Les commissures forment un ensemble de connexions nerveuses assurant la communication entre les neurones de chaque hémi partie du système nerveux central des bilatériens. Au cours du développement embryonnaire, les axones des neurones commissuraux sont guidés au travers de la ligne médiane délimitant ces deux parties. Plusieurs sources de signaux de guidage attractifs et répulsifs agissent de concert pour organiser les trajectoires de ces axones. Dans la moelle épinière, les axones commissuraux traversent la ligne médiane dans un territoire ventral, la plaque du plancher (PP). Au cours de la traversée de la PP, ils acquièrent une sensibilité à des signaux répulsifs exprimés par ce territoire qui leur empêchent de rebrousser le chemin et qui les poussent hors de la PP. Plusieurs couples ligands/récepteurs médient ces forces répulsives mais les mécanismes qui sous-tendent l'acquisition de la sensibilité aux signaux répulsifs restent encore peu connus. Par exemple on ignore si les axons se sensibilisent à tous les signaux répulsifs en même temps, quand précisément ce switch de réponse se fait, et les contributions précises de chacun de ces signaux. Une spécificité fonctionnelle est suggérée par l'analyse des phénotypes d'invalidation des gènes codant pour ces récepteurs chez la souris ou encore par des manipulations d'expression chez l'embryon de poulet. L'objectif de mes travaux de thèse a été de tester l'hypothèse selon laquelle la génération de spécificités fonctionnelles pourrait résulter de contrôles précis et distincts de la dynamique spatiale et temporelle des récepteurs de guidage à la surface du cône de croissance. J'ai tout d'abord développé un dispositif de vidéomicroscopie adapté à l'enregistrement de cônes de croissance accomplissant la traversée de la PP, sur des moelles épinières en configuration de «livre ouvert». Afin de visualiser l'adressage à la surface du cône de croissance, j'ai exploité une forme de GFP sensible au pH, dont les propriétés de fluorescence à pH neutre permettent un suivi spécifique du pool de surface des protéines (Nawabi et al., 2010; Delloye-Bourgeois et al, 2014). J'ai utilisé ce paradigme pour comparer la dynamique temporelle de 4 récepteurs médiant les réponses aux divers signaux répulsifs de la PP: Nrp2, Robo1, Robo2 et PlxnA1. Les vecteurs d'expression de ces formes pHLuo de récepteurs ont été introduits dans les neurones commissuraux de la moelle épinière d'embryon de poulet par électroporation in ovo. Par des approches de microscopie à super-résolution sur les livres-ouverts, j'ai aussi étudié la distribution spatiale des récepteurs répulsifs à la surface des cônes de croissances au cours de la traversée. L'ensemble de ces expériences a pu démontrer que les récepteurs sont adressés à la membrane à différents temps de la navigation de la PP et occupent, de plus, des domaines distincts du cône de croissance. J'ai ensuite adapté la technique d'électroporation à la moelle épinière d'embryon de souris. Ces expériences ont montré que les séquences temporelles observées chez le poulet sont conservées chez la souris. J'ai également réintroduit le récepteur Robo1 dans une lignée de souris présentant une invalidation des récepteurs Robo1/2 et montré que l'altération de la traversée de la PP caractéristique de cette lignée est abolie dans la population d'axones capables d'adresser le récepteur Robo1 à la membrane. Au final, mes résultats démontrent que les axones commissuraux ne sont pas sensibilisés aux signaux répulsifs par la mise en œuvre d'un programme général. Au contraire, les récepteurs de guidage possèdent des profils de dynamiques temporelles spécifiques, et des domaines de distribution distincts dans le cône de croissance. Le contrôle de la dynamique d'adressage représente ainsi un mécanisme permettant de discriminer des signaux concomitants, en les fonctionnalisant à différents temps de la navigation de la moelle épinière / During embryonic development, commissural axons are guided through the midline, crossing from one side of the CNS to the other one at specific time points and positions to project onto contralateral neurons. Several sources of attractive cues regulate their navigation. In addition, repulsive forces act at different steps to keep the axons along their path. In the developing spinal cord, commissural axons cross the midline in a ventral territory, the floor plate (FP). Commissural axons gain sensitivity to repellents present in the FP after their crossing. The setting of these novel properties is necessary for preventing the axons to cross back and also for pushing them towards FP exit. Various ligand/receptor couples have been reported to mediate these repulsive forces. Whether commissural axons gain response to all the repulsive cues at the same time is not known. Whether these repulsive cascades have specific functions is suggested by different outcome of their invalidation in mouse models, but how are set these differences also remains unknown. We hypothesized that the generation of functional specificities could be achieved though specific controls of the spatial and temporal dynamics of guidance receptors at the growth cone surface. During my PhD, I developed a set up for time-lapse imaging of “open book” spinal cords, to monitor the dynamics of guidance receptors in axons experiencing native guidance decisions across the midline. To visualize their cell surface sorting, receptors were fused to the pH-sensitive GFP, pHLuorin, whose fluorescence at neutral pH reports membrane protein pools (Nawabi et al, 2010; Delloye-Bourgeois et al, 2014), and were expressed in spinal commissural neurons through in ovo electroporation. This paradigm revealed striking differences in the temporal dynamics of Nrp2, Robo1, Robo2 and PlexinA1, the receptors known to mediate the responsiveness to the major midline repellents referenced in vertebrates: Slit-Ns, Slit-Cs and Semaphorin3B. Moreover, using super-resolution microscopy, I could evidence that PlexinA1 and Robo1 are sorted in distinct subdomains of commissural growth cones navigating the floor plate. I also introduced the pHLuo-tagged receptors in the mouse embryo. These experiments showed that the temporal sequences established in the chick are conserved in the mouse, and that FP crossing in Robo1/2 mutant embryos was rescued in growth cones that could achieve cell surface sorting of Robo1. Thus, my results show that guidance receptors for midline repellents have highly specific spatial and temporal dynamics. The generation of a temporal sequences of cell surface sorting thus represents a mechanism whereby commissural growth cones discriminate concomitant signals by functionalizing them at different timing of their spinal cord navigation

