Abstract Production of recombinant proteins and organic molecules by microbial fermentation is a widely used process in pharmaceutical, biofuel, food and chemical industries. Micro-organisms are cultivated in a bioreactor enabling a proper environment and conditions for production of the desired product molecule. Usually, however, the conditions in the bioreactor are inhomogeneous because of technical limitations such as insufficient mixing. This causes gradients in various parameters such as temperature, ph, dissolved oxygen or substrate concentration, which can have a negative effect on product quality and quantity. Understanding the effects of such environmental variations for the host organism and product molecule are crucial for the bioprocess control. The aim of this dissertation was to study the metabolic and gene expression level response of Escherichia coli bacterium for variating conditions in the bioreactor. The responses for rapid temperature increase and oxygen limitation was studied by shift experiments. The effect of oscillating oxygen and glucose concentrations, typical for industrial scale processes, was studied with a scale-down model. The main results were obtained in the oxygen downshift experiments. It was shown that a non-canonical amino acid norvaline, known to replace leucine in recombinant proteins, is accumulated in significant concentration under oxygen limitation. The accumulation of norvaline was also observed in the scale-down model indicating that norvaline could also be found in large scale processes. The quantitative gene expression results for the norvaline pathway genes showed no clear response. This indicates that the norvaline formation occurs due to the changes on metabolic rather than transcriptional level. The second key result of this dissertation was the finding, that the accumulation of formate, a typical anaerobic metabolite, was diminished by medium boosted with trace amounts nickel, selenium and molybdenum, enabling the activity of formate degrading enzyme complex. The results of this dissertation can be utilized in the industrial process optimisation and as a basis for further bioprocess studies. / Tiivistelmä Vierasproteiinien ja orgaanisten molekyylien tuottaminen fermentoimalla on paljon käytetty menetelmä lääke-, bioenergia-, elintarvike- sekä kemianteollisuudessa. Mikrobit kasvatetaan bioreaktorissa, joka mahdollistaa sopivan kasvuympäristön ja tuotanto-olosuhteet halutulle tuotteelle. Usein bioreaktorin olosuhteet ovat kuitenkin epätasaiset teknisten rajoitteiden kuten riittämättömän sekoitustehon vuoksi. Tämä aiheuttaa eri muuttujien, kuten happi- ja ravinnepitoisuuden, pH:n tai lämpötilan vaihtelua ajan ja paikan suhteen, millä voi olla haitallinen vaikutus tuotteen laatuun tai saantoon. Ympäristötekijöiden muutosten isäntäsolulle tai tuotemolekyylille aiheuttamien vaikutusten ymmärtäminen ovat yksi ratkaisevista tekijöistä bioprosessien hallinnassa. Tässä väitöskirjassa tutkittiin Escherichia coli -bakteerin aineenvaihdunnan sekä geeniekspression vasteita bioreaktorin ajan ja paikan suhteen vaihtelevissa olosuhteissa. Hapenpuutteen ja lämpötilan nousun vaikutusta tutkittiin kokeilla, joissa olosuhdetta kertaluontoisesti ja nopeasti muutettiin. Teollisille fermentointiprosesseille tyypillistä happi- ja ravinnepitoisuuksien jatkuvaa vaihtelua tutkittiin suurta bioreaktoria jäljittelevällä pienoismallilla. Tärkeimmät tulokset liittyivät kokeisiin, joissa tutkittiin hapenpuutetta. Kokeissa kävi ilmi, että happirajoitetuissa olosuhteissa muodostuu huomattavia määriä epätavallista aminohappoa norvaliinia, jonka tiedetään korvaavan leusiinia vierasproteiineissa. Norvaliinin muodostumista havaittiin myös pienoismallilla tehdyissä kasvatuksissa, osoittaen että norvaliinia voi mahdollisesti löytyä myös suuren mitan prosesseista. Geeniekspressiomittaukset eivät osoittaneet muutoksia norvaliinin aineenvaihduntareitillä, osoittaen että havaittu norvaliinin muodostuminen tapahtuu aineenvaihdunnallisten muutosten seurauksena. Toinen tässä väitöstutkimuksessa saatu tärkeä tulos oli muurahaishapon kertymisen vähentyminen, kun kasvatusliuokseen lisättiin nikkeliä, seleeniä ja molybdeeniä aktivoimaan muurahaishappoa hajottavaa entsyymikompleksia. Tämän väitöstutkimuksen tuloksia voidaan hyödyntää teollisten prosessien optimoinnissa ja perustana uusille tutkimusaiheille.

