Esse trabalho teve como objetivo a obtenção e caracterização de uma cepa transformante de Aspergilus nidulans para produção de uma lipase de Beauveria bassiana (denominada Bbl1) por meio do vetor pExpyr, utilizando xarope de milho como fonte de carbono indutora. Para isso utilizou-se o gene sob referência XP_008602131.1 (denominado bbl1) do NCBI que foi introduzido em vetores de pGEM-T, para multiplicação, e no pExpyr, para expressão. Foi feita a modelagem molecular dessa enzima, revelando cavidades hidrofóbicas para interação com substrato, e a \"tampa\", considerada característica comum das lipases \"verdadeiras\". A produção de Bbl1 em cultivos contendo maltose foi aproximadamente o dobro em relação à cepa selvagem B. bassiana. Posteriormente, com o intuito de melhorar a produção e baratear os custos de fermentação desta cepa, a maltose e o tampão HEPES (insumos caros e utilizados em escala laboratorial, porém inviáveis em padrão industrial) foram substituídos respectivamente por xarope de milho e tampão fosfato de sódio; o resultado foi a obtenção de quase 40 U.mL-1 de atividade de lipases em Erlenmeyer de 125 mL, quadruplicando a produção em relação a cepa selvagem. A Bbl1 foi purificada em colunas de Octyl-Sepharose e DEAE-celulose. Essa enzima demonstrou-se estável em solução com 0,5% de tween-20 e tween-80, e hiper-ativada na presença destes dois detergentes e de Triton X-100. Além disso, os ácidos oleico e linoleico demonstraram-se como inibidores análogos a não-competitivos. O estudo de imobilização revelou que o suporte de Octyl-Sepharose é o mais ideal para ativação de Bbl1, sendo que a atividade relativa da mesma foi cerca de 123%, em relação a mesma enzima em solução aquosa. Quanto à estabilidade térmica e ao pH, a imobilização promoveu um ganho de estabilidade nas temperaturas de 30°C até 60°C nos derivados de Octyl, Phenyl, Butyl, DEAE-celulose, MANAE e PEI, e na faixa de pH de 3 até 9 nesses mesmos suportes estudados, em comparação à enzima em solução. Por meio de estudos cinéticos, observou-se que a velocidade máxima de Bbl1 imobilizada em Octyl foi 2,39 vezes maior e o respectivo valor de K0,5, 2,7 vezes menor em relação à Bbl1 livre. O padrão de inibição pelos ácidos oleico e linoleico sofreu alteração em Bbl1 imobilizada, sendo dependente da concentração destes inibidores. Os produtos hidrólise dos óleos de açaí e buriti foram fracionados em fases polares e apolares e aplicados em culturas de monocamada de linhagens celulares de glioblastoma LN-18. Observou-se os produtos de hidrólise do óleo de buriti provocaram redução na viabilidade respiratório das células de glioblastoma até 120 horas de exposição, enquanto que nos cultivos de células de fibroblasto observou-se um \"ganho\" de viabilidade neste mesmo período de cultivo. Por fim, esse trabalho permitiu a gratificação em obter uma cepa de A. nidulans transformante para expressão de lipase - uma enzima comercialmente onerosa e com poucos trabalhos envolvendo sua produção de forma heteróloga. Além disso, tornou-se a utilização destas enzimas na hidrólise de óleos brasileiros como um potencial agente à obtenção de insumos para o tratamento de glioblastoma. / The objective of this work was to obtain and characterize a transforming strain of Aspergilus nidulans to produce a Beauveria bassiana lipase (called Bbl1) using the pExpyr vector, having corn syrup as inducing carbon source. For this purpose, the NCBI reference gene XP_008602131.1 (designated bbl1) was used, which was introduced into pGEM-T vectors for storage, and pExpyr for expression. The molecular modeling of this enzyme was performed, revealing hydrophobic cavities for the interaction with substrate, and the \"lid\", considered a common characteristic of \"true\" lipases. Production of Bbl1 in cultures containing maltose was approximately double that of B. bassiana wild strain. Later, in order to improve the production and to reduce the costs of fermentation of this strain, maltose and HEPES buffer (expensive and laboratory-grade inputs, however, not viable in an industrial standard) were replaced by corn syrup and sodium phosphate buffer; the result was the obtaining of almost 40 U.mL-1 of lipase activity in Erlenmeyer of 125 mL, quadrupling the production in relation to the wild strain. Bbl1 was purified on Octyl-Sepharose and DEAE-cellulose columns. This enzyme showed to be stable in solution with 0.5% tween-20 and tween-80, and hyperactivated in the presence of these two detergents and Triton X-100. In addition, oleic and linoleic acids have shown to be non-competitive analogues. The immobilization study revealed that Octyl-Sepharose support is the most ideal for the activation of Bbl1, and the relative enzymatic activity was about 123% in relation to the same non-immobilized enzyme. As for thermal stability and pH, immobilization promoted a stability gain at temperatures of 30 ° C to 60 ° C in the Octyl, Phenyl, Butyl, DEAEcellulose, MANAE and PEI derivatives, and in the pH range of 3 up to 9 in these same supports, compared to the enzyme in solution. By means of kinetic studies, it was observed that the maximum rate of Bbl1 immobilized on Octyl was 2.39 higher and the respective value of K0.5, 2.7 lower than the free Bbl1. The inhibition pattern for oleic and linoleic acids was altered in immobilized Bbl1, being dependent on the concentration of these inhibitors. The hydrolysis products of açai and buriti oils were fractionated in polar and nonpolar phases and applied to monolayer cultures of LN-18 glioblastoma cell lines. It was observed that the buriti oil hydrolysis products were able to cause a reduction in the respiratory viability of glioblastoma cells up to 120 hours of exposure, whereas in the fibroblast cell cultures a viability \"gain\" was observed in the same culture period. Finally, this work allowed the gratification in obtaining a strain of transforming A. nidulans for lipase expression - a commercially expensive enzyme with few studies involving its production in a heterologous way. In addition, the use of these enzymes in the hydrolysis of Brazilian oils has become a potential agent to obtain inputs for the treatment of glioblastoma.

