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La fragmentation de l'appareil de Golgi représente un des changements les plus précoces et les plus répandus dans les maladies neurodégénératives. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires de ces changements, j'ai étudié deux modèles expérimentaux de maladie du neurone moteur. 1. Les souris pmn (progressive motor neuronopathy) : Celles-ci sont atteintes d'une forme très grave de dégénérescence des neurones moteurs et des défauts moléculaires sont liés à une mutation faux-sens d'une protéine localisée au niveau du Golgi, la chaperonne des tubulines TBCE, identifiée par (Martin, Jaubert et al. 2002; Schaefer, Schmalbruch et al. 2007). Au cours de ma thèse, nous avons identifié des anomalies importantes du Golgi dans les neurones moteurs lombaires de souris pmn et déterminé leur relevance fonctionnelle ainsi que les mécanismes moléculaires. D'après les immunomarquages et la modélisation 3D des membranes, la fragmentation et l'atrophie du Golgi dans les neurones lombaires moteurs pmn ressemblent à celles rapportées dans la SLA et se produit dans des cinétiques similaires. Les analyses en microcopie électronique montrent que l'empilement des citernes golgiennes est progressivement remplacé par des petites vésicules. Les analyses biochimiques révèlent : 1/ une redistribution cytosolique des protéines d'arrimage tel que GM130, 2/ une diminution des protéines β-COP et 3/ une augmentation considérable des protéines golgiennes d'amarrage v-SNARE GS15 et GS28 contrôlant la fusion des vésicules. / Fragmentation of the Golgi apparatus represents one of the earliest and most constant pathological changes in neurodegenerative diseases. To understand the molecular mechanisms of these changes I investigated two experimental models of motor neuron diseases. 1. pmn mice with progressive motor neuronopathy. The pmn mice were chosen since they suffer from a very aggressive form of motor neuron degeneration and since their molecular defects represents a missense mutation in a Golgi-localized tubulin chaperone TBCE, as shown by previous (Martin et al 2002, Schäfer et al 2007). In the last years, we identified severe Golgi abnormalities in motor neurons of pmn mice and dissected out their functional relevance and molecular mechanisms. According to immunolabelings and 3D membrane modelings, Golgi fragmentation and atrophy in lumbar pmn motor neurons resembled those reported in human ALS and proceeded with similar kinetics. Electron microscopy illustrated that Golgi cisternae were progressively transformed into small vesicles. Biochemical analyses revealed : 1/ a cytosolic redistribution of tethering factor such as GM130, 2/ a decrease in β-COP protein level and 3/ a massive increase in the Golgi v-SNARE proteins GS15 and GS28 controlling vesicle fusion. These pathological changes were due to loss of TBCE expression since they could be rescued by transgenic expression of wildtype TBCE but not mimicked by sciatic nerve axotomy. They involved defective dynamics of Golgi-derived microtubules rather than accumulation of misfolded tubulins as shown by the differential effects of TBCE-depletion, Nocodazole and a folding-incompetent tubulin mutant.

