, com o propósito de permitir seu uso contínua e repetidamente, de modo a prevenir sua solubilização e promover uma forma molecular mais estável. Neste trabalho, buscouse imobilizá-la em microesferas de sílica-polietilenoglicol (sílica-PEG). O suporte foi silanizado com 3- aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) e ativado com glutaraldeído para gerar condições de imobilização de enzimas, que foi realizada a 6ºC e pH 6, durante 15h. O rendimento de imobilização e a atividade recuperada foram 83% e 73%, respectivamente. Os resultados foram comparados com estudos anteriores sobre a imobilização covalente de CGTase. As propriedades enzimáticas da CGTase imobilizada foram investigadas e comparadas com as da enzima solúvel. CGTases solúveis e imobilizadas apresentaram valores similares de pH ótimo. Por outro lado, a temperatura ótima foi de 100ºC e 80ºC para as formas solúvel e imobilizada da enzima, respectivamente. Em comparação com a CGTase solúvel, a forma imobilizada apresentou maior Km (constante de Michaelis), menor Vmax (velocidade máxima de reação), a estabilidade de armazenamento diminuiu cerca de 15% e apenas um ligeiro decréscimo foi observado quando a estabilidade térmica estava sob avaliação. A estabilidade operacional foi medida em repetidos processos de batelada e a enzima imobilizada reteve cerca de 60% da atividade catalítica inicial, após 15 ciclos. / Cyclodextrin glicosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is the enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins (CDs) via cyclization reaction. Cyclodextrins have numerous applications in the pharmaceutical, cosmetics, and food industry, because of their capacity to encapsulate hydrophobic molecules within their cavity. The CGTase from the Thermoanaerobacter sp. is able to degrade starch into CDs under industrial conditions (high temperature). For the industrial scale production of CDs, conventional batch production methods, which utilize soluble CGTase directly, have been mainly adopted. However the immobilization of CGTase has been pursued with the purpose of allow its reuse continuously and repeatedly by avoiding enzyme solubilization and promoting a more stable molecule form. In this research, Thermoanaerobacter CGTase was immobilized on silica-polyethyleneglycol (silica-PEG) microspheres. The support was silanized with 3- aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and activated with glutaraldehyde to generate conditions for enzyme immobilization, which was carried out at 6ºC and pH 6, during 15h. The immobilization yield and recovery activity was around 83% and 73%, respectively. Results were compared with previous studies on covalent immobilization of CGTase. The enzymatic properties of immobilized CGTase were investigated and compared with those of the soluble enzyme. Soluble and immobilized CGTases showed similar values for optimum pH. On the other hand, the optimum temperature was 100ºC and 80ºC for the soluble and immobilized forms, respectively. In comparison with the soluble CGTase, the immobilized form exhibited higher Km (Michaelis constant), lower Vmax (maximal reaction rate), the storage stability was decreased about 15% and just a slight decrease was observed when thermal stability was under evaluation. The operational stability was evaluated in repeated batch process and the immobilized enzyme retained about 60% of the initial catalytic activity after 15 cycles.

Ces travaux centrés essentiellement sur la fonction thiohydroximate s’articulent selon trois thèmes : (1) les acides thiohydroxamiques, (2) la synthèse et (3) l’étude de réactivité des N-oxydes de thioimidate (TINOs), avec pour objectif l’étude d’une enzyme : la S-glucosyltransférase (S-UGT). La S-UGT est une enzyme clé dans la formation des glucosinolates. Les travaux menés ont tout d’abord été axés sur la synthèse d’acides thiohydroxamiques, substrats de la S-UGT, pour l’étude cinétique de l’enzyme. Dans ce but, nous avons envisagé différentes méthodes et avons pu obtenir les molécules ciblées, permettant ainsi d’obtenir des résultats préliminaires quant à la cinétique de l’enzyme. D’autre part, la synthèse d’iminosucres, inhibiteurs potentiels de l’enzyme, a été envisagée par une double fonctionnalisation d’un N-oxyde de thioimidate (TINO) sur charpente pyranose. Nous avons donc développé une méthode robuste d’accès aux TINOs à partir de différents pyranoses. Le couplage de Liebeskind-Srogl a permis d’accéder aux nitrones. Des