O arroz (Oryza sativa L.) é consumido principalmente na forma polida, porém uma alternativa nutricionalmente melhor seria o arroz integral, que contém ao redor de 10% de farelo, rico em micronutrientes e compostos bioativos. Dentre esses destacam-se a vitamina E e &#947;-orizanol, aos quais se atribuem diversos efeitos benéficos à saúde. A literatura descreve vários estudos relacionados à presença desses compostos no arroz integral, porém pouco se sabe a respeito da sua estabilidade com o armazenamento, a parboilização e a cocção caseira. Pelo fato do arroz integral apresentar curta vida de prateleira, uma alternativa para aumentar o prazo para o consumo é o emprego da parboilização. A parboilização, que consiste em um processo hidrotérmico, provoca alterações estruturais no amido do grão e a literatura é controversa no que diz respeito à diminuição da digestibilidade do amido e consequentemente à redução do índice glicêmico (IG). Este trabalho teve como objetivos: avaliar os efeitos da parboilização sobre a disponibilidade do amido por meio da cinética de hidrólise do amido estimando o índice glicêmico (IG) em cultivares de arroz integral com diferentes teores de amilose; analisar o efeito da parboilização, do armazenamento por seis meses e da cocção caseira do arroz integral sobre a estabilidade dos compostos bioativos, e correlacionar os compostos bioativos com a atividade antioxidante do arroz, antes e após o processamento. Foram analisadas 36 amostras pertencentes a diferentes cultivares selecionadas de arroz integral e parboilizado integral das safras de 2007 e 2008 e outras três amostras de arroz integral e parboilizado integral, adquiridas no comércio local da cidade de São Paulo. A partir do índice de hidrólise (IH) in vitro, foi estimado o IG. A vitamina E e o &#947;-orizanol foram extraídos com metanol, separados por CLAE-fase reversa e quantificados por curvas padrão correspondentes. A atividade antioxidante foi avaliada pelos métodos de DPPH&#8226; e ORAC. Foi verificado que a disponibilidade do amido de todas as amostras de arroz foi pouco afetada pela parboilização nas condições empregadas de modo que os IH permaneceram similares aos das amostras não parboilizadas. As amostras com teor intermediário de amilose apresentaram os menores IH (p<0,05). O IG estimado nas amostras cruas e parboilizadas foi cerca de 80%, tanto nas cultivares de arroz selecionadas quanto nas amostras comerciais e não foi observada alteração com o processamento. Com relação aos compostos bioativos, os teores de vitamina E e &#947;-orizanol no arroz integral cru foram, em média de 25 e 188mg/kg, respectivamente. A vitamina E foi sensível ao processo de parboilização, ao armazenamento e à cocção, com perdas de 50% ou mais, em relação à concentração no grão integral in natura. Já o &#947;-orizanol mostrou-se mais estável frente a qualquer tratamento, com perda de no máximo 20% da sua concentração inicial. A maior correlação entre a concentração de compostos bioativos e atividade antioxidante foi encontrada para a vitamina E. / Rice (Oryza sativa L.) is consumed mostly in the milled form. However, due to its content of bran, vitamin E and &#947;-oryzanol, the intake of brown rice has been recommended. Although previous studies ascribed some important health benefits related to these brown rice\'s compounds, information regarding the effect of cooking, storage and parboiling on these substances remains to be elucidated. Rice parboiling is a hydrothermal process consisting of soaking, heating and drying that provide technological and nutritional benefits to the consumer. Until now, if parboiling process decreases the starch digestibility and consequently reduces the glycemic index (GI) is unclear. The objectives of the present study were: to evaluate the effect of the parboiling process on starch digestibility through a GI estimation by the kinetics of starch hydrolysis in rice cultivars with different levels of amylose; to analyze the effect of traditional parboiling, cooking and storage for six months on the stability of bioactive components as well as to correlate the content of bioactive components of rice with its antioxidant activity before and after parboiling. Thirty-six samples of brown rice and parboiled brown rice harvested in 2007 and 2008 were analyzed. In addition, three commercial cultivars of both brown and parboiled brown samples from local market that were obtained in São Paulo were also studied. The glycemic index (IG) was estimated from the hydrolysis index (IH). Vitamin E homologues and &#947;-oryzanol were extracted simultaneously with methanol and analyzed by HPLC-RP/UV and fluorescence detection in a single run. Peak areas were converted to the corresponding by the standards of &#945;- and &#947;-tocopherol, &#945;- and &#947;-tocotrienol and &#947;-oryzanol. The antioxidant capacity was evaluated by both, DPPH&#8226; and ORAC methods. The results indicated that starch digestibility from all rice samples was little affected by parboiling under the conditions employed in the present study. Samples with intermediate amylose content had the lowest HI (p <0.05). The estimated GI in raw and parboiled samples was 80% in all rice cultivars selected and in commercial samples as well. The parboiling showed no effect on GI. The total tocols and &#947;-orizanol contents in raw rice were 25 and 188 mg/kg, respectively. The vitamin E homologues were the most affected by parboiling, storage and cooking than &#947;-oryzanol with a decrease of 50% or more when compared to the raw grain. However, &#947;-oryzanol was more stable during either treatment with 20% loss of when compared to raw rice. The most significant correlation between the concentration of bioactive compounds and antioxidant activity was found for vitamin E.

