As feruloil esterases são enzimas relevantes para o processo de hidrólise de materiais lignocelulósicos oriundos de gramíneas. Estas enzimas são tradicionalmente determinadas com o emprego de substratos sintéticos de baixa massa molar. Entretanto, as atividades determinadas a partir desses ensaios não se correlacionam adequadamente com a ação das enzimas em substratos complexos e insolúveis como os materiais lignocelulósicos. Neste sentido, o presente trabalho visou desenvolver um método apropriado para medir a atividade de feruloil esterases utilizando um material lignocelulósico como substrato. Para isso, as medulas de híbridos de cana-de-açúcar com baixo teor de lignina e de um cultivar de referência com elevado teor de lignina foram usadas para preparar substratos de baixa recalcitrância usados na determinação da atividade de feruloil esterases de 3 origens diferentes. As medulas foram extraídas com água para remoção de sacarose e posteriormente analisadas quanto à composição química. As medulas foram ainda submetidas a uma etapa de pré-hidrólise com celulase comercial por 4 horas para preparar um substrato menos recalcitrante e adequado para a ação das enzimas. Após a avaliação do efeito da carga de feruloil esterases na cinética de hidrólise dos ésteres de ácido ferúlico, foi definido que os ensaios enzimáticos deveriam ser realizados com um tempo fixo de 5 minutos a fim de determinar a atividade numa faixa de conversão dos ésteres que fosse da ordem de 2%, assegurando a determinação na região de velocidade máxima de reação. Idealmente, o método foi desenhado para empregar diluições da enzima que gerassem dados de conversão levemente menores e maiores do que 2% de conversão, o que permitiu a determinação exata da carga de enzima necessária para converter 2% de éster do ácido ferúlico em ácido após 5 min de reação por interpolação de dados. As condições de reação foram fixadas em 40°C e pH 6,3. Os níveis de atividade e as reprodutibilidades experimentais determinadas para as 3 enzimas se mostraram dependentes do substrato, principalmente associadas ao teor inicial de lignina observado nas medulas in natura. Tomando as determinações de atividade da feruloil esterase de rúmen como exemplo, os dados obtidos, expressos em UI/?g de proteína, foram: 2,3 ± 0,2, 2,0 ± 0,8 e 0,6 ± 0,5, respectivamente para os substratos oriundos das medulas que continham originalmente 13,0 ± 0,3, 12,8 ± 0,5 e 19,1 ± 0,1% de lignina. Empregando os substratos oriundos de medulas com baixo teor de lignina original, o método se mostrou adequado para estudar os efeitos de variáveis como temperatura e pH do meio reacional sobre a atividade enzimática. No caso da feruloil esterase de rúmen, os estudos mostraram uma temperatura ótima de reação de 40°C e atividades crescentes em função do pH, com máximo na região de 6,3 a 7,2. Pode-se concluir que o trabalho permitiu a elaboração de uma metodologia adequada para a determinação de feruloil esterases empregando um substrato lignocelulósico, desde que este substrato seja preparado a partir de medulas de cana com baixa recalcitrância decorrente do baixo teor original de lignina. / Feruloyl esterases are important enzymes acting on the hydrolysis of lignocellulosic materials from grasses. These enzymes are traditionally determined using synthetic low molar mass substrates. However, the activities determined through these assays do not correlate with the action of the enzymes on complex and insoluble substrates such as lignocellulosic materials. According to this, the present work aimed to develop an appropriate method to measure feruloyl esterase activities using a lignocellulosic material as substrate. Pith regions, recovered from low lignin content sugarcane hybrids and from a high lignin content reference cultivar, were used to prepare low recalcitrance lignocellulosic substrates, used to determine the activity of 3 different feruloyl esterases. The pith samples were extracted with water to remove sucrose and then analyzed concerning its chemical composition. They were further subjected to a prehydrolysis step with commercial cellulase for 4 hours to prepare a less recalcitrant and proper substrates for the action of the feruloyl esterases. After evaluating the effect of enzyme loading on the hydrolysis kinetics of the ferulic acid esters, it was defined that the enzymatic assays should be done at a fixed time of 5 minutes, in order to determine the enzymatic activity in the region of maximal hydrolysis rate. Ideally, the method was designed to use enzyme dilutions that provide ferulic acid ester conversions in the range of 2 %, which allowed the exact determination of the enzyme load necessary to convert 2% of ferulic acid ester in acid after 5 minutes of reaction by interpolating data. The reaction conditions were fixed at 40°C and pH 6.3. The activity levels and the experimental reproducibility determined for the 3 enzymes showed to be dependent of the substrate, specially associated with the initial lignin content of each material. Taking the rumen feruloyl esterase activities as example, the data obtained in UI/?g of protein were 2.3 ± 0.2, 2.0 ± 0.8 e 0.6 ± 0.5, respectively for the substrates from sugarcane piths containing 13.0 ± 0.3, 12.8 ± 0.5 and 19.1 ± 0.1% of lignin. Employing the substrates with low lignin contents, the method showed to be appropriate to study the effects of variables such as the reaction temperature and pH on the enzymatic activity. For rumen feruloyl esterase, the studies showed optimum temperature at 40°C and increasing activities for increasingly pHs, with the maximum in the range 6.3-7.2. In conclusion, the work provided a proper methodology to determine feruloyl esterase activity using a lignocellulosic substrate, but the substrate needs to be prepared from a non-recalcitrance sugarcane pith that was observed in samples with low initial lignin content.

Devido à sua importante atividade celulolítica, o fungo Trichoderma harzianum possui um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. No entanto, as celulases deste fungo filamentoso ainda não foram caracterizadas em profundidade. A celobiohidrolase I (CBHI) é a principal enzima celulolítica produzida por Trichoderma sp. e atualmente é uma das celulases mais investigadas para aplicações de biocombustíveis. A CBHI hidrolisa celulose cristalina à unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar a CBHI de Trichoderma harzianum (ThCBHI) bioquímica, biofísica e estruturalmente. Primeiramente foi estabelecido um protocolo de purificação eficiente da proteína a partir da expressão homóloga no fungo. A caracterização bioquímica ThCBHI mostrou que a proteína possui uma massa molecular de 66 kDa, pI de 5,23 e o pH e a temperatura de atividade ótima foram 5,0 e 50 ºC, respectivamente. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias e atividade enzimática da ThCBHI foram analisados por espectroscopia de CD, fluorescência e SAXS, e os resultados mostraram que as perturbações de pH e de temperatura afetam a estabilidade por dois mecanismos diferentes. As variações de pH podem modificar a protonação dos resíduos, afetando diretamente sua atividade, levando a desestabilização estrutural apenas em limites extremos de pH, como pH 9,0. A temperatura, por outro lado, tem uma influência direta sobre enovelamento e compactação da enzima, fazendo com que na temperatura em torno de 60 ºC ocorra perda da estrutura secundária, e terciária. Quando as análises foram realizadas na presença do produto de reação e também inibidor competitivo, celobiose, a estabilidade térmica da ThCBHI aumentou significativamente de 61,5 para 65,9 ºC. Os estudos estruturais e simulações de dinâmica molecular mostraram que a flexibilidade do resíduo Tyr260, em comparação com a Tyr247 do homólogo de T. reesei CBHI (TrCBHI), é aumentada devido às cadeias laterais curtas adjacentes de Val216 e Ala384 criando uma abertura adicional na face lateral do túnel catalítico. A ThCBHI também apresenta um loop encurtado na entrada do túnel de interação com a celulose, o que tem sido descrito como o responsável por interagir com o substrato de TrCBHI. Estas características estruturais podem explicar por que a ThCBHI apresenta maior valor de kcat e menor inibição pelo produto em comparação com TrCBHI. / Trichoderma harzianum is a fungus that has a considerable potential in biomass hydrolysis application due to its elevated cellulolytic activity. Cellulases from Trichoderma reesei have been widely used as model in studies of cellulose breakdown. However, cellulases from Trichoderma harzianum are less-studied enzymes which have not been characterized biophysically and biochemically as yet. CBHI, a cellobiohydrolase I, is the major cellulolytic enzyme produced by Trichoderma sp. and is currently one of the most investigated cellulases for biofuel applications. CBHI hydrolyzes crystalline cellulose to soluble cellobiose units, which turns it into a key enzyme for producing fermentable sugars from biomass. The aim of this work was to purify and characterize the CBHI of Trichoderma harzianum (ThCBHI). We established an efficient purification protocol of ThCBHI, from the homologous expression. The biochemical characterization of ThCBHI showed that the protein has a molecular mass of 66 kDa, a pI of 5,23, and the optimum pH and temperature for its activity are 5,0 and 50 ºC, respectively. The effect of pH and temperature on secondary and tertiary structure and enzymatic activity of ThCBHI were analyzed by CD and Fluorescence spectroscopy and showed that they affect protein stability by two distinct mechanisms. Variations of pH modify protonation of the residues, affecting directly its activity, leading to structural destabilization only at extreme pH values, such as pH 9, 0. On the other hand, temperature has direct influence on mobility, fold and compactness of the folding enzyme, at temperatures above 60 ºC, there is loss of secondary and tertiary structure. When the assays were conducted in the presence of the cellobiose, a competitive inhibitor, thermal stability of ThCBHI was significantly increased to 61,5 to 65,9 ºC. Structural studies and molecular dynamics simulations showed that the flexibility of Tyr260, in comparison to the Tyr247 from the homologous T. reesei CBHI, is enhanced due to the short side chains of adjacent Val216 and Ala384 residues and creates an additional gap at the side face of the catalytic tunnel. In addition, CBHI of T. harzianum has a shortened loop at the entrance of the cellulose-binding tunnel, which has been described to interact with the substrate in T. reesei CBHI. These structural features might explain why T. harzianum enzyme displays higher kcat value and lower product inhibition on both glucosides and lactosides substrates in comparison to T. reesei CBHI.

