Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Rice husk is a fairly abundant agro-industrial waste in the state of Rio Grande do Sul, hence the same has been suggested and studied to be used as in lignocellulosic hydrolysis to produce fermentable sugars material. However, processes of hydrolysis in most cases are more expensive and impractical. In this context, this work aimed to study which evaluated acid and enzymatic hydrolysis of rice hulls to obtain fermentable sugars using some alternative technologies such as ultrasound and supercritical CO2 to increase the yields of sugars. In the acid hydrolysis, the yields obtained at optimized conditions were 113.0 and 162.0 g.kg-1 for conventional and ultrasound-assisted hydrolysis, where the yield obtained by ultrasound-assisted hydrolysis was around 43% higher than for the conventional hydrolysis. In the enzymatic hydrolysis, it was evaluated the use of supercritical CO2 as co-solvent and ultrasound-assisted hydrolysis and the results were compared with conventional procedure. Maximum yield of fermentable sugar obtained was about 16 g.kg-1using conventional or ultrasound-assisted hydrolyses. The yield obtained in the hydrolysis using supercritical CO2 as co-solvent was around 4.2 g.kg-1. Enzymatic hydrolysis using conventional procedure showed to be the best alternative to obtain fermentable sugar from rice hulls since the innovative technologies employed did not lead to better results. For acid hydrolysis, it was possible to obtain high yield using less acid and low temperature, in a manner that ultrasound can be used as a device for process intensification. / A casca de arroz é um resíduo agroindustrial bastante abundante no estado do Rio Grande do Sul, deste modo à mesma vem sendo sugerida e estudada para ser usada como material lignocelulósico em hidrólises para a produção de açúcares fermentescíveis. Entretanto, processos de hidrólises na maioria das vezes não possuem um alto rendimento o que torna o processo ainda mais caro e inviável. Dentro desse contexto o presente trabalho teve o intuito de realizar um estudo onde avaliou hidrólise ácida e enzimática da casca de arroz para a obtenção de açúcares fermentescíveis utilizando algumas tecnologias alternativas, como o banho de ultrassom e CO2 supercrítico para aumentar os rendimentos de açúcares. Os ensaios foram realizados em diferentes condições de temperatura, concentrações de ácido e umidade, pressão e concentrações de enzima do meio. Na hidrólise acida convencional obteve-se um rendimento de 113,0 g.kg-1 e na hidrólise ácida assistida por ultrassom o rendimento foi de 162,0 g.kg-1, com base nesses resultados dos rendimentos de açúcares foi possível concluir que o uso do ultrassom intensificou o processo ocorrendo um aumento do rendimento em cerca de 43% quando comparado com o rendimento de açúcares fermentescíveis da hidrólise convencional. Já na hidrólise enzimática utilizando o CO2 Supercrítico o rendimento foi de 4.2 g.kg-1 enquanto que o rendimento da hidrólise enzimática convencional e assistida por ultrassom foi de 16 g.kg-1, neste caso o uso do CO2 supercrítico não foi uma alternativa promissora, uma vez que a mesma causou uma desnaturação das enzimas causando uma diminuição na eficiência do processo.

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Dentre as etapas de produção do etanol de segunda geração tem-se no pré-tratamento da biomassa um dos pontos cruciais, uma vez que a eficiência deste processo está diretamente ligada à maior produção de monossacarídeos fermentáveis após hidrólise e consequentemente maior produtividade de etanol. Dentro deste contexto, no presente trabalho estudou-se o efeito da presença de espécies químicas derivadas do ácido bórico durante pré-tratamento alcalino de palha de soja (matéria-prima abundante no Brasil e ainda inexplorada), visando uma solubilização mais seletiva da lignina em condições brandas, onde a recuperação de carboidratos possa ser superior. Numa primeira etapa estudou-se através de metodologia de superfície de resposta (planejamento composto central) o efeito da concentração inicial de ácido bórico (0,06 a 0,49 mol/l), pH (9,27 a 13,00) e tempo de pré-tratamento (80 min a 280 min) na porcentagem de solubilização da biomassa e recuperação de carboidratos (glicose e xilose) após hidrólise enzimática - experimentos foram conduzidos em temperatura de refluxo. Os resultados mostraram que o tempo não tem efeito significativo dentro do intervalo estudado, e que as superfícies de resposta da porcentagem de solubilização e recuperação de monossacarídeos possuem comportamentos distintos. A máxima recuperação de monossacarídeos pode ser obtida teoricamente utilizando-se 0,33 mol/l de ácido bórico com tendência crescente da resposta conforme se aumenta o pH do meio, enquanto a porcentagem de solubilização indica um crescimento contínuo conforme se aumentam concomitantemente a concentração de ácido bórico e pH. Na melhor condição testada foram obtidos rendimentos de monossacarídeos superiores em 181,2% (glicose) e 507,8% (xilose) com relação à biomassa não tratada. Numa segunda etapa estudou-se comparativamente o pré-tratamento em três valores de pH diferentes (9,27, 11,10 e 13,00) na presença (0,28 mol/l) e ausência de ácido bórico inicial, constatando-se que em todas as condições onde existiam espécies derivadas do ácido bórico (comparadas para um mesmo pH) foram obtidos maiores valores de recuperação de monossacarídeos. Resultados obtidos pelas técnicas de FTIR, TG/DTG, MEV e DRX comprovaram a maior deslignificação em condições onde se tinha ácido bórico inicial presente. Pode-se concluir que a presença de espécies químicas derivadas do ácido bórico (pKa aproximadamente 9,27) em meio alcalino promovem uma maior deslignificação do material lignocelulósico, e que tal comportamento se deve provavelmente à complexação de íons borato (principal íon presente em soluções alcalinas) aos grupos fenólicos da lignina, promovendo desta forma uma maior solubilização e/ou impedindo que fragmentos obtidos da degradação desta se repolimerizem e se depositem novamente sobre a biomassa. / Among