La maladie d’Alzheimer est majoritairement sporadique et peu est connu sur les mécanismes déclenchant le développement de cette forme de la maladie. Les études sur la forme familiale ont attribué une importance particulière à la bêta-amyloïde (Aβ), un produit de clivage du précurseur de la protéine amyloïde (APP). Plusieurs facteurs de risques ont été identifiés comme déclencheurs potentiels du développement de la maladie d’Alzheimer dont le diabète de type II (T2D). En effet, la déficience de la signalisation de l’insuline par la désensibilisation des récepteurs de l’insuline (IR) dans le cerveau semble être une caractéristique commune aux deux maladies. Les effets à long terme de la résistance à l’insuline sur l’accumulation d’Aβ et sur la phosphorylation de Tau ont été étudiés, mais les effets de la perturbation aiguë des IR sont moins bien caractérisés. Aussi, les désordres métaboliques sont également des caractéristiques communes aux deux maladies. Le but de notre étude est de déterminer si la perturbation aiguë des IR peut affecter le clivage de l’APP et si la privation énergétique par le jeûne peut sensibiliser ce clivage à la perturbation aiguë des IR. Pour évaluer ceci, nous avons utilisé la Tyrphostin AG1024 à faible dose pour simuler une perturbation des IR plutôt qu’un blocage complet des récepteurs. Pour quantifié le clivage de l’APP, nous avons mesuré les changements de la quantité d’APP taille pleine totale par immunobuvardage de type Western. Pour s’assurer que les changements de la quantité d’APP taille pleine traduisait bien un clivage, nous avons développé un système de lecture par luciférase. Ce système nous permet de suivre le clivage de l’APP via l’expression de la luciférase Firefly puisque le facteur de transcription GAL4 est lié à la portion C-terminale de l’APP . Tout d’abord, nous avons observé que la perturbation aiguë des IR par la Tyrphostin mène au clivage de l’APP et que le jeûne augmente la vulnérabilité au clivage de l’APP suite à une plus petite dose de Tyrphostin. Ce clivage serait imputable à la voie amyloïdogénique puisque l’inhibition de la β-secrétase et de la γ-secrétase empêche le clivage de l’APP. Nous avons aussi montré que la perturbation des IR est nécessaire alors que la perturbation spécifique des IGF-1R n’est pas suffisante. De plus, ni l’autophagie, ni les caspases et ni le protéasomes ne semblent impliqués dans le clivage de l’APP suivant la combinaison du jeûne et de la petite perturbation des IR. L’activité de mTOR n’est également pas requise. Cependant, l’activité de la GSK3 est nécessaire au clivage et semble affecter le clivage par la γ-secrétase. Nous avons ensuite confirmé dans des cultures primaires neuronales que la combinaison du jeûne et de la perturbation aiguë des IR cause le clivage de l’APP et que la GSK3 est encore une fois fortement active. Ainsi, nos résultats suggèrent que la perturbation de la signalisation de l’insuline tel qu’observé dans le T2D augmente le clivage de l’APP via la voie amyloïdogénique et, donc, contribue à la pathologie de la maladie d’Alzheimer. / Little is known about the mechanisms that trigger the onset of Alzheimer’s disease (AD), a primarily sporadic disease. Studies on the familial form of AD attributed a particular importance to Amyloid beta (Aβ), a cleavage product of the Amyloid precursor protein (APP). Many risk factors have been identified as potential triggers of the development of AD including Type 2 diabetes (T2D). Indeed, the impairment of insulin signaling by the desensitization of insulin receptors (IR) in the brain seems to be a common hallmark of both diseases. The long term effects of IR resistance on the accumulation of Aβ and Tau hyperphosphorylation have been studied, but the acute effects of IR perturbation is less characterized. Also, both diseases show metabolic defects. Our research aimed to determine whether acute perturbation of IR signaling affects APP processing and if starving (energy deprivation) could sensitize this processing to acute perturbation of IR. To assess this, we used small doses of Tyrphostin AG1024 to simulate IR perturbations rather than a complete blocakade of the receptors. To quantify APP processing, we measured the change of total full- lenght APP by Western blot. To ensure that this change reflected APP processing we developed a luciferase based readout system. This system allowed us to monitor the occurrence of APP cleavage via GAL4-UAS Firefly luciferase driven expression because we linked GAL4 transcription factor to the C-terminal region of APP. First, we showed that IR perturbation with Tyrphostin leads to APP processing and that starving increased IR susceptibility to a smaller doses of Tyrphostin. This APP processing occurs via the amyloidogenic pathway because inhibition of β- and γ-secretase inhibited APP processing. We showed that this processing absolutely requires IR perturbation, while IGF-1R perturbation alone is insufficient. Furthermore, neither autophagy, caspases nor proteasome seemed to be implicated in APP processing following starvation and small IR perturbation. The activity of mTOR is also not required. On the contrary, GSK3 activation is necessary for the processing and seems to affect γ-secretase cleavage. We then confirmed in primary cultured neurons that the combination of acute starvation and small IR perturbation causes APP cleavage and GSK3 is again strongly activated. Taken together, our results suggest that the impairment of IR signalling seen in T2D increases the processing of APP via the amyloidogenic pathway and thereby contributes to the pathology of AD.