La polarité cellulaire est une caractéristique commune à tous les organismes. Jusqu’à récemment, il était assumé que la sécrétion de protéines vers des domaines polaires de la cellule végétale se faisait de façon non polarisée, mais ce point de vue a été re-étudié, la sécrétion est polarisée mais la dynamique, les voies de traficempruntées et les mécanismes sont toujours inconnus. Précédemment, mon laboratoire d’accueil a caractérisé un enrichissement en sphingolipides contenant des acides gras à très longues chaines (VLCFAs) au niveau d’un sous-domaine du trans-Golgi Network (TGN) appelé Vésicules de Sécrétions (SVs). Plus précisément, il a été montré que la longueur des acides gras des sphingolipides jouait un rôle critique dans la sécrétion du transporteur d’auxine PIN2 des SVs vers des domaines polaires de la membrane plasmique. Pendant ma thèse, je me suis intéressé à la question suivante : comment les sphingolipides agissent-t-ils au TGN? En identifiant le protéome des SVs, ainsi qu'en utilisant des outils génétiques et pharmacologiques en combinaison avec la visualisation de marqueurs lipidiques, j'ai pu identifier que les sphingolipides agissent sur l’homéostasie des phosphoinositides en mettant en avant un lien fonctionnel entre ces deux classes de lipides au sein de la cellule végétale. En utilisant un set de marqueurs des phosphoinositides (PIPs), j’ai pu montrer que les sphingolipides ciblent principalement le phosphatidyl-inositol-3-phosphate, PI(3)P et le phosphatidylinositol- 4-phosphate, PI(4)P. De plus, mon analyse protéomique a montré que la localisation d'un ensemble de protéines liées aux PIPs était diminuée dans les SVs/TGN immunopurifiées quand la composition des sphingolipides est altérée. Mes résultats nous forcent à revoir notre vision de la dynamique des lipides au niveau des membranes, et suggère l’idée que la dynamique de remodelage de la composition d’une classe de lipide, les phosphoinositides, peut être modulée par une autre classe de lipide, les sphingolipides. / Cell polarity is a defining feature of all organisms. Until very recently, it was thought that delivery of proteins to polar domains of root epidermal cells plasma membrane was non-polar, but this view has been re-examined, the delivery is polar but the dynamics, the paths taken, and the mechanisms are unknown. My host team previously characterised an enrichment of Very-Long-Chain-Fatty-Acids (VLCFAs)-containing sphingolipids at the site of secretory vesicles (SVs) sub-domain of the trans-Golgi Network (TGN). Moreover, the length of sphingolipids acyl-chain was found to play a critical role in secretory sorting of the auxin carrier PIN2 from SVsassociated TGN to apical polar domain of the plasma membrane (PM). During my PhD, I addressed the following question: how sphingolipids act at SVs/TGN? Using proteomics of SVs, genetics and pharmacological tools in combination with visualisation of lipid probes we could identify that sphingolipids act on phosphoinositides (PIPs) homeostasis establishing a new functional link between these two lipids in plant cells. Using a set of multi-affinity fluorescent PIPs probes I could show that sphingolipids target phosphatidylinositol-3-phosphate (PI3P) and phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P). Moreover, my proteomic analyses show that several PIPs-related proteins are downregulated in immuno-purified TGN-associated SVs when the sphingolipid composition is altered pharmacologically. My results force the reassessment of our view of lipid membranes dynamics and highlight the idea that dynamic remodelling of the composition of one lipid class, the phosphoinositides, can be modulated by another lipid class, the sphingolipids.

Le trafic intracellulaire est un processus fondamental qui maintient l'homéostasie cellulaire. Les RAB GTPases sont des régulateurs clés du trafic intracellulaire. RAB6 est la RAB résidente la plus abondante du Golgi. RAB6 est un régulateur clé de l'homéostasie Golgienne. Mon projet de thèse s'est intéressé à l'étude de la fonction de RAB6 dans la sécrétion post-Golgienne. Des études précédentes ont montré que la déplétion de RAB6 inhibe l'arrivée à la membrane plasmique de différents cargos : dans des cellules HeLa, NPY et VSV-G, et TNFα dans les macrophages. Nous avons donc émis l'hypothèse que RAB6 pourrait être un régulateur général de la sécrétion post-Golgienne. A l'aide de cellules MEFs RAB6 KO, nous avons d'abord montré que la sécrétion de toutes les protéines nouvellement synthétisées est inhibée. Pour comprendre les mécanismes entraînant cet effet, nous avons étudié le rôle de RAB6 dans le transport post-Golgien de trois types différents de cargos : GPI-APs (PLAP et CD59), collagen X, une protéine soluble, et une protéine transmembranaire TNFα. Afin de synchroniser le transport de cargos, nous avons utilisé le système RUSH. Ainsi, nous avons montré que RAB6 est présent sur les vésicules post-Golgiennes contenant les 3 types de cargos et que la déplétion de RAB6 affecte leur sécrétion. Les effecteurs de RAB6 sont aussi impliqués: Myosine II dans leur fission du Golgi, KIF5B dans leur transport vers la périphérie cellulaire, ELKS dans leur arrimage à la membrane plasmique. Finalement, nous avons pu montrer que les 3 cargos sont présents dans les mêmes vésicules post-Golgiennes avec RAB6. Ces résultats montrent que RAB6 régule la sécrétion de différents cargos. / Intracellular trafficking is a fundamental process which ensures cell homeostasis. RAB GTPases are key regulators of intracellular trafficking. RAB6 is the most abundant Golgi resident RAB and