A Hepatite Autoimune (HAI) é uma doença inflamatória crônica oriunda de autoimunidade, ocasionando fibrose hepática. O objetivo desse estudo foi verificar possíveis inter-relações entre HLA-G, BAMBI e processos inflamatórios/fibrogênicos hepáticos na Hepatite Autoimune, tanto em biópsias de pacientes pré quanto póstratamento com imunossupressores. Foram selecionadas noventa e cinco biópsias de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto diagnosticados com HAI, associados ou não a depósitos de ferro no fígado. As biópsias foram submetidas à imuno-histoquímica para marcação das proteínas HLAG e BAMBI. As estatísticas foram determinadas pelos testes Mann-Whitney e correlação de Spearman. A expressão de HLA-G e de BAMBI se apresentou aumentados conforme o agravamento da inflamação e fibrose em pacientes pré- tratamento com boa ou má resposta ao tratamento. No entanto, a expressão de HLAG e de BAMBI foi reduzida nas biópsias pós-tratamento apenas nos pacientes bom respondedores (diminuição da fibrose). Não houve quaisquer relações entre as quantificações de HLA-G e BAMBI com o número de plasmócitos ou com depósitos de ferro no fígado tanto em pacientes pré quanto pós-tratamento. Os resultados sugerem que tanto HLA-G quanto BAMBI são imunorreguladores sensíveis à intensidade do processo inflamatório no fígado, tendo suas expressões aumentadas ou diminuídas de acordo com a demanda por substâncias que regulem compostos e células imunológicas na HAI. Sugerem também que o infiltrado plasmocitário não é regulado diretamente pelo HLA-G ou BAMBI, e que os depósitos de ferro no fígado não são capazes de influenciar nem o grau inflamatório, nem as expressões de HLAG e BAMBI. / Autoimmune Hepatitis (HAI) is a chronic inflammatory disease originating from autoimmunity, causing liver fibrosis. The objective of this study was to verify possible interrelations between HLA-G, BAMBI and inflammatory / fibrogenic hepatic processes in Autoimmune Hepatitis, both in pre and post-treatment immunosuppressive biopsies. Ninety-five biopsies of patients from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto diagnosed with HAI, associated or not with iron deposits in the liver, were selected. Biopsies were submitted to immunohistochemistry for the labeling of HLA-G and BAMBI proteins. The statistics were determined by the Mann-Whitney tests and Spearman\'s correlation. The expression of HLA-G and BAMBI was increased as worsening of inflammation and fibrosis in pre-treatment patients with good or poor response to treatment. However, the expression of HLA-G and BAMBI was reduced in post-treatment biopsies only in patients with good responders (decreased fibrosis). There were no relationships between the quantifications of HLA-G and BAMBI with the number of plasma cells or with liver iron deposits in both pre and post-treatment patients. The results suggest that both HLA-G and BAMBI are immunoregulators sensitive to the intensity of the inflammatory process in the liver, their expressions being increased or decreased according to the demand for substances that regulate immune cells and compounds in HAI. They also suggest that plasmacytic infiltrate is not directly regulated by HLA-G or BAMBI, and that the liver iron deposits are not capable of influencing either the inflammatory grade or the expressions of HLA-G and BAMBI.

Made available in DSpace on 2015-03-03T14:02:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JussaraMCM_Tese.pdf: 1097860 bytes, checksum: 122136921e4dddbf8d0e434cbbbd3653 (MD5) Previous issue date: 2009-12-03 / The activation of hepatic stellate cells (HSC) is considered the most important event in hepatic fibrogenesis. The precise mechanism of this process is unknown in autoimmune hepatitis (AIH), and more evidence is needed on the evolution of fibrosis. The aim of this study was to assess these aspects in children with type 1 AIH. We analyzed 16 liver biopsy samples from eight patients, paired before treatment and after clinical remission, performed an immunohistochemical study with anti-actin smooth muscle antibody and graded fibrosisand inflammation on a scale of 0:4 (Batts and Ludwig scoring system). We observedthere was no significant reduction in fibrosis scores after 24? 18 months (2.5 ? 0.93 vs. 2.0? 0.53, P = 0.2012). There was an important decrease in inflammation: portal (2.6 ?0.74 vs. 1.3? 0.89, P = 0.0277), periportal/periseptal (3.0 ?0.76 vs. 1.4 ? 1.06, P = 0.0277), and lobular (2.8 ? 1.04 vs. 0.9? 