Este trabalho avaliou a extração de xilose da palha de cana-de-açúcar sob diferentes condições de hidrólise por ácido sulfúrico diluído visando à obtenção de um hidrolisado hemicelulósico rico em xilose e ainda a fermentabilidade deste para a bioconversão a etanol por Pichia stipitis Y-7124. Inicialmente caracterizou-se a palha de cana e a fração hemicelulósica representou 30,79% da massa seca da palha, enquanto que a celulose representou 40,84% e a lignina 25,80%. Verificou-se ainda que 26,57% da palha corresponde à xilose, representando 86,27% de sua fração hemicelulósica. As hidrólises ácidas foram realizadas de acordo com um planejamento experimental fatorial fracionado 24-1 visando-se à resposta concentração de xilose (g/L) no hidrolisado hemicelulósico. Levou-se em consideração os fatores: tempo, temperatura, concentração da solução ácida e a relação sólido:líquido. A melhor resposta para a concentração de xilose foi encontrada nas condições do ponto central, com a média da concentração igual a 31,70 g/L. A análise de variância foi realizada para um screening do planejamento e observou-se que apenas os fatores concentração da solução ácida e temperatura foram significativos ao nível de 95% de confiança. Em seguida realizou-se ensaios para otimização da hidrólise ácida considerando os fatores temperatura e concentração da solução ácida. As condições de ótimo encontradas foram 130 ºC e a solução de ácido sulfúrico em 2,9% m/v, empregadas com uma relação sólido:líquido igual a 1:4 (g/mL) por 30 minutos de reação. Estas condições de ótimo permitiram a obtenção de um hidrolisado hemicelulósico com concentração igual a 56,5 g/L de xilose, correspondendo à extração de 85,1% da xilose da palha. Posteriormente, ensaios de fermentação foram conduzidos com o hidrolisado hemicelulósico obtido, visando à produção de etanol por P. stipitis em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 100 mL de meio hidrolisado para avaliar a fermentabilidade do hidrolisado obtido bem como a necessidade de suplementação nutricional e utilizou-se um planejamento experimental fatorial 23 de face centrada para verificar a influência dos fatores: concentração de ureia, concentração de MgSO4*7H2O e concentração de extrato de levedura. Os ensaios foram conduzidos a 200 rpm e 30 ºC. Verificou-se que o extrato de levedura (5 g/L) exerceu maior influência sobre o processo fermentativo e que o MgSO4*7H2O (0,5 g/L) não apresentou significância estatística. A melhor condição na fermentação para produção de etanol por P. stipitis encontrada foi empregando-se extrato de levedura (5 g/L), ureia (5 g/L) e MgSO4*7H2O (1,0 g/L), em que se obteve um fator de rendimento em etanol YP/S igual a 0,38 g/g e produtividade volumétrica igual a 0,41 g/L.h, em 60 horas de fermentação. / This work evaluated the sugar cane straw xylose extration under different diluted sulfuric acid hydrolysis conditions aiming at the attainment of hemicellulosic hydrolysate rich in xylose and their fermentability for ethanol bioconversion by Pichia stipitis Y 7124. Previous assays for chemical characterization of the sugar cane straw has been carried. The hemicellulosic fraction represented 30.79% of the dry straw mass, whereas the cellulose represented 40.84% and the lignin represented 25,80%. It was verified despite 26,57% of the straw corresponded to xylose, representing 86,27% of its hemicellulosic fraction. The acid hydrolysis was carried out using an experimental design 24-1 aiming at it the xylose concentration (g/L) response on the hemicellulosic hydrolysate regarding the factors: time, temperature, acid solution concentration and the ratio solid:liquid. The best result for the xylose concentration has been found on the center point conditions, with concentration of 31,70 g/L. The analysis of variance was carried out to one screening of the design and it was observed that only the parameters temperature and acid solution concentration has been significant at 95% reliable level. After that acid hydrolysis assays has been carried regarding the factors temperature and acid solution concentration aiming the acid hydrolysis optimization. The optimum point conditions were 130 ºC and the sulfuric acid solution of 2,9% m/v, carried with the ratio solid:liquid of 1:4 (g/mL) at 30 minutes of reaction. Later, fermentation assays was carried out with the hemicellulosic hydrolysate obtained in 250 mL Erlenmeyer flasks containing 100 mL of hydrolysate to evaluate the hydrolysate fermentability obtained as well tha needless of nutritional supplementation and for it used an experimental design 23 of face centered to verify the influence of the factors: urea concentration, MgSO4*7H2O concentration and yeast extract concentration. Assays has been carried at 30 ºC and 200 rpm. It was verified that the yeast extract (5 g/L) exerts greater influence on the fermentation and the MgSO4*7H2O (0,5 g/L) did not present statistic significance. The best conditions were achieved using yeast extract (5 g/L), urea (5 g/L) and MgSO4*7H2O (0,5 g/L). with ethanol yield and volumetric productivity of 0,38 g/g and 0,41 g/L.h, respectively, after 60 hours of fermentation.