is a key regulator of Golgi homeostasis. My Ph.D project focused on understanding the function of RAB6 in post-Golgi secretion.Previous reports have shown that RAB6 depletion impairs the arrival at the plasma membrane of different cargoes: in HeLa cells, NPY and VSV-G and TNFα in macrophages. We thus hypothesized that RAB6 could be a general regulator of post-Golgi transport steps. Using MEF cells from RAB6 KO mice, we first showed that the secretion of all newly synthesized proteins is affected. To decipher the mechanisms leading to this inhibition, we have then investigated the role of RAB6 in the post-Golgi transport of three different classes of proteins, GPI-anchored proteins (such as Placental Alkaline phosphatase or PLAP and CD59), collagen X, a soluble protein, and the transmembrane protein TNFα. In order to synchronize transport of newly-synthetized cargoes along the secretory pathway, we used the RUSH system. Here, we show that RAB6 is present on post Golgi vesicles containing the three types of cargo and that RAB6 depletion affects their secretion to the plasma membrane. RAB6 effectors are also implicated: Myosin II for their fission from the Golgi, KIF5B for their transport to the cell periphery, ELKS/RAB2IP2 for their docking with the plasma membrane. Finally, we could show that these three cargoes are present in the same post-Golgi transport carriers with RAB6. Altogether, these results show that RAB6 regulates the secretion of a wide number of cargo proteins.

The Golgi apparatus is the main crossroad of the intracellular trafficking network in all eukaryotic cells and plays a crucial role in the distribution of cellular material. To ensure the proper sorting and delivery of cargo proteins to their destination while maintaining Golgi homeostasis the coordination of all transport events to and from this organelle is required. Although a cascade of activation events has already been reported for Golgi Ypt/Rab proteins that function in the exocytic pathway, their connection to incoming vesicles from endosomal compartments or to the different Arf mediated vesicle formation machineries has still to be established. In addition, the role of lipids and the interplay between lipid and protein regulators at the Golgi are largely missing. In the present study, we used several approaches to unravel the crosstalk between known regulators of Golgi trafficking and to identify new proteins involved in this process. As starting point, we considered the results from four different screens before focusing on the role of Arf exchange factors. We report two new physical interactors of the late Golgi Arf-GEF Sec7p: the lipid kinase Pik1p and the cyclic nucleotide phosphodiesterase Cpd1p. In addition, our studies on the function of Sec7p revealed additional feature of this protein and it’s relationship to the other yeast Golgi Arf-GEFs. Arf proteins and their regulators play an important role in the formation of vesicles at the exit from the Golgi apparatus. There are three Golgi-localized Arf-GEFs in S.cerevisiae, Sec7p and the redundant Gea1p/Gea2p. While it has been established that Sec7p function does not overlap with the Gea’s, the specific role of these proteins remains unclear. We show that Sec7p colocalizes poorly with the Gea’s, indicating that these proteins activate Arf on different Golgi sub-compartments. In addition, our data suggest that Sec7p mainly promotes the formation of post-Golgi transport vesicles supporting forward transport from the late Golgi while the Gea’s primarily regulate COPI-mediated retrograde traffic. This observation is consistent with published data from mammalian cells and suggests that the spatial and temporal regulation of Arf is conserved from yeast to mammals. Both Arf regulation and phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) metabolism are important factors for Golgi function. Here, we show that the yeast PI4-kinase, Pik1p binds specifically to Sec7p but not Gea1p or Gea2p. Taken together, the physical interaction, the colocalization and similar transport phenotypes of the respective mutants suggests a functional link between Pik1p and Sec7p but not the Gea’s. In addition, Pik1p binds to the catalytic domain of Sec7p and could directly influence the activity of the GEF. We propose that this interaction coordinates Arf activation with PI4P production to generate a highly specific dual recognition system for the recruitment of specific effectors to the late Golgi. Besides its catalytic domain, Sec7p shares several conserved regions with other members of the BIG/GBF Arf-GEF subfamilies, including the N-terminal DCB (Dimerization/Cyclophilin Binding) domain. We show that a single point mutation in the DCB domain of Sec7p efficiently inhibits Arf activation without affecting membrane recruitment of the GEF and could interfere with a possible dimerization of the protein. We identified Cpd1p as an allele specific dosage suppressor of the Sec7p DCB domain mutation. Cpd1p and Sec7p physically interact and both proteins localize independently to the late Golgi. Increased Golgi level of Cpd1p compensates for the loss of interaction due to the mutation in the DCB domain of Sec7p. The catalytic activity of Cpd1p is important for the rescue, indicating an intriguing connection between the Arf activation cycle and ADP-ribose derivates. We also find that Cpd1p interacts with several other proteins involved in Golgi- and post-Golgi transport events. Hence, Cpd1p is a new regulator of vesicular traffic at the Golgi that could act as a scaffolding factor for Sec7p and other transport proteins.