the second-generation ethanol production stages, one of the crucial points is the biomass pretreatment since its efficiency is directly linked to the higher production of fermentable monosaccharides after hydrolysis and consequently higher ethanol productivity. In this context, the effect of the presence of boric acid-based chemical species during alkaline pretreatment of soybean straw (a raw material abundant in Brazil and still unexplored) was studied, aiming at a more selective solubilization of lignin in soft conditions, where cellulose and hemicellulose recoveries may be higher. In a first step, the effects of the initial concentration of boric acid (0,06 to 0,49 mol / l), pH (9,27 to 13,00) and pretreatment time (80 min to 280 min) were studied through response surface methodology (central composite design) considering as responses the percentage of biomass solubilization and recovery of monosaccharides (glucose and xylose) after enzymatic hydrolysis - pretreatment experiments were conducted at reflux temperature. The results showed that the time has no significant effect within the range studied, and that the response surfaces of the solubilization and recovery percentage of monosaccharides have different behaviors. The maximum recovery of monosaccharides can be theoretically obtained using 0.33 mol/l of boric acid with increasing tendency as the pH of the medium is increased, while the percentage of solubilization indicates a continuous growth as the boric acid concentration and pH concomitantly increases. In the best tested condition, yields of monosaccharides with 181.2% (glucose) and 507.8% (xylose) were obtained in relation to the crude biomass. In a second step, the pretreatment was studied in three different pH values (9,27, 11,10 and 13,00) in the presence (0,28 mol / l) and absence of boric acid, being verified that in all conditions where boric acid had been added (compared to the same pH) there was a greater recovery of monosaccharides. Results obtained by FTIR, TG / DTG, SEM and XRD showed higher delignification under conditions where boric acid was present. It can be concluded that the presence of boric acid-derived chemical species (pKa approximately 9,27) in alkaline media promotes a greater delignification of the lignocellulosic material, and that this behavior is probably due to the complexation of borate ions (main ion present in alkaline solutions) to the phenolic groups of the lignin, promoting in this way a greater solubilization and / or preventing fragments of this one from being repolymerized and deposited again on the biomass.

O presente trabalho teve como objetivo avaliar como algumas condições de pré-tratamento de bagaço de cana-de-açúcar com H2SO4 diluído influenciam a distribuição granulométrica do bagaço de cana, a composição química dos sólidos pré-tratados e hidrolisados hemicelulósicos, além da digestibilidade enzimática dos sólidos pré-tratados. Para isso, previamente, uma amostra de bagaço de cana-de-açúcar in natura foi caracterizada quanto suas composições percentuais; a distribuição granulométrica de suas fibras também foi avaliada antes e após o pré-tratamento. O pré-tratamento do bagaço com H2SO4 diluído foi realizado em reator piloto, aquecido por vapor direto, com capacidade de 100 L, onde o teor inicial de sólidos foi fixado em 15% (p/p). A temperatura (131,91-168,09 °C), tempo de residência (11,90-48,09 min) e concentração ácida (0,19 - 3,81 p/p) variaram de acordo com um planejamento fatorial 23. Após o pré-tratamento, os bagaços pré-tratados e hidrolisados hemicelulósicos foram caracterizados quanto suas composições químicas. A composição química dos bagaços in natura e pré-tratados, assim como a composição química dos hidrolisados, foi determinada por gravimetria, espectrofotometria e cromatografia líquida de alta eficiência. De acordo com a condição de pré-tratamento, os teores de celulose, hemicelulose e lignina nos bagaços pré-tratados diferiram substancialmente sendo que a maior variação foi observada para hemicelulose (0,14-17,62 %). Os três fatores avaliados no pré-tratamento influenciaram a composição química do bagaço pré-tratado, sendo que a variável com maior poder de influência no teor de celulose, hemicelulose e lignina dos sólidos foi a concentração ácida, seguida da temperatura e tempo de reação. Xilose foi o açúcar predominante nos hidrolisados hemicelulósicos variando de 1,43 a 21,05 g/L, de acordo com o planejamento. A concentração de furfural variou entre 0,08 e 4,68 g/L. Condições severas de pré-tratamento acarretaram na maior remoção de hemicelulose dos bagaços pré-tratados, porém nestas mesmas condições foram encontradas baixas concentrações de xilose e altas concentrações de furfural nos hidrolisados. A concentração de xilose no hidrolisado se mostrou dependente da temperatura e da concentração ácida. A variável com maior influência na formação de furfural foi a temperatura, seguida pela concentração ácida e tempo. A digestibilidade enzimática dos bagaços obtidos de acordo com planejamento experimental em 24 h variou de 25,35 a 63,76%, conforme a composição química dos sólidos. A temperatura de pré-tratamento foi o fator que exerceu maior influência na conversão da celulose dos sólidos. Com o intuito de avaliar o efeito da lavagem dos sólidos na digestibilidade enzimática da celulose, bagaços pré-tratados obtidos nas condições mais branda e severa de pré-tratamento, lavados e não-lavados, foram submetidos à sacarificação enzimática. A sacarificação de bagaços não-lavados foi prejudicada pela presença de inibidores nos hidrolisados hemicelulósicos, variando entre 0- 23,9%, em 72h. As condições de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar que maximizam a concentração de xilose no hidrolisado hemicelulósico e a sacarificação enzimática do bagaço pré-tratado são diferentes. O pré-tratamento com H2SO4 diluído acarretou na diminuição do tamanho das partículas do bagaço de cana. / This study aimed to evaluate how certain pretreatment conditions of sugarcane bagasse with dilute H2SO4 influence the size distribution of sugarcane bagasse, the chemical