Lors du développement du système nerveux, les axones en croissance choisissent une<br />direction d'extension avec précision. Ce processus est permis par la détection sensible de<br />signaux de guidage par les récepteurs membranaires de la membrane du cône de croissance.<br />Nous avons étudié la dynamique de récepteurs individuels du GABA marqués par<br />des nanocristaux fluorescents. Les récepteurs répartis également dans la membrane d'un<br />cône de croissance soumis à un gradient de GABA sont spécifiquement redistribués vers sa<br />source. Cette réorganisation est due à des interactions avec les microtubules déplaçant les<br />récepteurs vers les régions à forte concentration de GABA, mises en évidence sur les trajectoires<br />des récepteurs. Son rôle fonctionnel a été révélé par la mesure d'une amplification<br />de l'asymétrie de la concentration intracellulaire de calcium, qui régule l'organisation du<br />cytosquelette. Ces observations permettent l'élaboration d'un modèle d'auto-organisation<br />des récepteurs, permettant une amplification du signal extérieur. Une faible activation<br />asymétrique des récepteurs induit une asymétrie de concentration de calcium et de l'organisation<br />du cytosquelette. Ceci crée une boucle de rétroaction positive en favorisant<br />la redistribution, qui renforce le signal induit par le gradient en amplifiant l'asymétrie<br />de la concentration de récepteurs et de calcium. L'auto-organisation des récepteurs est<br />décrite par un système d'équations stochastiques étudiées numériquement et analytiquement.<br />Les travaux présentés permettent de proposer un mécanisme général d'amplification<br />de signaux extérieurs dans l'axone en croissance et dans les systèmes chimiotactiques ou<br />polarisés.

Au cours du développement, les axones des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) voyagent sur de longues distances pour établir des connexions avec leurs cellules cibles. La navigation des cônes de croissance est guidée par différentes molécules chimiotropiques présentes dans leur environnement. Les endocannabinoïdes (eCB) sont d’importants neuromodulateurs qui régulent de manière rétrograde la fonction de nombreuses synapses du cerveau. Ils agissent principalement par le biais de leurs récepteurs liés à une protéine Gi/o CB1 (CB1R) et CB2 (CB2R). La présence des eCBs durant le stade fœtal et la période postnatale suggère leur implication dans des événements régulant le développement du système nerveux. Cette thèse confirme l’expression des récepteurs aux cannabinoïdes CB1 et CB2 ainsi que l’enzyme dégradant les eCBs lors du développement embryonnaire et perinatal des CGRs et de la voie rétinothalamique in vivo. La manipulation pharmacologique de l’activité de CB1R et CB2R réorganise la morphologie du cône de croissance des CGRs et des neurones corticaux in vitro. De plus, la stimulation locale avec un agoniste de CB1R ou de CB2R modifie le comportement du cône de croissance entraînant sa répulsion. CB1R et CB2R modulent par le biais de la voie de signalisation AMPc/PKA, la mobilisation de DCC à la membrane plasmique. Par ailleurs, les résultats de cette recherche démontrent également l’implication de CB1R et CB2R dans la ségrégation des projections ipsi- et controlatérales et le développement de la voie rétinothalamique. / Following differentiation, retinal ganglion cell (RGC) axons, tipped at their distal end by the growth cone (GC), navigate through relatively long distances in a highly directed manner in order to establish functional synapses with thalamic and superior colliculus (SC) neurons. This is achieved with the help of extracellular guidance molecules which steer RGC axon growth by regulating GC morphology by means of attractive and/or repulsive mechanisms. In the adult brain, endocannabinoids (eCBs) exert an important neuromodulatory function by acting as retrograde messengers to regulate the function of many synapses. Endocannabinoids act mainly via their Gi/o protein coupled receptors CB1 (CB1R) and CB2 (CB2R). Due to their presence at the fetal and early postnatal periods, it has been proposed that eCBs and their receptors might be involved in several developmental events, such as cell proliferation and migration, axon guidance and synaptogenesis. We observed that during early postnatal development, components of the eCB system are expressed along the visual pathway (the optic chiasm, the lateral geniculate nucleus and the SC). To assess the implication of the eCB system, in vitro, embryonic retinal explant and primary neuron cultures were treated with pharmacological agonists and inverse agonists of CB1R and CB2R. These experiments demonstrated that these cannabinoid receptors modify the GC’s morphology. Most importantly, CB1R and CB2R act through the cAMP/PKA pathway to modulate the presence of DCC at the plasma membrane. In vivo, CB1R and CB2R play a major role and the absence of either one of them induces a decrease in eye-specific segregation of retinal projections. These results show an implication of CB1R and CB2R during RGC growth and retinothalamic development.