No presente trabalho, avaliou-se o efeito limitante da lignina residual de bagaço de cana submetido a diferentes pré-tratamentos na hidrólise da celulose. O bagaço foi submetido a cinco pré-tratamentos: NaOH (5%), Na2SO3/NaOH (10%/5%), H2SO4 (0,75%), NaHSO3/H2SO4 (5%/0,75%) e explosão a vapor catalisada por SO2 (3%). Os pré-tratamentos resultaram em bagaços com diferentes composições químicas, sendo que os tratamentos alcalinos favoreceram a solubilização de lignina e os tratamentos ácidos favoreceram a solubilização de hemicelulose. Os bagaços tratados com Na2SO3/NaOH e por explosão a vapor resultaram em rendimentos de hidrólise de celulose superiores a 80% ao utilizar altas cargas de enzima (Celluclast), indicando a maior acessibilidade da celulose desses materiais. Isso foi confirmado pela técnica de coloração de Simons, que mostrou que a área superficial acessível da celulose desses dois bagaços foi maior que a dos demais. Boas correlações (R2>0,8) entre o rendimento de hidrólise da celulose em 72 h e a celulose superficial acessível só foram obtidos com altas cargas de enzima, evidenciando que fatores além da acessibilidade limitaram a hidrólise da celulose com quantidade menor de enzimas. As ligninas dos bagaços pré-tratados foram isoladas e a capacidade adsortiva de proteínas foi determinada. A lignina de bagaço tratado por explosão a vapor apresentou maior capacidade adsortiva, seguida da lignina de bagaço tratado com NaOH. Os pré-tratamentos com íons sulfito (Na2SO3/NaOH e NaHSO3/H2SO4) resultaram em ligninas com capacidades adsortivas inferiores quando comparado aos seus análogos sem sulfito (NaOH e H2SO4), possivelmente pela sulfonação da lignina residual, confirmada pela presença de grupos ácidos fortes nesses bagaços. A adição de BSA prévia à adição de celulases confirmou o forte efeito da adsorção improdutiva causada pela lignina nos bagaços tratados com NaOH e por explosão a vapor, materiais cujas ligninas apresentaram maiores capacidades adsortivas. A adsorção improdutiva foi menor ao utilizar o extrato enzimático Cellic CTec3, evidenciando que as enzimas desse coquetel são menos sensíveis à presença da lignina. Do extrato Celluclast, a enzima que mais adsorveu nas ligninas de bagaço tratado com NaOH e por explosão a vapor foi a ?-glicosidase, seguida da endoglucanase. As enzimas purificadas CBHI e EGII de T. longibrachiatum adsorveram menos à lignina de bagaço tratado por explosão a vapor que as mesmas enzimas de T. reesei. A ?-glicosidade de A. niger não adsorveu a essa lignina. Independentemente do pré-tratamento, a presença de fenóis solubilizados a partir da lignina, em baixas concentrações, resultou em aumento no rendimento de conversão de celulose ao utilizar baixas cargas de enzima, possivelmente pelo efeito positivo causado por esses na atividade de enzimas oxidativas, ou pela presença de lignossulfonatos. Em concentrações mais elevadas, independente da carga enzimática, os fenóis liberados foram inibitórios em todos os pré-tratamentos. A atividade de CBHI foi mais sensível à presença dos compostos fenólicos que a atividade de ?-glicosidase. A partir dos resultados, conclui-se o aumento da acessibilidade, seja pela remoção ou pela relocalização da lignina, é o fator que mais influencia a hidrólise eficiente da celulose do bagaço. A adsorção improdutiva foi dependente do pré-tratamento, e resultou em diminuição significativa dos rendimentos de hidrólise da celulose com baixas cargas de enzima. / The present work evaluated the limiting effect of the residual lignin of sugarcane bagasse submitted to different pretreatments: NaOH (5%), Na2SO3/NaOH (10%/5%), H2SO4 (0.75%), NaHSO3/H2SO4 (5%/0.75%) and SO2-catalyzed steam explosion (3%). The pretreatment resulted in bagasses with different chemical compositions, wherein the alkaline treatments resulted in a more efficient solubilization of lignin, and the acidic treatments solubilized the hemicellulose. The bagasses treated with Na2SO3/NaOH and by steam explosion resulted in cellulose hydrolysis yields above 80% using higher enzyme loadings (Celluclast), indicating the increased accessibility of the cellulose in these materials. This was confirmed by Simons\' Stain, which showed that the accessible surface area of the cellulose in these bagasses was higher than in the others. Good correlations (R2>0.80) between the 72 h hydrolysis yields and the accessible surface area of cellulose were only observed at higher enzyme loadings, indicating that other factors than accessibility, limit the hydrolysis at lower enzyme loadings. The lignins were isolated from the pretreated bagasses and the protein binding capacity was determined. The lignin from steam exploded bagasse showed the highest binding capacity, followed by the lignin extracted from NaOH-treated bagasse. The sulfite pretreatments (Na2SO3/NaOH e NaHSO3/H2SO4) resulted in lignins with lower binding capacities, when compared to their analogues without sulfite (NaOH e H2SO4), possibly because of the sulfonation of the residual lignin, confirmed by the presence of strong acid groups in these bagasses. BSA addition prior to the cellulases confirmed the strong effect of unproductive binding caused by the lignin in the NaOH-treated and steam exploded bagasses, materials with the highest binding capacity lignins. Less unproductive binding was observed using the enzyme extract Cellic CTec3, showing that the enzymes in this cocktail are less sensitive to the presence of lignin. From the extract Celluclast, the enzyme that most adsorbed to the lignins isolated from NaOH-treated and steam exploded bagasses was ?-glucosidase, followed by the endoglucases. The purified CBHI and EGII from T. longibrachiatum were less adsorbed to steam exploded bagasse lignin that the same enzymes from T. reesei. ?-glucosidase from A. niger did not bind to this lignin. Despite of the pretreatment, the presence of phenols solubilized from lignin, at lower concentrations, increased the cellulose hydrolysis yields with lower enzyme loading, possibly because of the positive effect of these compounds in the activity of oxidative enzymes, or because of the presence of lignosulfonates. At higher concentrations, despite of the enzyme loading, the phenols were inhibitory in all the pretreatments. The CBHI activity was more sensitive to the presence of phenolic compounds than the ?-glucosidase activity. From these results, it is possible to conclude that the increase in the accessibility, due to the lignin removal or relocation, influences the most the efficient hydrolysis of bagasse cellulose. The unproductive binding was pretreatment dependent and resulted in a significant decrease in the hydrolysis yields of the cellulose at lower enzyme loadings.