composition of solids pretreated and hemicellulosic hydrolysate, as well the enzymatic digestibility of pretreated solids. For that, previously, a sample of in natura sugarcane bagasse was characterized in terms of chemical composition; the size distribution of fibers was also evaluated before and after the pretreatment. The experiments of pretreatment of bagasse with dilute H2SO4 were conducted in a pilot reactor, heated by direct steam, with a capacity of 100 L, where the initial solids content was fixed at 15% (w / w). The temperature (131.91 to 168.09 ° C), residence time (11.90 to 48.09 min) and acid concentration (0.19 to 3.81 w / w) varied according to a factorial design 2³ . After pretreatment, the pretreated bagasse and hemicellulosic hydrolysates were characterized in terms of their chemical compositions. The chemical composition of in natura and pretreated bagasse , as well the chemical composition of the hydrolysates, was determined by gravimetry, spectrophotometry and high-efficiency liquid chromatography. According to the condition of pretreatment, cellulose, hemicellulose and lignin content in pretreated bagasse differed substantially, and the major variation was observed for hemicellulose content (0.14 to 17.62%).The three factors evaluated in the pretreatment influenced the chemical composition of pretreated bagasse, and the variable with greatest influence on the content of cellulose, hemicellulose and lignin concentration of solids was acid concentration, followed by temperature and reaction time.. Xylose was the predominant sugar in hemicellulose hydrolysates ranging from 1.43 to 21.05 g / L, according to the experimental design. Furfural concentration varied between 0.08 and 4.68 g / L. Severe conditions of pretreatment resulted in greater removal of hemicellulose from pretreated bagasse, but under these conditions were found low concentrations of xylose and high concentrations of furfural in the hydrolysates. The concentration of xylose in the hemicellulosic hydrolyzate were dependet of temperature and acid concentration. The variable with greatest influence on the formation of furfural was temperature, followed by acid concentration and time. The enzymatic digestibility of the pretreated solids, obtained according to experimental design, in 24 h, ranged from 25.35 to 63.76% depending on the chemical composition of solids. The temperature of the pretreatment was the factor that showed greater influence on the conversion of cellulose solids. In order to evaluate the effect of washing the solids in the enzymatic digestibility of cellulose, pretreated bagasses obtained in milder and severe conditions of pretreatment, non-washed and washed solids, were submitted to enzymatic saccharification. Saccharification of non-washed solids was impaired by the presence of inhibitors in hemicellulosic hydrolysates, ranging from 0 to 23.9% in 72h. The pretreatment conditions of sugarcane bagasse that maximize the concentration of xylose in the hemicellulosic hydrolyzate and enzymatic saccharification of pretreated bagasse are different. Pretreatment with dilute H2SO4 resulted in the decrease of particle size of bagasse.

A reação de hidrólise alcalina em fase aquosa de ions N-alquil-4-cianopiridíneos (RCP) foi caracterizada com relação a efeitos de pH, força iônica (&#181;) e constante dielétrica do meio (D) A hidrólise alcalina dos RCP resulta na formação de dois produtos, i.é., a N-alquil-4-carboxiamidopiridíneo (A) e a N-alquil-4-piridona (P) correspondentes. A relação P/A é função crescente de pH e atinge um valor limite de 1,75 para todos os RCP empregados. No entanto, em misturas água/dioxana a formação de P é preferencial. A constante de velocidade observada (k&#968;) de pseudo primeira ordem de hidrólise dos RCP é função de pH. Em solução aquosa (&#181;=0,02) esta dependência pode ser expressa por : log k&#968; = 1,0702 pH - 14,3 Os efeitos devidos a variações em &#181; e D sobre k&#968;, foram analisados segundo os modelos de Debye-Hückel (Robinson, R.A. e Stokes, R.H. em \"Electrolyte Solutions\", 1955) e Brönsted - Christiansen - Scatchard (Amis, E.S. em \"Solven t Effects on Reaction Rates and Mechanisms\", 1966). Os estudos dos efeitos de pH , &#181; e D sobre k&#968; serviram como modelos de referência para racionalizar efeitos de detergentes de vários tipos estruturais tanto na velocidade, como na razão de produtos resultantes da hidrólise alcalina dos RCP. Em soluções tamponadas de micelas de hexadeciltrimetilamônio (CTAB), a k&#968; de hidrólise do íon N-metil-4-cianopiridíneo (MCP) é independente da concentração de detergente. Por outro lado, k&#968; aumenta com CTAB, acima da concentração crítica de micelização (CMC) para íons N-butil (BCP), N-octil (OCP) e N-dodecil-4-cianopiridíneo (DCP) . No caso do DCP o valor máximo de k&#968; na presença de CTAB (k&#968;máx ) é cerca de 200 vêzes maior que k&#968; na ausência de CTAB (k&#968;o). Os dados referentes ao efeito de CTAB para a hidrólise de DCP , foram analisados quantitativamente utilizando o modelo teórico de Troca-Iônica em micelas (Quina, F.H. e Chaimovich, H. J.Phys.Chem. 83,1844 (1979)). Os resultados desta análise indicam que a constante de velocidade de segunda ordem na fase micelar (km2) é uma ordem de magnitude superior àquela na água (ko2). Esta diferença pode ser reproduzida supondo a reação num ambiente com D= 32 e &#181;=3. A adição de dodecilsulfato de sódio (SDS) acima da CMC, inibe a reação. Contudo, não é observada inibição total, mesmo no caso do DCP o qual é completamente incorporado à fase micelar. Empregando a teoria de Troca-Iônica em soluções micelares, explicitas considerações do produto iônico da água na fase micelar (Kw), conduzem a expressões da dependência de concentração de Na+ aquoso (livre) do pH local na superfície do SDS. Análise quantitativa dos resultados de velocidade de hidrólise dos RCP , fornecem o resultado que Kw = 0,025 Kw (kw é o produto iônico da água na fase aquosa), uma vez suposto km2= 10 ko2. Em soluções micelares de 3-(N,N-dimetil-N-dodecilamônio)- propano-l-sulfonato (SDP), k&#968; de hidrólise do DCP