Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und ermöglicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zusätzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-Stämme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Grünfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalität von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die Stämme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellulären Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validität des GFP-Reportersystems in Legionella bestätigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivität belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivität zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abhängiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin bestätigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend über Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zusätzliche Möglichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verfügung. Diese Ergebnisse bestätigen die postulierte Heterogenität der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierfür wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle ermöglicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht über die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivität des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufklärung der Sequenz ursächlich verhindert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivität des Legionella Mip-Proteins für die Invasion und das intrazelluläre Überleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-ähnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der äußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Domäne (AS 4-79) ein verkürztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminosäuren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouartärstruktur auf die Pathogenität wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivität für die Infektion von monozellulären Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivität an der Pathogenität von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivität wirkt sich, verglichen mit dem monozellulären System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazelluläre Überleben aus. Mit site-spezifisch verändertem Mip-Protein komplementierte Legionella-Stämme zeigten eine intrazelluläre Vermehrung in Abhängigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivität. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell bestätigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivität für die Infektion monozellulärer Systeme und höherer Organismen unterschiedlich ist. / The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila was first identified in 1977 as the etiologic agent of legionellosis, a severe and atypical pneumonia. It possesses a dual host system which allows the bacteria to replicate in protozoa in aquatic habitats as well as a pathogen in human phagocytic cells. In order to analyze the complex interaction of the bacterial pathogen and its host cells, in this thesis a new GFP reporter system was established and sussessfully evaluated. It is now possible to monitor a Legionella infection in vivo and to quantify bacterial invasion influenced by different factors in a more convenient way. To analyze GFP expression in Legionella a transcriptional fusion of the gfpmut2 gene with the Legionella-specific mip (macrophage infectivity potentiator) promoter was constructed. In addition, a vector habouring the sod (super oxid dimutase) promoter derived from Listeria monocytogenes was used. Following transformation into Legionella strains strong GFP-mediated fluorescence was detected confirming the functionality of GFP in Legionella for the first time. Using fluorescence microscopy, spectrofluorimetry and flow cytometry (FACS-analysis) the strains were examined regarding differences in virulence and intracellular replication. Re-confirming results from earlier studies obtained by using enumeration of CFU values showed the validity of the method. Quantification of the mip promoter activity revealed a constitutively expression, this indicates that differences in Legionella virulene are not due to variations in mip promoter activity. Moreover, the influence of different phagocytosis inhibitors on Legionella uptake into the protozoan hosts Acanthamoeba castellanii and Hartmannella vermiformis using the GFP reporter system was examined. Application of cytochalasin D had no influence on bacterial uptake in A. castellanii and H. vermiformis suggesting in microfilament-independent mechanism. Phagocytosis in H. vermiformis is mainly accomplished using receptor-mediated phagocytosis as it was evident from inhibition studies with cycloheximide and methylamine. In contrast, phagocytosis in A. castellanii is mediated by other receptors or additional mechanisms are available. This results confirm the proposed heterogeneity of uptake mechanisms by different protozoan hosts. After L. pneumophila is phagocytosed the endosomal pathway of