Berlin, Freie Univ., Diss., 2001. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format. Computerdatei im Fernzugriff.

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The human pathogen Chlamydia trachomatis is the main cause of sexually transmitted infections worldwide. The obligate intracellular bacteria are the causative agent of several diseases that reach from conjunctivitis causing trachoma and blindness as well as salpingitis and urethritis which can lead to infertility if left untreated. In order to gain genetically engineered Chlamydia that inducible knock down specific gene expression, the CRISPRi system was established in C. trachomatis. In a proof of principle experiment it was shown that C. trachomatis pCRISPRi:gCdu1III target ChlaDUB1 expression and reduce the protein amount up to 50 %. Knock-down of the DUB did not influence protein levels of anti-apoptotic Mcl-1 and did not make cells susceptible for apoptosis. However, reduced dCas9 protein size, bacterial growth impairment and off target effects interfering with the GFP signal, form obstacles in CRISPRi system in Chlamydia. For routinely use of the CRISPRi method in C. trachomatis further investigation is needed. Since the bacterial life cycle includes two morphological and functional distinct forms, it is essential for chlamydial spread to complete the development cycle and form infectious progeny. Therefore, Chlamydia has evolved strategies to evade the host immune system in order to stay undetected throughout the developmental cycle. The bacteria prevent host cell apoptosis via stabilization of anti-apoptotic proteins like Mcl-1, Survivin and HIF-1α and activate pro-survival pathways, inhibiting invasion of immune cells to the site of infection. The host cell itself can destroy intruders via cell specific defense systems that involve autophagy and recruitment of professional immune cells. In this thesis the role of the chlamydial deubiuqitinase ChlaDUB1 upon immune evasion was elucidated. With the mutant strain Ctr Tn-cdu1 that encodes for a truncated DUB due to transposon insertion, it was possible to identify ChlaDUB1 as a potent opponent of the autophagic system. Mutant inclusions were targeted by K48 and K63 chain ubiquitination. Subsequently the inclusion was recognized by autophagic receptors like p62, NBR1 and NDP52 that was reversed again by complementation with the active DUB. Xenophagy was promoted so far as LC3 positive phagosomes formed around the inclusion of Ctr Tn-cdu1, which did not fuse with the lysosome. The detected growth defect in human primary cells of Chlamydia missing the active DUB was not traced back to autophagy, but was due to impaired development and replication. It was possible to identify Ankib1, the E3 ligase, that ubiquitinates the chlamydial inclusion in a siRNA based screen. The activating enzyme Ube1 and the conjugating enzyme Ube2L3 are also essential in this process. Chlamydia have a reduced genome and depend on lipids and nutrients that are translocated from the host cell to the inclusion to proliferate. Recruitment of fragmented Golgi stacks to the inclusion surface was prevented when ChlaDUB1 was inactive, probably causing diminished bacterial growth. Additionally, the modification of the inclusion by Ankib1 and subsequent decoration by autophagic markers was not only present in human but also murine cells. Comparison of other Chlamydia strains and species revealed Ankib1 to be located at the proximity of the inclusion in C. trachomatis strains only but not in C. muridarum or C. pneumoniae, indicating that Ankib1 is specifically the E3 ligase of C. trachomatis. Moreover, the role of ChlaDUB1 in infected tissue was of interest, since ChlaDUB1 protein was also found in early EB stage and so might get in contact with invading immune cells after cell lysis. While bacteria spread and infect new host cells, Chlamydia can also infect immune cells. Infection of human neutrophils with Ctr Tn-cdu1 shows less bacterial survival and affirms the importance of the DUB for bacterial fitness in these cells. / Chlamydia trachomatis ist weltweit der häufigste Auslöser von sexuell übertragenen Krankheiten. Das obligat intrazelluläre Bakterium manifestiert sich in diversen Krankheitsbildern, darunter