0.99, P =0.0179). Anti-actin smooth muscle antibodies were expressed in the HSC of the initial biopsies (3491.93 ?2051.48 lm2), showing a significant reduction after remission (377.91 ?439.47 lm2) (P = 0.0117). HSC activation was demonstrated in the AIH of children. The reduction of this activation after clinical remission, which may precede a decrease in fibrosis, opens important perspectives in the follow-up of AIH. / A ativa??o das c?lulas hep?ticas estreladas (CHE) ? considerada o evento mais importante na fibrog?nese hep?tica. Na hepatite autoimune (HAI) este mecanismo ? desconhecido e maiores evid?ncias s?o necess?rias quanto ? evolu??o da fibrose. O objetivo desse estudo foi avaliar a ativa??o das CHE e a evolu??o da fibrose hep?tica em crian?as portadoras de HAI tipo 1. Foram analisadas 16 bi?psias hep?ticas pareadas de oito pacientes, antes do tratamento e ap?s a remiss?o cl?nica atrav?s de estudo imuno-histoqu?mico com anticorpo anti-??-actina de m?sculo liso e realizada a grada??o da fibrose e da inflama??o empregando-se o sistema de escores de Batts e Ludwig (0-4). N?o houve significante redu??o nos escores de fibrose ap?s intervalo de tempo de 24? 18 meses entre as bi?psias (2,5 ? 0,93 vs. 2,0? 0,53, P = 0,2012). Observou-se redu??o significante na inflama??o: portal (2,6?0,74 vs. 1,3? 0,89, P = 0,0277), periportal/perisseptal (3,0 ?0,76 vs. 1,4 ? 1,06, P =0,0277) e lobular (2,8 ? 1,04 vs. 0,9? 0,99, P =0,0179). A -actina de m?sculo liso nas CHE foi expressa em bi?psias hep?ticas iniciais (3491,93 ?2051,48 ?m2) e mostrou significante redu??o ap?s a remiss?o cl?nica (377,91 ?439,47 ?m2) (P = 0,0117). A ativa??o de CHE foi demonstrada em crian?as portadoras de HAI tipo 1. A redu??o de sua ativa??o ap?s remiss?o cl?nica, a qual pode preceder a redu??o da fibrose, abre importantes perspectivas no follow-up da HAI

INTRODUÇÃO: 50-86% dos pacientes recidivam a hepatite autoimune (HAI) após a suspensão do tratamento imunossupressor. A manutenção da imunossupressão em longo prazo diminui o risco de recidiva, entretanto é necessário ajuste da dose/suspensão do tratamento em 10-30%, em razão do maior risco de neoplasias e infecções. O difosfato de cloroquina (CQ) é droga imunomoduladora que foi utilizada anteriormente em monoterapia para manutenção da remissão da HAI com diminuição da recidiva quando comparada com controle histórico. O objetivo desse estudo foi investigar a eficácia e segurança do CQ na manutenção da remissão em estudo duplo cego e randomizado e avaliar se há um subgrupo com maior benefício ao seu uso. METODOLOGIA: 61 pacientes com diagnóstico provável ou definitivo de HAI em remissão histológica, 90,1% HAI tipo 1; 23% com reatividade do anti-SLA/LP, 56,6% com fibrose avançada (F3/4) à inclusão no estudo, mas com doença hepática compensada, foram randomizados de forma duplo cego e aleatória para receber CQ 250 mg/d ou placebo, durante 36 meses ou até recidiva da doença. No primeiro mês a droga foi utilizada em combinação com a imunossupressão que induziu remissão; com posterior desmame semanal da prednisona, suspensão imediata da azatioprina e manutenção do CQ/placebo até 36 meses. As curvas de sobrevida livre de recidiva foram estimadas pelo método de Kaplan-Meyer e comparadas pelo teste de Log-Rank; as razões de risco e seus respectivos intervalos de confiança foram estimados por regressão simples de Cox. Na regressão múltipla foram avaliadas co-variáveis clinicamente relevantes para recidiva. Para investigar o subgrupo com maior benefício, as interações entre a droga e reatividade de autoanticorpos e perfil de HLA foram analisadas por regressão múltipla de Cox. As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste exato de Fisher e as quantitativas pelo teste-t ou teste de Mann-Whitney. Foi considerado estatisticamente significante um valor de p < 0,05. RESULTADOS: 31 pacientes receberam CQ e 30 placebo. Não houve diferenças entre os grupos em relação aos achados clínicos, laboratoriais, histológicos e perfil de HLA. A sobrevida livre de recidiva foi significativamente maior no grupo CQ quando comparada ao placebo (59,3% X 19,9%, p=0,039). Após a suspensão da medicação ao término do estudo, houve 41,6% de recidiva no grupo CQ e 0% no placebo. Na regressão simples de Cox, os fatores associados com recidiva da HAI foram uso placebo, reatividade do anticorpo anti-SLA/LP, perfil de HLA DR3 e DR8. Na regressão múltipla, o uso de placebo (razão de risco de 2,4[IC 95%:1,05- 5,5], p=0,039) e reatividade do anticorpo anti-SLA/LP (razão de risco= 5.4 [IC 95%:1,91-15,3], p=0,002) associaram-se a maior risco de recidiva. Não foi possível definir subgrupo de maior benefício com uso de CQ no que se refere à reatividade do anti-SLA/LP ou perfil de HLA, embora a recidiva tenha ocorrido em 100% dos pacientes anti-SLA/LP(+) no grupo placebo e 50% no grupo CQ. No grupo CQ, 54,8% apresentaram efeitos colaterais, com suspensão da droga em 19,3%. Os efeitos colaterais mais comuns foram prurido e hiperpigmentação cutânea. CONCLUSÕES: O CQ reduziu com segurança o risco de recidiva de HAI, mas não foi possível definir subgrupo com maior benefício com essa medicação / INTRODUCTION: 50-86% of patients relapse autoimmune hepatitis (AIH) after immunosuppressive treatment withdrawal, with a