phagosome maturation is blocked, by means of secreted but as yet unidentified effector molecules. To study a putative protein translocation C-terminal Mip::GFP fusion proteins were constructed. The stability of the proteins was rather weak which is likely due to the dimeric conformational state of the Mip protein. In addition, transport over the cytoplasmic membran was not accomplished. Therefore the fusion proteins proved not to be useful for examine translocational events. Because of the unknown in vivo function of bacterial PPIases the focus in the the second part of this work was to identify a putative interaction partner of the Mip protein and to elucidate the influence of dimerization and PPIase activity on Legionella's virulence. Using cross linking experiments a putative interaction partner could be detected. N-terminal sequencing revealed no homology to already known Legionella or other proteins. N-terminal blockade of the putative partner molecule may be the cause that hampered sequence identification. It has been shown that the isomerase activity of the Legionella Mip protein is not necessary for invasion and intracellular survival in protozoan, monocytes and U937 macrophages. Additional features of the protein are its homodimeric conformational state and the assoziation with the outer membrane. In cooperation with the group of Prof. Dr. G. Fischer in Halle a N-terminal truncated (aa 4-79) dimerization-deficient Mip protein (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) was constructed and biochemically characterized. Using site specific mutagenesis participation of the N-terminal located amino acids (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) in the dimerization of the Mip protein was confirmed. To analyze the influence on pathogenicity of the dimeric state of the Mip protein a mip negative strain was complemented by providing the gene encoding the monomeric Mip (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) in cis. The proper integration and protein expression was confirmed. The results demonstrate that the isomerase activity is dispensable for intracellular growth in protozoan hosts. Moreover, the results clearly demonstrated that dimerization and not the isomearse activity are essential for virulence of Legionella in a monocellular system. In contrast, it could be shown that the isomerase activity is necessary for full virulence in the animal model (guinea pigs). The loss of the isomerase avtivity have a more dramatic impact on the intracellular survival of Legionella compared to the monocellular system (A. castellanii). Moreover, Legionella strains replicated intracellulary dependent on their remaining in vitro isomerase activity. Using the monomeric Mip expressing strain L.p.JR32-2.4 it could be demonstrated that dimerization also plays a role in the animal model. This work provides evidence for a different role of the isomerase activity of the Mip protein in monocellular systems and during the infection of higher organisms.

Nucleic acids are not only one of the most important classes of macromolecules in biochemistry but also a promising platform for the defined arrangement of chromophores. Thanks to their precise organization by directional polar and hydrophobic interactions, oligonucleotides can be exploited as suitable templates for multichromophore assemblies with predictable properties. To expand the toolbox of emissive, base pairing nucleobase analogs several barbituric acid merocyanine (BAM) chromophores with tunable spectroscopic properties were synthesized and incorporated into RNA, DNA and glycol nucleic acid (GNA) oligonucleotides. A multitude of duplexes containing up to ten BAM chromophores was obtained and analysis by spectroscopic methods revealed the presence of dipolarly coupled merocyanine aggregates with properties strongly dependent on the chromophore orientation toward each other and the backbone conformation. These characteristics were exploited for various applications such as FRET pair formation and polymerase chain reaction (PCR) experiments. The observed formation of higher-order aggregates implies future applications of these new oligonucleotide-chromophore systems as light-harvesting DNA nanomaterials. Besides oligonucleotide templated covalent assembly of chromophores also non-covalent nucleic acid-chromophore complexes are a broad field of research. Among these, fluorogenic RNA aptamers are of special interest with the most versatile ones based on derivatives of the GFP chromophore hydroxybenzylidene imidazolone (HBI). Therefore, new HBI-derived chromophores with an expanded conjugated system and an additional exocyclic amino group for an enhanced binding affinity were synthesized and analyzed in complex with the Chili aptamer. Among these, structurally new fluorogenes with strong fluorescence activation upon binding to Chili were identified which are promising for further derivatization and application as color-switching sensor devices for example. / Nukleinsäuren sind nicht nur