Chez les animaux à vision binoculaire, la vision tridimensionnelle permet la perception de la profondeur grâce à l'intégration de l'information visuelle en provenance des deux yeux. La première étape de cette intégration est rendue possible anatomiquement par la ségrégation des axones controlatéraux et ipsilatéraux des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) au niveau du chiasma optique. Les axones controlatéraux croisent la ligne médiane au chiasma en route du nerf optique vers le cerveau. À l’inverse, les axones ipsilatéraux s'écartent du chiasma et continuent dans le tractus optique ipsilatéral, en évitant la ligne médiane vers leurs cibles cérébrales. Les mécanismes moléculaires à la base de ce phénomène ne sont pas complètement compris. Les études présentées dans cette thèse montrent que Boc, le récepteur de Sonic Hedgehog (Shh) dans le guidage axonal, est enrichi dans les CGRs ipsilatérales de la rétine en développement. La présence de Shh sur la ligne médiane, et le mode d'expression complémentaire du récepteur nous ont conduit à émettre l'hypothèse que Shh pourrait repousser les axones ipsilatéraux au niveau du chiasma en activant le récepteur Boc. Conformément à cette hypothèse, nous avons constaté que seulement les CGR exprimant Boc se rétractent in vitro en réponse à Shh et que cette réponse est perdue dans les CGR mutantes pour Boc. In vivo, nous démontrons que Boc est requis pour la ségrégation normale des axones ipsilatéraux au niveau du chiasma optique et, inversement, que l'expression ectopique de Boc dans les CGR contralatérales empêche leurs axones de traverser le chiasma optique. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que Shh repousse les axones ipsilatéraux au niveau du chiasma optique par son récepteur Boc. Cette première partie de notre travail identifie un nouveau couple ligand-récepteur requis pour la ségrégation des axones au niveau du chiasma optique. Une interaction moléculaire impliquée dans cette ségrégation implique l’éphrine-B2 et ses récepteurs EphB (EphB1). Dans la deuxième partie de notre travail, nous montrons, in vivo, en utilisant des souris doubles et quadruples mutantes pour les récepteurs Boc, EphB1 ou les trois récepteurs EphB, que l’abrogation des deux voies de signalisation Shh et éphrine-B2 conduit à l'absence de projections ipsilatérales. Ceci indique que les deux signalisations agissent de façon indépendante dans des voies parallèles. De manière intéressante, ces souris mutantes ont été utilisées comme modèle génétique pour démontrer des défauts dans la perception de la profondeur de champs chez des animaux dépourvus de projections visuelles ipsilatérales. Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que la formation des projections rétiniennes ipsilatérales est essentielle à l’établissement de la vision binoculaire et dépend des voies induites par les récepteurs d’éphrine-B2 et Shh. / In animals with binocular vision, three dimensional vision allows perception of depth through the integration of visual information from both eyes. The first step of this integration is possible anatomically with the segregation of contralateral and ipsilateral axons at the optic chiasm. Contralateral axons cross the chiasm midline as they progress from the optic nerve to the optic tract. In contrast, ipsilateral axons deviate from the chiasm and continue in the ipsilateral optic tract. The molecular mechanism underlying this phenomenon is not completely understood. The studies presented in this thesis show that the Sonic Hedgehog (Shh) receptor Boc is enriched in ipsilateral RGCs of the developing retina. Together with the presence of Shh at the midline, this complementary expression pattern led us to hypothesize that Shh might repel ipsilateral RGC axons at the chiasm. Consistent with this hypothesis, we found that only Boc positive RGC axons retract in vitro in response to Shh and that this response is lost in Boc mutant RGCs. In vivo, we show that Boc is required for the normal segregation of ipsilateral axons at the optic chiasm and, conversely, that Boc expression in contralateral RGCs prevents their axons from crossing the optic chiasm. Taken together, these results suggest that Shh repels ipsilateral RGC axons at the optic chiasm via its receptor Boc. This first part of this thesis identifies a novel receptor required for the segregation of axons at the optic chiasm. The other couple ligand-receptor involved in this segregation is the Ephrin-B2/EphB signalling. In the second part of this thesis, I show that in vivo, the abrogation of both signalling pathways using quadruple knockout mice of the receptor Boc and three EphB receptors led to the absence of ipsilateral projections, indicating that Shh and ephrinB2 signalling act independently in two parallel pathways. More importantly, these animals, used as a new genetic model to perform visual tests, had a diminished ability to perceive depth. Thus, this thesis demonstrates for the first time that the establishment of ipsilateral retinal projections, essential for accurate binocular vision and perception of depth, is made possible by the combination of EphB and Shh signalling.