additions-éliminations sur les TINOs nous ont donné accès à des N-oxydes d’amidine et à de nouveaux TINOs. Les réactions de réduction et de débenzylation des TINOs ont également été explorées. Des tentatives de cycloaddition 1,3-dipolaire sur une nitrone ont été effectués en vue d’obtenir à des isoxazolidines, précurseurs d’iminosucres Alpha, Alpha-disubstitués. Les résultats concernant la synthèse d’inhibiteurs de la S-UGT restent préliminaires. Toutefois, après déprotection, les différentes molécules synthétisées durant cette thèse pourront être envisagées comme inhibiteurs de glycosidases. / This thesis is articulating into three topics: (1) synthesis of thiohydroxamic acids, (2) the synthesis and (3) the study of the reactivity of thioimidate N-oxides (TINOs). The purpose of these works is the study of the enzyme: S-glycosyltransferase (S-UGT). The enzyme S-UGT is an essential enzyme for the glucosinolate formation.The starting point of these works was focused on the synthesis of thiohydroxamic acids. These products are the substrates of the enzyme S-UGT and could be used for the study of the enzyme kinetic. The second point is to use TINOs anchored on pyranose backbones as precursors of iminosugars which are potential inhibitors of the enzyme S-UGT. An efficient methodology was developed to access a large panel of TINOs from different pyranoses. Liebeskind Srogl coupling allowed us to obtain nitrones. Addition-elimination on TINOs gave us amidine N-oxides and new TINOs. Reduction and debenzylation reactions on TINOs were also explored. 1,3-Dipolar cycloaddition attempts on a nitrone were performed to obtain isoxazolidines which are precursors Alpha, Alpha-disubstituted iminosugars. The results recording the synthesis of S-UGT inhibitors remain preliminary. However, after deprotection, the different molecules, synthesised during this thesis, will be tested as glycosidase inhibitors.

A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é a única enzima capaz de catalisar a reação de ciclização a partir do amido e, assim, formar oligossacarídeos cíclicos conhecidos como ciclodextrinas (CDs). Através desta reação é produzida uma mistura de α-, β- e γ-CD que, respectivamente, contém 6, 7 e 8 resíduos de glicose. As CDs têm atraído enorme atenção devido ao seu grande potencial de aplicação em diversas áreas da indústria. Potencial este proporcionado por sua estrutura cônica, com interior hidrofóbico, capaz de encapsular sólidos, líquidos e gases, conferindo propriedades importantes e protegendo-os. Neste trabalho foi estudada a imobilização de uma CGTase em sílica mesoporosa de forma direcionada às cisteínas presentes em sua superfície, alterando a exposição do sítio ativo. A ligação via cisteínas nativas da proteína aumentou em quatro vezes a eficiência da imobilização, quando comparada a ligação via grupamento amino. Esta, no entanto, apresentou maior atividade enzimática em faixas mais amplas de temperatura e pH, além de maior estabilidade operacional, mantendo 100 % de sua atividade após 200 h de reação contínua a 60 °C e pH 4. Ainda que apresentando menor estabilidade da ligação, o derivado obtido por ligação dissulfeto manteve 40 % da atividade inicial durante 200 h e então, o suporte pôde ser recarregado e reutilizado por igual período. Os suportes desenvolvidos apresentaram estabilidade satisfatória, possibilitando o uso do derivado imobilizado em reator de leito fixo operado de forma contínua. Quando avaliado em relação a produção das três ciclodextrinas principais, o derivado cuja imobilização da enzima ocorreu via grupamento amino, evidenciou a possibilidade de modulação da produção apenas variando as condições de reação. α- e β-CD foram produzidas preferencialmente em pH 8,0 e 2 min (3,44 mg mL-1 e 3,51 mg mL-1, respectivamente), enquanto que pH mais ácido (4,0) e maior tempo de reação (141 min) favoreceram a formação de γ-CD (3,35 mg mL-1), com baixa formação α-CD (0,75 mg mL-1). Por fim, os resultados deste estudo evidenciam a importância da imobilização da CGTase para a estabilização de sua estrutura a fim de aplicá-la em sistemas contínuos de produção de CDs onde é possível modular o perfil dos produtos gerados em função das condições de reação, aumentando assim a produtividade do biocatalisador. / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is the only enzyme capable of catalyzing the cyclization reaction from the starch and thus forming cyclic oligosaccharides known as cyclodextrins (CDs). Through