Le rôle des lipides comme des acteurs moléculaires de la voie sécrétoire des plantes n'est pas encore complètement élucidé. Le Glucosylceramide (GlcCer) est synthétisé par la Glucosylceramide synthase (GCS) chez les plantes et constitue un des sphingolipides complexes clé dans les membranes, mais on connaît peu les exigences cellulaires pour le GlcCer. Cette étude repose sur le blocage de la biosynthèse de GlcCer, par l'utilisation d'inhibiteurs chez le tabac et l’arabidopsis, et la production de mutants d'Arabidopsis, pour déterminer l'impact de la biosynthèse du GlcCer sur la dynamique endomembranaire des cellules végétales. Dans une approche qui inclue la biochimie des lipides, l'imagerie de cellules vivantes, des études ultrastructurales par microscopie electronique à transmission et des études sur le développement de la plante entière, nous avons acquis une meilleure compréhension de l'impact de la synthèse du GlcCer dans les cellules végétales qui peut être résumée comme suit: (1) Sur la base d’un analyse théorique et de la microscopie de cellules vivantes on a déterminé que la GCS est situé dans le Réticulum Endoplasmique (au début de la voie sécrétoire) dans les cellules végétales, (2) PDMP est un inhibiteur spécifique de GCS chez les plantes, (3) La perturbation de la biosynthèse du GlcCer par le PDMP et par un approche génétique ont montré que le GlcCer est important pour le trafic normale des protéines et pour la dynamique des endomembranes, notamment dans le maintien de la structure de l’appareil de Golgi, (4) La régulation du trafic des protéines mediée par la synthèse du GlcCer pourrait être critique dans l’etablissement et le maintien de la polarité cellulaire, tel qu’il est suggéré par des changements dans la localisation des marqueurs polaires chez l’Arabidopsis traitée avec PDMP, et (5) Un bloc dans la synthèse du GlcCer peut conduire à des défauts importants dans le développement des plantes, comme le montrent des mutants d'Arabidopsis avec une croissance anormale des racines primaires et incapables à se développer jusqu’aux étapes reproductives. Les interactions potentielles entre GlcCer et les machineries de transport sont discutés, ainsi que les mécanismes cellulaires qui sont potentiellement déclenchés dans les cellules végétales pour compenser une perturbation de la biosynthèse du GlcCer. / The role of lipids as molecular actors in protein secretion is not well understood in plants. Glucosylceramide (GlcCer) is synthesized by Glucosylceramide Synthase (GCS) in plants and constitutes a key complex sphingolipid in membranes, but little is known about the plant cellular requirements for GlcCer. This study relied upon the block of GlcCer biosynthesis, by the use of inhibitors in tobacco and Arabidopsis, and the production of Arabidopsis mutants, to determine the impact of GlcCer biosynthesis on plant cell endomembrane dynamics. In a comprehensive approach that included lipid biochemistry, live cell imaging, ultrastructural studies by Transmission Electron Microscopy, and whole plant developmental studies, we have gained a better understanding of the impact of GlcCer in plant cells that can be summarised as follows: (1) Based on theoretical analysis and live-cell microscopy the GCS is located to the Endoplasmic Reticulum (at the beginning of the secretory pathway) in plant cells, (2) PDMP is a specific inhibitor of GCS in plants, (3) Disruption of GlcCer biosynthesis using PDMP and genetic approaches showed that GlcCer is important for normal protein trafficking and endomembrane dynamics, notably in the maintenance of Golgi structure, (4) The regulation of protein trafficking by the synthesis of GlcCer could be critical in the establishment and maintenance of cell polarity, as suggested by defects in the localisation of polar markers in Arabidopsis treated with PDMP, and (5) A block in GlcCer synthesis may be conducive to severe defects in plant development, as Arabidopsis mutants showed abnormal primary root growth and inability to develop to reproductive stages. Potential interactions between GlcCer and the transport machineries are discussed, as well as cellular mechanisms that may be set off following a disruption of GlcCer biosynthesis in plant cells.

