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Vers l’étude de la spécificité d’enzymes de biosynthèse des HS : développement de méthodologies pour la synthèse de fragments de structure bien définie / Development of new methodologies for the synthesis of well-defined HS fragments : toward studying the specificity of HS biosynthesis enzymes

Sahloul, Kamar 17 October 2012 (has links)
Les Héparanes sulfates (HS) appartiennent à la famille des glycosaminoglycanes (GAGs) qui sont des polysaccharides existants sur la surface cellulaire ou dans la matrice extracellulaire des cellules animales. Les GAGs jouent des rôles essentiels dans plusieurs processus biologiques via leurs interactions avec certaines protéines (chemokines, cytokines, facteurs de croissance, enzymes…) dont ils modulent les activités biologiques. Ils sont constitués par la répétition d’un motif disaccharidique de base comportant un acide uronique lié à un 2-amino-sucre. Une diversité moléculaire considérable provient de l’existence de divers motifs de O-et/ou N-sulfatation ainsi que de motifs d’épimérisation au niveau de l’acide uronique. Cette diversité qui est responsable d’interactions spécifiques de haute affinité avec différentes protéines serait due à l’action des différentes enzymes de biosynthèse. Ce travail de thèse vise à développer de nouvelles méthodologies nécessaires à la préparation d’une chimiothèque octasaccharidique de fragments d’HS, dans le but d’étudier la spécificité des enzymes de biosynthèse des HS et principalement la N-déacétylase N-sulfotransférase (NDST) et la C-5 épimérase. La chimiothèque octasaccharidique peut être obtenue à partir d’un seul octasaccharide dont les quatre atomes d’azote seraient protégés par des groupements protecteurs différents (octasaccharide « N-différencié »). La synthèse de cet octasaccharide constitue notre objectif principal.Nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l’optimisation de la synthèse d’une brique disaccharidique impliquée dans la synthèse des fragments d’héparane sulfate. Dans cet objectif nous avons mis au point une méthode d’acétylation sélective de l’hydroxyle primaire, une méthode de benzylation compatible avec la présence à l’acétate et une procédure « one-pot » comportant quatre étapes de synthèse du disaccharide et facilitant l’accès au disaccharide avec 45 % de rendement global.Par la suite, nous avons optimisé la réaction de glycosylation entre les briques disaccharidiques en utilisant le donneur N-phényltrifluoroacétimidate, dans le but d’avoir une stéréosélectivité α maximale et d’améliorer le rendement de glycosylation. Les conditions optimisées ont permis l’accès au tétrasaccharide et à l’octasaccharide ayant les fonctions amines sous forme de groupements azido, avec un excellent rendement (95 %) et une bonne stéréosélectivité (96/4) en faveur de l’anomère α et sont reproductibles à grande échelle. La troisième partie était consacrée à une étude méthodologique afin de permettre la synthèse de l’octasaccharide « N-différencié » précurseur de la chimiothèque octasaccharidique. Dans ce but, nous avons choisi les groupements Fmoc, Alloc, pNZ et N3 comme groupements protecteurs des fonctions amines de l’octasaccharide. Nous avons préparé différents accepteurs ayant les fonctions amines protégées avec ces groupements afin d’étudier l’influence des différents groupements N-protecteurs de la fonction amine de l’accepteur sur la réaction de glycosylation. Les différents tétrasaccharides ont été obtenus avec d’excellents rendements (87–97 %) et une bonne stéréosélectivité (autour de 95/5 en faveur de l’anomère α). Enfin, nous avons effectué une étude de l’orthogonalité de la déprotection de ces groupements protecteurs (N3, Alloc, Fmoc et pNZ). Cette étude est essentielle avant la préparation de l’octasaccharide pour prouver la stratégie de la synthèse. En plus cette étude facilitera la préparation de la chimiothèque octasaccharidique une fois l’octasaccharide « N-différencié » préparé. / Heparan sulfate (HS), a highly sulfated glycosaminoglycan present in the extracellular matrix and at the cell surface, is known to play vital functional roles in various biological processes due to its interactions with proteins (chemokines, cytokines, growth factors, enzymes ...). HS consist of a repeating disaccharide unit, composed of a glucosamine and a hexuronic acid (glucuronic acid or its C5 epimer, iduronic acid).The HS chains are further modified by some epimerases and sulfotransferases during their biosynthesis. These sulfation/epimerization patterns provide considerable