this reaction, is produced a mixture of α-, β- and γ-CD containing, 6, 7 and 8 glucose residues respectively. Cyclodextrins (CD) have been attracting considerable attention because of its great potential for application in various areas of industry. This potential is provided by its conical structure with hydrophobic interior, capable of encapsulating solids, liquids and gases, changing important features and protecting them. In this work, the immobilization of CGTase in mesoporous silica was studied in a way directed to cysteines present on its surface, altering the exposure of the active site. The connection via native cysteine of the protein increased by four times the efficiency of immobilization compared to amino groups connection. The binding of amino groups, however, showed greater enzymatic activity in wider ranges of temperature and pH, and higher operational stability, while maintaining 100 % of its activity after 200 h of continuous reaction at 60 °C and pH 4. Although showing less stable connection, the derivative obtained by disulfide bond retained 40 % of the initial activity for 200 h and then, the support could be reloaded and reused for the same period. Developed supports showed satisfactory stability, enabling the use of the derivative assets in a packed bed reactor and operated continuously. It was demonstrated the possibility of modulating the CDs production just varying the reaction conditions, using the derivative of which the enzyme immobilization occurred via amino group, to evaluate the production of three main cyclodextrins. α- and β-CD were produced preferentially at pH 8.0 and 2 min (3.44 mg mL-1 and 3.51 mg mL-1, respectively), whereas the more acid pH (4.0) and longer reaction (141 min) favored the formation of γ-CD (3.35 mg mL-1 and 0.75 mg mL-1 of α-CD). Finally, the results of this study show the importance of the immobilization of CGTase to the stabilization of its structure in order to apply it in continuous CD production systems, where it is possible to modulate the profile of the products generated as a function of the reaction conditions, thus increasing the productivity of the biocatalyst.

A ciclodextrina glicosiltransferase (EC 2.4.1.19) é a única enzima capaz de converter amido e açúcares relacionados em ciclodextrinas através de reação de ciclização. Estes compostos podem formar complexos de inclusão com moléculas hidrofóbicas, tornando-se importante para aplicação nas indústrias alimentícias, farmacêuticas, agrícolas, químicas e de cosméticos. Um novo microorganismo produtor de CGTase foi encontrado entre bactérias isoladas do solo e foi identificado como Stenotrophomonas maltophilia. A enzima produzida por este microrganismo foi purificada em quatro etapas: precipitação por afinidade com amido, ultrafiltração, cromatografia de troca iônica e cromatografia de interação hidrofóbica. A CGTase assim purificada obteve, aproximadamente, atividade específica de 200.000 U/mg e fator de purificação de 2500. Com uma única banda, o peso molecular da enzima purificada foi estimado em 70kDa por SDS-PAGE. A temperatura ótima para atividade da enzima foi de 60 º C, enquanto que a atividade enzimática permaneceu praticamente estável entre pH 6 e 10, indicando natureza alcalotolerante. Km e Vmax para a enzima pura foram de 2,5 g/mL e 12,5 U/mg de proteína, respectivamente, usando amido solúvel como substrato. / Cyclodextrin glycosyltransferase (EC 2.4.1.19) is the unique enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins via cyclization reaction. These compounds can form inclusion complexes with hydrophobic molecules, becoming important for application in the food, pharmaceutical, agricultural, chemical and cosmetics industries. A new microorganism producing the CGTase was found among strains isolated from soil and identified as Stenotrophomonas maltophilia. The enzyme produced by this strain was purified by four steps: starch affinity precipitation, ultrafiltration, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The CGTase thus obtaining specific activity 200,000 U.mg-1 and 2500-fold purification. With a single band, the molecular weight of the purified enzyme was estimated in 70kDa by SDS-PAGE. The optimum temperature for enzyme activity was 60ºC, whereas the enzyme activity remained almost stable between pH 6 to 10, indicating its alkalotolerant nature. Km e Vmax for the pure enzyme were 2.5 g/mL and 12.5 U/mg protein, respectively, using soluble starch as substrate.

