Abstract Acute pancreatitis is a common disease, Finland being among the countries with the highest incidence. The majority of patients have a mild, self-limiting disease. However, 20% of these patients develop severe necrotizing pancreatitis with a mortality rate of 7 to 25%. The mechanisms for developing the severe disease are not known, it is not possible to accurately forecast the severity of the disease and there is no curative treatment yet. This study was aimed at analyzing the early phase of acute experimental porcine oedematous and necrotizing pancreatitis. In Study I, the pancreatic microcirculatory changes were measured and the expression of tight junction proteins (claudins-2, -3, -4, -5 and -7) and the rate of apoptosis in the pancreas were all measured. In Study II, bacterial translocation to the blood in the portal vein blood or to the mesenteric lymph nodes was analyzed and the intestinal expression of tight junction proteins (claudins-2, -3, -4, -5 and -7) and the intestinal apoptosis/ proliferation rates were measured. The basic histology of the jejunum and colon were analyzed. Study III analyzed which cytokines are released from the pancreas to the portal venous blood. In Study IV, the ultrastructure of the epithelium of the jejunum and colon was analyzed and the expression of adherens junction proteins, E-cadherin and β-catenin, were measured from both jejunum and colon. The first study (I) showed that membranous immunoreactivity of claudin-2 in acinar cells appeared in the pancreas during acute oedematous and necrotizing pancreatitis. The expressions of claudins -3, - 4, - 5 and 7 were unaffected. The second study (II) showed that bacterial translocation from the gut was not present at the beginning of acute porcine pancreatitis. The expressions of claudins-2 and -5 do not become altered; however, there might be some decrease in claudin-3 expression in the colon and decrease in the expression of claudins-4 and -7 in the jejunum in necrotizing pancreatitis. Performing the laparotomy itself caused increased apoptosis in the colon and the jejunum. In the third study (III), the initial inflammatory process was diverse in oedematous and necrotizing pancreatitis. Increased monocyte count in combination with elevated PDGF and IL-6 are characteristic of necrotizing pancreatitis in our model. The fourth study (IV) indicated that necrotizing pancreatitis caused damage to the epithelial and endothelial cells of the colon in the early stages of the disease. The expression of E-cadherin immunoreactivity showed a decreasing trend in the colon in both oedematous and necrotizing pancreatitis. The results of this study suggest that claudin-2 increases in acinar cells during acute porcine pancreatitis. Bacterial translocation is not present during the early phase of acute porcine pancreatitis. Increased monocyte count and elevated PDGF and IL-6 are characteristic of early phase necrotizing porcine pancreatitis and necrotizing porcine pancreatitis causes damage to the epithelial and endothelial cells of the colon. / Tiivistelmä Akuutti haimatulehdus on yleinen sairaus, jonka ilmaantuvuus Suomessa on verrattain suuri. Suurimmalla osalla potilaista tauti on lievä ja itsestään paraneva. Kuitenkin 20 %:lle potilaista kehittyy vaikea haimatulehdus, johon liittyy 7–25 %:n kuolleisuus. On epäselvää, miksi toisinaan kehittyy vaikea tautimuoto. Taudin vaikeusastetta ei voida etukäteen tarkasti ennustaa, eikä tautiin ole parantavaa hoitoa. Väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia lievän ja vaikean haimatulehduksen varhaisvaihetta kokeellisessa sikamallissa. Työssä I mitattiin haiman mikroverenkierron muutoksia, tutkittiin tiivisliitosproteiinien klaudiini-2:n, -3:n, -4:n, -5:n ja -7:n ilmenemistä sekä apoptoosin määrää