complexity. These modifications are required for interaction with many protein ligands.This thesis aims to develop new methodologies for the preparation of a library of octasaccharides, HS fragments, in order to study the specificity of HS biosynthesis enzymes, mainly N-deacetylase N-sulfotransferase (NDST) and the C-5 epimerase. The library can be obtained starting from a single octasaccharide whose four nitrogen atoms are protected by various protecting groups (octasaccharide N-differentiated). The synthesis of this octasaccharide is our main goal.We are interested in first to optimize the synthesis of a fully protected disaccharide which is used as building block in our heparan sulfate fragments synthesis. For this purpose we have developed a regioselective acetylation method of a disaccharide bearing three hydroxyl groups using a temporary protection, a benzylation method compatible with the presence of one acetate group using silver oxide and a one-pot procedure incorporating up to four steps, reducing work-up and time-consuming purifications. In the second chapter, we optimized the glycosylation reaction between two disaccharides using the N- phényltrifluoroacétimidate donor in order to have good α stereoselectivity and yield. We are now able to obtain the tetrasaccharide and the octasaccharide with 95 % yield and (α/β : 96/4) stereoselectivity.The third part was devoted to the methodological study to obtain the N-differentiated octasaccharide, precursor of a octasaccharides library. For this purpose, we chose Fmoc, Alloc, pNZ and N3 as protecting groups of the amine groups. We have prepared various acceptors with these different protecting groups in order to study them in glycosylation reactions. The tetrasaccharides were obtained with excellent yields (87-97%) and good stereoselectivity (around 95/5 for the α anomer) with the four protecting groups. Finally, we conducted a study to deprotect these protecting groups (N3, Alloc, Fmoc and pNZ) on the tetrasaccharides. This study is essential before preparing the octasaccharide as a proof of the synthesis strategy. In addition this study will facilitate the preparation of the octasaccharides library once the N-differentiated octasaccharide prepared.
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Combinatorial surface-based electronic tongue development : Analytical applications and conception of 2D and 3D biomimetic surfaces / Développement d'une langue électronique sur des surfaces combinatoires : applications analytiques et conception de surfaces biomimétiques 2D et 3D

Genua, Maria 24 October 2013 (has links)
L'objectif de cette thèse est le développement d'une langue électronique avec une méthode simplifiée d'obtention de récepteurs à réactivité croisée. Ces récepteurs sont préparés par une approche combinatoire novatrice qui consiste au mélange et à l'auto-assemblage de deux disaccharides. Le couplage de ces récepteurs avec un système de détection d'imagerie par résonance des plasmons de surface nous a permis de réaliser une langue électronique capable de différencier des échantillons de différentes complexités, y compris des protéines pures et des mélanges complexes. Cela se fait grâce aux profils et images d'évolution continue, assimilés à des « empreintes digitales » des échantillons. D'un autre côté, ce système peut être utilisé en tant qu'outil pour la conception de surfaces biomimétiques 2D et 3D. Ce système est prometteur pour l'étude des interactions sucre-protéine et pour la préparation de nanovecteurs biomimétiques qui ciblent de façon spécifique des protéines d'intérêt. / L'objectif de cette thèse est le développement d'une langue électronique avec une méthode simplifiée d'obtention de récepteurs à réactivité croisée. Ces récepteurs sont préparés par une approche combinatoire novatrice qui consiste au mélange et à l'auto-assemblage de deux disaccharides. Le couplage de ces récepteurs avec un système de détection d'imagerie par résonance des plasmons de surface nous a permis de réaliser une langue électronique capable de différencier des échantillons de différentes complexités, y compris des protéines pures et des mélanges complexes. Cela se fait grâce aux profils et images d'évolution continue, assimilés à des « empreintes digitales » des échantillons. D'un autre côté, ce système peut être utilisé en tant qu'outil pour la conception de surfaces biomimétiques 2D et 3D. Ce système est prometteur pour l'étude des interactions sucre-protéine et pour la préparation de nanovecteurs biomimétiques qui ciblent de façon spécifique des protéines d'intérêt.