Fungos de decomposição branca atuam eficientemente na biodegradação de substratos altamente lignificados, como a madeira. Tal característica permite supor que esses organismos apresentem um sistema celulolítico com atividade diferenciada em substratos ricos em lignina. O presente trabalho avaliou o efeito da adição de enzimas derivadas do fungo de decomposição branca Pleurotus ostreatus em preparações de celulases comerciais durante a hidrólise enzimática do bagaço de cana previamente submetido a tratamento quimiotermomecânico com sulfito alcalino. Duas cargas de sulfito alcalino foram empregadas nos pré-tratamentos: uma mais elevada de 10 g de Na2SO3 e 5 g de NaOH para cada 100g de bagaço, que gerou um substrato de baixa recalcitrância; e uma carga diminuída à metade da anterior, que originou um substrato de elevada recalcitrância. Primeiramente, a produção de endoglucanases (EG) em cultivos submersos de P.ostreatus foi avaliada em diferentes fontes de carbono, sendo a maior produção de EG (342 UI L-1) verificada após 20 dias de cultivo em meio contendo bagaço de cana moído e carboximetilcelulose (CMC). Contudo, devido a CMC ser considerada um interferente nos ensaios de hidrólise do bagaço, optou-se por utilizar enzimas derivadas dos cultivos que empregaram somente bagaço de cana como fonte de carbono. Os experimentos de hidrólise empregaram cargas de enzimas correspondentes a 10FPU (carga alta) e 5FPU (carga média) de celulases derivadas de Trichoderma reesei ATCC 26921, misturadas com uma carga de 15 UI.g-1 de ?-glicosidase (BGL) derivadas de Aspergillus niger, para cada grama de bagaço. Para os experimentos de hidrólise que empregaram enzimas derivadas de P. ostreatus ajustou-se a carga de endoglucanase para que 50% da atividade fosse derivada de T. reesei, e 50% proveniente de P. ostreatus. A suplementação com enzimas de P. ostreatus causou uma alteração no teor das demais enzimas hidrolíticas, verificando-se valores de atividades de xilanases e celulases, com exceção das celobiohidrolases, superiores aos observados com o emprego da carga alta de enzimas comerciais. A conversão da celulose obtida durante a hidrólise dos bagaços pré-tratados mostraram que as enzimas de P. ostreatus proporcionaram valores de velocidade inicial de hidrólise equivalentes aos obtidos nos ensaios com carga alta de enzimas comerciais. Esse resultado foi atingido mesmo com uma carga de celobiohidrolases duas vezes inferior a existente nos ensaios com alta carga de enzimas comerciais, o que levou a considerar que as enzimas derivadas de P. ostreatus possam apresentar atividade celulolítica diferenciada. Além disso, o maior teor de enzimas xilanolíticas nos extratos de P. ostreatus resultou em maiores valores de conversão da xilana. A maior remoção de xilana também pode ter favorecido a maior conversão de celulose obtida mesmo com baixa carga de celobiohidrolases nas misturas reacionais, visto que a remoção da xilana associada à celulose aumentaria a disponibilidade do substrato às celulases. Contudo, a conversão de celulose a partir de 8-24h de hidrólise suplementada com enzimas de P. ostreatus foi ligeiramente inferior ao obtido na hidrólise com carga alta de celulases de T. reesei. / White-rot fungi are able to degrade highly lignified substrates, such as wood. This characteristic allows us to assume that these organisms possess a cellulolytic system with differentiated activity on lignin-rich substrates. This study evaluates how cellulolytic enzymes produced by the white-rot fungus Pleurotus ostreatus perform in the hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse. The sugar cane bagasse was initially pretreated with two chemical loadings of alkaline sulphite: 10 g of Na2SO3 and 5 g of NaOH per 100g of pulp (high chemical load), generating a substrate with low recalcitrance; and a load decreased to half of the previous one, which gave a more recalcitrant substrate. The production of endoglucanases (EG) in submerged cultures of P.ostreatus was evaluated using different carbon sources in the culture media. The highest EG production (342 IU L-1) was observed after fungal growth for 20 days in the culture medium that contained sugarcane bagasse and carboxymethylcellulose (CMC) as carbon sources. However, residual CMC present in the culture extracts was considered to interfere in subsequent hydrolysis assays and we decided to use enzymes derived from the cultures that used only sugarcane bagasse as carbon source. The reference hydrolysis experiments were performed with enzyme loadings of 10 FPU (high loading) and 5 FPU (medium loading) from cellulases derived from Trichoderma reesei ATCC 26921 mixed with 15 UI of ?-glucosidase (BGL) from Aspergillus niger (enzyme loadings expressed in units per gram of pretreated bagasse). For the hydrolysis experiments that used enzymes from P. ostreatus, the enzyme loading was adjusted in order to have 50% of original endoglucanase activity from T. reesei enzymes replaced by enzymes from P. ostreatus enzymes. The addition of P. ostreatus enzymes caused a change in the overall levels of hydrolytic enzymes present in the reaction medium. Xylanase and beta-glucosidase activities were higher than those observed in the commercial enzymes mixture. However, the cellobiohydrolase levels were the half of the original values from the commercial enzymes. The cellulose conversion during the hydrolysis of pretreated bagasses showed that the enzymes from P. ostreatus provided initial hydrolysis rate values similar to those obtained in tests with the high loading of commercial enzymes. This result was achieved even with a cellobiohydrolase loading twice lower than in the assays with high loading of commercial enzymes, which led to the conclusion that the enzymes derived from P. ostreatus can show differentiated cellulolytic activity. In addition, the higher content of xylanolytic enzymes in P. ostreatus extracts resulted in higher xylan conversion. The higher removal of xylan may have also resulted in the higher conversion of cellulose, even with low cellobiohydrolases in the reaction mixtures, since removal of xylan increases the accessibility of the cellulases to the substrate. However, the cellulose conversion after 8-24h hydrolysis supplemented with enzymes from P. ostreatus was slightly lower than that obtained in the hydrolysis with high loading of cellulases from T. reesei.

No presente trabalho, avaliou-se o efeito limitante da lignina residual de bagaço de cana submetido a diferentes pré-tratamentos na hidrólise da celulose. O bagaço foi submetido a cinco pré-tratamentos: NaOH (5%), Na2SO3/NaOH (10%/5%), H2SO4 (0,75%), NaHSO3/H2SO4 (5%/0,75%) e explosão a vapor catalisada por SO2 (3%). Os pré-tratamentos resultaram em bagaços com diferentes composições químicas, sendo que os tratamentos alcalinos favoreceram a solubilização de lignina e os tratamentos ácidos favoreceram a solubilização de hemicelulose. Os bagaços tratados com Na2SO3/NaOH e por explosão a vapor resultaram em rendimentos de hidrólise de celulose superiores a 80% ao utilizar altas cargas de enzima (Celluclast), indicando a maior acessibilidade da celulose desses materiais. Isso foi confirmado pela técnica de coloração de Simons, que mostrou que a área superficial acessível da celulose desses dois bagaços foi maior que a dos demais. Boas correlações (R2>0,8) entre o rendimento de hidrólise da celulose em 72 h e a celulose superficial acessível só foram obtidos com altas cargas de enzima, evidenciando que fatores além da acessibilidade limitaram a hidrólise da celulose com quantidade menor de enzimas. As ligninas dos bagaços pré-tratados foram isoladas e a capacidade adsortiva de proteínas foi determinada. A lignina de bagaço tratado por explosão a vapor apresentou maior capacidade adsortiva, seguida da lignina de bagaço tratado com NaOH. Os pré-tratamentos com íons sulfito (Na2SO3/NaOH e NaHSO3/H2SO4) resultaram em ligninas com capacidades adsortivas inferiores quando comparado aos seus análogos sem sulfito (NaOH e H2SO4), possivelmente pela sulfonação da lignina residual, confirmada pela presença de grupos ácidos fortes nesses bagaços. A adição de BSA prévia à adição de celulases confirmou o forte efeito da adsorção improdutiva causada pela lignina nos bagaços tratados com NaOH e por explosão a vapor, materiais cujas ligninas apresentaram maiores capacidades adsortivas. A adsorção improdutiva foi menor ao utilizar o extrato enzimático Cellic CTec3, evidenciando que as enzimas desse coquetel são menos sensíveis à presença da lignina. Do extrato Celluclast, a enzima que mais adsorveu nas ligninas de bagaço tratado com NaOH e por explosão a vapor foi a ?-glicosidase, seguida da endoglucanase. As enzimas purificadas CBHI e EGII de T. longibrachiatum adsorveram menos à lignina de bagaço tratado por explosão a vapor que as mesmas enzimas de T. reesei. A ?-glicosidade de A. niger não adsorveu a essa lignina. Independentemente do pré-tratamento, a presença de fenóis solubilizados a partir da lignina, em baixas concentrações, resultou em aumento no rendimento de conversão de celulose ao utilizar baixas cargas de enzima, possivelmente pelo efeito positivo causado por esses na atividade de enzimas oxidativas, ou pela presença de lignossulfonatos. Em concentrações mais elevadas, independente da carga enzimática, os fenóis liberados foram inibitórios em todos os pré-tratamentos. A atividade de CBHI foi mais sensível à presença dos compostos fenólicos que a atividade de ?