higher risk of progression to liver cirrhosis, death due to liver disease and liver transplantation. The maintenance of long-term immunosuppression decreases the risk of relapse, however, treatment dose adjustment and/or interruption is required in 10-30%, with increased risk of neoplasias and infections. Chloroquine diphosphate (CQ) is an immunomodulatory drug used previously in monotherapy to maintain AIH remission with a decrease risk in relapse rates when compared to a historical control. The aims of this study were to investigate the efficacy and safety of CQ in the maintenance of remission in a double-blind and randomized study, and to evaluate if there is a subgroup with a greater benefit of its use. METHODS: 61 patients with probable or definitive diagnosis of AIH in histological remission, 90.1% type 1; 23% with anti-SLA / LP seropositivity, 56.6% with advanced fibrosis [F3 / 4] at inclusion in the study and with compensated liver disease were randomized double-blindly to receive either CQ 250 mg/day or placebo for 36 months or until relapse. In the first month, the drug was used in combination with the immunosuppressive regimen that induced the remission; with subsequent weekly weaning of prednisone, immediate withdrawal of azathioprine and maintenance of CQ/placebo for up to 36 months. Recurrence-free survival curves were estimated by the Kaplan-Meyer method and compared by the Log-Rank test; the hazard ratios and their respective confidence intervals were estimated by simple Cox regression. Clinically relevant covariables for relapse were re-evaluated bymultiple Cox regression. To investigate the existence of a subgroup with a greater benefit, interactions between the drug and autoantibody reactivity and HLA profile were analyzed by the Cox multiple regression. Categorical variables were compared by Fisher\'s exact test and the quantitative by the t-test or Mann- Whitney test. A p value of < 0.05 was considered statistically significant. RESULTS: 31 patients received CQ and 30 placebo. There were no differences between the two groups in relation to clinical, laboratory, histological and HLA profiles. Relapse-free survival was significantly higher in the CQ group when compared to placebo (59.3% X 19.9%, p=0.039). After antimalarial withdrawal at the end of the study, there was 41.6% relapse in the CQ group and 0% in the placebo. In the Cox simple regression, factors associated with AIH relapse were placebo use, anti-SLA/LP seropositivity, and HLA DR3 and DR8 profiles. In multiple regression, placebo use (Hazard Ratio = 2.4 [95% CI: 1.05-5.5], p = 0.039) and anti-SLA/LP seropositivity (Hazard Ratio = 5.4 [95% CI: 1.91-15.3], p = 0.002) were associated with a higher risk of relapse. It was not possible to define a subgroup with a greater benefit of CQ with respect to anti-SLA/LP positivity or HLA profile, although all anti-SLA/LP(+) patients in placebo group relapsed, compared to 50% in CQ group. In the CQ group, 54.8% had side effects, but 19.3% had drug withdrawal. The most common side effects were pruritus and cutaneous hyperpigmentation. CONCLUSIONS: Chloroquine safely reduced the risk of relapse of AIH, but it was not possible to define a subgroup with greater benefit with medication use

INTRODUÇÃO: 50-86% dos pacientes recidivam a hepatite autoimune (HAI) após a suspensão do tratamento imunossupressor. A manutenção da imunossupressão em longo prazo diminui o risco de recidiva, entretanto é necessário ajuste da dose/suspensão do tratamento em 10-30%, em razão do maior risco de neoplasias e infecções. O difosfato de cloroquina (CQ) é droga imunomoduladora que foi utilizada anteriormente em monoterapia para manutenção da remissão da HAI com diminuição da recidiva quando comparada com controle histórico. O objetivo desse estudo foi investigar a eficácia e segurança do CQ na manutenção da remissão em estudo duplo cego e randomizado e avaliar se há um subgrupo com maior benefício ao seu uso. METODOLOGIA: 61 pacientes com diagnóstico provável ou definitivo de HAI em remissão histológica, 90,1% HAI tipo 1; 23% com reatividade do anti-SLA/LP, 56,6% com fibrose avançada (F3/4) à inclusão no estudo, mas com doença hepática compensada, foram randomizados de forma duplo cego e aleatória para receber CQ 250 mg/d ou placebo, durante 36 meses ou até recidiva da doença. No primeiro mês a droga foi utilizada em combinação com a imunossupressão que induziu remissão; com posterior desmame semanal da prednisona, suspensão imediata da azatioprina e manutenção do CQ/placebo até 36 meses. As curvas de sobrevida livre de recidiva foram estimadas pelo método de Kaplan-Meyer e comparadas pelo teste de Log-Rank; as razões de risco e seus respectivos intervalos de confiança foram estimados por regressão simples de Cox. Na regressão múltipla foram avaliadas co-variáveis clinicamente relevantes para recidiva. Para investigar