Konjunktivitis, die zu einem Trachom oder sogar Erblindung führen kann und Salpingitis oder Urethritis, die unbehandelt unfruchtbar macht. Das CRISPRi System wurde in C. trachomatis etabliert, um genetisch veränderte Bakterien zu bekommen, in denen induzierbar die spezifische Genexpression herunter gefahren werden kann. Es wurde gezeigt, dass in C. trachomatis pCRISPRi:gCdu1III, einem Stamm, der mit der Genexpression von ChlaDUB1 interferiert, die Menge an ChlaDUB1 um bis zu 50 % reduziert ist. Die Sensitivität für Apoptose durch sinkende Mcl-1 Proteinmengen wurde dadurch jedoch nicht wieder hergestellt. Das verkürzte dCas9 Protein, vermindertes bakterielles Wachstum, sowie Effekte auf andere Genexpressionen, wie z.B. das GFP Signal zeigen die Problematik des CRISPRi Systems in C. trachomatis. Um CRISPRi als Routinemethode für genetische Transformation in Chlamydien zu etablieren, stehen noch weitere Untersuchungen an. Der Lebenszyklus von Chlamydien zeichnet sich durch zwei morphologisch und funktionell unterschiedliche Stadien aus, weshalb die Vollendung des Lebenszyklus und die Produktion infektiöser Partikel essenziell sind. Daher haben die Pathogene Strategien entwickelt, um dem Immunsystem des Wirts zu entgehen und sich unerkannt in der Zelle zu entwickeln. Die Bakterien verhindern Apoptose infizierter Zellen durch die Stabilisierung von anti-apoptotischen Proteinen wie Mcl-1, Survivin und HIF-1α und aktivieren Überlebens-Signalwege, die die Invasion von Immunzellen in das infizierte Gewebe unterdrücken. Die Wirtszelle selbst ist in der Lage bakterielle Eindringlinge durch die eigenen Abwehrmechanismen wie Autophagie und die Rekrutierung von professionellen Immunzellen zu zerstören. In dieser Arbeit wurde die Rolle der chlamydiellen Deubiquitinase ChlaDUB1 auf die Vermeidungsstrategien vor dem Immunsystem untersucht. Mit Hilfe der Mutante Ctr Tn-cdu1, die durch Insertion eines Transposons für eine verkürzte und inaktive Deubiquitinase codiert, konnte gezeigt werden, dass ChlaDUB1 ein Gegenspieler des Autophagiesystems ist. Die Inklusionen der Mutante wurden mit K48 und K63 Ubiquitinketten modifiziert, was die Rekrutierung von Autophagiemarkern wie p62, NBR1 und NDP52 zur Folge hatte. Die Rekomplementierung mit aktivem ChlaDUB1 Protein hob die Modifikation der Inklusion wieder auf. Jedoch wurde die Xenophagie so weit vorangetrieben, bis sich LC3 positive Phagosomen um die Inklusionen von Ctr Tn-cdu1 bildeten, die allerdings nicht mit dem Lysosom verschmolzen. Das beobachtete Wachstumsdefizit in Chlamydien, die keine funktionelle Deubiquitinase exprimieren, konnte nicht auf die Autophagie zurückgeführt werden, sondern war voraussichtlich aufgrund verlangsamter Entwicklung und Replikation entstanden. In einem siRNA basierten Experiment konnte die E3 Ligase Ankib1 für die Ubiquitinierung der Ctr Tn-cdu1 Inklusion identifiziert werden. Des Weiteren sind das Ubiquitin aktivierende Enzym Ube1 und das Ubiquitin konjugierende Enzym Ube2L3 essentiell für die Modifikation der Inklusion. Da Chlamydien ein reduziertes Genom haben und nicht für alle Enzyme selbst kodieren, sind sie auf Lipide und Metabolite der Wirtszelle für ihr Wachstum angewiesen. Die Rekrutierung der fragmentierten Glogi-Membranen zur Inklusionsoberfläche wurde durch inaktives ChlaDUB1 Protein verhindert, das wahrscheinlich die bakterielle Entwicklung negativ beeinflusst. Des Weiteren ubiquitinierte Ankib1 nicht nur Inklusionen in humanen, sondern auch in murinen Zellen, was auch hier die Bindung von Autophagiemarkern zur Folge hatte. Der Vergleich unter verschiedenen chlamydiellen Serotypen und Arten zeigte, dass Ankib1 nur an Inklusionen von C. trachomatis zu finden war, nicht aber für C. muridarum oder C. pneumoniae. Des Weitern wurde die Rolle von ChlaDUB1 in infiziertem Gewebe genauer betrachtet, da die Protease auch während frühen EB Phasen nachgewiesen wurde, in denen sie Kontakt zu immigrierenden Immunzellen haben könnte. Während der Zelllyse werden Bakterien frei gesetzt, die neue Wirtszellen, aber auch Immunzellen, infizieren können. Die Infektion von humanen Neutrophilen mit Ctr Tn-cdu1 zeigte vermindertes bakterielles Wachstum und verdeutlicht die Bedeutung von ChlaDUB1 für das Überleben in diesen Immunzellen.