-glicosidase. A partir dos resultados, conclui-se o aumento da acessibilidade, seja pela remoção ou pela relocalização da lignina, é o fator que mais influencia a hidrólise eficiente da celulose do bagaço. A adsorção improdutiva foi dependente do pré-tratamento, e resultou em diminuição significativa dos rendimentos de hidrólise da celulose com baixas cargas de enzima. / The present work evaluated the limiting effect of the residual lignin of sugarcane bagasse submitted to different pretreatments: NaOH (5%), Na2SO3/NaOH (10%/5%), H2SO4 (0.75%), NaHSO3/H2SO4 (5%/0.75%) and SO2-catalyzed steam explosion (3%). The pretreatment resulted in bagasses with different chemical compositions, wherein the alkaline treatments resulted in a more efficient solubilization of lignin, and the acidic treatments solubilized the hemicellulose. The bagasses treated with Na2SO3/NaOH and by steam explosion resulted in cellulose hydrolysis yields above 80% using higher enzyme loadings (Celluclast), indicating the increased accessibility of the cellulose in these materials. This was confirmed by Simons\' Stain, which showed that the accessible surface area of the cellulose in these bagasses was higher than in the others. Good correlations (R2>0.80) between the 72 h hydrolysis yields and the accessible surface area of cellulose were only observed at higher enzyme loadings, indicating that other factors than accessibility, limit the hydrolysis at lower enzyme loadings. The lignins were isolated from the pretreated bagasses and the protein binding capacity was determined. The lignin from steam exploded bagasse showed the highest binding capacity, followed by the lignin extracted from NaOH-treated bagasse. The sulfite pretreatments (Na2SO3/NaOH e NaHSO3/H2SO4) resulted in lignins with lower binding capacities, when compared to their analogues without sulfite (NaOH e H2SO4), possibly because of the sulfonation of the residual lignin, confirmed by the presence of strong acid groups in these bagasses. BSA addition prior to the cellulases confirmed the strong effect of unproductive binding caused by the lignin in the NaOH-treated and steam exploded bagasses, materials with the highest binding capacity lignins. Less unproductive binding was observed using the enzyme extract Cellic CTec3, showing that the enzymes in this cocktail are less sensitive to the presence of lignin. From the extract Celluclast, the enzyme that most adsorbed to the lignins isolated from NaOH-treated and steam exploded bagasses was ?-glucosidase, followed by the endoglucases. The purified CBHI and EGII from T. longibrachiatum were less adsorbed to steam exploded bagasse lignin that the same enzymes from T. reesei. ?-glucosidase from A. niger did not bind to this lignin. Despite of the pretreatment, the presence of phenols solubilized from lignin, at lower concentrations, increased the cellulose hydrolysis yields with lower enzyme loading, possibly because of the positive effect of these compounds in the activity of oxidative enzymes, or because of the presence of lignosulfonates. At higher concentrations, despite of the enzyme loading, the phenols were inhibitory in all the pretreatments. The CBHI activity was more sensitive to the presence of phenolic compounds than the ?-glucosidase activity. From these results, it is possible to conclude that the increase in the accessibility, due to the lignin removal or relocation, influences the most the efficient hydrolysis of bagasse cellulose. The unproductive binding was pretreatment dependent and resulted in a significant decrease in the hydrolysis yields of the cellulose at lower enzyme loadings.

A utilização de resíduos agroindustriais como fontes lignocelulósicas para a obtenção de diversos insumos químicos é uma alternativa para contribuir para a valorização destes subprodutos. Neste contexto, o etanol produzido a partir de materiais lignocelulósicos torna-se uma opção interessante para aumentar a produção deste combustível sem aumentar a área plantada das colheitas utilizadas para sua produção, já que a demanda de etanol vem aumentando cada vez mais nos últimos anos, com o objetivo de substituir o petróleo e seus derivados, contribuindo significativamente para a redução dos impactos negativos ao meio ambiente, tais como o aquecimento global provocado pela queima dos combustíveis fósseis. Para que a produção de etanol celulósico seja economicamente viável é necessário que estas fontes lignocelulósicas sejam fracionadas de forma a disponibilizar a maior quantidade de carboidratos possível para o processo de fermentação alcoólica. Neste trabalho propôs-se avaliar a sacarificação enzimática dos materiais, palha de cana-de-açúcar, bagaço de cana-deaçúcar e pseudocaule de bananeira, nas formas -in natura?, pré-tratada e deslignificada de forma a verificar o efeito do pré-tratamento e da deslignificação no aumento da conversão enzimática da celulose de cada biomassa vegetal. Todos os materiais lignocelulósicos foram caracterizados quimicamente nas formas -in natura?, pré-tratada e deslignificada. Análises de FTIR para cada biomassa comprovaram a alteração na estrutura química proporcionada pelo pré-tratamento e deslignificação destes materiais. O pré-tratamento com H2SO4 1,0% (m/v) a 120 °C por 10 min, seguido de deslignificação com NaOH 1,0% (m/v) a 100 °C por 1h, ambos em reator piloto agitado de 350 L promoveu uma solubilização de 88,8 % de hemicelulose e 77,9% de lignina para a palha de cana, e uma solubilização de 79,3% de hemicelulose e 62,3% de lignina para o pseudocaule de bananeira. Já o bagaço de cana foi pré-tratado hidrotermicamente em reator de 20 L, nas condições, 180 °C/10 min, 185 °C/10 min, 190 °C/10 min e 195 °C/10 min, sendo que esta última condição, seguida de deslignificação com NaOH a 1,0% (m/v) a 100 °C por 1h proporcionou uma solubilização de 95,8% de hemicelulose e 80,9% de lignina para este material. Os ensaios de conversão enzimática dos materiais lignocelulósicos mostraram que a conversão celulósica aumentou consideravelmente, para todos os materiais, após o pré-tratamento seguido de deslignificação, atingindo 85% de conversão para a palha de cana, 89,2% de conversão para o bagaço de cana e 61,0% de conversão para o pseudocaule de bananeira. Após as etapas de pré-tratamento e deslignificação alcalina, os materiais lignocelulósicos apresentaram uma estrutura morfológica modificada, com as células vegetais livres de células de parênquima, conforme verificado pelas análises de MEV, e com redução da cristalinidade da celulose remanescente, conforme mostrado pelas análises de Difratometria de Raios X. Ensaios de fermentabilidade dos hidrolisados celulósicos de bagaço de cana utilizando a levedura Candida guilliermondii mostraram uma boa resposta da levedura à produção de etanol alcançando uma concentração máxima de 20 g/L. / The use of agroindustrials residues about lignocellulosics sources to obtain many chemicals products it\'s an alternative to contribute for the valuation of these subproducts. In this context, the ethanol produced by lignocellulosic materials it´s an interesting option for increase the production of this fuel without increase the agriculture area for production of biofuels, since the ethanol demand has increasing even more in the last years, with the objective of substitute the oil and his derivates, contribute significatively for reduce of negative impacts for environment, about the greenhouse gas impacts produced by burning of fossil fuels. For that production of cellulosic ethanol will be economic favorable it´s necessary that lignocellulosics sources will be fractionates for to make it available many carbohydrates possible for alcohol fermentation processes. This work had objective to evaluate enzymatic saccharification of materials, sugar cane straw, sugar cane bagasse and pseudosteam of banana, in this raw, pretreated and delignificated forms, for analyze the effect of pretreatment and delignification on the increase of enzymatic saccharification of cellulose wich biomass. Every lignocellulosic materials went submitted a chemical characterization in this raw, pretreated and delignificated forms. FTIR analysis for each biomass confirmed the change of chemical structure challenge for pretreatment and delignification of this materials. The pretreatment with H2SO4 1.0% (m/v), 120 °C, 10 min, followed of delignification with NaOH 1.0% (m/v), 100 °C, 1h, both in 350 L agitated reactor, promoted a solubilization of 88.8% for hemicellulose and 77.9% of lignin for sugar cane straw, and a solubilization of 79.3% for hemicellulose and 62.3% of lignin for pseudosteam of banana. The sugar cane bagasse went carried hydrothermal processing pretreatment on reactor of 20 L, in this conditions, 180 °C/10 min, 185 °C/10 min, 190 °C/10 min e 195 °C/10 min, although in this last condition, followed of delignification with NaOH 1,0% (m/v), 100 °C for 1h to affored a solubilization of 95.8% for hemicellulose and 80.9% of lignin for this material. The experiments of enzymatic saccharification of lignocellulosic materials showed that cellulosic conversion increased considerably, for all materials, after pretreatment followed of delignification, attaining 85% of conversion for the sugar cane straw, 89.2% of conversion for the sugar cane bagasse and 61% of conversion for the pseudosteam of banana. After pretreatments steps and alkaline delignification, the lignocellulosic materials showed changed morphologic estrutural, with vegetable cells lived of parenchyme cells, according to the SEM analysis, and with reduce of cellulose cristallinity remaining, according to the X Ray diffraction analysis. Experiments of fermentation of cellulosics hydrolysates of sugar cane bagasse using Candida guilliermondii it has showed a good reply of yeast for the ethanol production aimed the máxime concentration of 20 g/L.