Atualmente, o aquecimento global, a deterioração ambiental, a eminente escassez das limitadas reservas de combustíveis fósseis e a forte demanda e dependência da matriz energética mundial face a esses combustíveis constituem sérias ameaças à sustentabilidade do desenvolvimento mundial, o que se têm revertido a favor de um crescente interesse por fontes alternativas de energia renováveis, dentre os quais a biomassa lignocelulósica se destaca como uma das mais promissoras. Neste contexto, a produção de etanol a partir do bagaço de cana-de-açúcar pela via enzimática e bioquímica se apresenta como uma das mais oportunas alternativas para a produção integrada e sustentável de biocombustível visando otimização de recursos, redução de resíduos e minimização de impactos ambientais nefastos. Todavia, o desenvolvimento de um pré-tratamento eficaz, a par da produção de enzimas hidrolíticas, constitui a chave para a viabilização da produção de etanol a partir de lignocelulósicos. Assim sendo, o propósito deste trabalho foi determinar os efeitos produzidos pelo pré-tratamento hidrotérmico catalisado com sulfito sobre a composição química do bagaço de cana e correlacionar esses valores com a eficiência da sacarificação enzimática e fermentabilidade do hidrolisado obtido desse bagaço. Após caracterização química inicial, o bagaço in natura foi pré-tratado com sulfito neutro e alcalino e verificou-se que a celulose foi recuperada quase que integralmente nas frações sólidas da reação. Por seu turno, as xilanas obtiveram solubilizações máximas de 72,0% e 35,4% enquanto a deslignificação máxima foi de 43,5% e 76,7%, para as reações catalisadas com sulfito neutro e sulfito alcalino respectivamente. Verificou-se maior efetividade do sulfito alcalino no enriquecimento de carboidratos no bagaço pré-tratado bem como uma maior deslignificação, pelo que, foi escolhido para as etapas seguintes do projeto. A partir de um planejamento fatorial 33, foram obtidos substratos pré-tratados que levaram aos máximos de sacarificação enzimática de 79,91% e 70,69% para celulose e xilanas, respectivamente, utilizando 10 UPF de celulases e 10 UCB de ?-glucosidase. Pela análise do rendimento global de glucanas foi definida a condição ótima para o prétratamento empregando 10% (m/m) de sulfito alcalino a 150ºC, por 30 min, o que foi corroborada pela análise estatística. Hidrolisados enzimáticos de bagaços pré-tratados em condições otimizadas foram fermentados a etanol com eficiência de, praticamente, 100% pela Saccharomyces cerevisiae PE-2 e 80,41% pela Scheffersomyces (Pichia) stipitis CBS 5773. Para as duas leveduras, os parâmetros fermentativos do hidrolisado foram em tudo semelhantes aos verificados para os meios semissintéticos contendo glicose e xilose puras. Conclui-se assim, que o pré-tratamento adotado neste trabalho apresentou grande potencialidade em gerar substratos com alta digestibilidade enzimática e hidrolisados tão fermentáveis quanto meios semissintéticos. / Currently, global warming, environmental degradation, imminent shortage of limited fossil fuel reserves and an intense demand and dependence of global energy on these fuels constitute serious threats to the sustainability of world development, which have led to a growing interest in alternative sources of renewable energy, among which lignocellulosic biomass stands out as one of the most promising. In this context, the production of ethanol from sugarcane bagasse by enzymatic and biochemical routes appears as the most promising alternative for integrated and sustainable production of biofuel aiming resource optimization, waste reduction and mitigation of adverse environmental impacts. However, the development of an effective pretreatment, as well as the production of hydrolytic enzymes, is the key to enabling the production of ethanol from lignocellulosics. Therefore, the purpose of this study was to determine the effects of hydrothermal pretreatment catalyzed by sulfite on the chemical composition of sugarcane bagasse and establish a correlation of these values with the efficiency of enzymatic saccharification and fermentability of these bagasse hydrolyzate. After the initial chemical characterization, the bagasse was pretreated with neutral and alkaline sulfite and was found that cellulose was almost fully recovered in the solid fraction of the reaction. In turn, xylan obtained its maximum solubilization of 72.0% and 35.4% while the maximum delignification was 43.5% and 76.7%, for the reactions catalyzed by neutral and alkaline sulfite, respectively. The alkaline sulfite was found more effective for carbohydrates enrichment in the pretreated bagasse and led to a greater delignification, therefore, it was chosen for the following stages of the project. From a 33 full factorial experiments were obtained pretreated substrates which led to maximum enzymatic saccharification of 79.91% and 70.69% for cellulose and xylans, respectively, using 10 FPU cellulases and 10 CBU ?