aumenta, a razão k máx/ko&#968;; chega a cerca de 15. Esta aceleração pode ser devida a existência de um campo potencial diplar na superfície da micela de SDP. Como no caso de misturas dioxano-água, a razão de produtos P/A em presença de micelas (CTAB, SDS e SDP) refletem a formação preferencial de P. Esta preferência foi analisada considerando os possíveis estados de transição envolvidos. Finalmente descreve-se uma metodologia simples para determinação rápida da homogeneidade dos detergentes derivados de sais de amônio (distribuição do comprimento de cadeias alquila). Esta técnica é em essência uma eliminação micro-Hoffman, devido a direta injeção do detergente na forma de hidróxido e posterior pirólise no cromatógrafo a gás. Como tal, quantidades negligíveis de detergente são requeridas, como também os passos de isolamento e manipulação (e eventuais erros sistemáticos) associados com a eliminação de Hoffman convencional, seguidos por análise no cromatógrafo a gás, são evitados. / The alkaline hydrolysis of N-alkyl-4-cyano pyridinium ions (RCP) in aqueous solution was characterized with respect to the eftects on pH, ionic strength (&#181;) and medium dieletric constant (D) on the reaction. Alkaline hydrolysis of RCP results in the formation of two products, i.e., the corresponding N-alkyl-4-carboxamidopyridinium ion (A) and N-alKyl-4-pyridone (P). In aqueous solution the P/A product ratio increases with pH, attaining a limiting value of 1,75 at high pH for all the RCP. In water-dioxane mixture, however, there is preferential formation of P. The observed pseudo-first-order rate constant (k&#968; ) for hydrolysis of the RCP in aqueous solution (&#181; =0,02) varies with pH according to: LOG k&#968; = 1,0702 pH - 14,3.The effect of changes in &#181; or D on k&#968; were analysed within the framework of the models of Debye-Huckel (Robinson, R.A. and Stockes, R.H. in \"Electrolyte Solutions\", 1955 ) and Brönsted- Christiansen - Scatchard (Amis, E.S. in \"Solvent Effects on Reaction Rates and Mechanisms\", 1966) . These dependences of k&#968; and of the P/A product ratio on pH, &#181; and D served as a basis for rationalization of the effects of detergents of various structural types on both the rate of alkaline hydrolysis of the RCPand the resultant produc ratio. In Buffered micellar solutions o hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), k&#968; for alkaline hydrolysis of the N-methyl-4-cyanopyridinium ion (MCP) is independent of detergent concentration. In contrast, k&#968; increases with (CTAB) above the critical micelle concentration (CMC) for the N-Butil (BCP), N-octyl (OCP) and N-dodecyl-4 cyanopyrydinium (DCP) ions. In the case of DCP, the maximum value of k&#968; in the presence of CTAB (k&#968; max) is 200 times greater than k&#968; in the absence of CTAB (ko&#968; ). The effect of CTAB on k&#968; for alkaline hydrolysis of DCP was analyzed quantitatively using the conceptual model for ion exchange (Quina, F.H. and Chaimovich, H. J.Phys.Chem. 83, 1844 (1979)). The results of this analysis indicate that the second order rate constant for hydrolysis in the micellar phase (km2) is an order of magnitude greater than that in the aqueous phase (ko<sub2). This difference betwen km2 and ko2 can be reproduced by assuming a reaction environment with D=32 and &#181; = 3. Micellar sodium dodecyl sulfate (SDS) inhibit the rate of alkaline hydrolysis of all the RCP. Nonetheless, total inhibition is not observed, even in the case of DCP, which is completely incorporated into the micellar phase. Using the theory of ion exchange in micellar solutions, explicitly consideration of the ionic product of water in the micellar phase (Kw) leads to expression for the external (free) N+a dependence of the local pH at the SDS micellar surface. Quantitative analysis of the rate data for the alkaline hydrolysis of the RCP, assuming km2= 10 ko2, furnishes the result that Kw= 0,025 Kw, where Kw is the product of water in the aqueous phase.In micellar solutians of 3-(N,N-dimethyl-N-dodecylammonium) propane-l-sulfanate (SDP), k&#968; for alkalyne Hydrolysisof DCP increases, the ratia k&#968;max/ko&#968; attaining a value of ca. 15. The observed rate acceleration is suggested to be due to the existence of a dipolar potencial field at the SDP micellar surface. As in the case of water-dioxane mixtures, the P/A product ratio in the presence of detergent micelles (CTAB, SDS and SDP) reflects preferential formation of P. This preference was analyzed on the basis of considerations of possible transition states involved. Finally, a simple methodology for rapid determination of the homogeneity (distribution of alkyl chain lengths) of ammonium-derived detergents is described. This technique is in essence a micro Hoffmannelimination effected by direct injection pyrolysis glpc of the detergent in the hydroxide form. As small negligible quantities of detergent are required and the product isolation and manipulation steps and attendant systematic errors) associated with a conventional Hoffmannelimination, followed by glpc analysis of the products are circunve ted.

No presente estudo, fungos ligninolíticos isolados de ecossistemas brasileiros foram avaliados quanto a capacidade de descolorir corantes reativos e, a linhagem Peniophora cinerea, selecionada, teve seu sistema ligninolítico caracterizado. As lacases deste fungo foram avaliadas para duas aplicações: descoloração de efluentes têxteis e auxílio na hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar. Lacase foi a única enzima ligninolítica extracelular detectada nos culivos de P. cinerea. A produção de lacase por P. cinerea foi avaliada em meios sintético e complexo, de forma a obter melhores níveis de produção da enzima. Em meio complexo (milhocina 0,5%, sacarose 0,5% e cobre como indutor de lacase) P. cinerea produziu cerca de aproximadamente 1000 U/l de lacase. Em meio sintético, contendo xilidina e tween 80, P. cinerea imobilizado (em esponja de poliuretano) produziu 3505 U/l de lacase em cultivo em Erlenmeyer e somente 150 U/l em reator de tanque com agitação por pás. Lacases produzidas por P. cinerea