eine der wichtigsten Klassen biochemisch relevanter Makromoleküle, sondern stellen auch eine vielversprechende Plattform für die definierte räumliche Organisation kleiner funktioneller Moleküle, wie beispielsweise Chromophore, dar. Oligonu-kleotide können aufgrund ihrer präzise gegliederten Struktur, die durch gerichtete polare und hydrophobe Wechselwirkungen hervorgerufen wird, als nützliche Template für die mehrfache kovalente und nicht-kovalente Anordnung von Chromophoren zu Aggregaten mit vorhersagbaren spektroskopischen Eigenschaften genutzt werden. Obwohl eine Vielzahl solcher Chromophorsysteme bereits in der Literatur beschrieben ist, basieren die meisten Chromophordesigns nur auf hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Chromophoren und lassen die intrinsische Fähigkeit kanonischer Nukleobasen, komplementäre Basenpaare zu bilden, außen vor. Allerdings liegt es auf der Hand, dass die Berücksichtigung dieser polaren Wechselwirkungen nicht nur zu einer Stabilisierung der Oligonukleotid-Sekundärstruktur führen kann, sondern auch die Interpretation spektroskopischer Effekte vereinfacht. Um das bekannte Spektrum emittierender Nukleobasen-Analoga zu erweitern und den zusätz-lichen Einfluss dieser polaren Wechselwirkungen auszunutzen, wurden im Zuge dieser Arbeit verschiedene, strukturell unterschiedliche Barbitursäure-Merocyanin-Chromophore (BAM) entworfen. Die Barbitursäure-Akzeptoreinheit dieser künstlichen Nukleobasensurrogate ähnelt der Watson-Crick-Basenpaarungsseite der natürlichen T- und U-Nukleobasen und soll somit die Basenpaarung mit Adenosin ermöglichen. Durch die Kombination dieses Akzeptors mit unterschiedlich aufgebauten aromatischen Donoreinheiten, wie zum Beispiel Indol und Benzothiazol, konnten Merocyanine mit interessanten spektroskopischen Eigenschaften erhalten werden. Da die Konstitution des Nukleinsäurerückgrates einen starken Einfluss auf die Strukturparameter und die thermodynamische Stabilität der resultierenden Duplexstruktur hat, wurden die synthetisierten BAM-Chromophore in Phosphoramiditbausteine für die kovalente Assemblierung innerhalb verschiedener Oligonukleotidsysteme umgewandelt. Neben der Synthese entsprechender DNA- und RNA-Nukleotide wurden die BAM-Chromophore auch als Glykolnukleinsäure-Bausteine (GNA) mit einem azyklischen Rückgrat hergestellt. Der erfolgreiche Einbau der erhaltenen künstlichen Nukleoside konnte durch Festphasensynthese erreicht werden, wobei über 100 modifizierte Einzelstränge erhalten werden konnten. Die Hybridisierung der künstlichen Oligonukleotid-Einzelstränge mit ihren jeweiligen Gegensträngen führte zu einer Vielzahl kurzer Duplexstrukturen mit bis zu zehn BAM-Chromophoren in unterschiedlicher Anordnung. Mithilfe verschiedenster spektroskopischer Methoden konnte ein Einblick in die strukturelle Organisation der Merocyanine innerhalb dieser Systeme erhalten werden, wobei sich die Bildung dipolar-gekoppelter Merocyanin-Dimere und -Multimere zeigte. Die hierfür erforderliche ungewöhnliche \textit{syn}-Konformation der BAM-Chromophore wurde weiterhin durch Oligonukleotid-NMR bestätigt. Erstaunlicherweise wiesen die spektroskopischen und thermodynamischen Eigenschaften BAM-modifizierter Nukleinsäuren eine starke Abhängigkeit von der Chromophororientierung und der Konformation des Rückgrates auf. Dieser Effekt konnte für verschiedene Anwendungen wie die Bildung von FRET-Paaren und die Verwendung als internes fluoreszentes Stop-Nukleotid in Polymerasekettenreaktionen ausgenutzt werden. Mithilfe von Rasterkraftmikroskopie wurde außerdem die Bildung von Aggregaten höherer Ordnung beobachtet, was eine zukünftige Verwendung dieser neuen Oligonukleotid-Chromophor-Systeme als Materialien für Lichtsammelkomplexe oder für die DNA-Nanotechnologie denkbar macht. Ein weiteres großes Forschungsfeld neben kovalenten Chromophoranordnungen mit Oligonukleotiden als Templat sind nicht-kovalente Nukleinsäure-Chromophorkomplexe. Insbesondere fluorogene RNA-Aptamere sind hier von großer Bedeutung wobei die wichtigsten auf der Fluoreszenzaktivierung von Derivaten 4-Hydroxybenzylidenimidazolon-Fluorophors (HBI), dem Chromophor des natürlich vorkommenden grün fluoreszierenden Proteins (GFP), beruhen. Allerdings zeigen viele der berichteten Aptamer-Ligand-Systeme signifikante Nachteile wie unter anderem unspezifische Bindung, eine starke Tendenz zu Photoisomerisierung oder ineffiziente Zellpermeabilität. Deshalb wurden im Zuge dieser Arbeit neue, von HBI abgeleitete Chromophore mit einem vergrößerten konjugierten $\uppi$-System und einer zusätzlichen exozykli-schen Aminogruppe für eine erhöhte Bindungsaffinität synthetisiert und im Komplex mit dem bekannten Chili-Aptamer untersucht. Einige dieser strukturell neuen Chromophore zeigten einen starken Anstieg der Emission bei Bindung an dieses Aptamer und wurden daher weiter charakterisiert. Sie stellen eine vielversprechende Möglichkeit für weitere Derivatisierung und die zukünftige Anwendung beispielsweise als schaltbare Aptamer-basierte Fluoreszenzsensoren dar.