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Mechanical Strain-Mediated Syndecan Regulation and Its Effects on Adhesion of Vascular Smooth Muscle Cells

Julien, Mathéau A. 19 January 2005 (has links)
An injured vascular system has a substantial impact on an individuals overall health, and an understanding of the mechanisms that underlie blood vessel pathophysiology is required for the development of rational and effective treatment strategies. The phenotypic modulation of smooth muscle cells (SMC) during vascular injury, characterized by altered adhesion, migration and synthetic behavior, plays an important role in the eventual outcome. Specifically, the ability of SMCs to adhere to and remodel their extracellular environment via regulation of the syndecan class of cell adhesion molecules dictates the response of the vascular wall to local injury. The effect of in vitro syndecan-4 regulation on SMC adhesion was investigated through the use of a glass microsphere centrifugation assay, and an antisense-mediated reduction in gene expression was found to correlate with decreased adhesive strength. Regulation of syndecan-1, syndecan-2, and syndecan-4 gene expression was observed experimentally by mechanical strain of SMCs. Using real-time polymerase chain reaction (PCR), the kinetics of both static and cyclic mechanical strain were found to modify the gene expression in a time and strain magnitude-dependent manner unique to each syndecan. In particular, the responses of syndecan-4 were acute, but transient, while the evolution of syndecan-1 and syndecan-2 regulation was delayed by comparison. Mechanical strain also modulated syndecan-4 protein expression and ectodomain shedding, as measured by Western immunoblotting, and this effect was found, through selective inhibition, to be at least in part dependent on mitogen-activated protein (MAP) kinase signaling. In particular, intact extracellular signal-regulated MAP kinase (ERK) 1/2 and c-Jun NH2-terminal kinase / stress-activated protein kinase (JNK/SAPK) signaling pathways were found to be required for the observed strain-induced shedding. These findings offer a better understanding of syndecan function in response to mechanical strain and suggest potential new mechanisms by which physical forces may modulate vascular SMC behavior and regulation during normal physiology, pathologic conditions, and engineered arterial substitute development.
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Étude quantitative du rôle spécifique de glycosaminoglycanes dans le mécanisme d'internalisation de l'homéoprotéine engrailed 2 / Quantitative study of glycosaminoglycan specific role on internalization mecanism of the homeoprotein engrailed 2

Cardon, Sébastien 12 October 2017 (has links)
Les homéoprotéines sont des facteurs de transcription importants au cours du développement des organismes vivants, capables notamment de voyager de cellule en cellule. Ces protéines comportent une longue extrémité N-terminale désordonnée, suivie de trois hélices α séparées par une boucle et un tour. Des études de relations structure-activité ont montré que des domaines cationiques (riches en K et R) particuliers dans ces protéines sont responsables de ces propriétés de transfert cellulaire leur permettant d’être secrétées et internalisées dans les cellules. Ces processus impliquent que ces protéines hydrophiles soient capables de franchir la membrane plasmique composée d'un coeur hydrophobe. La membrane plasmique est en effet composée d’une bicouche lipidique, dans laquelle sont insérées de nombreuses protéines, telles que les protéoglycanes portant des ramifications de glycosaminoglycanes (GAG), polysaccharides anioniques. Dans le but de comprendre au niveau moléculaire le processus d'entrée des homéoprotéines dans des cellules eucaryotes, différentes constructions protéiques ont été produites et étudiées : le peptide pénétrant les cellules correspondant à l'hélice 3 (H3), la séquence correspondant à l'homéodomaine (HD), l'homéodomaine étendu d'une séquence putative de liaison aux GAG (NLS-HD) et la protéine entière (En2). La quantification absolue de l’entrée de ces constructions dans des cellules CHO-K1 par spectrométrie de masse a mis en évidence une efficacité d'entrée meilleure pour H3 > NLS-HD > HD, ainsi que l’importance des GAG de surface