Les cellules de Golgi constituent une composante essentielle du cortex cérébelleux et la seule source d’inhibition de la couche granulaire. Leur ablation produit des déficits moteurs sévères. Malgré plusieurs études intensives, notre compréhension de la fonction des ces cellules et de leur influence sur le transfert d’informations dans le cortex cérébelleux reste limitée. La fonction de la cellule de Golgi découle de ses interconnexions synaptiques locales. Lors de ma thèse nous avons identifié’ un véritable circuit de rétro-inhibition, qui est implémenté par les synapses entre les axones ascendants des cellules granulaires et les dendrites baso-latérales des cellules de Golgi. Cette connectivité puissante constitue la première preuve de l’existence d’un circuit de rétro-inhibition dans la couche granulaire. Nous avons par la suite cherché à comprendre comment le recrutement des interneurones de Golgi par l’activité détermine la dynamique du transfert d’informations. Nous avons développé un système de stimulation optique basé sur la déflection acousto-optique (AODs) de faisceaux Gaussiens de faible convergence, qui évoqué des patrons d’activité des fibres moussues avec une grande répétabilité et précision temporelle. Des stimulations électriques minimales des fibres moussues, qui à elles seules n’évoquent pas de potentiel d’action dans les cellules en grain, évoquent de large CPSEs phasique dans les cellules de Purkinje lorsqu’elles sont couplées avec des stimulations optogénétiques. Nous proposons un modèle de codage contextuel par lequel les évènements notables sont transmis par les cellules en grain dans le contexte d’activité des autres fibres moussues. / Golgi interneurons are an essential cellular component of the cerebellar cortex and the only source of inhibition to billions of granule cells. Their acute ablation causes severe motor deficits. Despite extensive research for the last decades, we still have limited understanding of Golgi cell function and of its impact on the information flow in the cerebellar cortex. Golgi cell function will ultimately depend on its synaptic connections within the cerebellar microcircuit. During my thesis we demonstrated the existence of a specific local feedback circuit onto granule cells, which is implemented by synapses between the ascending axons of granule cells and the basolateral dendrites of Golgi cells. The abundance of these local connections constitutes the first evidence of a powerful feed-back inhibitory circuit in the granule cell layer. Further we sought to understand how Golgi interneurons recruitment by the activity may influence information transfer in the granular layer. We developed a new illumination device, based on acousto–optic deflectors (AODs) stirring of low NA Gaussian beams at 1MHz, which delivered patterned optogenetic stimulations of mossy fibers with high reproducibility and sub-millisecond precision. Minimal electrical stimulations of the mossy fibers in the white matter, which alone where unable to fire granule cells, evoked large phasic EPSCs in Purkinje cells, when paired with asynchronous optogenetic stimulations. We propose that optimal sparse encoding of mossy fiber activity by granule cells is obtained through the relay of salient events (spiking onset, sensory driven synchrony or bursts) in the context of previous ongoing mossy fiber activity.