o subgrupo com maior benefício, as interações entre a droga e reatividade de autoanticorpos e perfil de HLA foram analisadas por regressão múltipla de Cox. As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste exato de Fisher e as quantitativas pelo teste-t ou teste de Mann-Whitney. Foi considerado estatisticamente significante um valor de p < 0,05. RESULTADOS: 31 pacientes receberam CQ e 30 placebo. Não houve diferenças entre os grupos em relação aos achados clínicos, laboratoriais, histológicos e perfil de HLA. A sobrevida livre de recidiva foi significativamente maior no grupo CQ quando comparada ao placebo (59,3% X 19,9%, p=0,039). Após a suspensão da medicação ao término do estudo, houve 41,6% de recidiva no grupo CQ e 0% no placebo. Na regressão simples de Cox, os fatores associados com recidiva da HAI foram uso placebo, reatividade do anticorpo anti-SLA/LP, perfil de HLA DR3 e DR8. Na regressão múltipla, o uso de placebo (razão de risco de 2,4[IC 95%:1,05- 5,5], p=0,039) e reatividade do anticorpo anti-SLA/LP (razão de risco= 5.4 [IC 95%:1,91-15,3], p=0,002) associaram-se a maior risco de recidiva. Não foi possível definir subgrupo de maior benefício com uso de CQ no que se refere à reatividade do anti-SLA/LP ou perfil de HLA, embora a recidiva tenha ocorrido em 100% dos pacientes anti-SLA/LP(+) no grupo placebo e 50% no grupo CQ. No grupo CQ, 54,8% apresentaram efeitos colaterais, com suspensão da droga em 19,3%. Os efeitos colaterais mais comuns foram prurido e hiperpigmentação cutânea. CONCLUSÕES: O CQ reduziu com segurança o risco de recidiva de HAI, mas não foi possível definir subgrupo com maior benefício com essa medicação / INTRODUCTION: 50-86% of patients relapse autoimmune hepatitis (AIH) after immunosuppressive treatment withdrawal, with a higher risk of progression to liver cirrhosis, death due to liver disease and liver transplantation. The maintenance of long-term immunosuppression decreases the risk of relapse, however, treatment dose adjustment and/or interruption is required in 10-30%, with increased risk of neoplasias and infections. Chloroquine diphosphate (CQ) is an immunomodulatory drug used previously in monotherapy to maintain AIH remission with a decrease risk in relapse rates when compared to a historical control. The aims of this study were to investigate the efficacy and safety of CQ in the maintenance of remission in a double-blind and randomized study, and to evaluate if there is a subgroup with a greater benefit of its use. METHODS: 61 patients with probable or definitive diagnosis of AIH in histological remission, 90.1% type 1; 23% with anti-SLA / LP seropositivity, 56.6% with advanced fibrosis [F3 / 4] at inclusion in the study and with compensated liver disease were randomized double-blindly to receive either CQ 250 mg/day or placebo for 36 months or until relapse. In the first month, the drug was used in combination with the immunosuppressive regimen that induced the remission; with subsequent weekly weaning of prednisone, immediate withdrawal of azathioprine and maintenance of CQ/placebo for up to 36 months. Recurrence-free survival curves were estimated by the Kaplan-Meyer method and compared by the Log-Rank test; the hazard ratios and their respective confidence intervals were estimated by simple Cox regression. Clinically relevant covariables for relapse were re-evaluated bymultiple Cox regression. To investigate the existence of a subgroup with a greater benefit, interactions between the drug and autoantibody reactivity and HLA profile were analyzed by the Cox multiple regression. Categorical variables were compared by Fisher\'s exact test and the quantitative by the t-test or Mann- Whitney test. A p value of < 0.05 was considered statistically significant. RESULTS: 31 patients received CQ and 30 placebo. There were no differences between the two groups in relation to clinical, laboratory, histological and HLA profiles. Relapse-free survival was significantly higher in the CQ group when compared to placebo (59.3% X 19.9%, p=0.039). After antimalarial withdrawal at the end of the study, there was 41.6% relapse in the CQ group and 0% in the placebo. In the Cox simple regression, factors associated with AIH relapse were placebo use, anti-SLA/LP seropositivity, and HLA DR3 and DR8 profiles. In multiple regression, placebo use (Hazard Ratio = 2.4 [95% CI: 1.05-5.5], p = 0.039) and anti-SLA/LP seropositivity (Hazard Ratio = 5.4 [95% CI: 1.91-15.3], p = 0.002) were associated with a higher risk of relapse. It was not possible to define a subgroup with a greater benefit of CQ with respect to anti-SLA/LP positivity or HLA profile, although all anti-SLA/LP(+) patients in placebo group relapsed, compared to 50% in CQ group. In the CQ group, 54.8% had side effects, but 19.3% had drug withdrawal. The most common side effects were pruritus and cutaneous hyperpigmentation. CONCLUSIONS: Chloroquine safely reduced the risk of relapse of AIH, but it was not possible to define a subgroup with greater benefit with medication use