haimassa. Toisessa työssä tutkittiin mahdollista bakteeritranslokaatiota porttilaskimovereen ja vatsaontelon imusolmukkeisiin, mitattiin suoliston tiivis liitos-proteiinien klaudiinien-2, -3, -4, -5 ja -7 ilmenemistä ja suoliston apoptoosin ja soluproliferaation määrää. Mahdollisia muutoksia ohut- ja paksusuolen perushistologiassa analysoitiin. Kolmannessa työssä mitattiin sytokiinipitoisuuksia porttilaskimoverestä. Neljännessä työssä analysoitiin ohut- ja paksusuolen mikrorakennetta elektronimikroskopian avulla ja mitattiin vyöliitosproteiinien E-cadherin ja β-catenin määrää. I työssä todettiin klaudiini-2:n ilmaantuvan haiman asinaarisolujen solukalvoille lievässä ja vaikeassa kokeellisessa haimatulehduksessa. Klaudiinien 3,- 4,- 5 ja 7 esiintyminen haimassa ei muuttunut. II työssä todettiin, että bakteeritranslokaatiota ei tapahtunut seuranta-aikana. Suolistossa klaudiinien-2 ja -5 ilmenemisessä ei tapahtunut muutoksia. Klaudiini-3:n ilmenemisessä paksusuolessa ja klaudiinien -4 ja -7 ilmenemisessä ohutsuolessa saattaa tapahtua vähenemistä vaikeassa haimatulehduksessa. Tutkimustoimenpide itsessään aiheutti ohut- ja paksusuolen apoptoosin lisääntymistä. III työn mukaan tulehdusvaste oli erilainen akuutissa lievässä ja vaikeassa kokeellisessa haimatulehduksessa. Monosyyttimäärän sekä PDGF:n ja IL-6:n pitoisuuksien lisääntyminen, olivat tyypillisiä vaikealle haimatulehdukselle tässä mallissa. IV työssä todettiin, että vaikea haimatulehdus vaurioittaa paksusuolen epiteeli- ja endoteelisoluja. E-cadherin: n määrässä todettiin jonkin verran vähentymistä sekä lievässä että vaikeassa haimatulehduksessa. Näiden tulosten mukaan klaudiini-2 lisääntyy sian haiman asinaarisoluissa akuutissa haimatulehduksessa. Sialla ei tapahdu bakteerien translokaatiota haimatulehduksen varhaisvaiheessa. Sian vaikeaan haimatulehdukseen liittyy monosyyttien, PDGF:n ja IL-6:n lisääntyminen. Kokeellisessa vaikeassa haimatulehduksessa paksusuolen epiteeli- ja endoteelisolut vaurioituvat jo varhaisvaiheessa.

Abstract Heavy alcohol consumption places a substantial burden on health all over the world. Metabolites of alcohol evoke alterations that lead to tissue damage in many organs. Phosphatidylethanol (PEth) is a unique phospholipid formed in the cellular membranes during the metabolism of ethanol after alcohol consumption. PEth has attracted special attention as it is postulated to be a reliable marker of long term heavy alcohol consumption. The aims of present study were to investigate the immunogenicity of phosphatidylethanol in mice and to analyze the plasma antibodies binding to phosphatidylethanol in humans. In this study a clear immune response was generated in mice immunized with PEth in human low density lipoprotein (LDL) carrier. Mouse monoclonal IgM antibodies binding specifically to phosphoethyl head group of PEth were generated using hybridoma technology. Since PEth was shown to be immunogenic in mice, plasma was analyzed for the presence of antibodies also in humans. PEth-specific antibodies of IgG, IgA and IgM isotypes in plasma were detected in heavy drinkers of alcohol with or without pancreatitis as well as in the controls. The plasma levels of the antibodies binding to PEth were significantly lower in the study subjects with heavy alcohol use and in this present study sample the low IgA levels to PEth were better indicators of heavy alcohol consumption as compared to the some of the traditional markers of heavy alcohol use. The antibody levels to PEth associated significantly to plasma antibodies binding to malondialdehyde-acetaldehyde adducts that are known to be formed during alcohol metabolism but not to antibodies binding to phosphocholine which is generated by lipid oxidation in humans. In conclusion, this study demonstrates that phosphatidylethanol is