dans le processus et plus particulièrement celui des héparanes sulfates (HS). Des expériences complémentaires d’ITC, de dichroïsme circulaire et de RMN ont permis d'identifier deux sites d’interaction avec l’héparine (un site principal de haute affinité et un site secondaire de plus basse affinité), interagissant principalement avec le polysaccharide par interactions électrostatiques. In fine, ces études conduisent à une meilleure compréhension moléculaire du processus d'internalisation des homéoprotéines dans des cellules eucaryotes. / Homeoproteins are important transcription factors during the development of living organisms, and are able to travel from cell to cell. These proteins contain a long N-terminal extremity structurally disordered, followed by three α helices separated by a U-turn. Structure-activity relation studies have shown that in these proteins, some cationic domains (rich in K and R) confer them the cellular transfer properties, allowing them to be secreted by and internalized into cells. These processes imply that the hydrophilic proteins are able to cross plasma membrane. Indeed, the plasma membrane possess a hydrophobic heart and is composed by a lipidic bilayer, in which numerous proteins are inserted, such as proteoglycans carrying glycosaminoglycan (GAG) ramifications, that belong to anionic polysaccharids. In order to understand the entry process of homeoproteins into eukaryotic cells at a molecular level, different proteic constructions have been produced and studied: the cell penetrating peptide corresponding to the third α helix (H3), the sequence corresponding to its homeodomain (HD), the homeodomain with an added putative GAG-binding domain (NLS-HD), and the wild-type protein Engrailed 2 (En2). The absolute mass spectrometry quantification of the peptide and proteins in cells shows a range of internalization efficiency as follows: H3 > NLS - HD > HD. It also highlights the importance of cell-surface GAGs in the internalization and more particularly that of heparan sulfates (HS). Complementary experiments of ITC, circular dichroism and NMR have shown two interaction sites for the heparin (one principal site of high affinity and a secondary site showing a lower affinity) both interacting mainly with polysaccharidic residues using electrostatic interactions. In fine, these studies lead to a better molecular understanding of homeoproteins internalization process in eukaryotic cells.
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Efficient production of inhibitor-free foamy virus glycoprotein-containing retroviral vectors by proteoglycan-deficient packaging cells

Munz, Clara Marie, Kreher, Henriette, Erdbeer, Alexander, Stanke, Nicole, Richter, Stefanie, Westphal, Dana, Yi, Buqing, Behrendt, Rayk, Lindel, Fabian, Lindemann, Dirk 04 June 2024 (has links)
Foamy viruses (FVs) or heterologous retroviruses pseudotyped with FV glycoprotein enable transduction of a great variety of target tissues of disparate species. Specific cellular entry receptors responsible for this exceptionally broad tropism await their identification. Though, ubiquitously expressed heparan sulfate proteoglycan (HS-PG) is known to serve as an attachment factor of FV envelope (Env)-containing virus particles, greatly enhancing target cell permissiveness. Production of high-titer, FV Env-containing retroviral vectors is strongly dependent on the use of cationic polymer-based transfection reagents like polyethyleneimine (PEI). We identified packaging cell-surface HS-PG expression to be responsible for this requirement. Efficient release of FV Env-containing virus particles necessitates neutralization of HS-PG binding sites by PEI. Remarkably, remnants of PEI in FV Env-containing vector supernatants, which are not easily removable, negatively impact target cell transduction, in particular those of myeloid and lymphoid origin. To overcome this limitation for production of FV Env-containing retrovirus supernatants, we generated 293T-based packaging cell lines devoid of HS-PG by genome engineering. This enabled, for the first, time production of inhibitor-free, high-titer FV Env-containing virus supernatants by non-cationic polymer-mediated transfection. Depending on the type of virus, produced titers were 2- to 10-fold higher compared with those obtained by PEI transfection.