Introdução: Os anticorpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) são classificados em três padrões observados na imunofluorescência indireta (IFI) utilizando neutrófilos humanos fixados em etanol e formaldeído como substrato. O c-ANCA apresenta forte associação com a enzima neutrofílica proteinase 3 (PR3), enquanto o p-ANCA está fortemente associado à mieloperoxidase (MPO). Na hepatite autoimune (HAI), colangite esclerosante primária (CEP) e doença inflamatória intestinal (DII) é observado outro padrão de IFI classificado como p-ANCA atípico que não apresenta reatividade contra as enzimas PR3 e MPO. Objetivo: Determinação da frequência dos diferentes padrões de ANCAs na CEP com ou sem DII concomitante (CEP/DII+, CEP/DII-), em três subtipos de hepatite autoimune (HAI-1 com anticorpo antimúsculo liso padrão tubular; HAI-2 com anticorpo antimicrossoma de fígado e rim tipo 1; HAI antiantígeno hepático solúvel/fígado e pâncreas, na colangite biliar primária (CBP) e em controles saudáveis. O anticorpo antinúcleo poderia estar presente em todos os subtipos. Os resultados dos ANCAs foram comparados com os do ELISA para verificação de concordância entre os padrões e as reatividades antigênicas. Metodologia: Foram estudados 249 pacientes (42 CEP/DII+; 33 CEP/DII-; 31 HAI-1; 30 HAI-2; 31 HAI-3; 52 CBP; 30 indivíduos saudáveis). As amostras de soro desses pacientes foram processadas pelos ensaios comerciais INOVA: ANCA Etanol, Quanta LiteTM MPO ELISA, Quanta LiteTMPR3 ELISA, Quanta LiteTM FAN HEp-2; e em lâminas com neutrófilos humanos fixados em etanol preparadas in house. Para as análises estatistícas foram utilizados os testes de Fisher com correção de Holm, os testes kappa e de McNemar. Resultados: O p-ANCA esteve presente em 4 (1,6%), o c-ANCA em 3 (1,2%), o p-ANCA atípico em 62 (24,9%), o c-ANCA atípico em dois (0,8%) e o padrão inconclusivo em 14 (5,6%) de 249 amostras testadas. O p-ANCA atípico foi mais frequentemente detectado na CEP/DII+ (52,4%; IC 95% = 37,7-66,6) em relação à CEP/DII- (21,2; IC 95% = 10,4-38,0), p=0,005. Não houve diferença significante na frequência do p-ANCA atípico na CEP/DII- em relação a CBP (15,38%, IC 95% = 7,83-27,89), p=0,501. O p-ANCA atípico foi significantemente mais positivo na HAI-1 (45,2%, IC 95% = 29,15-62,24, p < 0,001) e HAI-3 (32,3%, IC = 18,46-49,97, p=0,012) em comparação a HAI-2 (3,3%, IC 95% = 0-18,09). Não foi detectada diferença entre a HAI-1 e a HAI-3 (p=0,434). Ao considerarmos todos os padrões conjuntamente, persistiram as mesmas diferenças significantes entre a CEP/DII+ versus CEP/ DII- (p=0,037) e entre a HAI-2 versus HAI-1 (p=0,011) e versus HAI-3 (p=0,024). A reatividade do anti-PR3 foi encontrada em 25 das 249 amostras, sendo mais frequente na CEP/DII+ (31,0% IC 95%: 22,94 - 50,88) do que na CEP/ DII- (12,1%, IC 95%: 4,52-29,46, p = 0,025). Anticorpos anti-MPO foram identificados em oito de 249 amostras (3,2%). Das 25 amostras positivas para o anti-PR3 apenas uma apresentou c-ANCA; outras duas amostras positivas para o c-ANCA foram negativas para o anti-PR3. As oito amostras positivas para o anti-MPO não apresentaram reatividade para o p-ANCA e as quatro que tinham esse padrão não foram reativas para o anti-MPO. Entre as 62 amostras reativas para o p-ANCA atípico 49 não apresentaram reatividade para o anti-PR3 e anti-MPO. Das treze amostras positivas para o p-ANCA atípico e que exibiram reatividade ao ELISA, doze apresentaram positividade para o anti-PR3 e uma para o anti-MPO e para o anti-PR3. Conclusões: 1) Do ponto de vista de reatividade dos ANCAs e do anti-PR3 a CEP/DII+ teve comportamento diferente da CEP/ CEP/ DII - que que que que teve comportamento semelhante ao da CBP, o que pode sugerir que a maior frequência do p-ANCA atípico e do anti-PR3 esteja mais associada à DII do que à CEP; 2) Quanto à reatividade dos ANCAs, pacientes com HAI-1 e HAI-3 tiveram características semelhante entre si e diferente do da HAI-2; 3) Não houve concordância entre os resultados da IFI para os padrões c-ANCA e p-ANCA clássicos e os do ELISA anti-PR3 e anti-MPO; 4) A melhor concordância de leitura dos padrões do ANCA foi para o p-ANCA atípico, porque a maioria dos soros com esse padrão não teve reatividade nem para o anti-PR3 nem para o anti-MPO por ELISA; 5) Para doenças do aparelho digestivo (DII, CEP e HAI) é difícil relacionar os padrões do ANCA obtidos na imunofluorescência indireta com a reatividade observada nos ELISAs comerciais / Background: The antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) has 3 main subtypes according to the pattern observed by indirect immunofluorescence (IIF) on ethanol and formalin fixed human neutrophils. The cANCA has a strong association to a neutrophil