In der vorliegenden Arbeit wurden Fusionsprodukte aus verschiedenen nukleolären Proteinen mit fluoreszierenden Proteinen (GFP und dsRed: rot fluoreszierendes Protein) in lebenden Zellen von Säugern und Xenopus laevis exprimiert und lokalisiert. Dadurch standen "Marker" für die drei Hauptkomponenten des Nukleolus zur Verfügung. Die dynamischen Eigenschaften dieser Fusionsproteine wurden quantitativ mit Hilfe von "Photobleaching"-Experimenten analysiert (FRAP: fluorescence recovery after photobleaching). Im einzelnen wurde durch die Untersuchung von RNA-Polymerase I der rDNA Transkriptionsort im fibrillären Zentrum des Nukleolus bestätigt. Die kinetischen Analysen von zwei pol I-Untereinheiten (RPA194 und RPA53) durch FRAP in transkriptionell aktiven und inaktiven Nukleoli erlaubten direkte Rückschlüsse auf die Transkriptionsdauer der rRNA-Gene in vivo. Die individuellen pol I-Untereinheiten bewegen sich rasch zwischen Nukleoplasma und Nukleolus und interagieren in den fibrillären Zentren mit dem rDNA-Promoter. Dann werden sie in produktive Transkriptionskomplexe integriert, die während der Elongationsphase, die bei Raumtemperatur etwa fünf Minuten dauert, stabil bleiben und erst nach der Termination dissoziieren. Zumindest ein Teil der Untereinheiten wandert anschließend in das Nukleoplasma. Die Ergebnisse widersprechen Modellen, welche die dichte fibrilläre Komponente als Transkriptionsort ansehen oder immobile RNA Polymerase I-Moleküle postulieren. Die Identifizierung des fibrillären Zentrums als rDNA-Transkriptionsort wurde durch die Koexpression der pol I-Untereinheiten mit Fibrillarin, einem Leitprotein der dichten fibrillären Komponente, ermöglicht. Durch die Expression der beiden Proteine als unterschiedlich fluoreszierende Fusionsproteine konnten die Orte der Transkription (die fibrillären Zentren) und die Orte der ersten Prozessierungsschritte, an denen Fibrillarin beteiligt ist (die dichte fibrilläre Komponente), in lebenden Zellen als direkt benachbarte, aber räumlich getrennte Kompartimente identifiziert werden. Die Rolle der granulären Komponente als Ort späterer Prozessierungschritte und Integration ribosomaler Proteine wurde durch die Expression von B23 und der ribosomalen Proteine L4, L5 und L10 verdeutlicht. Dabei wurde die nukleoläre Lokalisation von L10 erstmals belegt. In der Literatur wurde bisher angenommen, L10 würde erst im Cytoplasma mit Ribosomen assoziieren. Dies ist nicht der Fall, wie insbesondere Experimente mit Leptomycin B gezeigt haben. Diese Droge hemmt den CRM1-abhängigen Kernexport und führte zu einer deutlichen Akkumulation von L10-haltigen Präribosomen im Nukleoplasma von menschlichen Zellen. Schließlich sollte ein neues nukleoläres Protein von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, das mit verschiedenen Antikörpern in der granulären Komponente des Nukleolus lokalisiert wurde. Durch massenspektrometrische Analysen nach zweidimensionaler Gelelektrophorese wurden die Antigene überraschenderweise als Cytokeratin-Homologe identifiziert. Im Verlauf dieser Arbeit wurden drei bisher unveröffentlichte Cytokeratin 19 Isoformen von Xenopus kloniert, sequenziert und als GFP-Fusionsproteine exprimiert. Diese wurden allerdings wie reguläre Cytokeratine in cytoplasmatische Intermediärfilamente integriert und konnten, auch nach Translokation in den Zellkern durch ein experimentell eingefügtes Lokalisationssignal, nicht im Nukleolus nachgewiesen werden. Nach der Kotransfektion mit verschiedenen Zellkern-Proteinen wurde Cytokeratin 19 mit diesen in den Zellkern und mit nukleolären Proteinen in den Nukleolus transportiert. Obwohl diese Versuche auf einen "Huckepack"-Transportmechanismus für ein normalerweise cytoplasmatisches Protein hinweisen, konnte Cytokeratin 19 nicht spezifisch in der granulären Komponente des Nukleolus lokalisiert werden. Daher