immunogenic in mice when using carriers such as human LDL in the immunization process. The binding of the monoclonal antibodies specifically to the PEth head group suggests that it would be feasible to develop a diagnostic immunoassay to PEth. The presence of antibodies binding to PEth in plasma indicates that PEth may be a target of humoral immunity in humans. / Tiivistelmä Runsas alkoholinkulutus aiheuttaa maailmanlaajuisesti merkittäviä terveydellisiä haittoja. Alkoholin aineenvaihduntatuotteet muuttavat kudoksien rakenteita ja aiheuttavat kudosvaurioita. Fosfatidyylietanoli on alkoholin aineenvaihdunnan tuloksena solukalvoilla syntyvä fosfolipidi, jota on tutkittu kahdenkymmenen vuoden ajan lupaavana alkoholin suurkulutuksen merkkiaineena. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää fosfatidyylietanolin immunisoinnin aiheuttamaa vasta-aineiden muodostumista koe-eläinmallina käytetyissä hiirissä sekä määrittää ihmisten plasmanäytteistä vasta-aineita, jotka sitoutuvat fosfatidyylietanoliin. Tutkimuksessa havaittiin immuunivasteen muodostuminen hiirissä, jotka immunisoitiin ihmisen LDL hiukkasiin liitetyllä fosfatidyylietanolilla. Hiiren monoklonaalisia fosfatidyylietanoliin sitoutuvia IgM-luokan vasta-aineita tuotettiin tutkimuksessa soluviljelyn avulla. Fosfatidyylietanolin aiheuttama vasta-aineiden muodostuminen hiirillä johdatti mittaamaan fosfatidyylietanoliin sitoutuvia vasta-aineita myös ihmisiltä. Tutkimuksessa havaittiin fosfatidyylietanoliin sitoutuvia IgG-, IgA- ja IgM-luokan vasta-aineita alkoholin suurkuluttajilla, alkoholihaimatulehdusta sairastavilla ja verrokkihenkilöillä. Vasta-aineiden pitoisuudet olivat alkoholia runsaasti käyttävillä koehenkilöillä merkitsevästi pienemmät kuin verrokkiryhmällä. Matalat IgA-vasta-ainepitoisuudet osoittautuivat aineistossa paremmaksi alkoholin suurkulutuksen osoittajiksi kuin eräät tavanomaisesti käytetyt alkoholinkäytön merkkiaineet. Plasman fosfatidyylietanoli-vasta-aineiden ja alkoholin aineenvaihdunnan seurauksena syntyvien malondialdehydi-asetaldehydi-addukteihin sitoutuvien vasta-aineiden määrän välillä havaittiin merkitsevä yhteys, jota ei havaittu rasvojen hapettumisen seurauksena syntyvien fosfokoliini-vasta-aineiden ja fosfatidyylietanoli-vasta-aineiden välillä. Tutkimus osoittaa, että hiirillä voidaan aikaansaada vasta-ainevälitteinen immuunivaste, kun ne rokotetaan ihmisen LDL-hiukkaseen liitetyllä fosfatidyylietanolilla. Fosfatidyylietanoliin spesifisesti sitoutuvien monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen voi tulevaisuudessa johtaa immunologisen diagnostisen määritysmenetelmän kehittämiseen. Fosfatidyylietanoliin sitoutuvien plasman vasta-aineiden havaitseminen viittaa siihen, että fosfatidyylietanoli on vasta-ainevälitteisen immuunivasteen kohde myös ihmisillä.

Abstract Various genetic aetiologies — including mitochondrial diseases, chromosomal disorders, and other monogenic diseases — are involved in status epilepticus (SE), a common neurologic emergency occurring in children and adults that exhibits high rates of morbidity and mortality. The exact frequency of mitochondrial SE is currently undefined. Furthermore, patients with pathogenic variants of POLG1 encoding mitochondrial DNA polymerase gamma have an increased risk of acute liver failure (ALF) induced by the common antiepileptic drug, valproic acid (VPA), which is problematic due to these patients also often experiencing drug-resistant seizures. Overall, the role of liver transplantation (LT) in VPA-ALF due to mitochondrial disease has been controversial. In the present work, large retrospective cohort studies were conducted for two main purposes: (1) to determine the genetic aetiologies of SE among Finnish paediatric and adult patients by specifically focusing on the common