Le peptide oncolytique LTX-315 a été développé comme un peptide cationique amphipathique qui tue les cellules cancéreuses et qui se révèle stimulant pour la réponse anti-cancer immune quand il est localement injecté dans des tumeurs présentent chez des souris immunocompétentes. La microscopie électronique par transmission révélées que LTX-315 a échoué à induire la condensation nucléaire apoptotique mais induit plutôt un phénotype nécrotique. Par conséquent, LTX-315 a échoué à stimuler l'activation de caspase-3, et l'inhibition des caspases par le biais de Z-VAD-fmk n'a pas été capable de réduire la mort cellulaire par LTX-315. En outre, deux inhibiteurs importants de la nécroptose, nommés necrostatin-1 et cycospotin-A, ont échoué à réduire la mort cellulaire par LTX-315. En conclusion, il semble que LTX-315 déclenche une nécrose non-régulée, qui peut contribuer à ses effets pro-inflammatoires et pro-immunitaires. Le fractionnement subcellulaire des cellules traitées par LTX-315, suivie par une quantification spectrométrique massive, a révélé que cet agent était enrichi en mitochondries. LTX-315 a causé un arrêt immédiat de la respiration mitochondriale sans aucun effet majeur de découplage. Par conséquent, LTX-315 a interrompu le réseau mitochondrial, a dissipé le potentiel mitochondrial de la membrane interne, et a causé la libération des protéines inter-membranaires mitochondriales dans le cytosol. LTX-315 était relativement inefficace dans la mitophagie stimulante. Les cellules dépourvues de deux pro-apoptotiques protéines à domaines multiples BAX et BAK, étaient moins susceptibles de mourir par LTX-315. De plus, les cellules conçues pour perdre leurs mitochondries étaient relativement résistantes à LTX-315, soulignant l'importance de cet organite pour la cytotoxicité induite par LTX-315. Au total, ces résultats soutiennent la notion que LTX-315 tue les cellules cancéreuses par sa vertue à perméabiliser les membranes mitochondriales. Nous avons observé que LTX-315 induit toutes les charactéristiques d'ICD connues. Cette conclusion a étévalidée par diverses méthodes indépendantes incluant la teinture par immunofluorence, dosage par bioluminescence, immunodosages, RT-PCRs. Quand il a été injecté dans des cancers créés, LTX-315 a causé une nécrose focale transitoirement hémorragique accompagnée d'une libération massive de HMGB1, aussi bien que l'activation de caspase-3 dans une partie des cellules. LTX-315 était au moins aussi efficace que le controle positif, l' anthracycline mitoxantrone en induisant une inflammation locale par infitration de cellules myéloïdes et de lymphocytes T. Collectivement, ces résultats appuient l'idée que LTX-315 peut induire l'ICD, expliquant sa capacité à induire des effets thérapeutiques immuno-dépendants.L'autre Lytix composé LTX-401 est un acide aminé oncolytique dérivé avec des propriétés immunogéniques potentielles. Nous démontrons que LTX-401 détruit sélectivement la strucutre du dispositif Golgi. Le fractionnement subcellulaire suivi par une détection spectométrique massive a révélé que LTX-401 a enrichi sélectivement dans le Golgi mieux que dans la mitochondrie ou dans le cytosol. Lagent Golgi-dissociant Brefeldin A a réduit la mort cellulaire par LTX-401 comme cela a partiellement inhibé la libération mitochondrial induite par LTX-401 de cytochrome C et l'activation de BAX. L'effet cytotoxique de LTX-401 a été atténué par la double suppression de BAX et BAK, comme la déplétion mitophagique forcée de la mitochondrie, déjà réfractaire à l'inhibition de caspase. LTX-401 induit toutes les caractéristiques majeures de la mort cellulaire immunogénique. En outre, les tumeurs traitées par LTX-401 ont manifesté une forte infiltration lymphoïde. Ensemble, ces résultats soutiennent l'idée que LTX-401 peut stimuler la mort immunogétique des cellules à travers un passage dans lequel LTX-401 localisé sur Golgi opère en amont de la perméabilisation de la membrane mitochondriale. / The oncolytic peptide LTX-315 has been developed as an amphipathic cationic peptide that kills cancer cells and turned out to stimulate anticancer immune responses when locally injected into tumors established in immunocompetent mice. We investigated whether LTX-315 induces apoptosis or necrosis. Transmission electron microscopy or morphometric analysis of chromatin-stained tumor cells revealed that LTX-315 failed to induce apoptotic nuclear condensation and rather induced a necrotic phenotype. Accordingly, LTX-315 failed to stimulate the activation of caspase-3. Moreover, inhibition of caspases by Z-VAD-fmk was unable to reduce cell killing by LTX-315. In addition, two prominent inhibitors of necroptosis, necrostatin-1 and cyclosporin A, failed to reduce LTX-315-induced cell death. In conclusion, it