Le syndrome des mouvements en miroir congénitaux (MMC) est une maladie génétique caractérisée par l’existence de mouvements involontaires symétriques d’une main qui reproduisent à l’identique les mouvements volontaires de l’autre main. Deux structures sont impliquées dans la physiopathologie de cette maladie : le corps calleux (CC) et le faisceau corticospinal (FCS). Deux gènes ont été liés aux MMC à ce jour : DCC et RAD51. Tandis que DCC joue un rôle crucial dans le guidage des axones commissuraux, RAD51 intervient dans la réparation de l’ADN, et son rôle dans le développement du système moteur était inattendu.Chez la souris, nous avons étudié le rôle de RAD51 et DCC dans le développement du FCS et du CC, ainsi que l’implication de ces deux structures dans la latéralisation du contrôle moteur. Nous avons prouvé que DCC contrôle le guidage du FCS à la ligne médiane de façon indirecte. RAD51 intervient dans le développement du neocortex, mais son rôle précis dans le développement du système moteur demeure inconnu. Nous avons par ailleurs comparé un groupe de patients MMC à des volontaires sains afin d’étudier la latéralisation de l’activité corticale lors de la préparation motrice. L’activation et les interactions inter-hémisphériques des aires motrices sont anormales dès la préparation du mouvement chez les patients MMC. L’inhibition de l’aire motrice supplémentaire (AMS) chez les volontaires sains reproduit les défauts d’interactions inter-hémisphériques observés chez les patients. Ces résultats suggèrent que l’AMS est impliquée dans la préparation des mouvements latéralisés, potentiellement en modulant les interactions entre les deux hémisphères via le CC. / Mirror movements are involuntary symmetrical movements of one side of the body that mirror voluntary movements of the other side. Congenital mirror movements (CMM) is a rare genetic disorder transmitted in autosomal dominant manner, in which mirror movements are the only clinical abnormality. Two structures are involved in the physiopathology of CMM: the corpus callosum (CC) and the corticospinal tract (CST). The two main culprit genes identified so far are DCC and RAD51. While the role of DCC in commissural axons guidance during development is well known, RAD51 is involved in DNA repair, and its link with CMM was totally unexpected. In mice, we investigated the role of RAD51 and DCC in the development of the CC and CST, as well as the role of these two structures in motor lateralization. We showed that DCC controls CST midline crossing in an indirect manner. Our work clarified the role of RAD51 in neocortex development, but how RAD51 influences motor system development remains unknown. We compared a group of CMM patients with healthy volunteers to investigate the lateralization of cortical activity during movement preparation. We showed that activation of motor/premotor areas and interhemispheric interactions during movement preparation differed between the CMM patients and healthy volunteers. Transient inhibition of the supplementary motor area (SMA) in the healthy volunteers resulted in abnormal interhemispheric interactions during movement preparation, reminiscent of the situation observed in the patients. These results suggest the SMA is involved in lateralized movements preparation, potentially by modulating interhemispheric interactions via the CC.