Métodos que convertem o bagaço de cana-de-açúcar em açúcares fermentescíveis são geralmente compostos por duas etapas principais: pré-tratamento para degradar a estrutura da planta e uma etapa de hidrólise enzimática ou química para converter as cadeias poliméricas em açúcares. Cada tecnologia de pré-tratamento tem um mecanismo diferente de ação sobre a estrutura do bagaço induzindo modificações físicas e/ou químicas, que são necessárias devido a presença de hemicelulose e lignina na parede celular da planta, o que impede o acesso das celulases nas partes internas do substrato. No presente trabalho, o processo quimio-mecânico foi utilizado para pré-tratar o bagaço de cana com o objetivo de aumentar a acessibilidade na parede celular pelas enzimas hidrolíticas. O processo associa a vantagem da remoção de um ou mais componentes do bagaço e o aumento da área superficial por trituração. Após o tratamento quimio-mecânico, rendimento do processo com adição de álcali foi de 91% e com sulfito alcalino de 75%, que corresponde à remoção de 33% e 53% de lignina e 13% e 29% da hemicelulose, respectivamente.A conversão de celulose de amostras pré-tratadas com álcali e sulfito-alcalino atingiu 50% e 85%, respectivamente, após 96 h de hidrólise enzimática. Duas amostras de bagaço com menor teor de lignina que a amostra proveniente da usina foram pré-tratadas com NaOH e refinadas. Uma das amostras com 14,2% de lignina foi obtida pela deslignificação seletiva com clorito de sódio e a outra com 19,2% de lignina foi selecionada em um programa de melhoramento genético da cana-de-açúcar e neste trabalho foi denominado de híbrido. As amostras com menor teor inicial de lignina foram hidrolisadas mais rapidamente nas primeiras 24 h de digestão enzimática. Por exemplo, a hidrólise enzimática da amostra com o menor teor de lignina inicial (14,2%) alcançou a conversão de celulose 64%, após apenas 24 h de hidrólise em comparação aos 30% observado para o bagaço de usina que continha um teor inicial de lignina de 24,4% .Um estudo adicional foi feito, em que o bagaço da usina e os híbridos foram pré-tratados quimio-mecanicamente com diferentes concentrações de hidróxido de sódio e sulfito. Foram avaliadas três concentrações de NaOH (2,5%, 3,75% e 5%) em combinação com sulfito de sódio (5%, 7,5% e 10%), mantendo-se a proporção de 1:2 de reagentes, respectivamente. As polpas obtidas do bagaço híbrido foram hidrolisadas mais facilmente que as polpas obtidas do bagaço da usina pré-tratadas na mesma concentração de sulfito-NaOH. O tempo necessário para hidrolisar 70% da celulose do bagaço híbrido foi a metade daquele necessário para hidrolisar o bagaço de usina. O menor teor de lignina e a presença de grupos sulfônicos podem ser fatores relevantes na digestibilidade enzimática do bagaço, portanto, plantas com baixo teor de lignina podem ser pré-tratadas por processos alcalinos relativamente brandos produzindo substratos mais facilmente hidrolisáveis por celulases. / Methods that convert sugarcane bagasse into fermentable sugars are generally comprised of two main steps: a pretreatment to degrade the plant structure and an enzymatic or chemical hydrolysis step to convert the polymeric chains into monomeric sugars. Each pretreatment technology has a different mechanism of action on the bagasse structure inducing physical and/or chemical modifications, which are necessary because the presence of hemicellulose and lignin in the cell walls prevents cellulases from accessing inner parts of the substrate. In this present work, chemomechanical processing was used to pretreat sugarcane bagasse with the aim of increasing cell wall accessibility to hydrolytic enzymes. The process combines the advantage of removal one or more components of bagasse and the increase in surface area by refining. After chemomechanical treatment, the yield of the process with the addition of alkali was 91% and 75% with alkaline-sulfite,corresponding to the removal of 33% and 53% of lignin and 13% and 29% of hemicellulose, respectively. Cellulose conversion of the alkaline- and alkaline/sulfite-chemomechanical pretreated samples reached 50% and 85%, respectively, after 96 h of enzymatic hydrolysis. Two samples of pulp with lower lignin content than the sample from the mill were pretreated with NaOH and refined. One of the samples with 14.2% of lignin was obtained by selective delignification with sodium chlorite and the other with 19.2% of lignin was selected in a breeding program of cane sugar and at this work has been called hybrid. Samples with lower initial lignin content hydrolyzed faster in the first 24 h of enzymatic digestion. For example, enzymatic hydrolysis of the sample with the lower initial lignin content (14.2%) reached 64% cellulose conversion after only 24 h of hydrolysis as compared to the 30% observed for the mill-processed bagasse containing an initial lignin content of 24.4%. An additional study was done,in which the mill bagasse and the hybrid were chemomechanically treated with different concentrations of NaOH and sulfite. Three concentrations of NaOH were evaluated (2.5%, 3.75% and 5%) in combination with sodium sulfite (5%, 7.5% and 10%), keeping the 1:2 ratio of reagents, respectively. Pulps obtained from hybrid bagasse were hydrolyzed more easily than the pulp obtained from the mill-processed bagasse treated in the same concentration of sulfite-NaOH. The time required to hydrolyze 70% of hybrid bagasse was half that required to hydrolyze the mill-processed bagasse. The lower lignin content and the presence of sulfonic groups may be important factors in the enzymatic digestibility of bagasse, therefore, plants with low lignin content can be pre-treated by relatively mild alkali processes producing substrates more easily hydrolysable by cellulase.