konnte bisher, trotz intensiver Bemühungen, die Identität des in der Immunfluoreszenz nachgewiesenen nukleolären Proteins leider nicht aufgeklärt werden. / In the present work, nucleolar proteins were expressed as fusions with fluorescent proteins (GFP: green fluorescent protein or dsRed: red fluorescent protein) in living mammalian and Xenopus laevis cells. These tagged proteins were used as markers for the three main components of the nucleolus. The dynamic properties of the fusion proteins were analyzed quantitatively in photobleaching experiments (FRAP: fluorescence recovery after photobleaching). The analysis of RNA polymerase I allowed the conclusion that the fibrillar centers are the site of rDNA transcription. The kinetic FRAP analysis of two pol I subunits (RPA194 and RPA53) in transcriptionally active and inactive nucleoli allowed an estimate of the transcription time of rDNA genes in vivo. The individual pol I subunits move rapidly between the nucleoplasm and the nucleolus and associate at rDNA promoter sites. Then they are integrated into productive transcription complexes, which remain stable for the elongation phase of about five minutes at room temperature, and dissociate after termination. At least part of the subunits migrate to the nucleoplasm. The obtained results disagree with models that assume the site of transcription to be in the dense fibrillar component, as well as proposing immobile RNA Polymerase I molecules. The designation of the fibrillar center as site of rDNA transcription was further corroborated by the coexpression of pol I subunits with fibrillarin, a major protein of the dense fibrillar component. Using two differently fluorescing tags, the sites of transcription (fibrillar centers) and the sites of early processing steps, in which fibrillarin participates (dense fibrillar components), could be identified in living cells as closely neighboured but clearly separated compartments. The granular component as the site of late processing steps and assembly of ribosomal proteins was visualized by the expression of B23 and ribosomal proteins L4, L5 and L10. In the course of this work L10 was shown to be localized in the nucleolus for the first time. In the literature, human L10 was assumed to associate with ribosomes only in the cytoplasm. This is not the case, as was shown in particular by experiments with Leptomycin B. This drug inhibits the CRM1 dependent nuclear export pathway and resulted in a clear accumulation of L10 containing preribosomes in the nucleoplasm of human cells. Finally, a novel nucleolar protein (p52) of Xenopus laevis was studied in detail. Antigens of various p52 antibodies, localized in the granular component of nucleoli by immunofluorescence were surprisingly identified as cytokeratin homologs by two-dimensional immunoblot analysis and mass spectrometry. In the course of this work three hitherto unpublished Cytokeratin 19 isoforms of Xenopus were cloned, sequenced and expressed as GFP-fusion proteins. However, these proteins behaved like regular cytokeratins and were integrated into intermediate filaments. They were not detectable in the nucleolus, even after translocation into the nucleus by means of an experimentally added localization signal. Following cotransfection with various nuclear RFP-fusion proteins, GFP-CK19 was transported into the nucleus and localized with ist coexpressed partner. When coexpressed with nucleolar proteins, Cytokeratin 19 was also transported into the nucleolus. Although these experiments indicate a possible piggyback transport mechanism for a normally cytoplasmic protein, Cytokeratin 19 was not specifically located in the granular component of the nucleolus. Therefore, despite all efforts, until now the identity of the nucleolar protein originally identified by immunofluorescence remains to be clarified.