Les circuits nerveux s'organisent autour des grands axes de polarité du corps. Au cours du développement, la navigation ainsi que l'arrangement spatial des projections au sein de leurs territoires cibles sont contrôlés par de nombreux facteurs de guidage. Pendant ma thèse je me suis intéressée à deux modèles de formation des circuits neuronaux présentant une polarité dans l'axe droite-gauche. Le premier concerne la mise en place des projections des interneurones commissuraux de la moelle épinière, un modèle de navigation orientée et le second, porte sur l'innervation des motoneurones phréniques, un modèle d'organisation asymétrique dans le territoire cible. Les mouvements comme la marche, la course ou la nage font intervenir des circuits neuronaux particuliers dédiés à la coordination des deux côtés du corps. Ces circuits sont formés majoritairement par les projections des interneurones commissuraux de la moelle épinière. Au cours du développement, ces interneurones élaborent un axone qui traverse la ligne médiane partageant les deux moitiés du système nerveux central pour se connecter aux motoneurones ou à d'autres interneurones de l'hémi-moelle opposée. De nombreux travaux ont porté sur les mécanismes de traversée de la ligne médiane et ont mis en évidence un rôle fondamental de facteurs de guidage comme la Nétrine, les Slit et les Sémaphorines. Ces molécules sont secrétées par les cellules de la plaque du plancher (PP) environnant la ligne médiane ventrale. Lors de leur traversée les axones commissuraux sont tout d'abord attirés par les signaux attractifs secrétés par les cellules de la PP. Une fois que les axones ont traversé la ligne médiane, ils perdent leur sensibilité aux facteurs attractifs et développent des nouvelles sensibilités pour des facteurs répulsifs qui les guident hors de la PP. Une étude menée par mon équipe a permis de montrer que les axones commissuraux acquièrent une réponse à la Sémaphorine3B seulement après avoir traversé la ligne médiane. Dans cette étude, l'équipe a montré que pendant la phase qui précède la traversée de la PP, une protéase, la Calpaine-1, dégrade la Plexine-A1, le corécepteur de Sema3B (Nawabi et al., 2010). L'inhibition de cette voie pendant la traversée de la PP conduit à la stabilisation de la PlexineA1 à la surface du cône de croissance et la formation d'un complexe récepteur de Sema3B fonctionnel composé de la Plexine-A1 et de la sous-unité de liaison de Sema3B, la Neuropiline2. La suppression de l'activité Calpaine est contrôlée par des signaux de la PP dont la nature n'était pas connue. Au cours de ma thèse j'ai identifié et caractérisé les contributions fonctionnelles de deux signaux de la PP qui sont responsables de la suppression de l'activité Calpaine et la sensibilisation des axones à Sema3B après la traversée. Ces résultats ont permis d'élargir les fonctions du facteur neurotrophique gdnf, et d'apporter de nouveaux éléments sur les voies de contrôle de la signalisation Sémaphorine, les processus de traversée et les modulations post-traductionnelles des récepteurs Plexines. Dans un deuxième projet, je me suis intéressée aux asymétries droite-gauche du système nerveux, par l'étude d'un nouvel exemple de circuit neuronal asymétrique : l'innervation motrice du diaphragme. Le diaphragme est un muscle indispensable à la respiration, il est composé d'une région centrale tendineuse et de deux muscles latéraux. Ces muscles sont innervés par un groupe particulier de motoneurones provenant de la moelle épinière cervicale, qui forment les nerfs phréniques droits (D) et gauches (G). Malgré une position centrale dans l'organisme et une morphologie apparente symétrique, nous avons découvert que le diaphragme présente une asymétrie musculaire ainsi qu'une asymétrie nerveuse. Etonnamment les motoneurones phréniques établissent un motif de connexion typique et différent sur les muscles droit et gauche du diaphragme [etc...] / The nervous circuits have stereotype positions within the major body axes. During development, axonal navigation and special positioning of the axon tracts in the target territories are regulated by many axon guidance factors. During my thesis I have been interested in two models of neuronal circuit formation that present a leftright polarity. The first one concerns the formation of the spinal commissural neurons projections, a model of oriented navigation along the left-right axis and the second one is the innervation of the phrenic motoneurons, a novel model of left-right asymmetric innervation pattern. Rhythmic locomotor movements like walking, running or swimming require neuronal circuits ensuring left-right coordination. Central components of these circuits are commissural neurons of the spinal cord. During development theses neurons are projecting axons across the midline that divides the nervous system in two parts, which connect the contralateral side of the spinal cord. Extensive work focused on the mechanisms controlling midline crossing. These study revealed a fundamental role of guidance factors secreted by floor plate cells at the ventral midline such as Netrins, Slits and Semaphorins. They also revealed that before crossing, axons are attracted towards the floor plate, and navigating by the floor plate they lose responsiveness to these attractive factors and develop a new sensitivity to repulsive cues that drive them out of the floor plate. In a previous study, my team showed that commissural axons gain response to Sema3B only after floor plate crossing (Nawabi et al., 2010). Before crossing, Plexin-A1 the Sema3B receptor is processed by a protease: the Calpain1. During crossing suppression of this pathway enable Plexin-A1 expression at growth cone