O bagaço de cana-de-açúcar é um material rico em celulose, molécula que pode ser convertida enzimaticamente em glicose pela ação de celulases. No entanto, no bagaço, a celulose está associada à hemicelulose e à lignina, componentes que limitam a sua digestibilidade enzimática. A lignina é o principal limitante da hidrólise da celulose, reduzindo a acessibilidade das enzimas celulolíticas. A hemicelulose também limita a ação das celulases e a presença de ácidos hidroxicinâmicos, como ferúlico e cumárico contribuem para reduzir os níveis de hidrólise. Nesse trabalho, o bagaço de cana-de-açúcar foi tratado com clorito de sódio em meio ácido com o objetivo de remover seletivamente a lignina e produzir modelos com teores reduzidos desse componente. O bagaço de cana controle continha 22,8% de lignina e após a deslignificação por 4 horas, materiais com até 6,8% de lignina foram obtidos, mantendo quase inalteradas as frações celulósicas e hemicelulósicas. Os bagaços foram submetidos à hidrólise enzimática com celulases comerciais. Apenas 26% da celulose de bagaço controle foram convertidos em glicose e 11% da xilana foram convertidos em xilose, com 72 horas de hidrólise. Nos bagaços com menores teores de lignina, os valores de conversão de celulose e de xilana alcançaram 85% e 64% no mesmo tempo de hidrólise, respectivamente. Os resultados mostraram que existe uma correlação inversa entre o teor de lignina e a conversão de polissacarídeos e que a remoção de 60% da lignina confere níveis elevados de hidrólise. Para reduzir a inibição pelos produtos de hidrólise da celulose, foi adicionada β-glicosidase ao meio reacional. Com a adição dessa enzima, os bagaços mais deslignificados alcançaram 100% de conversão de celulose e 82% de xilana, com 48 horas de hidrólise. No presente trabalho, o efeito da lignina não ligada aos polissacarídeos também foi avaliado. Para isso, lignina de bagaço de cana foi adicionada ao cartão de celulose, e este foi submetido à hidrólise enzimática. Não houve diferença entre os níveis de hidrólise na presença e ausência de lignina, indicando que a lignina limita a hidrólise dos polissacarídeos quando ligada a eles. Foi utilizada a técnica de microespectrofotometria ultravioleta para detectar a lignina e os ácidos hidroxicinâmicos em fibras, vasos e células de parênquima das regiões de córtex e de medula, deslignificados e controle. Os espectros UV dos três tipos celulares mostraram bandas em 278 nm, associada à lignina, e em 315 nm, associada aos ácidos hidroxicinâmicos. Os vasos foram os tipos celulares mais lignificados, seguidos pelas fibras e células parenquimatosas. O tratamento com clorito causou uma rápida remoção dos ácidos hidroxicinâmicos das células de parênquima, enquanto que as fibras foram deslignificadas apenas com 4 horas de tratamento. As amostras de córtex e de medula também foram submetidas à hidrólise com celulases. A região de medula não tratada foi prontamente hidrolizada, alcançando 63% de conversão de celulose com 72 horas, enquanto que o córtex não tratado atingiu apenas 20%. O tratamento com clorito de sódio não aumentou os níveis de hidrólise da medula. No entanto, a remoção de lignina do córtex aumentou consideravelmente a conversão. / The sugarcane bagasse is a material rich in cellulose, wich can be enzymatically converted into glucose by the action of cellulases. However, in the bagasse, it is associated to hemicellulose and lignin, components that limit its enzymatic digestibility. Lignin is the main limitant of the enzymatic hydrolysis of cellulose, reducing the accessibility of cellulases. Hemicellulose also limits the cellulase action and the presence of the hydroxycinnamic acids, as ferulic and coumaric, contribute to reduce the hydrolysis levels. In this work, the sugarcane bagasse was treated with acid sodium chlorite, aiming to selective remove the lignin and produce models with lower contents of this component. The control bagasse had 22.8% of lignin and after a 4-hour delignification, materials with up to 6.8% of lignin were obtained, retaining the cellulosic and hemicellulosic fractions almost unchanged. The bagasses were submitted to the enzymatic hydrolysis with comercial cellulases. Only 26% of the cellulose of the control bagasse were converted into glucose and 11% of the xylan were converted into xylose, with 72 hours of hydrolysis. In the bagasses with lower lignin content, the cellulose and xylan conversion values reached 85% and 64% in the same time of hysylysis, respectively. The results showed that there is an inverse correlation between the lignin content and the enzymatic conversion of polysaccharides and that the removal of 60% of the lignin results in high levels of hydrolysis. To reduce the inhibition by the products of the cellulose hydrolysis, β- glucosidase was added to the reaction medium. With this enzyme, the most delignified bagasses reached 100% of cellulose and 82% of xylan convertion, with 48 hours of hydrolysis. In this work, the effect of non-linked lignin was also analysed. For this, sugarcane bagasse lignin was added to cellulose card, and it was submitted to the enzymatic hydrolysis. There were no differences between the hydrolysis levels in the presence or absence of lignin, suggesting that lignin only limits hydrolysis when linked to the polysaccharides. The ultraviolet microspectrophotometry technique was used to detect lignin and hydroxycinnamic acids in fiber, vessels and parenchyma cells in rind and pith regions, delignified and control. The UV spectra of the three cell types showed bands in 278 nm, related to lignin, and 315 nm, related to the hydroxycynamic acids. The vessels were the most lignified cell type, followed by fibers and parenchyma cells. The chlorite treatment caused a rapid removal of hydroxycynnamic acids from parenchyma cell walls, while fibers where delignified only with a 4-hour treatment. The rind and pith samples were also submitted to enzymatic hydrolysis. The untreated pith region was promptly hydrolysed, reaching 63% of cellulose convertion in 72 hours, while untreated rind reached only 20%. The sodium chlorite treatment did not enhance the pith hydrolysis levels. However, the lignin removal in rind samples substantially enhanced the conversion.

Curauá é uma planta cultivada na região da Amazônia e suas fibras lignocelulósicas contém um alto teor de celulose. Este estudo teve como objetivo contribuir com a diversificação de aplicações da fibra de curauá através da conversão da fração de polissacarídeos a açúcares fermentescíveis (sacarificação), por meio de hidrólise enzimática. Estes açúcares posteriormente podem ser convertidos no chamado etanol celulósico, através de fermentação. As fibras de curauá usadas neste estudo apresentaram como composição em torno de 76% de α-celulose, 16% de hemiceluloses e 8% de lignina Klason total. Fibras ricas em celulose, como as de curauá, têm ótimo potencial como material de partida para conversão a açúcares (neste caso glicose) fermentescíveis. Pré-tratamentos podem aumentar a eficiência desta conversão, através da modificação de propriedades das fibras como dimensões, morfologia da superfície, teor de lignina e/ou hemiceluloses, cristalinidade. Estudos anteriores corresponderam a uma exploração inicial da fibra de curauá quanto ao processo de sacarificação, submetendo-a a pré-tratamentos com solução aquosa alcalina (NaOH 20%) a temperatura ambiente, durante 2 h, o que aumentou o rendimento de glicose em relação a fibra não pré-tratada. O presente estudo visou explorar condições relativamente brandas para pré-tratamentos usando solução aquosa ácida de ácido oxálico (0,9M), selecionado por poder ser obtido a partir de fontes naturais, assim como testar condições diferentes das já usadas para pré-tratamento alcalino. Fibras previamente lavadas com água a temperatura ambiente e a 70 ºC (visando remover resíduos ou sais aderidos a fibra), e então submetidas a extração com mistura de etanol e cicloexano 1:1 (visando remover ceras, terpenos e ácidos graxos) foram submetidas a pré-tratamentos utilizando solução de ácido oxálico (AO) 0,9M na proporção de 1:30 de massa de fibra por volume de solução (g/mL), durante 1,5h a temperatura ambiente (AC0915AM), 1,5 h a 60 ºC (AC091560) e 3,0 h a 60 ºC (AC093060), e a pré-tratamento utilizando solução de hidróxido de sódio 20% durante 2 h (NaOH202060) e 5 h a 60 ºC (NaOH205060). Estas fibras pré-tratadas com AO e NaOH202060 foram posteriormente submetidas a hidrólise enzimática. As fibras pré-tratadas ou não foram caracterizadas quanto ao teor de holocelulose, de α-celulose, hemiceluloses, lignina total, microscopia eletrônica de varredura (MEV), cristalinidade (DRX), análise termogravimétrica (TGA, DTG), dimensões, e os resultados indicaram as seguintes mais relevantes modificações comparativamente às fibras não tratadas: aumento no teor de holocelulose de 92,1±0,4% para 93,1±0,7% (AC0915AM), redução no teor de α-celulose de 76,3±0,1% para 70,1±0,1% (AC091560), aumento no teor de hemiceluloses de 15,9±0,4% para 21,9±0,6% (AC091560), , e variação em cristalinidade de 61% (fibra de partida) para 75% (AC093060), indicando consumo de cadeias de celulose presentes nos domínios não cristalinos durante o pré-tratamento. O teor de lignina não apresentou variação significativa Os resultados também indicaram que tanto ácido quanto a base têm preferência em atacar as superfícies das fibras, comparativamente às extremidades, diminuindo a espessura das mesmas. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostrou mudanças na superfície das fibras após pré-tratamento com AO e com NaOH nas diferentes condições, indicando que o maior tempo de pré-tratamento e maior temperatura resultaram em maiores modificações na morfologia das superfícies das fibras. A hidrólise enzimática foi realizada utilizando o complexo enzimático Accellerase 1500 (Genecor) que possui exoglucanases, endoglucanases, hemicelulases e β-glucanases e foi conduzia em tampão de citrato (50mL tampão/g fibra, pH 5), durante 48 h. Durante a hidrólise enzimática, alíquotas foram retiradas do meio em determinados intervalos de tempo, e as fibras não reagidas foram separadas por filtração do licor contendo os açúcares hidrolisados. As fibras não reagidas foram caracterizadas conforme as fibras de partida. As curvas DTG mostraram diminuição na intensidade do pico referente à decomposição térmica da celulose (em torno de 375 ºC) em diferentes tempos de reação da hidrólise enzimática devido a conversão da mesma em glicose, e mostraram redução do \"ombro\" referente a decomposição das hemiceluloses, devido a hidrólise das mesmas durante a reação. Os resultados referentes à avaliação das dimensões das fibras indicaram que a enzima atuou preferencialmente a partir da superfície das mesmas, comparativamente às extremidades, pois as variações na densidade das fibras foram superiores em relação a espessura comparativamente ao comprimento. Os resultados de índice de cristalinidade (DRX) indicaram que a enzima teve preferência em consumir preferencialmente as cadeias de celulose de domínios não cristalinos. As análises dos licores por HPLC foram realizadas tanto para as fibras pré-tratadas quanto para as fibras não pré-tratadas (esta somente após 48h). Após 48 h de reação, utilizando 0,5 mL.g-1 de enzima, os rendimentos foram de 58,6% (fibra não pré-tratada), 72,0% (AC0915AM), 74,8% (AC091560), 77,4% (AC093060) e 71,6% (NaOH202060). Para as fibras AC091560, utilizando 1,5 mL.g-1 de enzima o rendimento aumentou para 81,9%, mas uma análise de viabilidade econômica é necessária para avaliar se o gasto com enzimas não se contrapõe ao aumento no rendimento. As micrografias (MEV) mostraram que durante o pré-tratamento o ácido atacou a superfície das fibras de partida, diminuindo as espessuras das fibras mais espessas e a cristalinidade de 74% para 65%. O aumento no rendimento de glicose em relação a fibra de partida indica que esses fatores facilitaram o acesso das enzimas às cadeias de celulose. O tratamento alcalino resultou em rendimento maior (71,6 %) em relação a estudos anteriores. No entanto, este resultado foi aquém do esperado, indicando que o aumento na cristalinidade de 61% (fibras não pré-tratadas) para 79% dificultou o acesso das enzimas às cadeias de celulose. O presente estudo aprofundou investigações prévias, levando a um importante conjunto de resultados que podem embasar futuros estudos. / Curauá is a plant grown in the Amazon region and its lignocellulosic fibers contain a high content of cellulose. The aim of this study was to contribute to the diversification of curauá fiber applications by converting the polysaccharide fraction to fermentable sugars (saccharification) through enzymatic hydrolysis. Cellulosic ethanol is obtained from the fermentation of these sugars. The curauá fibers used in this study had around 76% of α-cellulose, 16% of hemicelluloses and 8% of total lignin Klason. Cellulose-rich fibers, such as curauá, have excellent potential as a starting material for converting to fermentable sugars (glucose). Pre-treatments may increase the efficiency of this conversion by modifying fiber properties such as size, surface morphology, lignin and/or hemicelluloses contents, and crystallinity. Previous studies corresponded to an initial exploration of the curauá fibers for the saccharification process, subjecting them to pre-treatments with aqueous alkaline solution (NaOH, 20% ), , room temperature,for 2 h, which increased the yield of glucose compared to untreated fiber. The present study aimed to explore relatively mild conditions for pre-treatments with acidic aqueous solution of oxalic acid (0,9M), which can be obtained from natural sources, as well as to test conditions different from those already used for alkaline pretreatment. Fibers previously washed with water at room temperature and at 70° C (to remove residues or salts adhered to fiber). Thereafter the fibers were extracted with a mixture of ethanol and cyclohexane 1:1 (to remove waxes, terpenes and fatty acids). After that the fibers were subjected to pretreatments using 0.9M oxalic acid solution (AO) at the ratio of 1:30 (g/mL) during 1.5h at room temperature (AC0915AM), 1.5 h at 60 ºC (AC091560) and 3.0 h at 60 ºC (AC093060). The fiber was also pretreated with sodium hydroxide 20% during 2.0 h at 60 ºC (NaOH 202060) and during 5.0 h at 60 ºC (NaOH 205060). The AO pretreated fibers were subsequently subjected to enzymatic hydrolysis, as well as NaOH 202060. The fibers were evaluated as to hollocelulose, α-cellulose, hemicelluloses and total lignin contents, crystallinity (DRX), thermogravimetric analysis (TGA, DTG), scanning electron microscopy (SEM). The results indicated the following most relevant modifications compared to untreated fiber: increase in holocellulose content from 92,1±0,4% to 93,1±0,7% (AC0915AM), reduction in α-cellulose content of 76,3±0.1% to 70,1±0,1% (AC091560), increase in hemicelluloses content from 15,9±0,4% to 21,9±0,6% (AC091560), and crystallinity variation from 61% to 75% (AC093060), indicating preferential consumption of the cellulose chains present in the non-crystalline domains of the fiber during pretreatment No significant change was observed for the lignin content. The results also indicated that both acid and base have a preference in attacking the surfaces of the fibers compared to the ends, decreasing their thickness. SEM showed changes in the surface of the fibers after pre-treatment with AO and NaOH under different conditions, indicating that the longer pretreatment time and higher temperature resulted in greater modifications in the fiber surface morphology. Enzymatic hydrolysis was performed using the enzyme complex Accellerase 1500 (Genecor) having exoglucanases, endoglucanases, hemicellulases and β-glucanases and was run in citrate buffer (50mL buffer/g fiber, pH 5) for 48 h. During the enzymatic hydrolysis, aliquots were withdrawn from the medium at certain time intervals, and the unreacted fibers were separated by filtration of the liquor containing the hydrolyzed sugars. The unreacted fibers were characterized according to the starting fibers. The DTG curves showed a decrease in the intensity of the peak relative to the thermal decomposition of the cellulose (around 375 ºC) in different reaction times of the enzymatic hydrolysis due to the conversion of the same into glucose, and showed reduction of the \"shoulder\" referring to the decomposition of hemicelluloses, due to their hydrolysis during the reaction. The results concerning the evaluation of the fiber dimensions indicated that the enzyme acted preferentially from the surface of the fibers, compared to the ends, since the variations in fiber density were higher in relation to the thickness compared to the length. The crystallinity index results indicated that the enzyme consumed preferentially cellulose chains of non-crystalline domains. Analysis of the liquors were performed by HPLC for both pretreated and non-pretreated fibers (this one only after 48h). After 48 h of reaction using 0.5 mL.g-1 enzyme, the yields were 58.6% (non-pretreated fiber), 72.0% (AC0915AM), 74.8% (AC091560), 77.4% (AC093060) and 71.6% (NaOH202060). For AC091560 fibers, using 1.5 mL.g-1 of enzyme the yield increased to 81.9%, but an economic viability analysis is required to assess whether the enzymes expense does not counteract the increase in yield. The micrographs (SEM) showed that during the pretreatment the acid attacked the surface of the starting fibers, decreasing the thicknesses of the thicker fibers, and the crystallinity from 74% to 65%. The increase in glucose yield relative to the starting fiber indicates that these factors facilitated the access of the enzymes to the cellulose chains. Alkaline treatment resulted in higher yield (71.6%) than in previous studies. However, this result was lower than expected, indicating that the increase in crystallinity from 61% (non-pretreated fibers) to 79% disfavored the access of the enzymes to the cellulose chains. The present study deepened previous investigations, leading to an important set of results that may support future studies.