alpha2-adrenerge Rezeptoren, von denen drei verschiedene Subtypen (alpha2A, alpha2B, alpha2C) kloniert wurden, gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und vermitteln vielfältige physiologische Funktionen der Transmitter Adrenalin und Noradrenalin. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Rezeptorsubtypen, die subzelluläre Lokalisation von Rezeptoren oder der Differenzierungsstatus einer Zelle für die funktionelle Diversität der alpha2-Rezeptor-Effekte in vivo verantwortlich sind. Im ersten Teil des Projektes wurde ein transgenes Mausmodell untersucht, bei dem selektiv alpha2A-Rezeptoren unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase Promotors in adrenergen Neuronen exprimiert wurden. In diesem Modell sollte getestet werden, ob ein einzelner Rezeptorsubtyp in den verschiedenen Neuronen des sympathischen Nervensystems in vivo identische Funktionen hat. Transgene alpha2A-Rezeptoren hemmten in vivo zwar die Freisetzung von Noradrenalin aus sympathischen Nervenfasern nicht aber die Exozytose von Adrenalin aus dem Nebennierenmark. Deshalb stellte sich die Frage, ob die Rezeptorfunktion von der Morphologie, dem Differenzierungsstatus der Zellen oder von der subzellulären Lokalisation der Rezeptoren abhängt. Hierfür wurden alpha2A-Rezeptoren durch Varianten des grün fluoreszierenden Proteins markiert und mittels FRET-Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In PC12 Phäochromozytomzellen, die durch NGF zum Auswachsen neuronaler Fortsätze stimuliert wurden, waren die Agonist-bedingten Konformationsänderungen von alpha2A-Rezeptoren jedoch weder vom Differenzierungsstatus der Zellen noch von deren subzellulärer Lokalisation abhängig. Lediglich in transient transfizierten Zellen waren im Vergleich zu stabil transfizierten Zellen höhere Agonist-Konzentrationen zur Rezeptoraktivierung erforderlich. Diese Befunde zeigen, dass zusätzlich zur Diversität der Rezeptorsubtypen auf Proteinebene der zelluläre Kontext, in dem ein Rezeptor exprimiert wird, eine ganz wesentliche Rolle für dessen Funktion spielt. / alpha2-adrenergic receptors of which three different subtypes were cloned (alpha2A, alpha2B, alpha2C), are part of the family of G-protein coupled receptors and mediate many physiological functions of the transmitters adrenaline and noradrenaline. This study was initiated to determine whether receptor subtypes, their subcellular localization or the status of differentiation of a cell are responsible for the functional diversity of effects of alpha2-adrenergic receptors in vivo. In the first part of this project a transgenic mouse model was characterized, in which alpha2-adrenergic receptors were expressed under control of the dopamine-beta-hydroxylase-promotor in adrenergic neurons selectively. This model was used to test whether a single receptor subtype has identical functions in different neurons of the sympathetic nervous system in vivo. Transgenic alpha2A-adrenergic receptors inhibited the release of noradrenaline from sympathetic nerves in vivo, but not the exocytosis of adrenaline from the adrenal medulla. Therefore the question arose whether the functions of receptors are dependent on cell morphology, the status of differentiation of cells or the subcellular localization of receptors. To address this question, alpha2A-receptors were tagged with variants of the green fluorescent protein and investigated by means of FRET fluorescence microscopy. In PC12 rat pheochromocytoma cells which were stimulated by nerve growth factor to develop neurites, the conformational changes of alpha2A-adrenergic receptors upon agonist activation, however, did not dependent on the status of cellular differentiation or on the subcellular localization of receptors. Only in transiently transfected cells, higher agonist concentrations were necessary for the activation of receptors as determined by FRET microscopy. These findings demonstrate that the cellular context in which receptor subtypes are expressed play an essential role for their function.