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Caractérisation de l'interaction de l'auto-antigène ADN topoisomérase I avec les fibroblastes dans la sclérose systémique

Arcand, Julie 06 1900 (has links)
La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique. / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease of unknown etiology characterized by vascular damage, cellular and immunological disorders. The vast majority of patient sera are characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear proteins. The autoantibodies are associated with specific clinical manifestations and thus useful for diagnostic and classification of the disease. One of the major autoantibody groups are the anti-DNA topoisomerase I (anti-topo). They are associated with the diffuse form of the disease which is characterized by extensive cutaneous and visceral fibrosis. Increased extracellular matrix synthesis and deposition by fibroblast result in the development of fibrosis. Although anti-topo are associated with the worst form of the disease, correlated with the activity and the severity of SSc, their exact role in the pathogenesis of SSc is controversial and still unravelled. On the other hand, there is now strong evidence for active contribution of autoantigens, targeted by autoantibodies, in autoimmune diseases. Indeed, numerous cells have been shown to be influenced by the interaction of autoantigens with their cognate receptors present on their surface. These autoantigens display cytokine-like effects toward their target cell and are called bifunctional autoantigen. Hence, determination of the exact role of these autoantigens and characterization of their interaction with their target cell may open up research perspectives for the elucidation of the potential pathogenic role of their autoantibodies. In our study, we demonstrated that topo activates intracellular signaling pathways leading to the stimulation of fibroblast migration. We undertook experiments to characterize the interaction of the autoantigen topo with fibroblasts responsible of these cellular effects. Our results strongly suggest a direct interaction of topo with CCR7, a chemokine receptor, present on the surface of fibroblasts. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), abundantly present on fibroblast surfaces, were found to act as coreceptors for topo binding. Previous work has demonstrated that once bound to fibroblast surfaces, topo recruits anti-topo autoantibodies, which subsequently lead to adhesion and activation of monocytes. Here, we demonstrated that anti-topo autoantibodies from SSc sera lead to the amplification of topo binding to HSPG on fibroblast surfaces. The binding of topo/anti-topo IC could mediate the initiation and maintenance of an inflammatory cascade and further fibrosis development. Hence, perturbing the binding of topo/anti-topo immune complexes to HSPG became an interesting therapeutic approach. Heparin and low molecular weight heparins were found to prevent the binding of topo and topo/anti-topo immune complexes to the fibroblast surfaces. Moreover, topo/anti-topo immune complexes could be dissociated from fibroblast surfaces by these molecules. Hence, the prevention of topo/anti-topo immune complexes binding to HS chains could result in the absence of the inflammatory cascade initiation. Overall, our results support an active role for topo as a bifunctional autoantigen toward fibroblasts and a pathogenic role for anti-topo autoantibodies in SSc. Finally, a potential therapeutic approach is proposed which could target inflammatory and fibrotic development characteristic of SSc.
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Caractérisation de l'interaction de l'auto-antigène ADN topoisomérase I avec les fibroblastes dans la sclérose systémique

Arcand, Julie 06 1900 (has links)
La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique. / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease of unknown etiology characterized by vascular damage, cellular and immunological disorders. The vast majority of patient sera are characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear proteins. The autoantibodies are associated with specific clinical manifestations and thus useful for diagnostic and classification of the disease. One of the major autoantibody groups are the anti-DNA topoisomerase I (anti-topo). They are associated with the diffuse form of the disease which is characterized by extensive cutaneous and visceral fibrosis. Increased extracellular matrix synthesis and deposition by fibroblast result in the development of fibrosis. Although anti-topo are associated with the worst form of the disease, correlated with the activity and the severity of SSc, their exact role in the pathogenesis of SSc is controversial and still unravelled. On the other hand, there is now strong evidence for active contribution of autoantigens, targeted by autoantibodies, in autoimmune diseases. Indeed, numerous cells have been shown to be influenced by the interaction of autoantigens with their cognate receptors present on their surface. These autoantigens display cytokine-like effects toward their target cell and are called bifunctional autoantigen. Hence, determination of the exact role of these autoantigens and characterization of their interaction with their target cell may open up research perspectives for the elucidation of the potential pathogenic role of their autoantibodies. In our study, we demonstrated that topo activates intracellular signaling pathways leading to the stimulation of fibroblast migration. We undertook experiments to characterize the interaction of the autoantigen topo with fibroblasts responsible of these cellular effects. Our results strongly suggest a direct interaction of topo with CCR7, a chemokine receptor, present on the surface of fibroblasts. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), abundantly present on fibroblast surfaces, were found to act as coreceptors for topo binding. Previous work has demonstrated that once bound to fibroblast surfaces, topo recruits anti-topo autoantibodies, which subsequently lead to adhesion and activation of monocytes. Here, we demonstrated that anti-topo autoantibodies from SSc sera lead to the amplification of topo binding to HSPG on fibroblast surfaces. The binding of topo/anti-topo IC could mediate the initiation and maintenance of an inflammatory cascade and further fibrosis development. Hence, perturbing the binding of topo/anti-topo immune complexes to HSPG became an interesting therapeutic approach. Heparin and low molecular weight heparins were found to prevent the binding of topo and topo/anti-topo immune complexes to the fibroblast surfaces. Moreover, topo/anti-topo immune complexes could be dissociated from fibroblast surfaces by these molecules. Hence, the prevention of topo/anti-topo immune complexes binding to HS chains could result in the absence of the inflammatory cascade initiation. Overall, our results support an active role for topo as a bifunctional autoantigen toward fibroblasts and a pathogenic role for anti-topo autoantibodies in SSc. Finally, a potential therapeutic approach is proposed which could target inflammatory and fibrotic development characteristic of SSc.