foram purificadas e caracterizadas. O sobrenadante do meio de cultivo foi aplicado em coluna de troca aniônica, DEAE-Sepharose CL-6B, e três picos com atividade de lacase foram observados e aplicados separadamente em Mono Q (coluna de troca aniônica). Oito isoenzimas de lacase, com massas entre 30 e 70 kDa e ponto isoelétrico (pI) entre 3 e 6 foram reveladas em géis de eletroforese em condições desnaturantes e não desnaturantes e por focalização isoelétrica (IEF). Algumas isoenzimas apresentaram alta termoestabilidade a 50ºC, pH ótimo entre 2,6 e 4,0 e Km para o ABTS entre 12,7 e 20 ?M, dependendo do tipo de lacase. Diferentes mediadores de lacases de P. cinerea foram avaliados (HBT, HBA, 2,3 DHBA, DOPAC, ABTS, siringaldeido, oxalato de sódio e Mn2+). O sistema composto por lacase, siringaldeído, oxalato de sódio e Mn2+ produziu a maior descoloração do Reactive Blue 19. As lacases foram utilizadas para descoloração de um efluente simulado, preparado com 100 mg/l de Reactive Red 271, hidrolisado em NaOH 2 M, e um efluente real, fornecido por uma indústria têxtil. O efluente simulado foi totalmente descolorido, em 24h, pelo extrato enzimático. A partir desta constatação, o efluente real foi tratado com os extratos de P. cinerea e mais de 60% de descoloração foi obtida com o uso de lacase e mediadores. Lacases produzidas por P. cinerea foram também utilizadas para hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar. As amostras de bagaços foram obtidas de tratamentos com sulfito ácido, sulfito alcalino, ácido sulfúrico, clorito de sódio ou sem tratamento (in natura). Duas formas de tratamento foram avaliadas: tratamento simultâneo, ou seja, lacases foram adicionadas juntamente com um preparado comercial de celulases; ou num tratamento sequencial, em que a polpa do bagaço foi previamente tratada com lacase para depois ser hidrolisada com celulases. O tratamento simultâneo com lacase e celulase resultou em menor conversão de celulose, devido a possível inativação das celulases pela ação oxidativa de lacase. A aplicação sequencial das enzimas nos bagaços pré-tratados por sulfito ácido ou por sulfito alcalino favoreceu à hidrólise da celulose. Estudos futuros para tratamento sequencial de lacase à hidrólise de bagaço de cana devem considerar aspectos reacionais básicos: maior carga enzimática, temperatura, tempo de reação e mediadores. Lacases são excepcionalmente versáteis para aplicações biotecnológicas e a produção em larga escala integrará o uso da enzima em diferentes processos industriais. / In the present estudy, ligninolytic fungi isolated from Brazilian ecosystems were evaluated for the ability to decolorize reactive dyes and a selected strain of Peniophora cinerea had its ligninolytic system characterized. Laccases from this fungi were evaluated for two biotechnology applications: decolorization of textile effluents and enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse. P. cinerea produced an halotolerant laccase activity, unique feature with the data available in the literature and with potential for biotechnological applications, making it the object of our studies. Laccase was the only ligninolytic enzyme detected in the extracellular extract from P. cinerea. The production of laccase by P. cinerea was evaluated in synthetic and complex media, in order to obtain higher levels of enzyme production. In complex medium (corn steep liquor 0.5%, sucrose 0.5% and copper, as inducer of laccase) P. cinerea produced about 1000 U/l of laccase. In synthetic medium containing tween 80 and xylidine, P. cinerea immobilized in polyurethane foam produced 3505 U/l of laccase in culture in flasks; in STR reactor P. cinerea produced only 150 U/l. Laccases produced by P. cinerea were purified and characterized. The supernatant of the culture medium was loaded on an anion exchange column, DEAE-Sepharose CL-6B, and three peaks with laccase activity were detected and applied separately on a Mono Q column. Eight isoenzymes of laccases with molecular weigh between 30 and 70 kDa and isoelectric point (pI) between 3 and 6 were revealed on electrophoresis gels at denaturing, native conditions and isoelectric foccusing (IEF). Some isoenzymes showed high thermostability at 50°C, optimal pH between 2.6 and 4.0, and Km for the ABTS between 12.7 and 20 ?M., depending on the type of laccase. Different mediators for laccases of P. cinerea were evaluated (HBT, HBA, 2,3 DHBA, DOPAC, ABTS, syringaldehyde, sodium oxalate and Mn2+). The system laccase, syringaldehyde, sodium oxalate and Mn2+ produced the highest decolorization of Reactive Blue 19. Laccases produced by P. cinerea were used for decolorization of a simulated efluent prepared with 100 mg/l of Reactive Red 271 hydrolyzed with NaOH 2 M and a real effluent, provided by a textile industry. The simulated efluent was completely decolorized within 24 hours by the enzymatic extract. In face of that, the real effluent was evaluated for decolorization by the extracts of P. cinerea and more than 60% of decolorization was obtained by laccase-mediator system. Laccases produced by P. cinerea were also used to hydrolize the sugar cane bagasse. Sugarcane bagasse samples were obtained by acid sulfite, alkaline sulfite, sulfuric acid, sodium chlorite or untreated (in natura). Two forms of treatment were evaluated: simultaneous treatment, ie, laccases have been added along with a commercial cellulase complex for hydrolysis of sugarcane bagasse, or a sequential treatment, in witch bagasse was pre-treated with laccase followed by cellulases. Simultaneous treatment with both enzymes resulted in lower conversion of cellulose than sequential treatment due to possible inactivation of cellulases by the oxidative action of laccase. Future studies of sequential treatment with laccase and hydrolysis of sugarcane bagasse should consider additional basic concepts of reactions such as: increase of enzyme load, temperature, reaction time and mediators. Laccases are exceptionally versatile for biotechnological applications and the production in large scale integrate the use of the enzyme in different industrial processes.