The establishment of transgenesisi in axolotls is crucial for studying development and regeneration, as it would allow for long-term fate tracing as well as gene expression analysis, therefore we were interested in both obtaining animals expresing the transgene with little mosaicism in F0 generation and transgenesis. We demonstrate here that plasmid injection into one cell stage axolotl embryo generates transgenic animals that display germline transmission of a transgene. However, the efficiency of simple plasmid injection is very low, expression of the transgene is mosaic and seems to be promoter dependant. We have tested several methods of transgenesis developed in other systems. First we used Adeno-Associated Viral Terminal Repeats inserted into the injected construct to enhance the expression level of the transgene and reduce mosaicism. However, in the axolotl system we do not observe the enhancement of expression. Moreover, the expression appeared to be transient and disappeared after two months. Further, we tested the effect of the inclusion of ISceI meganuclease in the injections, succesful transgenesis method in the medaka system. It resulted in a higher percentage of F0 animals displaying strong , stable expression throughout the body. This represents the first demonstration in the axolotl of germline transmission of the transgene. Using this technique we have generated a germline transgenic anima expressing GFP ubiquitously in all tissue examined. We have used this anima to study cell fate in the dirsal fin during development. We have discovered a contribution of somite cells to dorsal fin mesenchyme in the axolotl, which was previously assumed to derive solely from neural crest. We have also studied the role of blood during tail regeneration by transplanting the ventral blood-forming region from GFP+ embryos into unlabeled host. During tail regeneration, we do not observe GFP+ cells contributing to muscle or nerve, suggesting that during tail regeneration blood stem cells do not undergo significant plasticity. We are interested in characterization of pluripotency of blastema cells. Previously, it has been shown that neural progenitor cells form the spinal cord can transdifferentiate to muscle and other tissue types in the regenerating tail. To test if blastema cells have the potency of differentiating into a neural tissue , we transplanted GFP+ 4day blastema into an injured spinal cord. Our result shows that blastema cells don't seem to contribute to the regenerating spinal cord.

The establishment of transgenesisi in axolotls is crucial for studying development and regeneration, as it would allow for long-term fate tracing as well as gene expression analysis, therefore we were interested in both obtaining animals expresing the transgene with little mosaicism in F0 generation and transgenesis. We demonstrate here that plasmid injection into one cell stage axolotl embryo generates transgenic animals that display germline transmission of a transgene. However, the efficiency of simple plasmid injection is very low, expression of the transgene is mosaic and seems to be promoter dependant. We have tested several methods of transgenesis developed in other systems. First we used Adeno-Associated Viral Terminal Repeats inserted into the injected construct to enhance the expression level of the transgene and reduce mosaicism. However, in the axolotl system we do not observe the enhancement of expression. Moreover, the expression appeared to be transient and disappeared after two months. Further, we tested the effect of the inclusion of ISceI meganuclease in the injections, succesful transgenesis method in the medaka system. It resulted in a higher percentage of F0 animals displaying strong , stable expression throughout the body. This represents the first demonstration in the axolotl of germline transmission of the transgene. Using this technique we have generated a germline transgenic anima expressing GFP ubiquitously in all tissue examined. We have used this anima to study cell fate in the dirsal fin during development. We have discovered a contribution of somite cells to dorsal fin mesenchyme in the axolotl, which was previously assumed to derive solely from neural crest. We have also studied the role of blood during tail regeneration by transplanting the ventral blood-forming region from GFP+ embryos into unlabeled host. During tail regeneration, we do not observe GFP+ cells contributing to muscle or nerve, suggesting that during tail regeneration blood stem cells do not undergo significant plasticity. We are interested in characterization of pluripotency of blastema cells. Previously, it has been shown that neural progenitor cells form the spinal cord can transdifferentiate to muscle and other tissue types in the regenerating tail. To test if blastema cells have the potency of differentiating into a neural tissue , we transplanted GFP+ 4day blastema into an injured spinal cord. Our result shows that blastema cells don't seem to contribute to the regenerating spinal cord.