Abstract Efficient production of biologically functional recombinant proteins is a cornerstone of modern biotechnological research. Laboratory-scale protein production is most commonly accomplished in simple shaking bioreactors such as shake flasks. However, productivity of these cultures is often severely limited by low biomass yield and non-optimal growth conditions regarding medium composition, pH and oxygen supply. In many cases, poor culture performance can constitute a major research bottleneck. This study aims to improve recombinant protein production in shaking Escherichia coli cultures by use of enzyme-controlled, fed-batch-like glucose feeding in a rich medium, and by investigating the effects of culture aeration on different aspects of protein production. The results show that the enzymatic fed-batch medium can provide higher cell densities, volumetric protein yields and, in some cases, improved product solubility or activity compared to traditionally used media. While these improvements could be obtained in ordinary shaking vessels, the results also demonstrate that cultivation in shake flasks with elevated aeration capacity can further improve cell density and volumetric productivity in the fed-batch medium. However, enhanced aeration may also have an adverse effect on the expression of certain proteins such as Fab antibody fragments. Maximum volumetric Fab yield was achieved under reduced aeration rates, and lower oxygen availability also contributed to substantially increased accumulation of periplasmically produced Fab fragments into extracellular medium. Hence modification of aeration conditions and medium composition can be used to control periplasmic/extracellular product localization as outlined in this study. Moreover, high aeration was detrimental to expression in a glycerol-based lactose autoinduction medium, but this strict dependency on aeration level could be mitigated and robustness of expression improved by an autoinduction medium based on the enzymatic glucose feeding as the supporting carbon source instead of glycerol. The results of this study can be utilized to improve volumetric productivity, protein solubility and control of product localization in small-scale protein production, as well as to facilitate robust and efficient high-throughput protein expression for such applications as structural and functional characterization. / Tiivistelmä Biologisesti aktiivisten vierasproteiinien tehokas tuottaminen on yksi bioteknologisen tutkimuksen kulmakivistä. Laboratoriomittakaavan proteiinituotto toteutetaan yleisimmin yksinkertaisissa ravistelubioreaktoreissa, kuten ravistelupulloissa. Näiden viljelmien tuottavuutta rajoittaa kuitenkin usein biomassan matala saanto sekä epäoptimaaliset olosuhteet kasvualustan koostumuksen, pH:n ja hapen suhteen. Monissa tapauksissa viljelmän heikko tuottavuus muodostaa tutkimukselle merkittävän pullonkaulan. Tämän tutkimuksen tavoite on parantaa vierasproteiinien tuottoa Escherichia coli –ravisteluviljelmissä hyödyntäen entsymaattisesti kontrolloitua, panossyöttökasvatusta jäljittelevää glukoosisyöttöä rikkaassa kasvualustassa, sekä selvittää ilmastuksen vaikutusta proteiinituoton eri osatekijöihin. Tulosten mukaan glukoosisyöttöön perustuva kasvualusta mahdollistaa korkeamman solutiheyden sekä proteiinituoton verrattuna tavallisimmin käytettyihin kasvualustoihin. Joissain tapauksissa myös proteiinin liukoisuus tai aktiivisuus voi parantua. Vaikka nämä edut pystyttiin saavuttamaan myös tavanomaisissa ravistelupulloissa, voidaan panossyöttökasvualustan solutiheyttä ja tuottoa tilavuutta kohti edelleen lisätä käyttämällä korkeamman ilmastustehokkuuden ravistelupulloja. Toisaalta tehostetun ilmastuksen havaittiin olevan mahdollisesti haitallista tiettyjen proteiinien, kuten Fab-vasta-ainefragmenttien, tuotolle. Fab-fragmenttien maksimaalinen tuotto saavutettiin ilmastustehokkuutta laskemalla. Lisäksi matalampi hapen saatavuus edisti periplasmaan ohjattujen Fab-fragmenttien kerääntymistä solunulkoiseen kasvualustaan. Näin ollen ilmastusolosuhteita ja kasvualustan koostumusta muokkaamalla voidaan vaikuttaa tuotteen lopulliseen sijoittumiseen. Korkean ilmastustehokkuuden havaittiin myös olevan haitallista proteiinituotolle glyserolipohjaisessa autoinduktiokasvualustassa. Tätä riippuvuutta ilmastuksen tasosta pystyttiin vähentämään ja autoinduktion luotettavuutta parantamaan käyttämällä kasvualustaa jossa hiililähteenä toimii glyserolin sijaan entsymaattinen glukoosisyöttö. Tutkimuksen tuloksia hyödyntäen voidaan parantaa vierasproteiinien saantoa, liukoisuutta ja periplasmisen/solunulkoisen kerääntymisen säätelyä, sekä mahdollistaa luotettava ja tehokas proteiinituotto viljelmien suurta lukumäärää vaativiin sovelluksiin, kuten proteiinien rakenteen ja toiminnan tutkimukseen.