Após as crises de petróleo ocorridas no século passado, vários países buscaram o desenvolvimento de novos combustíveis a fim de reduzir a dependência deste recurso natural. O Brasil foi um deles e criou o Programa Nacional do Álcool (Pró-Álcool) para incentivar a produção de etanol. Hoje, mais de 80% da frota nacional de veículos rodam ou somente com etanol ou com a mistura de gasolina e etanol. Para atender a crescente demanda de etanol, sem competir com áreas cultiváveis voltadas para produção de alimentos, fontes de materiais lignocelulósicos podem ser utilizadas com o intuito de se aproveitar a fração celulósica para obtenção de açúcar fermentável. Neste trabalho propôs-se avaliar o efeito de tecnologias de pré-tratamento dos subprodutos sucroalcooleiros (bagaço e palha de cana), seguida ou não de uma etapa de deslignificação, sobre a conversão enzimática da celulose de cada biomassa vegetal. Os materiais lignocelulósicos foram pré-tratados por explosão a vapor (bagaço), impregnação a vapor (palha) e por ultrassom (bagaço e palha). A etapa de pré-tratamento por explosão a vapor foi realizada no reator industrial de 5 m3 sob a condição de 200°C por 7min, das Usinas de Açúcar, Álcool e Biodiesel Vale do Rosário. A etapa de pré-tratamento por impregnação de vapor foi realizada em reator de 20 L sob as condições de 180, 185, 190, 195 °C por 10 min e 190°C por 15 min. Já a etapa de pré-tratamento por ultrassom foi realizada em banho de ultrassom a 55°C por 40 min e radiação de 40 kHz/120W. Os materiais pré-tratados foram deslignificados sob a condição de NaOH 1% (m/v), 100°C por 1h, variando somente o tamanho reator em função da quantidade de biomassa disponível. Para o bagaço explodido a vapor, a deslignificação organosolv também foi testada, variando as condições numa matriz de planejamento L18 de Taguchi. Os ensaios de hidrólise enzimática foram realizados empregando Celluclast 1.5L (15 FPU/g de amostra) e ?-Glucosidase (10 UI/g de amostra). Das três técnicas de pré-tratamento avaliadas (explosão a vapor, impregnação a vapor e ultrassom), somente os métodos baseados em vapor foram eficientes na desagregação dos constituintes dos subprodutos sucroalcooleiros. Esses métodos foram capazes de remover grande parte da hemicelulose (acima de 70%) e uma parte da lignina (<40%), elevando a digestibilidade da celulose pelas enzimas celulolíticas (conversão de 66 a 68%). O método de pré-tratamento com ultrassom provocou o aumento da recalcitrância dos materiais lignocelulósicos tanto para o agente deslignificante (soda cáustica) como para as celulases, sendo, portanto, um método não indicado, dentro da faixa das condições avaliadas, para um processo de conversão dos subprodutos sucroalcooleiros em açúcares fermentáveis. A etapa de deslignificação com soda cáustica foi essencial para elevar a digestibilidade dos materiais lignocelulósicos pré-tratados por explosão a vapor ou com ultrassom. Entretanto, para a palha pré-tratada hidrotermicamente, a etapa de extração alcalina não promoveu um efeito positivo sobre a conversão enzimática de celulose. De forma geral, observou-se que o bagaço de cana apresenta um potencial ligeiramente maior para conversão em açúcares fermentáveis em comparação com a palha de cana. / After the oil crises occurred in the last century, many countries have been to develop new fuels to reduce dependence on this natural resource. Brazil was one of them and created the National Alcohol Program (Pro-álcool) to promote the production of ethanol. Today, more than 80% of the national vehicles run on ethanol or with a mixture of gasoline and ethanol. To supply the growing demand for ethanol, without it to affect the food production farmland, sources of lignocellulosic materials can be used in order to take advantage of the cellulosic fraction for production of fermentable sugar. This work had objective to evaluate the effect of pretreatment technologies of sugarcane byproducts (bagasse and straw), followed or not by a stage of delignification, on the cellulose enzymatic conversion of each biomass. The lignocellulosic materials were pretreated by steam explosion (bagasse), vapor impregnation (straw) and ultrasound (bagasse and straw). The steam explosion pretreatment was carried out in 5 m3 industrial reactor under the condition of 200 °C for 7 min, from Usinas de Açúcar, Álcool e Biodiesel Vale do Rosário. The steam impregnation pretreatment was carried out in 20 L reactor under conditions of 180, 185, 190, 195 °C for 10 min and 190 °C for 15 min. The ultrasound pretreatment was performed in the ultrasonic bath at 55 °C for 40 min and 40 kHz/120W radiation. The pretreated materials were deslignified on condition of 1% (w/v) NaOH, 100 °C for 1 h, using different sizes of reactors due to amount of biomass available. For the steam exploded bagasse, one stage of organosolv delignification was also tested varying the conditions in a L18 Taguchi matrix. The enzymatic hydrolysis tests were performed using Celluclast 1.5L (15 FPU/g of material) and ?-Glucosidase (10 IU/g of material). From three pretreatment techniques evaluated (steam explosion, steam impregnation and ultrasonic), only the vapor-based methods were efficient in the breakdown of the constituents of sugarcane byproducts. These methods were able to remove most of the hemicellulose (above 70%) and a part of the lignin (<40%), increasing the cellulose digestibility by cellulolytic enzymes (conversion 66-68%). The ultrasound pretreatment increases the recalcitrance of lignocellulosic materials both for the caustic soda and for cellulases. Therefore, this pretreatment method is not indicated, within the conditions range assessed, for a conversion process of sugarcane byproducts to fermentable sugars. The delignification stage with caustic soda was essential to increase the digestibility of lignocellulosic materials pretreated by steam explosion or ultrasound. However, for the straw pretreated hydrothermically, the alkaline extraction did not cause a positive effect on the enzymatic conversion of cellulose. Overall, it was observed that sugarcane bagasse has a slightly higher potential for conversion to fermentable sugars in relation to sugarcane straw.