mitochondrial genetic defects associated with an increased risk of SE and (2) to examine whether common POLG1 p.Q1236H and p.E1143G variants are connected to liver or pancreatic toxicity upon exposure to VPA monotherapy. This thesis also describes the characteristics of VPA-ALF associated with the pathogenic POLG1 variant p.W748S and the prognosis of LT in a retrospective case series. Mitochondrial diseases explained 4.5% of SE cases in the study cohort. Patients with mitochondrial SE suffered from refractory SE significantly more often than patients with other forms of genetic or non-genetic SE. Additionally, mortality rates were higher in patients with mitochondrial or chromosomal disorders compared with the other groups, reflecting the severity of the underlying condition and the higher frequency of refractory SE. POLG1 variants p.Q1236H and p.E1143G could not be identified as risk factors for VHT or pancreatic toxicity, implying that VPA treatment might be suitable for patients harbouring these variants when other pathogenic variants are absent. Finally, the homozygous status of the pathogenic POLG1 variant p.W748S and older age of the patient during the presentation of VPA-ALF seem to be associated with higher survival rates following LT, which should be considered in the management of VPA-ALF. / Tiivistelmä Useita perinnöllisiä syitä, kuten mitokondriotauteja, kromosomihäiriöitä ja muita geenimuutoksia on tunnistettu status epilepticuksen (SE) eli pitkittyneen epileptisen kohtauksen taustalla. SE on yleinen neurologinen hätätilanne, johon liittyy merkittävää oheissairastavuutta ja kuolleisuutta sekä lapsilla että aikuisilla. Mitokondriotauteihin liittyvän SE:n tarkkaa esiintyvyyttä ei tiedetä. Potilailla, joilla on patogeenisia variantteja mitokondrioiden DNA-polymeraasia koodaavassa tuman POLG1-geenissä, on todettu kohonnut riski yleisesti käytetyn epilepsialääkkeen valproaatin (VPA) aiheuttaman akuutin maksavaurion kehittymiselle. Tämä tekee lääkehoidon valinnasta ongelmallista, koska näillä potilailla on usein epilepsialääkkeille resistenttejä kohtauksia. Maksansiirron merkitys akuutin maksavaurion hoidossa mitokondriotauteja sairastavilla potilailla on ollut kiistanalainen. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää SE:n perinnöllisiä syitä suomalaisilla lapsi- ja aikuispotilailla retrospektiivisesti kerätyssä laajassa potilasaineistossa. Tutkimuksessa keskityttiin yleisimpiin mitokondriaalisiin perinnöllisiin muutoksiin, joiden on aiemmin todettu liittyvän SE:n lisääntyneeseen riskiin. Tutkimuksen toisena päätavoitteena oli selvittää väestössä yleisten POLG1-geenin muutosten eli varianttien p.Q1236H ja p.E1143G yhteyttä maksatoksisuuteen tai haimatoksisuuteen VPA-monoterapian aikana. Lisäksi tutkittiin VPA:n aiheuttaman maksavaurion kliinisiä erityispiirteitä patogeeniseen POLG1-varianttiin p.W748S liittyen sekä mutaatiostatuksen vaikutusta maksansiirron jälkeiseen ennusteeseen. Mitokondriotaudit selittivät 4,5 % SE-tapauksista tämän väitöskirjatyön potilasaineistossa ja näillä potilailla SE pitkittyi hoitoresistentiksi tai erittäin resistentiksi merkitsevästi muita potilasryhmiä useammin. Kuolleisuus oli suurin potilailla, joilla todettiin mitokondriotauti tai kromosomihäiriö, liittyen todennäköisimmin vakavaan taustasairauteen ja hoitoresistentin SE:n suurempaan esiintyvyyteen. Tutkittuja POLG1-variantteja p.Q1236H ja p.E1143G ei voitu tunnistaa maksa- tai haimatoksisuuden riskitekijöiksi, mikä tarkoittaa, että VPA-hoito voisi sopia näille potilaille, mikäli muita patogeenisiä variantteja ei todeta. Patogeenisen POLG1-variantin p.W748S homotsygoottisuus ja nuoruusikä tai varhainen aikuisikä maksavaurion ajankohtana ovat maksansiirron ennustetta parantavia tekijöitä, mikä tulisi ottaa huomioon hoitopäätöksiä tehtäessä.