appears that LTX-315 triggers unregulated necrosis, which may contribute to its pro-inflammatory and pro-immune effects. Subsequently, we investigated the putative involvement of mitochondria in the cytotoxic action of LTX-315. Subcellular fractionation of LTX-315-treated cells, followed by mass spectrometric quantification, revealed that the agent was enriched in mitochondria. LTX-315 caused an immediate arrest of mitochondrial respiration without any major uncoupling effect. Accordingly, LTX-315 disrupted the mitochondrial network, dissipated the mitochondrial inner transmembrane potential, and caused the release of mitochondrial intermembrane proteins into the cytosol. LTX-315 was relatively inefficient in stimulating mitophagy. Cells lacking the two pro-apoptotic multidomain proteins BAX and BAK, were less susceptible to LTX-315-mediated killing. Moreover, cells engineered to lose their mitochondria were relatively resistant against LTX-315, underscoring the importance of this organelle for LTX-315-mediated cytotoxicity. Altogether, these results support the notion that LTX-315 kills cancer cells by virtue of its capacity to permeabilize mitochondrial membranes. Following, we investigated whether LTX-315 may elicit the hallmarks of immunogenic cell death (ICD). Overally, we observed that LTX-315 induces all known ICD characteristics. This conclusion was validated by several independent methods including immunofluorescence staining, bioluminescence assays, immunoassays, and RT-PCRs. The injection of LTX-315 into established cancers resulted in transiently hemorrhagic focal necrosis that was accompanied by massive release of HMGB1, as well as caspase-3 activation in a fraction of the cells. LTX-315 was equal or more efficient as the positive control, the anthracycline mitoxantrone (MTX), in inducing local inflammation with infiltration by myeloid cells and T lymphocytes. Collectively, these results support the idea that LTX-315 can induce ICD, explaining its capacity to mediate immune-dependent therapeutic effects. The second Lytix compound investigated, LTX-401, is an oncolytic amino acid derivative with potential immunogenic properties. We demonstrated that LTX-401 selectively destroys the structure of the Golgi apparatus. Subcellular fractionation followed by mass spectrometric detection revealed that LTX-401 was selectively enriched in the Golgi rather than in the mitochondria or in the cytosol. The Golgi-dissociating agent Brefeldin A (BFA) reduced cell killing by LTX-401 as it partially inhibited LTX-401-induced mitochondrial release of cytochrome c and the activation of BAX. The cytotoxic effect of LTX-401 was attenuated by the double knockout of BAX and BAK, as well as the mitophagy-enforced depletion of mitochondria, yet was refractory to caspase inhibition. LTX-401 induced all major hallmarks of immunogenic cell death. Moreover, LTX-401-treated tumors manifested a strong lymphoid infiltration. Altogether, these results support the contention that LTX-401 can stimulate immunogenic cell death through a pathway in which Golgi-localized LTX-401 operates upstream of mitochondrial membrane permeabilization.

Yes / The contribution of the actin cytoskeleton to the unique architecture of the Golgi complex is manifold. An important player in this process is Coronin7 (CRN7), a Golgi-resident protein that stabilizes F-actin assembly at the trans-Golgi network (TGN) thereby facilitating anterograde trafficking. Here, we establish that CRN7-mediated association of F-actin with the Golgi apparatus is distinctly modulated via the small Rho GTPase Cdc42 and N-WASP. We identify N-WASP as a novel interaction partner of CRN7 and demonstrate that CRN7 restricts spurious F-actin reorganizations by repressing N-WASP ‘hyperactivity’ upon constitutive Cdc42 activation. Loss of CRN7 leads to increased cellular F-actin content and causes a concomitant disruption of the Golgi structure. CRN7 harbours a Cdc42- and Rac-interactive binding (CRIB) motif in its tandem β-propellers and binds selectively to GDP-bound Cdc42N17 mutant. We speculate that CRN7 can act as a cofactor for active Cdc42 generation. Mutation of CRIB motif residues that abrogate Cdc42 binding to CRN7 also fail to rescue the cellular defects in fibroblasts derived from CRN7 KO mice. Cdc42N17 overexpression partially rescued the KO phenotypes whereas N-WASP overexpression failed to do so. We conclude that CRN7 spatiotemporally influences F-actin organization and Golgi integrity in a Cdc42- and N-WASP-dependent manner. / This work was supported by SFB 670 and DFG NO 113/22. K.B. was supported by a fellowship from the NRW International Graduate School “From Embryo to Old Age: the Cell Biology and Genetics of Health and Disease” (IGSDHD), Cologne.