Métodos que convertem o bagaço de cana-de-açúcar em açúcares fermentescíveis são geralmente compostos por duas etapas principais: pré-tratamento para degradar a estrutura da planta e uma etapa de hidrólise enzimática ou química para converter as cadeias poliméricas em açúcares. Cada tecnologia de pré-tratamento tem um mecanismo diferente de ação sobre a estrutura do bagaço induzindo modificações físicas e/ou químicas, que são necessárias devido a presença de hemicelulose e lignina na parede celular da planta, o que impede o acesso das celulases nas partes internas do substrato. No presente trabalho, o processo quimio-mecânico foi utilizado para pré-tratar o bagaço de cana com o objetivo de aumentar a acessibilidade na parede celular pelas enzimas hidrolíticas. O processo associa a vantagem da remoção de um ou mais componentes do bagaço e o aumento da área superficial por trituração. Após o tratamento quimio-mecânico, rendimento do processo com adição de álcali foi de 91% e com sulfito alcalino de 75%, que corresponde à remoção de 33% e 53% de lignina e 13% e 29% da hemicelulose, respectivamente.A conversão de celulose de amostras pré-tratadas com álcali e sulfito-alcalino atingiu 50% e 85%, respectivamente, após 96 h de hidrólise enzimática. Duas amostras de bagaço com menor teor de lignina que a amostra proveniente da usina foram pré-tratadas com NaOH e refinadas. Uma das amostras com 14,2% de lignina foi obtida pela deslignificação seletiva com clorito de sódio e a outra com 19,2% de lignina foi selecionada em um programa de melhoramento genético da cana-de-açúcar e neste trabalho foi denominado de híbrido. As amostras com menor teor inicial de lignina foram hidrolisadas mais rapidamente nas primeiras 24 h de digestão enzimática. Por exemplo, a hidrólise enzimática da amostra com o menor teor de lignina inicial (14,2%) alcançou a conversão de celulose 64%, após apenas 24 h de hidrólise em comparação aos 30% observado para o bagaço de usina que continha um teor inicial de lignina de 24,4% .Um estudo adicional foi feito, em que o bagaço da usina e os híbridos foram pré-tratados quimio-mecanicamente com diferentes concentrações de hidróxido de sódio e sulfito. Foram avaliadas três concentrações de NaOH (2,5%, 3,75% e 5%) em combinação com sulfito de sódio (5%, 7,5% e 10%), mantendo-se a proporção de 1:2 de reagentes, respectivamente. As polpas obtidas do bagaço híbrido foram hidrolisadas mais facilmente que as polpas obtidas do bagaço da usina pré-tratadas na mesma concentração de sulfito-NaOH. O tempo necessário para hidrolisar 70% da celulose do bagaço híbrido foi a metade daquele necessário para hidrolisar o bagaço de usina. O menor teor de lignina e a presença de grupos sulfônicos podem ser fatores relevantes na digestibilidade enzimática do bagaço, portanto, plantas com baixo teor de lignina podem ser pré-tratadas por processos alcalinos relativamente brandos produzindo substratos mais facilmente hidrolisáveis por celulases. / Methods that convert sugarcane bagasse into fermentable sugars are generally comprised of two main steps: a pretreatment to degrade the plant structure and an enzymatic or chemical hydrolysis step to convert the polymeric chains into monomeric sugars. Each pretreatment technology has a different mechanism of action on the bagasse structure inducing physical and/or chemical modifications, which are necessary because the presence of hemicellulose and lignin in the cell walls prevents cellulases from accessing inner parts of the substrate. In this present work, chemomechanical processing was used to pretreat sugarcane bagasse with the aim of increasing cell wall accessibility to hydrolytic enzymes. The process combines the advantage of removal one or more components of bagasse and the increase in surface area by refining. After chemomechanical treatment, the yield of the process with the addition of alkali was 91% and 75% with alkaline-sulfite,corresponding to the removal of 33% and 53% of lignin and 13% and 29% of hemicellulose, respectively. Cellulose conversion of the alkaline- and alkaline/sulfite-chemomechanical pretreated samples reached 50% and 85%, respectively, after 96 h of enzymatic hydrolysis. Two samples of pulp with lower lignin content than the sample from the mill were pretreated with NaOH and refined. One of the samples with 14.2% of lignin was obtained by selective delignification with sodium chlorite and the other with 19.2% of lignin was selected in a breeding program of cane sugar and at this work has been called hybrid. Samples with lower initial lignin content hydrolyzed faster in the first 24 h of enzymatic digestion. For example, enzymatic hydrolysis of the sample with the lower initial lignin content (14.2%) reached 64% cellulose conversion after only 24 h of hydrolysis as compared to the 30% observed for the mill-processed bagasse containing an initial lignin content of 24.4%. An additional study was done,in which the mill bagasse and the hybrid were chemomechanically treated with different concentrations of NaOH and sulfite. Three concentrations of NaOH were evaluated (2.5%, 3.75% and 5%) in combination with sodium sulfite (5%, 7.5% and 10%), keeping the 1:2 ratio of reagents, respectively. Pulps obtained from hybrid bagasse were hydrolyzed more easily than the pulp obtained from the mill-processed bagasse treated in the same concentration of sulfite-NaOH. The time required to hydrolyze 70% of hybrid bagasse was half that required to hydrolyze the mill-processed bagasse. The lower lignin content and the presence of sulfonic groups may be important factors in the enzymatic digestibility of bagasse, therefore, plants with low lignin content can be pre-treated by relatively mild alkali processes producing substrates more easily hydrolysable by cellulase.