Abstract Acute infected necrotizing pancreatitis (ANP) is a very complex disease with a high risk of complications and death. ANP is difficult to treat and is often associated with poor outcomes. Despite the increasing data on the technical details required to perform a mini-invasive necrosectomy for walled-off necrosis (WON), relatively few studies have focused on the presence and consequences of pancreatic duct disruption in the context of APN. Moreover, the long-term prognosis of patients with acute pancreatitis (AP) is scant. The aim of this study was to examine the diagnosis, treatment and prophylaxis of pancreatic fistulas (PFs) associated with APN. In addition, the long-term prognosis of AP was evaluated. The study population consists of the patients with AP treated at Oulu University Hospital, Finland (Studies I–IV) and Copenhagen University Hospital, Denmark (Study II) during 1995–2015. In the first part of the study, all consecutive patients following open necrosectomy for infected ANP were demonstrated to have PF. Endoscopic transpapillary pancreatic stenting (ETPS) was attempted and proven to be an effective and safe treatment for patients with PF. In Study II, prophylactic pancreatic stenting in the early stage of the disease was tested in a randomized controlled trial to the patients with ANP to prevent PFs associated with the disease. However, the study showed that the patients with ANP did not benefit from early prophylactic pancreatic ductal stenting (PPDS); instead, it seemed to be harmful for the patients. The results of Study III showed that single drain amylase level measurement after surgical necrosectomy is unreliable. According to this study, serial measurements are recommended to diagnose PFs after necrosectomy. Study IV including 1644 patients showed that AP, especially alcohol AP, was associated with a high long-term mortality. On the other hand, AP without an alcohol aetiology had a minimal impact on survival. In conclusion, in patients with infected ANP, a PF has to be considered in treatment, but the prevention of ductal leak with PPDS is not recommended. In addition, the poor long-term outcome among alcohol AP patients was due to alcohol-related diseases. / Tiivistelmä Akuutti nekrotisoiva haimatulehdus ja erityisesti siihen liittyvä bakteeri-infektio on sairaus, johon liittyy korkea komplikaatio- ja kuolleisuusriski. Tautia usein komplisoi infektion lisäksi nekroosiin liittyvä haimafisteli, joka tekee hoidosta entistä haasteellisemman. Viime aikaisissa tutkimuksissa on käsitelty runsaasti mini-invasiivista nekrosektomiaa, mutta suhteellisen vähän on tutkimuksia nekrotisoivaan haimatulehdukseen liittyvästä fisteliongelmasta. Haimatulehdus-potilaiden pitkäaikaisennuste on myös epäselvä. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli selvittää nekrotisoivaan haimatulehdukseen liittyvän haimafistelin yleisyyttä, diagnostiikkaa, ehkäisyä ja hoitoa. Lisäksi tarkasteltiin akuuttiin haimatulehdukseen sairastuneiden potilaiden pitkäaikaisennustetta. Ensimmäisessä osatyössä ilmeni, että kaikille potilaille, joille suoritettiin haiman nekrosektomia kehittyi fisteli ja endoskooppinen transpapillaarinen haimateiden stenttaus (ETPS) osoittautui hyväksi ja turvalliseksi hoidoksi fistelin hoidossa. Toisessa prospektiivisessa randomoidussa kontrolloidussa osatyössä tutkittiin profylaktista haimateiden stenttausta nekrotisoivassa haimatulehduksessa. Tutkimus osoitti, etteivät potilaat hyötyneet stenttauksesta: toimenpiteestä oli enemmän haittaa kuin hyötyä. Tämän tutkimuksen mukaan protetisointia ei suositella tehtäväksi taudin alkuvaiheessa. Kolmannessa osatyössä selvitettiin haiman nekrosektomian jälkeisen haimafistelin diagnosointia. Tutkimustuloksen mukaan haimafistelin osoittamiseksi dreenieritteen amylaasitasoa mittaamalla tarvitaan useita mittauskertoja, koska yksittäisen mittauksen sensitiivisyys on matala. Neljännessä osatyössä analysoitiin Oulun yliopistollisessa sairaalassa 1995–2012 akuutin haimatulehduksen sairastaneiden työikäisten potilaiden pitkäaikaisennustetta ja kuolinsyitä. Noin kymmenen vuoden seurannassa tutkimusryhmän (n = 1 644) kuolleisuus oli yli nelinkertainen verrattuna ikä- ja sukupuolivakioituihin verrokeihin (n = 8 220). Merkittävin kuolleisuutta lisäävä tekijä oli alkoholi. Tutkimuksemme osoitti, että infektoituneen haimanekroosiin liittyvä haimafisteli on huomioitava hoidossa. Varhaisesta profylaktisesta haimateiden protetisoinnista ei tutkimuksessa osoitettu olevan hyötyä. Alkoholin aiheuttaman haimatulehduksen pitkäaikaisennusteen mortaliteetti on korkea johtuen alkoholin käytöstä ja siihen liittyvistä sairauksista.