enzyme proteinase 3 (PR3), while the classical pANCA has a strong association to myeloperoxidase (MPO), catepsin G, elastase, lactoferrin, lysozyme. Autoimmune hepatitis (AIH), primary sclerosing cholangitis (PSC) and inflammatory bowel disease (IBD), shows another pattern called atypical pANCA that does not react to the enzymes PR3 and MPO. Aims: Determine the frequency of different types of ANCA in PSC, with or without association to IBD (PSC/IBD+, PSC/IBD-); 3 AIH subtypes (AIH type 1, with antismooth muscle antibody (ASMA) with the tubular pattern and with or without antinuclear antibody (ANA); AIH type 2, with anti-LKM1 antibody; AIH anti-Soluble liver antigen/liver pancreas antigen (anti-SLA/LP), with or without ANA associated); primary biliary cholangites (CBP) and healthy controls. Methods: we studied 249 patients (42 PSC/IBD+; 33 PSC/IBD-; 31 AIH-1; 30 AIH-2; 31 HAI antiSLA/LP; 52 CBP; 30 healthy controls). The serum sample of these patients were processed with the INOVAÒ commercial kits: ANCA Etanol, Quanta LiteTM MPO ELISA, Quanta LiteTM PR3 ELISA, Quanta LiteTM FAN HEp-2; and human neutrophil slides ethanol fixed in house. Statistical analysis were performed using the Fisher Test, with Holm correction when nedeed, McNemar and Kappa Test. Results: The classical pANCA were present in 1.9% (IC 95%: 0 - 11.07) CBP patients and 7.1% (IC 95%: 1.77 - 19.7) of PSC/IBD+ patients. There were no statistical significance between groups. The atypical pANCA were identified in 62 out of 249 samples (24.9%). It were more frequently detected in PSC/IBD+ (52.4%, IC 95%: 37.72-66.6) then in PSC/IBD- (21.2%, IC 95%: 10.38 - 38.05), p = 0.005. The Fisher test did not show statistical significance between PSC/IBD+ and CBP for atypical pANCA reactivity (21.2%, IC 95%: 10.38-38.05 versus 15.4%, IC 95%: 7.74 - 27.79), p = 0.56. However, there was statistical significance for atypical pANCA between AIH subtypes, p < 0,001. Among AIH subtypes, the atypical pANCA were more frequent in AIH-1 than in AIH-2 (45.2%, IC 95%: 29.15 - 62.24 versus 3.3%, IC 95%: 0 - 18.09, p < 0.001) and more frequent in AIH-3 than in AIH-2 (32.3%, IC 95%: 18.46-49.97 versus.3.3%, IC 95%: 0 - 18.09, p = 0.012). There were no statistical diference between AIH-1 e a AIH-3 (p = 0.434).None of the 30 healthy controls showed the atypical pANCA pattern. The classical cANCA were present in just 3 of 249 patient samples (1.2%), 1 CBP, 1 PSC/IBD+ and 1 AIH-1. The atypical cANCA is rarely described in the literature. We identified just 2 samples with the atypical cANCA of 249 samples (0.8%), one PSC/IBD+ patient and another AIH-2 patient. 14 out of 249 samples (5.6%), showed a positive fluorescence on ethanol fixed slides, even though we couldn\'t define a ANCA pattern because of the ANA interference. However, the Fisher test did not show a statistical significance between the studied groups (among AIH subtypes, p= 0.207 and PSC/IBD+ versus PSC/IBD-, p = 0.945). Antibodies against proteinase-3, that is considered the classical cANCA target, we detected 25 out of 249 samples (10.0%). The anti-PR3 were more frequent in PSC/IBD+ (31.0%, IC 95%: 22.94-50.88) than in PSC/IBD- (12.1%, IC 95%:4.52-29.46), p = 0,025. Antibodies against antimyeloperoxidase, one of the target antigens of the classical pANCA, were identified in 8 out of 249 samples (3.2%). The overall ELISA results, adding the anti-PR3 and anti-MPO, show that this autoantibodies were more frequent in PSC among the other groups, mainly PSC/IBD+ (p= 0.002). It is worth mentioning that PSC/IBD+ 2 patients showed simultaneously anti-PR3 and anti-MPO reactivity. If we consider atypical pANCA as atypical pANCA by IIF and negative ELISA (anti-MPO and anti-PR3), 49 out of 249 samples (19.7%), The Fisher test showed a difference statistical significance in atypical pANCA IIF+/ELISA- between PSC/IBD+ (35.7%, IC 95%: 22.94 - 50.88) and PSC/IBD- (12.1%, IC 95%:4.21 - 27.93), p = 0,018. The Fisher test did not show significant difference between PSC/IBD- and CBP (13.5%, IC 95%: 6.37 - 25.58), p = 1. The same test showed statistical significance reactivity of ANCA IIF+/ELISA- among AIH subtypes (p=0,001), been more frequent in AIH-1 then in AIH-2 (p = 0.001) and among AIH-3 versus AIH-2 (p = 0.025). There was no statistical difference among AIH-1 versus AIH-3, p = 0,426. Conclusion:SC/IBD+ had a different serological pattern compared with PSC/IBD-, since atypical p-ANCA and anti-PR3 antibodies were significantly more frequent in the former. According to the ANCA profile, PSC/IBD- had a similar behavior to PBC which may suggest that atypical p-ANCA and anti-PR3 antibodies are more associated with IBD than with PSC. Patients with ASMA AIH and with anti-SLA/LP had higher frequency of atypical p-ANCA than anti-LKM1 AIH; There was no concordance between the results of indirect immunofluorescence and those of ELISA. Then, the results of ANCA by immunofluorescence are completely observer-dependent