- glucosidase. By analysis of the glucans overall yield the optimal condition for the pretreatment has been defined as 10% (w/w) alkaline sulfide at 150°C for 30 min, which was confirmed by statistical analysis. Enzymatic hydrolysates of bagasse pretreated in optimized conditions were fermented into ethanol with efficiency of virtually 100% by Saccharomyces cerevisiae PE-2 and 80.41% by Scheffersomyces (Pichia) stipitis CBS 5773. For both yeasts, the hydrolyzate fermentation parameters were at all similar to those seen for the semisynthetic media containing pure glucose and xylose. Therefore, we concluded that the pre-treatment used in this work showed great potential to generate substrates with high enzymatic digestibility and hydrolysates as fermentable as semisynthetic media.

A despolimerização enzimática de componentes de biomassa é um processo chave para indústrias de bioenergia. A busca por novas enzimas aumentou os estudos dos secretomas de microrganismos degradadores de biomassa. Os fungos filamentosos são importantes agentes na reciclagem de carbono na natureza, apresentando potenciais enzimas para a conversão de biomassa. Malbranchea pulchella é um ascomiceto termofílico bioprospectado na Floresta Atlântica (região de Minas Gerais-Brasil), cuja análise e caracterização do secretoma, juntamente com a capacidade de biodegradação, foram foco deste estudo. O cultivo semi-sólido deste fungo em substratos lignificado (madeira de eucalipto moída) e \"não lignificado\" (polpa Kraft branqueada) por 60 dias resultou em perdas de peso de cerca de 5% e 52%, respectivamente. Para o estudo da diversidade das enzimas produzidas por M. pulchella, o secretoma foi avaliado em culturas submersas de 3 dias, utilizando as fontes de carbono anteriormente mencionadas. Os resultados de LC-MS/MS mostraram que o fungo foi capaz de secretar uma série de enzimas lignocelulolíticas. As enzimas proeminentes foram as glicosil-hidrolases com um total de 29 e 37 CAZymes nos substratos lignificado e \"não-lignificado\", respectivamente, sendo as famílias GH3 e GH18 encontradas em maior número. Considerando as enzimas oxidativas, um total de 12 e 13 CAZymes nos substratos lignificado e \"não lignificado\", respectivamente, sendo as famílias AA7 e AA9 as mais predominantes. Também foram detectadas proteínas não-CAZymes apresentando domínios alergênicos, que estão relacionados com proteínas semelhantes a expansinas de plantas. O secretoma produzido com substrato de polpa branqueada foi utilizado em ensaio de hidrólise com polpa Kraft e também em contribuição com Celluclast 1,5 L para hidrólise de polpa de dissolução e de Avicel. Os resultados indicaram que M. pulchella produz uma maquinaria enzimática interessante, que pode degradar celulose amorfa e cristalina, sendo potencial aplicação em hidrólise da biomassa lignocelulósica. / Enzymatic depolymerization of biomass components is a key process for bioenergy industries. The search for new enzymes for this task has increased secretome studies in biomass-degrading microorganisms. Filamentous fungi are important players in carbon recycling in nature, presenting potential enzymes for biomass conversion. Malbranchea pulchella is a thermophilic ascomycete bio prospected in Brazilian Atlantic forest whose secretome analysis and characterization together with biodegradation ability were focus of this study. Semi-solid cultivation of this fungus on lignified (milled eucalyptus wood) and non-lignified (bleached eucalyptus pulp) substrates for 60 days resulted in almost 5% and 52% weight losses, respectively. To understand the diversity of enzymes produced by M. pulchella the secretome was evaluated in 3-day submerse cultures using the previously mentioned carbon sources. LC-MS/MS results showed the fungus was able to secrete an array of lignocellulolytic enzymes. The prominent enzymes were glycosyl hydrolases with a total of 29 and 37 CAZymes in lignified and non-lignified substrates, respectively, with GH3 and GH18 families found in greatest number. Considering the oxidative enzymes, a total of 12 and 13 CAZymes were found in lignified and non-lignified substrates, respectively, being AA7 and AA9 families most expressive. Non-CAZymes proteins showing allergen domains, which are related with expansin-like proteins from plants, were also detected. The secretome produced with bleached eucalyptus pulp substrate was assayed for hydrolysis of Kraft pulp and in contribution with Celluclast 1.5 L for dissolving pulp and Avicel hydrolysis as well. Results indicated that M. pulchella produce an interesting enzymatic array that can disrupt both amorphous and crystalline cellulose, demonstred as potencial secretome for biomass hydrolysis.

Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e &beta;-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de &beta;-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 &Aring;, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 &Aring;, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 &deg;C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 &deg;C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 &deg;C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 &deg;C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de &alpha;-hélice e 42% de folhas- &beta;. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and &beta;-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both &beta;-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 &Aring;, and Rg of 20 and 27 &Aring;, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 &deg;C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 &deg;C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 &deg;C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 &deg;C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de &alpha;-helices and 42% de &beta;-sheet.

O presente trabalho avaliou a recalcitrância de diferentes regiões do entrenó de plantas de cana-de-açúcar que apresentavam teores contrastantes de lignina total. As amostras com baixo teor de lignina corresponderam aos híbridos experimentais denominados de H58 e H89, com 18,6% e 16,8% de lignina, respectivamente. As amostras com elevado teor de lignina corresponderam ao híbrido H140 e a um cultivar comercial (CR), com 21,5% e 24,5% de lignina, respectivamente. De cada cana foram obtidas quatro regiões distintas dos entrenós: medula, interface medula-córtex, córtex e fração externa (epiderme mais córtex periférico). Cada uma das amostras foi submetida à hidrólise enzimática com celulases comerciais. Os resultados mostraram uma maior conversão de celulose e hemicelulose na região da medula (celulose: 86%, 78%, 85% e 50%; xilanas: 50%, 36%, 31% e 30% após 72h, para CR, H58, H89 e H140, respectivamente). O córtex e a fração externa foram as regiões mais recalcitrantes, já que as conversões de celulose e xilanas atingiu somente 10% a 38% no córtex e 6% a 10% na fração externa. Embora seja pouco recalcitrante, a medula representou menos do que 10% do volume e da massa do entrenó. Em contraste, o córtex representou 49% do volume do entrenó e 48% a 63% da massa, dependendo do híbrido estudado. A região medular também mostrou a predominância de glucanas (41% - 55%) e menor teor de hemiceluloses (16,8% - 20,5%; exceto H140) e lignina total (12,6% - 18,5%) em relação às demais frações. A determinação de ácidos hidroxicinâmicos nas amostras indicou a predominância de ligações destes ácidos na forma de éster com a hemicelulose e simultaneamente éter com a lignina, independentemente da fração de cana avaliada. Dentre os híbridos, o H89 e o H140 se destacaram por sua baixa e alta recalcitrância, respectivamente. Nas análises microscópicas, o número de feixes vasculares por área foi maior na região do córtex (13 a 22 feixes por 16 mm2) quando comparada com outras regiões, enquanto a fração externa apresentou apenas fibras. A medula se mostrou preenchida, em sua maior parte, por células do parênquima, contendo menos feixes vasculares (5 a 8 feixes por 16 mm2). Dentre os híbridos, o H140 foi o que apresentou menos feixes por área, porém com os maiores diâmetros (entre 390 e 583 ?m, dependendo da região). A presença de feixes vasculares mostrou ser muito importante para explicar a recalcitrância das amostras. Dentre os estudos de correlação realizados, foi possível notar que a recalcitrância das canas estudadas pode ser relacionada não apenas com o teor de lignina total, mas também com a densidade do material, a disponibilidade de celulose e a extensão dos feixes vasculares por área. / This study evaluated the recalcitrance of different regions of the internodes of sugarcane plants which presented contrasting lignin contents. Samples with low lignin content corresponded to the experimental hybrids termed H58 and H89, each one with 18,6% and 16,8% of lignin, respectively. The samples with high lignin content corresponded to the hybrid H140 and a commercial variety of sugarcane (CR), with 21,5% and 24,5%, respectively. Different fractions of the internodes were obtained from each plant: pith, pith-rind interface, rind and outermost rind (epidermis plus peripheral rind). Each sample was submitted to enzymatic hydrolysis with commercial cellulases. Results showed a higher conversion of cellulose and hemicellulose in the pith (cellulose: 86%, 78%, 85% and 50%, xylan: 50%, 36%, 31% and 30% after 72 hours for CR, H58, H89 and H140, respectively). Rind and outermost rind were the most recalcitrant regions, since the cellulose and xylan conversions reached only 10% to 38% in rind and 6% to 10% in the outermost rind. Despite its low recalcitrance, the pith region represented less than 10% of the volume and the dry mass of the internode. In contrast, the rind represented 49% of the internode volume and 48% to 63% of the dry mass, depending on the evaluated hybrid. The pith region also showed the predominance of glucan (41% - 55%) and the lowest contents of hemicellulose (16.8% - 20.5%, except for H140) and total lignin (12.6% - 18.5%). From the hydroxycinnamic acids determination, it was found that these acids were mostly linked to hemicellulose as esters and, simultaneously, to lignin as ether, regardless which fraction was analyzed. Among the hybrids, H89 and H140 stood out for its low and high recalcitrance, respectively. In microscopic analysis, the number of vascular bundles per area was greater in the rind region (13 to 22 bundles per 16 mm2) when compared to other regions, meanwhile the outermost rind showed only fiber cells. The pith showed itself occupied mostly by parenchyma cells, containing less vascular bundles (5 to 8 bundles per 16 mm2). Among the hybrids, H140 showed the smallest number of vascular bundles per area, but with the largest diameters (between 390 and 583 ?m, depending on the region type). The presence of the vascular bundles was found to be very important in order to explain the recalcitrance of the samples. Among the correlation analysis performed, it was noticeable that the recalcitrance of the studied sugarcanes could be related, not only to the total lignin content, but also to the biomass density, the cellulose availability and the extent of vascular bundles per area.