surface, leading to sensitization to Sema3B. The suppression of Calpain activity was found controlled by floor plate signals, which remained unknown. During my thesis I have identified and characterized the functional contribution of two floor plate signals that are responsible for the inhibition of Calpain activity and axon sensitization to Sema3B after midline crossing: the neurotrophic factor gdnf and the cell adhesion molecule NrCAM. My results bring new elements on the control of midline crossing processes, Semaphorin signaling, and post-translational modifications of the Plexins receptors. In my second project, I have been interested in left-right asymmetries of the nervous system through the study of a new model of left-right asymmetry: the diaphragm innervation. The diaphragm is a muscle essential for breathing, it is composed of one central tendinous region and two lateral muscles. These muscles are innervated by a subset of cervical spinal cord motoneurons which forms the left and right phrenic nerves. Despite its central disposition in the organism and its apparent symmetry, we noticed that the diaphragm presents nervous and muscular asymmetries. Surprisingly phrenic motoneurons present typical and different nerve patterns on the left and right diaphragm muscles. Diverse left-right characteristic have been documented in the brain but none concerned yet the spinal cord or peripheral projections. My thesis work has been dedicated to the identification of the mechanisms that control the asymmetry of the diaphragm innervation. My work showed that this asymmetry is set up very early during development via a molecular pathway that is known to control the visceral organ asymmetry. This work opens numerous perspectives and brings new information on the molecular diversity of spinal neurons that could shed a new light on the mechanisms of motoneuron physiopathology

Durant le développement du système visuel, les cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) envoient des axones qui seront influencés par divers signaux guidant leur cône de croissance, permettant ainsi la navigation des axones vers leurs cibles terminales. Les endocannabinoïdes, des dérivés lipidiques activant les récepteurs aux cannabinoides (CB1 et CB2), sont présents de manière importante au cours du développement. Nous avons démontré que le récepteur CB2 est exprimé à différents points du tractus visuel durant le développement du hamster. L’injection d’agonistes et d’agonistes inverses pour le récepteur CB2 a modifié l’aire du cône de croissance et le nombre de filopodes présents à sa surface. De plus, l’injection d’un gradient d’agoniste du récepteur CB2 produit la répulsion du cône de croissance tandis qu’un analogue de l’AMPc (db-AMPc) produit son attraction. Les effets du récepteur CB2 sur le cône de croissance sont produits en modulant l’activité de la protéine kinase A(PKA), influençant la présence à la membrane cellulaire d’un récepteur à la nétrine-1 nommé Deleted in Colorectal Cancer (DCC). Notamment, pour que le récepteur CB2 puisse moduler le guidage du cône de croissance, la présence fonctionnelle du récepteur DCC est essentielle.. Suite à une injection intra-occulaire d’un agoniste inverse du récepteur CB2, nous avons remarqué une augmentation de la longueur des branches collatérales des axones rétiniens au niveau du LTN (noyau lateral terminal). Nous avons également remarqué une diminution de la ségrégation des projections ganglionnaires au niveau du dLGN, le noyau genouillé lateral dorsal, chez les animaux transgéniques cnr2-/-, ayant le gène codant pour le récepteur CB2 inactif. Nos données suggèrent l’implication des endocannabinoïdes et de leur récepteur CB2 dans la modulation des processus de navigation axonale et de ségrégation lors du développement du système visuel. / Retinal projection navigation towards their visual targets is regulated by guidance molecules and growth cone transduction mechanisms. Here, we show that cannabinoid receptor 2 (CB2R) is widely expressed throughout the visual pathway during development and in cultured retinal ganglion cells (RGCs) and cortical neurons. Both the number of filopodia and the surface area of the growth cone (GC) are modulated by CB2R activity in a PKA-dependant manner. Furthermore, DCC is required for CB2R induced morphological changes of the GC. CB2R agonists induce GC chemorepulsion. Treatments altering CB2R activity change retinal explants projections length. These effects are specific to CB2R as no changes were observed in cnr2 knockout mouse. A single intraocular injection of AM630 increases retinal projection branch length and aberrant projections were also observed. Moreover, we report defect in eye-specific segregation of retinal projections in the dLGN in cnr2-/- mice. These findings highlight the modulatory role of endocannabinoids and their CB2R during axon guidance.