Introdução: Os anticorpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) são classificados em três padrões observados na imunofluorescência indireta (IFI) utilizando neutrófilos humanos fixados em etanol e formaldeído como substrato. O c-ANCA apresenta forte associação com a enzima neutrofílica proteinase 3 (PR3), enquanto o p-ANCA está fortemente associado à mieloperoxidase (MPO). Na hepatite autoimune (HAI), colangite esclerosante primária (CEP) e doença inflamatória intestinal (DII) é observado outro padrão de IFI classificado como p-ANCA atípico que não apresenta reatividade contra as enzimas PR3 e MPO. Objetivo: Determinação da frequência dos diferentes padrões de ANCAs na CEP com ou sem DII concomitante (CEP/DII+, CEP/DII-), em três subtipos de hepatite autoimune (HAI-1 com anticorpo antimúsculo liso padrão tubular; HAI-2 com anticorpo antimicrossoma de fígado e rim tipo 1; HAI antiantígeno hepático solúvel/fígado e pâncreas, na colangite biliar primária (CBP) e em controles saudáveis. O anticorpo antinúcleo poderia estar presente em todos os subtipos. Os resultados dos ANCAs foram comparados com os do ELISA para verificação de concordância entre os padrões e as reatividades antigênicas. Metodologia: Foram estudados 249 pacientes (42 CEP/DII+; 33 CEP/DII-; 31 HAI-1; 30 HAI-2; 31 HAI-3; 52 CBP; 30 indivíduos saudáveis). As amostras de soro desses pacientes foram processadas pelos ensaios comerciais INOVA: ANCA Etanol, Quanta LiteTM MPO ELISA, Quanta LiteTMPR3 ELISA, Quanta LiteTM FAN HEp-2; e em lâminas com neutrófilos humanos fixados em etanol preparadas in house. Para as análises estatistícas foram utilizados os testes de Fisher com correção de Holm, os testes kappa e de McNemar. Resultados: O p-ANCA esteve presente em 4 (1,6%), o c-ANCA em 3 (1,2%), o p-ANCA atípico em 62 (24,9%), o c-ANCA atípico em dois (0,8%) e o padrão inconclusivo em 14 (5,6%) de 249 amostras testadas. O p-ANCA atípico foi mais frequentemente detectado na CEP/DII+ (52,4%; IC 95% = 37,7-66,6) em relação à CEP/DII- (21,2; IC 95% = 10,4-38,0), p=0,005. Não houve diferença significante na frequência do p-ANCA atípico na CEP/DII- em relação a CBP (15,38%, IC 95% = 7,83-27,89), p=0,501. O p-ANCA atípico foi significantemente mais positivo na HAI-1 (45,2%, IC 95% = 29,15-62,24, p < 0,001) e HAI-3 (32,3%, IC = 18,46-49,97, p=0,012) em comparação a HAI-2 (3,3%, IC 95% = 0-18,09). Não foi detectada diferença entre a HAI-1 e a HAI-3 (p=0,434). Ao considerarmos todos os padrões conjuntamente, persistiram as mesmas diferenças significantes entre a CEP/DII+ versus CEP/ DII- (p=0,037) e entre a HAI-2 versus HAI-1 (p=0,011) e versus HAI-3 (p=0,024). A reatividade do anti-PR3 foi encontrada em 25 das 249 amostras, sendo mais frequente na CEP/DII+ (31,0% IC 95%: 22,94 - 50,88) do que na CEP/ DII- (12,1%, IC 95%: 4,52-29,46, p = 0,025). Anticorpos anti-MPO foram identificados em oito de 249 amostras (3,2%). Das 25 amostras positivas para o anti-PR3 apenas uma apresentou c-ANCA; outras duas amostras positivas para o c-ANCA foram negativas para o anti-PR3. As oito amostras positivas para o anti-MPO não apresentaram reatividade para o p-ANCA e as quatro que tinham esse padrão não foram reativas para o anti-MPO. Entre as 62 amostras reativas para o p-ANCA atípico 49 não apresentaram reatividade para o anti-PR3 e anti-MPO. Das treze amostras positivas para o p-ANCA atípico e que exibiram reatividade ao ELISA, doze apresentaram positividade para o anti-PR3 e uma para o anti-MPO e para o anti-PR3. Conclusões: 1) Do ponto de vista de reatividade dos ANCAs e do anti-PR3 a CEP/DII+ teve comportamento diferente da CEP/ CEP/ DII - que que que que teve comportamento semelhante ao da CBP, o que pode sugerir que a maior frequência do p-ANCA atípico e do anti-PR3 esteja mais associada à DII do que à CEP; 2) Quanto à reatividade dos ANCAs, pacientes com HAI-1 e HAI-3 tiveram características semelhante entre si e diferente do da HAI-2; 3) Não houve concordância entre os resultados da IFI para os padrões c-ANCA e p-ANCA clássicos e os do ELISA anti-PR3 e anti-MPO; 4) A melhor concordância de leitura dos padrões do ANCA foi para o p-ANCA atípico, porque a maioria dos soros com esse padrão não teve reatividade nem para o anti-PR3 nem para o anti-MPO por ELISA; 5) Para doenças do aparelho digestivo (DII, CEP e HAI) é difícil relacionar os padrões do ANCA obtidos na imunofluorescência indireta com a reatividade observada nos ELISAs comerciais / Background: The antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) has 3 main subtypes according to the pattern observed by indirect immunofluorescence (IIF) on ethanol and formalin fixed human neutrophils. The cANCA has a strong association to a neutrophil enzyme proteinase 3 (PR3), while the classical pANCA has a strong association