Com o crescente aumento da demanda energética e a redução dos recursos fósseis, os biocombustíveis obtidos a partir de biomassa lignocelulósica emergem como uma importante fonte de energia alternativa e sustentável. A biomassa lignocelulósica é formada basicamente por celulose, hemicelulose e lignina, cujo agrupamento compõem a complexa matriz da parede vegetal. A celulose é o principal composto de interesse presente na biomassa, uma vez que pode ser quebrada em glicose e usada no metabolismo de microrganismos para a posterior produção de etanol combustível. No entanto, diversos fatores tornam a biomassa recalcitrante ao processo de conversão, o que eleva o custo de produção dos biocombustíveis. Nesse contexto, proteínas aditivas, como as Expansinas vegetais vêm ganhando grande destaque devido à sua capacidade de afrouxar a parede celular por meio do enfraquecimento da ligação entre os polissacarídeos de forma não covalente, o que diminuí o estresse da parede celular e facilita assim a quebra da celulose por enzimas específicas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo identificar genes da superfamília das Expansinas em quatro espécies de gramíneas (Zea mays, Sorghum bicolor, Brachypodium distachyon e Saccharum spp.). As sequências nucleotídicas obtidas a partir de bancos transcriptômicos de cana-deaçúcar foram usados na construção de árvores filogenéticas, por meio das quais pode se inferir as relações de ortologia entre espécies e selecionar sequências com potencial aplicação biotecnológica na promoção da sacarificação enzimática, aumento de biomassa e resistência vegetal à estresse abiótico, sendo estes ShEXPA14, ShEXPA24, ShEXPB22, ShEXPL3, ShEXPA1- zm, ShEXPA33, ShEXPB28, ShEXPB3, ShEXPB21, ShEXPB25 e ShEXPB4. Adicionalmente, os genes de sorgo e cana-de-açúcar foram caracterizados quanto aos domínios e motivos conservados das Expansinas de plantas, identificando as diferenças estre as subfamílias que podem contribuir para a maior especificidade das ?-expansinas em parede celular de gramíneas. / With increasing energy demand and the reduction of fossil resources, biofuels obtained from lignocellulosic biomass emerge as an important source of alternative and sustainable energy. The lignocellulosic biomass is basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin, whose grouping makes up the complex matrix of the vegetal cell wall. Cellulose is the main compound of interest present in biomass since it can be broken down into glucose and used in the metabolism of microorganisms for the subsequent production of fuel ethanol. However, several factors make the biomass recalcitrant to the conversion process, which raises the biofuel production cost. In this context, additive proteins, such as vegetable Expansins have been gaining prominence due to their ability to loosen the cell wall by weakening the bond between the polysaccharides in a non-covalent way, which decreases the stress of the cell wall and thus facilitates the break of cellulose by specific enzymes. Thus, the present work aimed to identify nucleotide sequences of the Expansinas superfamily in four species of grasses (Zea mays, Sorghum bicolor, Brachypodium distachyon and Saccharum spp.). Sugarcane transcripts were used in the construction of phylogenetic trees, through which one can infer the relations of orthology between species and obtain sequences with potential biotechnological application in the promotion of enzymatic saccharification, biomass increase and plant resistance to abiotic stress, these being ShEXPA14, ShEXPA24, ShEXPB22, ShEXPL3, ShEXPA1-zm, ShEXPA33, ShEXPB28, ShEXPB3, ShEXPB21, ShEXPB25 and ShEXPB4. In addition, sorghum and sugarcane genes were characterized by the conserved domains and motifs of plant Expansins, identifying the differences between the subfamilies that may contribute to the greater specificity of the EXPB in the cell wall of grasses.