Afin de mieux comprendre l’évolution des fonctions du récepteur EphA4 pendant le développement du système nerveux central (SNC), nous avons étudié sa localisation cellulaire et subcellulaire dans l’hippocampe du rat, d’abord chez l’adulte, puis pendant le développement postnatal, ainsi que ses rôles potentiels dans la genèse, la migration ou la maturation des cellules granulaires dans l’hippocampe adulte. Pour ce faire, nous avons utilisé la méthode d’immunocytochimie en microscopie photonique, électronique et confocale. En microscopie photonique, une forte immunoréactivité (peroxydase/DAB) pour EphA4 est observée aux jours 1 et 7 suivant la naissance (P1 et P7) dans les couches de corps cellulaires, avec un marquage notamment associé à la surface des corps cellulaires des cellules granulaires et pyramidales, ainsi que dans les couches de neuropile du gyrus dentelé et des secteurs CA3 et CA1. L’intensité du marquage diminue progressivement dans les couches de corps cellulaires, entre P7 et P14, pour devenir faible à P21 et chez l’adulte, tandis qu’elle persiste dans les couches de neuropile, sauf celles qui reçoivent des afférences du cortex entorhinal. En microscopie électronique, après marquage à la peroxydase/DAB, EphA4 décore toute la surface des cellules pyramidales et granulaires, du corps cellulaire jusqu’aux extrémités distales, entre P1 et P14, pour devenir confiné aux extrémités synaptiques, c’est-à-dire les terminaisons axonales et les épines dendritiques, à P21 et chez l’adulte. À la membrane plasmique des astrocytes, EphA4 est redistribué comme dans les neurones, marquant le corps cellulaire et ses prolongements proximaux à distaux, à P1 et P7, pour devenir restreint aux prolongements périsynaptiques distaux, à partir de P14. D’autre part, des axones en cours de myélinisation présentent souvent une forte immunoréactivité punctiforme à leur membrane plasmique, à P14 et P21. En outre, dans les neurones et les astrocytes, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi et les vésicules de transport, organelles impliquées dans la synthèse, la modification posttraductionnelle et le transport des protéines glycosylées, sont aussi marqués, et plus intensément chez les jeunes animaux. Enfin, EphA4 est aussi localisé dans le corps cellulaire et les dendrites des cellules granulaires générées chez l’adulte, au stade de maturation où elles expriment la doublecortine (DCX). De plus, des souris adultes knockouts pour EphA4 présentent des cellules granulaires DCX-positives ectopiques, c’est-à-dire positionnées en dehors de la zone sous-granulaire, ce qui suggère un rôle d’EphA4 dans la régulation de leur migration. Ces travaux révèlent ainsi une redistribution d’EphA4 dans les cellules neuronales et gliales en maturation, suivant les sites cellulaires où un remodelage morphologique s’effectue : les corps cellulaires lorsqu’ils s’organisent en couches, les prolongements dendritiques et axonaux pendant leur croissance, guidage et maturation, puis les épines dendritiques, les terminaisons axonales et les prolongements astrocytaires distaux associés aux synapses excitatrices, jusque chez l’adulte, où la formation de nouvelles synapses et le renforcement des connexions synaptiques existantes sont exercés. Ces localisations pourraient ainsi correspondre à différents rôles d’EphA4, par lesquels il contribuerait à la régulation des capacités plastiques du SNC, selon le stade développemental, la région, l’état de santé, ou l’expérience comportementale de l’animal. / To gain more insight into the various functions of EphA4 receptor during the development of the central nervous system (CNS), we have characterized its cellular and subcellular localization in the rat hippocampus, first in the adult, and second during the postnatal development. We have also examined its potential roles in the genesis, migration, or maturation of the granule cells in the adult hippocampus. For that purpose, we have used immunocytochemistry in light, electron, and confocal microscopy. At the light microsocpic level, a strong EphA4 immunoreactivity (peroxidase/DAB) is observed at postnatal days 1 and 7 (P1 and P7) in the cell body layers, with a labeling notably associated with the surface of pyramidal and granule cell bodies, as well as in the neuropil layers of CA3, CA1, and dentate gyrus regions. The intensity of the labeling diminishes progressively in the cell body layers, between P7 and P14, to become weak at P21 and in the adult, while it persists in the neuropil layers, except in those receiving inputs from the entorhinal cortex. At the electron microscopic level, after peroxidase/DAB labeling, EphA4 covers the entire surface of pyramidal and granule cells, from the cell body to the distal extremities, between P1 and P14, but becomes restricted to the synaptic extremities, i.e. the axon terminals and dendritic spines, at P21 and in the adult. At the plasma membrane of astrocytes, EphA4 is redistributed as in neurons, from the cell body and proximal to distal processes, at P1 and P7, to the distal perisynaptic processes, at P14 and older ages. In addition, axons in the process of myelination present strong punctiform immunoreactivity at their plasma membrane, at P14 and P21. Moreover, in neurons and astrocytes, the endoplamic reticulum, Golgi apparatus, and transport vesicles, organelles involved in the synthesis, post-translational modifications, and transport of glycosylated proteins, are also labeled, and also more intensely in younger animals. Lastly, EphA4 is located in the cell body and dendrites of adult-generated granule cells, at the stage of maturation where they express doublecortin (DCX). In addition, EphA4 adult knockout mice display DCX-positive granule cells in an ectopic position, outside of the subgranular zone, suggesting a role for EphA4 in the regulation of their migration. This work thus reveals a redistribution of EphA4 in neuronal and glial cells, in the cellular sites where cellular motility occurs during their maturation: the cell bodies when they position and organize themselves into layers, the dendritic and axonal processes during their growth, guidance, and maturation, and the dendritic spines, axon terminals, and distal astrocytic processes when synapses are formed or strengthened. These locations could thus reflect different roles for EphA4, similarly associated with the regulation of plasticity in the CNS, according to the stage of development, the region, the CNS integrity, or the behavioural experience of an animal.