to myeloperoxidase (MPO), catepsin G, elastase, lactoferrin, lysozyme. Autoimmune hepatitis (AIH), primary sclerosing cholangitis (PSC) and inflammatory bowel disease (IBD), shows another pattern called atypical pANCA that does not react to the enzymes PR3 and MPO. Aims: Determine the frequency of different types of ANCA in PSC, with or without association to IBD (PSC/IBD+, PSC/IBD-); 3 AIH subtypes (AIH type 1, with antismooth muscle antibody (ASMA) with the tubular pattern and with or without antinuclear antibody (ANA); AIH type 2, with anti-LKM1 antibody; AIH anti-Soluble liver antigen/liver pancreas antigen (anti-SLA/LP), with or without ANA associated); primary biliary cholangites (CBP) and healthy controls. Methods: we studied 249 patients (42 PSC/IBD+; 33 PSC/IBD-; 31 AIH-1; 30 AIH-2; 31 HAI antiSLA/LP; 52 CBP; 30 healthy controls). The serum sample of these patients were processed with the INOVAÒ commercial kits: ANCA Etanol, Quanta LiteTM MPO ELISA, Quanta LiteTM PR3 ELISA, Quanta LiteTM FAN HEp-2; and human neutrophil slides ethanol fixed in house. Statistical analysis were performed using the Fisher Test, with Holm correction when nedeed, McNemar and Kappa Test. Results: The classical pANCA were present in 1.9% (IC 95%: 0 - 11.07) CBP patients and 7.1% (IC 95%: 1.77 - 19.7) of PSC/IBD+ patients. There were no statistical significance between groups. The atypical pANCA were identified in 62 out of 249 samples (24.9%). It were more frequently detected in PSC/IBD+ (52.4%, IC 95%: 37.72-66.6) then in PSC/IBD- (21.2%, IC 95%: 10.38 - 38.05), p = 0.005. The Fisher test did not show statistical significance between PSC/IBD+ and CBP for atypical pANCA reactivity (21.2%, IC 95%: 10.38-38.05 versus 15.4%, IC 95%: 7.74 - 27.79), p = 0.56. However, there was statistical significance for atypical pANCA between AIH subtypes, p < 0,001. Among AIH subtypes, the atypical pANCA were more frequent in AIH-1 than in AIH-2 (45.2%, IC 95%: 29.15 - 62.24 versus 3.3%, IC 95%: 0 - 18.09, p < 0.001) and more frequent in AIH-3 than in AIH-2 (32.3%, IC 95%: 18.46-49.97 versus.3.3%, IC 95%: 0 - 18.09, p = 0.012). There were no statistical diference between AIH-1 e a AIH-3 (p = 0.434).None of the 30 healthy controls showed the atypical pANCA pattern. The classical cANCA were present in just 3 of 249 patient samples (1.2%), 1 CBP, 1 PSC/IBD+ and 1 AIH-1. The atypical cANCA is rarely described in the literature. We identified just 2 samples with the atypical cANCA of 249 samples (0.8%), one PSC/IBD+ patient and another AIH-2 patient. 14 out of 249 samples (5.6%), showed a positive fluorescence on ethanol fixed slides, even though we couldn\'t define a ANCA pattern because of the ANA interference. However, the Fisher test did not show a statistical significance between the studied groups (among AIH subtypes, p= 0.207 and PSC/IBD+ versus PSC/IBD-, p = 0.945). Antibodies against proteinase-3, that is considered the classical cANCA target, we detected 25 out of 249 samples (10.0%). The anti-PR3 were more frequent in PSC/IBD+ (31.0%, IC 95%: 22.94-50.88) than in PSC/IBD- (12.1%, IC 95%:4.52-29.46), p = 0,025. Antibodies against antimyeloperoxidase, one of the target antigens of the classical pANCA, were identified in 8 out of 249 samples (3.2%). The overall ELISA results, adding the anti-PR3 and anti-MPO, show that this autoantibodies were more frequent in PSC among the other groups, mainly PSC/IBD+ (p= 0.002). It is worth mentioning that PSC/IBD+ 2 patients showed simultaneously anti-PR3 and anti-MPO reactivity. If we consider atypical pANCA as atypical pANCA by IIF and negative ELISA (anti-MPO and anti-PR3), 49 out of 249 samples (19.7%), The Fisher test showed a difference statistical significance in atypical pANCA IIF+/ELISA- between PSC/IBD+ (35.7%, IC 95%: 22.94 - 50.88) and PSC/IBD- (12.1%, IC 95%:4.21 - 27.93), p = 0,018. The Fisher test did not show significant difference between PSC/IBD- and CBP (13.5%, IC 95%: 6.37 - 25.58), p = 1. The same test showed statistical significance reactivity of ANCA IIF+/ELISA- among AIH subtypes (p=0,001), been more frequent in AIH-1 then in AIH-2 (p = 0.001) and among AIH-3 versus AIH-2 (p = 0.025). There was no statistical difference among AIH-1 versus AIH-3, p = 0,426. Conclusion:SC/IBD+ had a different serological pattern compared with PSC/IBD-, since atypical p-ANCA and anti-PR3 antibodies were significantly more frequent in the former. According to the ANCA profile, PSC/IBD- had a similar behavior to PBC which may suggest that atypical p-ANCA and anti-PR3 antibodies are more associated with IBD than with PSC. Patients with ASMA AIH and with anti-SLA/LP had higher frequency of atypical p-ANCA than anti-LKM1 AIH; There was no concordance between the results of indirect immunofluorescence and those of ELISA. Then, the results of ANCA by immunofluorescence are completely observer-dependent