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Abstract Anion exchanger 2 (AE2) is a member of the anion exchanger gene family, which includes three additional members, AE1, AE3, and AE4. They are also known as Na+-independent Cl-/HCO3- exchangers, and their major function is to regulate intracellular pH and chloride concentration. All four isoforms have several N-terminally truncated variants that are often expressed cell type specifically. Red blood cells express the full-length AE1 isoform that interacts with ankyrin, an adapter protein linking plasma membrane to the spectrin-based membrane skeleton. This membrane skeleton association is essential for maintaining the membrane integrity of red blood cells. AE3 variants are mainly found in the brain and heart, whereas AE4 is localized in the kidney. Anion exchanger 2 is expressed in every cell line and tissue studied thus far, and it has been mainly localized to the plasma membrane. However, we found two types of localization/targeting of the AE2 protein in several of the cell lines studied. The protein was localized to either the plasma membrane or the Golgi complex, depending on the cell type. The AE2 variant expressed in these cells was identified as the full-length AE2 protein. The determinants of differential intracellular targeting were assessed. We hypothesized that Golgi-AE2 is anchored to the Golgi membranes via its association with the Golgi membrane skeleton. We were able to show that the Golgi localization of AE2 correlated with the cell type specific expression of Ank195, a Golgi membrane skeletal protein. In cells where AE2 was targeted to the plasma membrane, Ank195 was not expressed. In addition, the detergent insolubility and co-redistribution properties of AE2 and Ank195 strongly suggested that these proteins interact with each other. The Golgi membrane skeleton has been shown to be necessary for maintaining the Golgi structure. Our studies were consistent with these findings, showing that in cells in which AE2 expression was reduced by using AE2-specific antisense oligonucleotides, the Golgi complex was dispersed. The spectrin-based membrane skeleton was probably partially detached from the Golgi membranes leading to breakdown of the Golgi structure and disorganization of the microtubules associated with it. The present findings suggest that the targeting of AE2 is cell type specific, and that Golgi-localized AE2 serves as a membrane association site for the spectrin-based Golgi membrane skeleton, thereby participating in the maintenance of the Golgi structure.

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Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La maduración ovocitaria involucra cambios nucleares y citoplasmáticos que comprenden la reanudación de la meiosis y la redistribución de organelos como el aparato de Golgi. La coordinación de estos procesos en el tiempo es un evento crítico para el establecimiento de desarrollo embrionario normal. Este trabajo estudió la dinámica del aparato de Golgi (AG) durante la maduración de ovocitos de perra y su relación con la progresión nuclear. La localización del AG se evaluó mediante inmunofluorescencia indirecta en ovocitos no madurados, madurados in vitro (IVM) hasta 96 hrs y madurados in vivo, los cuales fueron distribuidos aleatoriamente para ser incubados con los Ac contra las proteínas del AG GM130 y Giantin; la configuración cromatínica se determinó mediante tinción DAPI, en vesícula germinal (VG), reinicio meiótico (GVBD), metafase I (MI) y II (MII). Los resultados mostraron dos patrones de distribución de la inmunomarca: a) Homogéneo en el citoplasma, que predominó en ovocitos no madurados (99%) presentando paralelamente el estado de VG (87%) y, b) Cortical, principalmente en ovocitos sometidos a IVM (97%), donde se reanuda la meiosis incrementando el desarrollo meiótico con el tiempo de cultivo y predominando el estado MI (75%). Todos los ovocitos madurados in vivo mostraron patrón cortical y 94% de MII. Estos resultados sugieren que el AG se relocaliza durante la IVM de ovocitos de perra, lo que se relaciona con la progresión meiótica pero de manera no coordinada, siendo in vitro menos eficiente que in vivo / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1110265

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Abstract not available