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Depuis la mise en évidence de l’existence des protéines kinases vers la fin des années 1950 cette famille d’enzymes s’est vu attribuer d’importants rôles dans divers mécanismes pathologiques notamment dans des processus de cancérisations. Plus récemment ces enzymes ont été identifiées comme potentiellement impliquées dans d’autres types de maladies telles que les maladies neurodégénératives.Deux projets de recherche seront présentés. Le premier projet expose la conception et la synthèse de nouveaux composés tricycliques de la famille des pyrido[3,4-g]quinazolines. Les propriétés inhibitrices de kinases des premiers dérivés ont été évaluées sur un panel de cinq kinases (CDK5, CK1, GSK3, CLK1 and DYRK1A) connues pour leurs implications dans la maladie d’Alzheimer. L’intérêt de ces nouveaux squelettes tricycliques comme inhibiteurs de kinases a été validé par des activités inhibitrices nanomolaire à l’encontre des kinases DYRK1A et CLK1. D’autre part l’obtention de structures co-crystallographiques d’interaction de deux dérivés avec le site ATP de la kinase CLK1 a permis de rationnaliser la substitution du motif pyrido[3,4-g]quinazoline. Le second projet présente le développement d’un nouveau dérivé de la staurosporine aglycone (K252c) dans lequel la partie lactame a été remplacée par un noyau pyrazole. Une étude préliminaire des propriétés biologiques de l’indolopyrazolocarbazole obtenu met en avant une cytotoxicité, du même ordre de grandeur que K252c, contre les lignées cellulaires K562 (leucémie humaine) et HCT116 (carcinome du colon). En revanche, le composé chef de file s’est révélé être un faible inhibiteur de cibles connues de K252c, les isoformes α and γ de la protéine kinase C et présente un bon potentiel inhibiteur des kinases Pim 1-3. Ce nouveau chemotype pourrait être un inhibiteur de kinases prometteur. / In 1950’s protein kinases were found to play a critical role in cell signaling, rising strong research potential for this enzyme family. Initially investigated for their implications in cancerogenesis they were more recently found to be involved in a wide variety of diseases including neurodegenerative pathologies. Herein will be presented two research projects that offer bright new perspectives for the inhibition of kinases involved whether in neurodegenerative diseases or cancers.First, the design and synthesis of new pyrido[3,4-g]quinazoline derivatives will be described as well as their protein kinase inhibitory potencies toward five CMGC family members (CDK5, CK1, GSK3, CLK1 and DYRK1A) that are known to play a potential role in Alzheimer’s disease. The interest for this original tricyclic heteroaromatic scaffold as modulators of CLK1/ DYRK1A activity was validated by nanomolar potencies. CLK1 co-crystal structures with two inhibitors revealed the binding mode of these compounds within the ATP-binding pocket and led to the synthesis of new diversely substituted pyrido[3,4-g]quinazolines.Then the synthesis of a new derivative of the staurosporine aglycon (K252c), in which the lactam ring was replaced by a pyrazole moiety, will be depicted. The resulting indolopyrazolocarbazole inhibited Pim isoforms 1–3 whereas it did not impair the activity of two known targets of K252c, protein kinase C isoforms α and γ . The lead compound exhibited same cytotoxic activity as K252c toward both human leukemia and colon carcinoma cell lines (K562 and HCT116), strongly suggesting that this new scaffold deserves further investigations for treatment of malignancies associated with kinases activities.

L´apoptosi, o mort cel.lular programada, és un procés actiu que mobilitza els recursos cel.lulars amb l´objectiu de mantenir l´homeostasi de l´organisme a expenses del suïcidi de cèl.lules individuals. Diferents estudis han mostrat un increment de l´activiat d´algunes cdk, especialment Cdk1 i Cdk2, en correlació amb la progressió dels primers estadis apoptòtics. En el nostre laboratori l´estudi de l´apoptosi en timòcits, els quals no tenen una activitat cdk significativa degut a l´aturada del cicle cel.lular en G1, demostren que la inducció de l´activitat de Cdk2 després del tractament amb radiació gamma o amb glucocorticoides és necessària per l´inici de l´apoptosi. Mentre cap de les ciclines conegudes sembla ser la proteïna activadora de Cdk2 en apoptosi, en el nostre laboratori hem identificat un nou membre de la família de les ciclines, denominada Ciclina O, capaç d´activar aquesta kinasa in vivo en línies cel.lulars. L´expressió d´aquesta nova ciclina en el timus, i altres teixits, s´indueix ràpidament després del tractament amb radiació gamma i coincideix amb l´aparició de l´apoptosi. Aquests resultats posicionen la Ciclina O com a millor candidat a ser l´activador de Cdk2 necessari per induïr la mort cel.lular programada en el timus, i probablement també en altres òrgans. / The apoptosis, also called programmed cell death, is an active process able to use the cellular mechanisms to kill individual cells in order to keep the functional homeostasis of the whole organism. Different studies had shown a correlation between the first apoptotic events and the induction of some cdk proteins, particularly Cdk1 and Cdk2. The studies of thymocytes in our laboratory, wich lacks the most amount of cdk activity related to the cell cycle because of its arrest in G1, had shown that the induction of Cdk2 activity after the treatment with gamma radiation or glucocorticoids is a necessary step for the apoptosis induction. While any of the cyclins described at the moment seems to be the Cdk2 activator for apoptosis a new member of the cyclin family able to activate the kinase Cdk2 in vivo in cell lines has been identified in our laboratory. The expresion of this cyclin, known as Cyclin O, is quickly induced in the thymus after the treatment with gamma radiation and correlates with the induction of apoptosis. These results position Cyclin O as the best candidate to activate Cdk2 and inuce the programmed cell death in the thymus, and probably other tissues.