O bagaço de cana-de-açúcar é um material rico em celulose, molécula que pode ser convertida enzimaticamente em glicose pela ação de celulases. No entanto, no bagaço, a celulose está associada à hemicelulose e à lignina, componentes que limitam a sua digestibilidade enzimática. A lignina é o principal limitante da hidrólise da celulose, reduzindo a acessibilidade das enzimas celulolíticas. A hemicelulose também limita a ação das celulases e a presença de ácidos hidroxicinâmicos, como ferúlico e cumárico contribuem para reduzir os níveis de hidrólise. Nesse trabalho, o bagaço de cana-de-açúcar foi tratado com clorito de sódio em meio ácido com o objetivo de remover seletivamente a lignina e produzir modelos com teores reduzidos desse componente. O bagaço de cana controle continha 22,8% de lignina e após a deslignificação por 4 horas, materiais com até 6,8% de lignina foram obtidos, mantendo quase inalteradas as frações celulósicas e hemicelulósicas. Os bagaços foram submetidos à hidrólise enzimática com celulases comerciais. Apenas 26% da celulose de bagaço controle foram convertidos em glicose e 11% da xilana foram convertidos em xilose, com 72 horas de hidrólise. Nos bagaços com menores teores de lignina, os valores de conversão de celulose e de xilana alcançaram 85% e 64% no mesmo tempo de hidrólise, respectivamente. Os resultados mostraram que existe uma correlação inversa entre o teor de lignina e a conversão de polissacarídeos e que a remoção de 60% da lignina confere níveis elevados de hidrólise. Para reduzir a inibição pelos produtos de hidrólise da celulose, foi adicionada &#946;-glicosidase ao meio reacional. Com a adição dessa enzima, os bagaços mais deslignificados alcançaram 100% de conversão de celulose e 82% de xilana, com 48 horas de hidrólise. No presente trabalho, o efeito da lignina não ligada aos polissacarídeos também foi avaliado. Para isso, lignina de bagaço de cana foi adicionada ao cartão de celulose, e este foi submetido à hidrólise enzimática. Não houve diferença entre os níveis de hidrólise na presença e ausência de lignina, indicando que a lignina limita a hidrólise dos polissacarídeos quando ligada a eles. Foi utilizada a técnica de microespectrofotometria ultravioleta para detectar a lignina e os ácidos hidroxicinâmicos em fibras, vasos e células de parênquima das regiões de córtex e de medula, deslignificados e controle. Os espectros UV dos três tipos celulares mostraram bandas em 278 nm, associada à lignina, e em 315 nm, associada aos ácidos hidroxicinâmicos. Os vasos foram os tipos celulares mais lignificados, seguidos pelas fibras e células parenquimatosas. O tratamento com clorito causou uma rápida remoção dos ácidos hidroxicinâmicos das células de parênquima, enquanto que as fibras foram deslignificadas apenas com 4 horas de tratamento. As amostras de córtex e de medula também foram submetidas à hidrólise com celulases. A região de medula não tratada foi prontamente hidrolizada, alcançando 63% de conversão de celulose com 72 horas, enquanto que o córtex não tratado atingiu apenas 20%. O tratamento com clorito de sódio não aumentou os níveis de hidrólise da medula. No entanto, a remoção de lignina do córtex aumentou consideravelmente a conversão. / The sugarcane bagasse is a material rich in cellulose, wich can be enzymatically converted into glucose by the action of cellulases. However, in the bagasse, it is associated to hemicellulose and lignin, components that limit its enzymatic digestibility. Lignin is the main limitant of the enzymatic hydrolysis of cellulose, reducing the accessibility of cellulases. Hemicellulose also limits the cellulase action and the presence of the hydroxycinnamic acids, as ferulic and coumaric, contribute to reduce the hydrolysis levels. In this work, the sugarcane bagasse was treated with acid sodium chlorite, aiming to selective remove the lignin and produce models with lower contents of this component. The control bagasse had 22.8% of lignin and after a 4-hour delignification, materials with up to 6.8% of lignin were obtained, retaining the cellulosic and hemicellulosic fractions almost unchanged. The bagasses were submitted to the enzymatic hydrolysis with comercial cellulases. Only 26% of the cellulose of the control bagasse were converted into glucose and 11% of the xylan were converted into xylose, with 72 hours of hydrolysis. In the bagasses with lower lignin content, the cellulose and xylan conversion values reached 85% and 64% in the same time of hysylysis, respectively. The results showed that there is an inverse correlation between the lignin content and the enzymatic conversion of polysaccharides and that the removal of 60% of the lignin results in high levels of hydrolysis. To reduce the inhibition by the products of the cellulose hydrolysis, &#946;- glucosidase was added to the reaction medium. With this enzyme, the most delignified bagasses reached 100% of cellulose and 82% of xylan convertion, with 48 hours of hydrolysis. In this work, the effect of non-linked lignin was also analysed. For this, sugarcane bagasse lignin was added to cellulose card, and it was submitted to the enzymatic hydrolysis. There were no differences between the hydrolysis levels in the presence or absence of lignin, suggesting that lignin only limits hydrolysis when linked to the polysaccharides. The ultraviolet microspectrophotometry technique was used to detect lignin and hydroxycinnamic acids in fiber, vessels and parenchyma cells in rind and pith regions, delignified and control. The UV spectra of the three cell types showed bands in 278 nm, related to lignin, and 315 nm, related to the hydroxycynamic acids. The vessels were the most lignified cell type, followed by fibers and parenchyma cells. The chlorite treatment caused a rapid removal of hydroxycynnamic acids from parenchyma cell walls, while fibers where delignified only with a 4-hour treatment. The rind and pith samples were also submitted to enzymatic hydrolysis. The untreated pith region was promptly hydrolysed, reaching 63% of cellulose convertion in 72 hours, while untreated rind reached only 20%. The sodium chlorite treatment did not enhance the pith hydrolysis levels. However, the lignin removal in rind samples substantially enhanced the conversion.

As enzimas constituem parte essencial à vida, sendo catalisadores capazes de aumentar em várias ordens de grandeza a velocidade da reação. As lipases, que catalisam a hidrólise de triacilglicerídeos, são enzimas versáteis e de fácil obtenção e por isso estão presentes em diversos setores da indústria e também constituem tema de estudo no meio acadêmico. Tem-se como os objetivos principais deste trabalho a elaboração de um método para se avaliar a cinética hidrólise de lipase suportada por intermédio de espectroscopia de fluorescência. O sistema utilizado foi o DAQ (diaceto-quinizarina) / quinizarina. Este sistema é propício, pois a DAQ, que não é fluorescente, quando hidrolisada resulta na quinizarina, altamente fluorescente. Para se tratar a cinética de hidrólise foi desenvolvido um modelo considerando-se duas etapas seqüenciais de hidrólise, uma vez que a enzima catalisa a quebra de apenas um grupo éster por ciclo catalítico. O modelo mostrou-se bastante fiel no ajuste dos dados experimentais obtidos, sendo possível obter a constante cinética envolvida no processo global de hidrólise, que constitui uma combinação linear das constantes cinéticas dos processos elementares. / Enzymes are essential to life and are capable to increase in many orders of magnitude the velocity of reaction. Lipases, that catalyses the hydrolysis of triacylglyceride, are versatile enzymes and easy to obtain and are present in many industry segments and also constitutes academic studies. The objective of this work is the elaboration of a method to evaluate the hydrolysis kinetic of immobilized lipase through fluorescence spectroscopy. The system used was DAQ (diacetate-quinizarin) / quinizarin. This system is auspicious because DAQ, not-fluorescent, when hydrolyzed results quinizarin, highly fluorescent. To treat the hydrolysis kinetic, a model that consider a twostep sequential reaction were developed, once the enzymes breaks only one ester in each catalytic cycle. The model agreed with the experimental data, and it was possible to obtain the global kinetic constant, that is a linear combination of the elementary constants