La maladie de Parkinson (MP) est caractérisée par une dégénérescence des neurones dopaminergiques de la voie nigrostriée. La thérapie cellulaire, par transplantation intranigrale de cellules fœtales issues de mésencéphale ventral (MV), assure un rétablissement anatomique et fonctionnel de cette voie. Des molécules de guidage axonal (MGA) joueraient ainsi un rôle dans la reconnexion axonale des cellules transplantées. Pour tester cette hypothèse, nous avons étudié l'expression de MGA dans le cerveau adulte intact et dans des cellules destinées à la transplantation, ainsi que dans le cerveau adulte d'un modèle murin de la MP après transplantation. Dans le tissu intact, nous avons montré que semaphorin7A (Sema7A) et Sema3A et leurs récepteurs, plexinC1 et neuropilin1, conservent leur expression protéique. De plus, grâce à l'utilisation de puces à ADN, nous avons montré que les récepteurs Robo2, neuropilin1, neuropilin2, EphA5 et DCC sont exprimés de manière différentielle dans les deux populations cellulaires utilisées pour la transplantation. Ceci suggère que ces molécules seraient impliquées dans la restauration fonctionnelle observée. Enfin, dans le tissu lésé, nous avons observé, par RT-qPCR, des variations d'expression de l'ARNm de ces MGA après transplantation intranigrale des cellules fœtales du MV, suggérant plus particulièrement l'implication de Sema3A, Sema3F et Sema7A dans la reconstruction de la voie. Ce travail met en lumière l'action de sémaphorines dans le guidage axonal des cellules transplantées. L'intégration de ces MGA dans les procédures de transplantation pourrait aider à optimiser les procédures de thérapie cellulaire dans la MP. / Parkinson's disease (PD) is characterised by the degeneration of the dopaminergic nigrostriatal pathway. Cell therapy using intranigral transplantation of foetal ventral mesencephalon (VM) cells in a mouse model of PD results in anatomical and functional reconstruction of the pathway. This suggests a role for axon guidance molecules (GMs) in reconnecting transplanted cells to their striatal target. To test this hypothesis, we studied the expression of axon GMs in the intact adult brain, on cells used for transplantation and in a mouse model of PD after cell therapy. In the intact brain, we showed that GMs as semaphorin7A (Sema7A) and Sema3A and their corresponding receptors, plexinC1 and neuropilin1, retain an expression at the protein level, therefore showing a possible role for these guidance cues in the adult brain. Moreover, using microarray, we studied GM receptor expression profiles in two types of cells used for transplantation and exhibiting different functional ameliorations. Robo2, neuropilin1, neuropilin2, EphA5 and DCC receptors showed differential expression between the two cellular populations, indicating their possible contribution to the different functional outcomes observed. In the lesioned mouse brain, we observed, using RT-qPCR, variations of mRNA expression of these axon GMs after intranigral transplantation of foetal VM derived cells, thus suggesting the implication of Sema3A, Sema3F, and Sema7A in the reconstruction of the pathway. Overall, this work highlights particular importance of semaphorins in the nigrostriatal pathway reconstruction. Integrating these cues in transplantation procedures can possibly optimize cell therapy for PD patients.

Durant le développement du système visuel, les cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) envoient des axones qui seront influencés par divers signaux guidant leur cône de croissance, permettant ainsi la navigation des axones vers leurs cibles terminales. Les endocannabinoïdes, des dérivés lipidiques activant les récepteurs aux cannabinoides (CB1 et CB2), sont présents de manière importante au cours du développement. Nous avons démontré que le récepteur CB2 est exprimé à différents points du tractus visuel durant le développement du hamster. L’injection d’agonistes et d’agonistes inverses pour le récepteur CB2 a modifié l’aire du cône de croissance et le nombre de filopodes présents à sa surface. De plus, l’injection d’un gradient d’agoniste du récepteur CB2 produit la répulsion du cône de croissance tandis qu’un analogue de l’AMPc (db-AMPc) produit son attraction. Les effets du récepteur CB2 sur le cône de croissance sont produits en modulant l’activité de la protéine kinase A(PKA), influençant la présence à la membrane cellulaire d’un récepteur à la nétrine-1 nommé Deleted in Colorectal Cancer (DCC). Notamment, pour que le récepteur CB2 puisse moduler le guidage du cône de croissance, la présence fonctionnelle du récepteur DCC est essentielle.. Suite à une injection intra-occulaire d’un agoniste inverse du récepteur CB2, nous avons remarqué une augmentation de la longueur des branches collatérales des axones rétiniens au niveau du LTN (noyau lateral terminal). Nous avons également remarqué une diminution de la ségrégation des projections ganglionnaires au niveau du dLGN, le noyau genouillé lateral dorsal, chez les animaux transgéniques cnr2-/-, ayant le gène codant pour le récepteur CB2 inactif. Nos données suggèrent l’implication des endocannabinoïdes et de leur récepteur CB2 dans la modulation des processus de navigation axonale et de ségrégation lors du développement du système visuel. / Retinal projection navigation towards their visual targets is regulated by guidance molecules and growth cone transduction mechanisms. Here, we show that cannabinoid receptor 2 (CB2R) is widely expressed throughout the visual pathway during development and in cultured retinal ganglion cells (RGCs) and cortical neurons. Both the number of filopodia and the surface area of the growth cone (GC) are modulated by CB2R activity in a PKA-dependant manner. Furthermore, DCC is required for CB2R induced morphological changes of the GC. CB2R agonists induce GC chemorepulsion. Treatments altering CB2R activity change retinal explants projections length. These effects are specific to CB2R as no changes were observed in cnr2 knockout mouse. A single intraocular injection of AM630 increases retinal projection branch length and aberrant projections were also observed. Moreover, we report defect in eye-specific segregation of retinal projections in the dLGN in cnr2-/- mice. These findings highlight the modulatory role of endocannabinoids and their CB2R during axon guidance.