Micro- and nanostructured polymer brushes on diamond can be directly prepared by carbon templating and amplification of the latent structures by photografting of a broad variety of vinyl monomers such as styrenes, acrylates and methacrylates. Even template structures with lateral dimensions as small as 5 nm can be selectively amplified and defined polymer brush gradients of a variety of functional polymers are realizable by this technique. Furthermore, conjugation with a model protein (GFP) results in protein density gradients of high loading and improved chemical stability. The effective functionalization of chemically and biologically inert diamond surfaces with stable functional polymer brushes, the possibility of structuring by the carbon templating technique and the direct biofunctionalization are crucial steps for the development of diamond based biosensors. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Die vorliegende Arbeit untersucht das Differenzierungsverhalten adulter muriner Knochenmarkzellen im Zentralnervensystem in vivo und in vitro. Hierzu wurden letal bestrahlte Mäuse mit Knochenmark aus transgenen Mausmutanten transplantiert, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des humanen GFAP-Promoters exprimieren. Ein Teil der Rezipienten wurde vier Wochen nach Transplantation einer transienten fokalen cerebralen Ischämie unterzogen, um den Einfluss postischämischer inflammatorischer Vorgänge auf das Differenzierungsverhalten eingewanderter Zellen zu untersuchen. Eine zelluläre Koexpression von GFP und GFAP als Zeichen der Differenzierung hämatogener Zellen zu GFAP-exprimierenden Astrozyten fand sich bei keinem der analysierten Tiere. Für die in vitroVersuche wurden murine Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten und auf organotypischen entorhinal-hippocampalen Hirnschnitten kokultiviert. Die hierzu verwendeten Knochenmarkzellen waren entweder retroviral mit GFP transfiziert oder stammten aus zwei verschiedenen transgenen Mausmutanten, von denen eine GFP nahezu ubiquitär unter dem b-Actin-Promoter, die andere GFP unter der Kon-trolle des humanen GFAP-Promoters exprimiert. Während zahlreiche Knochenmarkzellen nach wenigen Tagen der Kokultur die morphologischen Charakteristika ruhender Mikroglia annahmen und Immunoreaktivität für den Makrophagen/Mikroglia-Marker Iba1 aufwiesen, fand sich keine einzige Zelle mit Koexpression von GFP und GFAP. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass adulte murine Knochenmarkzellen bzw. ihre Abkömmlinge im zirkulierenden Blut nicht in GFAP-exprimierende Astrozyten differenzieren. / It has been postulated that adult murine bone marrow cells have the potential to differentiate into cells of neuroectodermal origin. In order to examine whether bone marrow cells can adopt an astroglial fate, various in vivo and in vitro approaches were chosen. Lethally irradiated recipient mice were transplanted with bone marrow derived from transgenic mice which express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the human GFAP promoter. Four weeks after transplantation, several animals underwent transient focal cerebral ischemia. Although postischemic inflammatory processes may eventually have a permissive effect on cell differentiation, not a single cells coexpressing GFAP and GFP was found in the brains of all reci-pients examined. For in vitro studies, murine bone marrow cells were co-cultured on astrocytic monolayers or organotypic entorhinal-hippocampal brain slices. Bone marrow cells were either labelled by retroviral transfection with GFP or derived from two different transgenic mouse mutants expressing GFP under the control of the human GFAP-promoter or the murine b-Actin-promoter, respectively. After several days of co-culture bone marrow derived cells developed a ramified morphology and showed immunoreactivity for the monocytic/microglial marker Iba1. However, differentiation of bone marrow derived cells into GFAP-expressing astrocytes was not observed. Our results suggest that adult murine bone marrow cells cannot differentiate into GFAP-expressing astrocytes in vivo or in vitro.

Micro- and nanostructured polymer brushes on diamond can be directly prepared by carbon templating and amplification of the latent structures by photografting of a broad variety of vinyl monomers such as styrenes, acrylates and methacrylates. Even template structures with lateral dimensions as small as 5 nm can be selectively amplified and defined polymer brush gradients of a variety of functional polymers are realizable by this technique. Furthermore, conjugation with a model protein (GFP) results in protein density gradients of high loading and improved chemical stability. The effective functionalization of chemically and biologically inert diamond surfaces with stable functional polymer brushes, the possibility of structuring by the carbon templating technique and the direct biofunctionalization are crucial steps for the development of diamond based biosensors. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

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