Betanina e indicaxantina foram obtidas e purificadas e a hidrólise térmica de betanina foi investigada em diferentes pHs, concentrações de tampão, temperaturas e com a adição de sais. Para a decomposição de indicaxantina, foi realizado um estudo em diferentes pHs. Tampões acetato e citrato se mostraram adequados para estudos com betanina, dentro de sua faixa de tamponamento. Os experimentos realizados com tampão fosfato indicaram a ocorrência de catálise geral pelo íon fosfato presente no tampão. O efeito dos sais sobre a hidrólise de betanina foi investigado em pHs 3 e 6,2, com a adição de sais de sódio, amônio e sais cloretos. p-Toluenosulfonato de sódio, cloreto de amônio e cloreto tetrabutilamônio foram os sais que apresentaram maior efeito sobre a constante cinética observada de hidrólise de betanina. A hidrólise das duas betalaínas apresentou um comportamento semelhante com a variação do pH e o ajuste multiparamétrico dos dados sugere que a catálise básica específica é a principal responsável pela hidrólise de betanina e indicaxantina. Um modelo que sugere a abertura do anel 1,2,3,4-tetrahidropiridínico das betalaínas é proposto para explicar o efeito do pH sobre a constante cinética de decomposição determinada em meio ácido. / Betanin and indicaxanthin were obtained and purified and the thermal hydrolysis of betanin was investigated at different pH, buffer concentration, temperature and in the presence of different salts. For the decomposition of indicaxanthin, a study was conducted at different pHs. Acetate buffer and citrate buffer proved to be suitable for the study of betanin. The experiments carried out with phosphate buffer indicated the occurrence of general base catalysis by phosphate ion present in the buffer. The effect of salts on the betanin hydrolysis was investigated at pH 3 and 6.2 with the addition of sodium salts, ammonium salts and chlorides. Sodium p-toluenesulfonate, ammonium chloride and tetrabutylammonium chloride had the larger effects on the observed rate constant for the hydrolysis of betanin. The variation of pH resulted in similar hydrolysis profile for both betalains studied and multiparameter fitting of the data suggests that the specific base catalysis is primarily responsible for the hydrolysis of betanin and indicaxanthin. A model that suggests the opening of the 1,2,3,4-tetrahydropyridine ring of betalains is proposed to explain the effect of pH on the decomposition rate constant under acidic conditions.

A investigação do processo de interação da enzima responsável pela hidrólise da biomassa lignocelulósica e das suas alterações estruturais são de suma importância no que diz respeito à otimização da produção do etanol de segunda geração proveniente da biomassa lignocelulósica. Neste contexto, metodologias óticas foram desenvolvidas e empregadas no presente trabalho na caracterização da interação enzimática com substrato celulósico. Basicamente, foram utilizadas espectroscopia de absorção Uv/vis, fluorescência e dicroísmo circular (CD). Fibras de eucalipto e celulose microcristalina (Avicel) foram usadas como substrato. Com o auxílio da fluorescência intrínseca da enzima Celobiohidrolase I de Thrichoderma harzianum (ThCBHI), foi possível desenvolver o método de arraste enzimático que nos permitiu determinar a dependência da interação enzima-substrato com o pH e a temperatura e estimar o número de enzimas adsorvidas na biomassa lignocelulósica. O efeito destes parâmetros sobre as estruturas secundárias da enzima ThCBHI e de sua influencia na interação enzimática também foi estudado. Medidas da seção choque efetiva de absorção demonstraram que a estrutura da ThCBHI sofreu grande influencia do pH e da temperatura, o que foi confirmado de forma complementar pela técnica de CD. Estimativas da fração de cobertura das enzimas na superfície do substrato indicam uma forte dependência da interação enzima-substrato com o pH e temperatura. Observou-se que essa interação é basicamente determinada pelas cargas efetivas acima e abaixo do ponto isoelétrico associado ao modulo de ligação à celulose, CBM. Além disso, o método colorimétrico Somogyi-Nelson (SN) permitiu quantificar com precisão pequenas quantidades de produto da hidrólise da biomassa pela enzima ThCBHI. Os resultados de atividade mostraram forte correlação entre o perfil de interação e as mudanças estruturais sofridas pela enzima ThCBHI. Com essa metodologia foi possível estimar a máxima atividade da ThCBHI durante 24 horas de reação. Os valores do produto nos permitiu computar atividades específicas de 0,1 U/mg e 0,2 U/mg para 25°C e 50°C, respectivamente. / The investigation of the interaction process of enzymes during hydrolysis of lignocellulosic biomass and the effect of structural changes are issues of fundamental importance in respect to optimization of ethanol second generation production. In this context, optical methodologies were developed and employed in the present work in the characterization of enzymatic interactions with cellulosic substrates. Basically, we used for this purpose absorption and fluorescence spectroscopy and circular dichroism (CD). Eucalyptus fibers and microcrystalline cellulose (Avicel) were used as substrate. The interaction between enzyme and substrate was determined by the use of enzymatic drag methodology by measuring directly the intrinsic fluorescence of the Thrichoderma harzianum Celobiohydrolases I (ThCBHI) enzymes as a function of the temperature and pH of the reaction medium. The effect of these parameters on the enzyme secondary structure was also subject of the present study. Furthermore, both effective cross-section and molar extinction coefficient of the ThCBHI were determined and correlated to structural changes due to temperature and pH, as confirmed by CD measurements. Estimation of the enzyme covering ration for eucalyptus fiber showed a strong dependence on both temperature and pH due to changes of the effective charges above and below the enzyme isoelectric point and to thermal effects on the enzymatic structure and on the enzyme-substrate interaction associated to the Carbohydrate Binding Modules (CBM). In addition, we use the Somogyi-Nelson methodology to measure very small amount of hydrolyses product. As a result, a strong correlation between interaction profile and ThCBH structural changes was demonstrated. Specific activities of 0,1 U/mg e 0,2 U/mg for 25°C e 50°C, respectively, were found for the eucalyptus fiber.