A ciclodextrina glicosiltransferase (EC 2.4.1.19) é a única enzima capaz de converter amido e açúcares relacionados em ciclodextrinas através de reação de ciclização. Estes compostos podem formar complexos de inclusão com moléculas hidrofóbicas, tornando-se importante para aplicação nas indústrias alimentícias, farmacêuticas, agrícolas, químicas e de cosméticos. Um novo microorganismo produtor de CGTase foi encontrado entre bactérias isoladas do solo e foi identificado como Stenotrophomonas maltophilia. A enzima produzida por este microrganismo foi purificada em quatro etapas: precipitação por afinidade com amido, ultrafiltração, cromatografia de troca iônica e cromatografia de interação hidrofóbica. A CGTase assim purificada obteve, aproximadamente, atividade específica de 200.000 U/mg e fator de purificação de 2500. Com uma única banda, o peso molecular da enzima purificada foi estimado em 70kDa por SDS-PAGE. A temperatura ótima para atividade da enzima foi de 60 º C, enquanto que a atividade enzimática permaneceu praticamente estável entre pH 6 e 10, indicando natureza alcalotolerante. Km e Vmax para a enzima pura foram de 2,5 g/mL e 12,5 U/mg de proteína, respectivamente, usando amido solúvel como substrato. / Cyclodextrin glycosyltransferase (EC 2.4.1.19) is the unique enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins via cyclization reaction. These compounds can form inclusion complexes with hydrophobic molecules, becoming important for application in the food, pharmaceutical, agricultural, chemical and cosmetics industries. A new microorganism producing the CGTase was found among strains isolated from soil and identified as Stenotrophomonas maltophilia. The enzyme produced by this strain was purified by four steps: starch affinity precipitation, ultrafiltration, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The CGTase thus obtaining specific activity 200,000 U.mg-1 and 2500-fold purification. With a single band, the molecular weight of the purified enzyme was estimated in 70kDa by SDS-PAGE. The optimum temperature for enzyme activity was 60ºC, whereas the enzyme activity remained almost stable between pH 6 to 10, indicating its alkalotolerant nature. Km e Vmax for the pure enzyme were 2.5 g/mL and 12.5 U/mg protein, respectively, using soluble starch as substrate.

Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é a enzima capaz de converter o amido e seus açúcares relacionados em ciclodextrinas (CDs) através da reação de ciclização. As CDs têm inúmeras aplicações na indústria farmacêutica, cosmética e de alimentos, devido à sua capacidade de encapsular moléculas hidrofóbicas dentro de sua cavidade. A CGTase de Thermoanaerobacter sp. é capaz de converter o amido em CDs sob condições de processo industrial, em temperaturas elevadas. A produção de CDs em escala industrial é feita, geralmente, em processos de batelada, nos quais é utilizada a enzima livre diretamente. No entanto, a imobilização da CGTase tem sido testada, com o propósito de permitir seu uso contínua e repetidamente, de modo a prevenir sua solubilização e promover uma forma molecular mais estável. Neste trabalho, buscouse imobilizá-la em microesferas de sílica-polietilenoglicol (sílica-PEG). O suporte foi silanizado com 3- aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) e ativado com glutaraldeído para gerar condições de imobilização de enzimas, que foi realizada a 6ºC e pH 6, durante 15h. O rendimento de imobilização e a atividade recuperada foram 83% e 73%, respectivamente. Os resultados foram comparados com estudos anteriores sobre a imobilização covalente de CGTase. As propriedades enzimáticas da CGTase imobilizada foram investigadas e comparadas com as da enzima solúvel. CGTases solúveis e imobilizadas apresentaram valores similares de pH ótimo. Por outro lado, a temperatura ótima foi de 100ºC e 80ºC para as formas solúvel e imobilizada da enzima, respectivamente. Em comparação com a CGTase solúvel, a forma imobilizada apresentou maior Km (constante de Michaelis), menor Vmax (velocidade máxima de reação), a estabilidade de armazenamento diminuiu cerca de 15% e apenas um ligeiro decréscimo foi observado quando a estabilidade térmica estava sob avaliação. A estabilidade operacional foi medida em repetidos processos de batelada e a enzima imobilizada reteve cerca de 60% da atividade catalítica inicial, após 15 ciclos. / Cyclodextrin glicosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is the enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins (CDs) via cyclization reaction. Cyclodextrins have numerous applications in the pharmaceutical, cosmetics, and food industry, because of their capacity to encapsulate hydrophobic molecules within their cavity. The CGTase from the Thermoanaerobacter sp. is able to degrade starch into CDs under industrial conditions (high temperature). For the industrial scale production of CDs, conventional batch production methods, which utilize soluble CGTase directly, have been mainly adopted. However the immobilization of CGTase has been pursued with the purpose of allow its reuse continuously and repeatedly by avoiding enzyme solubilization and promoting a more stable molecule form. In this research, Thermoanaerobacter CGTase was immobilized on silica-polyethyleneglycol (silica-PEG) microspheres. The support was silanized with 3- aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and activated with glutaraldehyde to generate conditions for enzyme immobilization, which was carried out at 6ºC and pH 6, during 15h. The immobilization yield and recovery activity was around 83% and 73%, respectively. Results were compared with previous studies on covalent immobilization of CGTase. The enzymatic properties of immobilized CGTase were investigated and compared with those of the soluble enzyme. Soluble and immobilized CGTases showed similar values for optimum pH. On the other hand, the optimum temperature was 100ºC and 80ºC for the soluble and immobilized forms, respectively. In comparison with the soluble CGTase, the immobilized form exhibited higher Km (Michaelis constant), lower Vmax (maximal reaction rate), the storage stability was decreased about 15% and just a slight decrease was observed when thermal stability was under evaluation. The operational stability was evaluated in repeated batch process and the immobilized enzyme retained about 60% of the initial catalytic activity after 15 cycles.

Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é a enzima capaz de converter o amido e seus açúcares relacionados em ciclodextrinas (CDs) através da reação de ciclização. As CDs têm inúmeras aplicações na indústria farmacêutica, cosmética e de alimentos, devido à sua capacidade de encapsular moléculas hidrofóbicas dentro de sua cavidade. A CGTase de Thermoanaerobacter sp. é capaz de converter o amido em CDs sob condições de processo industrial, em temperaturas elevadas. A produção de CDs em escala industrial é feita, geralmente, em processos de batelada, nos quais é utilizada a enzima livre diretamente. No entanto, a imobilização da CGTase tem sido testada, com o propósito de permitir seu uso contínua e repetidamente, de modo a prevenir sua solubilização e promover uma forma molecular mais estável. Neste trabalho, buscouse imobilizá-la em microesferas de sílica-polietilenoglicol (sílica-PEG). O suporte foi silanizado com 3- aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) e ativado com glutaraldeído para gerar condições de imobilização de enzimas, que foi realizada a 6ºC e pH 6, durante 15h. O rendimento de imobilização e a atividade recuperada foram 83% e 73%, respectivamente. Os resultados foram comparados com estudos anteriores sobre a imobilização covalente de CGTase. As propriedades enzimáticas da CGTase imobilizada foram investigadas e comparadas com as da enzima solúvel. CGTases solúveis e imobilizadas apresentaram valores similares de pH ótimo. Por outro lado, a temperatura ótima foi de 100ºC e 80ºC para as formas solúvel e imobilizada da enzima, respectivamente. Em comparação com a CGTase solúvel, a forma imobilizada apresentou maior Km (constante de Michaelis), menor Vmax (velocidade máxima de reação), a estabilidade de armazenamento diminuiu cerca de 15% e apenas um ligeiro decréscimo foi observado quando a estabilidade térmica estava sob avaliação. A estabilidade operacional foi medida em repetidos processos de batelada e a enzima imobilizada reteve cerca de 60% da atividade catalítica inicial, após 15 ciclos. / Cyclodextrin glicosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is the enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins (CDs) via cyclization reaction. Cyclodextrins have numerous applications in the pharmaceutical, cosmetics, and food industry, because of their capacity to encapsulate hydrophobic molecules within their cavity. The CGTase from the Thermoanaerobacter sp. is able to degrade starch into CDs under industrial conditions (high temperature). For the industrial scale production of CDs, conventional batch production methods, which utilize soluble CGTase directly, have been mainly adopted. However the immobilization of CGTase has been pursued with the purpose of allow its reuse continuously and repeatedly by avoiding enzyme solubilization and promoting a more stable molecule form. In this research, Thermoanaerobacter CGTase was immobilized on silica-polyethyleneglycol (silica-PEG) microspheres. The support was silanized with 3- aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and activated with glutaraldehyde to generate conditions for enzyme immobilization, which was carried out at 6ºC and pH 6, during 15h. The immobilization yield and recovery activity was around 83% and 73%, respectively. Results were compared with previous studies on covalent immobilization of CGTase. The enzymatic properties of immobilized CGTase were investigated and compared with those of the soluble enzyme. Soluble and immobilized CGTases showed similar values for optimum pH. On the other hand, the optimum temperature was 100ºC and 80ºC for the soluble and immobilized forms, respectively. In comparison with the soluble CGTase, the immobilized form exhibited higher Km (Michaelis constant), lower Vmax (maximal reaction rate), the storage stability was decreased about 15% and just a slight decrease was observed when thermal stability was under evaluation. The operational stability was evaluated in repeated batch process and the immobilized enzyme retained about 60% of the initial catalytic activity after 15 cycles.