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Etude des réponses lymphocytaires T CD4 anti-tumorales : de l'identification de cibles à leur utilisation pour l'immunomonitorage / Study of antitumor CD4 T cell responses : from identification of targets to their use for immunomonitoring

Galaine, Jeanne 14 December 2015 (has links)
Les cellules du système immunitaire sont capables de reconnaître et d'éliminer les cellules cancéreuses prévenant ainsi l'apparition de cancers. Parmi celles-ci, l'activité antitumorale est principalement attribuée aux lymphocytes T CD4 helper de type 1 (Thl). Les lymphocytes CD4 sont activés lors de la reconnaissance d'un antigène (Ag) de tumeur présenté par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II). Ils possèdent des propriétés cytotoxiques propres et activent les autres cellules immunitaires. Dans un premier temps, nous nous somme intéressés au mécanisme de présentation sur le CMH-II de la télomérase (hTERT). La protéine hTERT est capable d'interagir avec les HSPGs facilitant ainsi son internalisation par les DC. Elle emprunte ensuite les voies endolysosomale et cytosolique pour générer des peptides nommés UCP présentés dans le contexte HLA-DR. Cette découverte soutient son utilisation en immunothérapie associée aux chimiothérapies. Nous avons ensuite identifié quatre peptides dérivés de hTERT restreints HLA-DP4 puis comparé leur immunogénicité avec les UCP. Cette analyse a mis en évidence la supériorité des UCP en termes d'immunoprévalence et d'immunodominance. Enfin, nous avons étudié l'impact de l'acquisition d'une résistance à l'oxaliplatine sur le profil antigénique de lignées tumorales de cancers colorectaux (CCR). L'évaluation des réponses immunitaires de patients atteints de CCR nous a permis d'identifier des peptides immunogènes dérivés d'Ag surexprimés après une exposition à l'oxaliplatine. En conclusion, ces travaux pourront participer à l'amélioration des stratégies d'immunothérapie et d'immunomonitoring ciblant les lymphocytes CD4 Thl. / Immune cells are able to recognize and eliminate cancer cells to prevent from cancer development. Among them, antitumoral activity is mainly attributed to CD4 T helper 1 (Thl) cells. CD4 Thl cells are activated upon recognition of tumor antigen presented on the Major Histocompatibility Complex class II (MHC-II) molecules. These cells possess their own cytotoxic capacities and activate other immune cells. Firstly, we were interested in the mechanism of presentation of the catalytic subunit of telomerase (hTERT) which is an attractive tumor antigen target for immunotherapies. hTERT protein can interact with cell surface HSPGs facilitating its internalization by DC. Then, hTERT uses thé endo-lysosomal and cytosolic proteolysis pathways to generale immunogenic peptides named UCP (Universal Cancer Peptide) presented in HLA-DR context. This discovery is an additional argument in favor of using hTERT as a target for cancer immunotherapies. Then, we identified four novel hTERT-derived peptides presented by HLA-DP4 and compared their immunogenicity with UCP. This analysis highlighted the superiority of UCP in term of immunoprevalence and immunodominance. This stresses the importance of considering MHC-II locus for immunotherapy strategies stimulating CD4 T cells. Finally, we studied the impact of oxaliplatin treatment and/or oxaliplatin résistance acquisition on CRC antigenome. Evaluation of immune responses in CRC patients permitted the identification of immunogenic peptides derived from antigens upregulated after oxaliplatin exposition. In conclusion, this work could participate in the improvement of cancer immunotherapies and immunomonitoring targeting CD4 Thl cells.

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