No Brasil o etanol é considerado a melhor escolha para reduzir as dependências dos combustíveis fósseis. Para atender as metas de produção desse combustível renovável, fontes de materiais lignocelulósicos podem ser utilizadas com o intuito de se aproveitar a fração celulósica para obtenção de açúcar fermentável. Contudo, é preciso desenvolver métodos de pré-tratamento eficientes e economicamente viáveis custo para reduzir a recalcitrância da biomassa vegetal in natura, aumentando dessa forma a eficiência da etapa de hidrólise enzimática. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do pré-tratamento por explosão a vapor e do pré-tratamento com ácido diluído, seguidos ou não de uma etapa de deslignificação alcalina, na hidrólise enzimática da palha de cana-de-açúcar. O pré-tratamento por explosão a vapor foi realizado em reator de 2,5 m3 sob temperaturas de 180 °C, 190 °C e 200 °C, por 15 min. O pré-tratamento com ácido diluído (1% m:m) foi feito em reator rotatório de 20 L a 180 °C, 185 °C, 190 °C e 195 °C, por 10 min. A etapa de deslignificação com NaOH (1% m:v) foi feita a 100 °C, por 1 h, em reator de 350 L para a palha pré-tratada por explosão a vapor e em ampolas de 500 mL para a palha de cana pré-tratada com ácido diluído. Amostras de todos os tratamentos foram analisadas por FTIR e MEV. Foram feitos ensaios de hidrólise enzimática utilizando Celluclast 1.5L (15 FPU/g de amostra) e &#946;-Glucosidase (10 UI/g de amostra). Os hidrolisados enzimáticos foram usados em testes de fermentabilidade conduzidos a 30 °C por 48 h utilizando S. cerevisiae UFPEDA 1238. Através de ambos pré-tratamentos foi possível remover mais de 90% de hemicelulose. O pré-tratamento com ácido diluído provocou uma maior degradação da celulose em relação ao pré-tratamento por explosão a vapor, bem como uma maior solubilização da lignina. A etapa de deslignificação alcalina somada ao pré-tratamento contribuiu para a remoção de até 80% da lignina. Análises de FTIR e MEV revelaram alterações das bandas de vibração dos grupamentos químicos e mudanças morfológicas das amostras tratadas em relação à palha in natura. O pré-tratamento por explosão a vapor a 200 °C promoveu a maior conversão enzimática (80%) e esse percentual foi aumentado para 85% pela aplicação da deslignificação alcalina. A fermentação dos hidrolisados enzimáticos se mostrou satisfatória, apresentando percentuais de eficiência acima de 70%. / In Brazil, ethanol is considered the best alternative to reduce dependence on fossil fuels. In order to enhance the production of this renewable fuel, lignocellulosic materials must be used with the goal of harnessing the cellulosic fraction to obtain fermentable sugar. However, an efficient pretreatment method to reduce recalcitrance of raw material is required for increasing the efficiency of enzymatic hydrolysis. This study aimed to evaluate the effect of two pretreatments, steam explosion and dilute acid, followed or not by an alkaline delignification, on enzymatic hydrolysis of sugarcane straw. Steam explosion was conducted in 2.5 m3 reactor at temperatures of 180 °C, 190 °C and 200 °C for 15 min. Dilute acid pretreatment was carried out in 20 L reactor at 180 °C, 185 °C, 190 °C and 195 °C for 10 min, using H2SO4 (1% w:w). Alkaline delignification was made with NaOH (1% w:v) at 100 °C for 1 h. Samples of all treatments were analyzed by FTIR and SEM. Enzymatic hydrolysis was performed with commercial cellulase Celluclast 1.5L (15 FPU/w of sample) and &#946;-Glucosidase (10 IU/w of sample). Alcoholic fermentation by S. cerevisiae UFPEDA 1238 was conducted at 30 °C for 48 h. The pretreatments studied were able to remove over 90% of hemicellulose fraction. Higher degradation of cellulose and lignin fractions was observed during diluted acid pretreatment. Alkaline delignification contributed to the removal of more than 80% of lignin. FTIR and SEM analysis revealed changes in the vibration bands of chemical groups and morphological variation of the treated samples compared to raw material. Steam explosion at 200 °C promoted the higher enzymatic conversion (80%) and this percentage was increased to 85% by application of alkaline delignification. Fermentation tests efficiency was above than 70%.