A degradação da interface adesiva em dentina pode acometer tanto a porção resinosa como a porção orgânica da camada híbrida. Evidências indicam que a degradação da porção orgânica pode ocorrer em parte devido a atividade enzimática de proteases da própria dentina. As metaloproteinases da matriz (MMPs) constituem a primeira classe de enzimas relacionada com a degradação da matriz orgânica. É possível que as MMPs, possam ser reativadas durante o procedimento adesivo em conseqüência da queda do pH do meio. Objetivo: Esta investigação teve como objetivos avaliar a influência de soluções desmineralizadoras com diferentes concentrações de ácido fosfórico (AF1%, AF10% e AF37%) na atividade proteolítica da dentina humana sadia, na degradação do colágeno exposto pela desmineralização, além de identificar imunologicamente as metaloproteinases. Material e Métodos: Vinte dentes molares permanentes foram triturados para obtenção de um pó de dentina. Alíquotas de 1g do pó foram acondicionadas em tubos plásticos para que a desmineralização do substrato pudesse ser realizada de acordo com as três diferentes concentrações de ácido fosfórico testadas. Após a neutralização do ácido com NaOH, as amostras foram centrifugadas. O sobrenadante foi utilizado para mensuração espectrofotométrica do conteúdo de Cálcio (Ca) liberado pela desmineralização. O precipitado obtido foi incubado com tampão de extração de proteínas por 24h a 4°C sob agitação. Nova centrifugação foi realizada e o sobrenadante utilizado para avaliação da atividade da MMP-2 e MMP-9 por zimografia e para a identificação imunológica das metaloproteinases por western blot. O precipitado obtido pela centrifugação foi liofilizado e separado em alíquotas de 40mg (n=10) de pó de dentina para cada condição experimental. As alíquotas foram incubadas em saliva artificial por 24h a 37°C sob agitação e hidrolisadas em autoclave. Após incubação a 65°C por 40 min, as amostras foram avaliadas por espectrofotometria para que a mensuração da concentração do aminoácido hidroxiprolina (HYP) liberado pela degradação do colágeno exposto pudesse ser obtida. Fatias de 0.3 mm da dentina coronária de outro dente foram obtidas e desmineralizadas, de acordo com as diferentes concentrações de ácido fosfórico para avaliação da atividade enzimática através do método da zimografia in situ. Os resultados foram submetidos à análise de variância de um fator sem vinculação ou teste de Kruskal-Wallis para identificação das diferenças existentes entre os grupos experimentais. Para contraste das médias foi realizado o teste de Student-Newman-Keuls com nível de significância de 5% (=0,05). Resultados: A atividade enzimática de MMP-2 foi estatisticamente maior quando a dentina foi desmineralizada com AF 1% ou 10%. O uso do ácido fosfórico 37% diminuiu consideravelmente a atividade desta enzima, em relação ao AF10% (<0,05). Em nenhuma das amostras desmineralizadas com AF foi detectada a atividade enzimática da MMP-9. A identidade da MMP-2 foi confirmada pelo immunoblotting da enzima com anticorpo específico. A MMP-9 não foi expressa nos extratos analisados. A expressão de MMP-2 foi maior quando utilizado AF 1% ou 10% e menor quando foi utilizado o AF 37%. A utilização do AF 37% liberou valores de Ca, em g/mL, estatisticamente superiores aos valores determinados para os demais grupos (<0,05). A maior concentração de HYP, em g/mL, foi encontrada nos extratos desmineralizados com AF 10%. Em seguida, aparecem os valores encontrados com o uso do AF1%. Os menores valores da concentração de HYP aparecem no grupo em que foi utilizado o AF 37% (<0,05). A concentração de HYP em função do peso de dentina utilizado (40mg) também foi calculada. A maior concentração de HYP por mg de dentina foi obtida com AF 10%, seguida pelos extratos desmineralizados com AF1%. Os menores valores foram detectados com AF 37% (<0,05). O uso do AF10% demonstrou ser responsável pela maior taxa de degradação de colágeno exposto (20,13%). Em seguida, aparecem valores intermediários (11,34%) obtidos com AF1%. Por último, surgem os menores valores (0,68%) com AF37%. A análise das imagens obtidas após a realização da zimografia in situ demonstrou maior atividade enzimática quando a dentina foi desmineralizada com AF10%. Conclusão: O uso do AF37% para o condicionamento da dentina durante a realização do procedimento adesivo pode minimizar os efeitos degradantes das proteases endógenas sobre o colágeno. Em contrapartida, estudos realizados com pó de dentina desmineralizado com AF1% ou 10% podem estar sobreestimando a atividade das MMPs, em relação à prática clínica. / The dentin adhesive interface degradation can occur in resin and in organic portion of the hybrid layer. Evidence indicates that the degradation of organic matrix may partially occur due to the enzymatic activity of proteases own dentin. The matrix metalloproteinases (MMPs) have been described as the first class of enzymes associated with degradation of the organic matrix. It is possible that MMPs may be reactivated during the adhesive procedure as a result of the fall of pH. Purpose: The objectives of the present investigation are to evaluate the influence of different demineralizing phosphoric acid solutions (PA1%, PA10% and PA37%) on the proteolytic activity of human sound dentin, on the collagen degradation that was exposed after demineralization, as well as to identify the metaloproteases immunologically. Material and Methods: Dentin powder was obtained from twenty human molars. One gram aliquots were placed in polyestyrene tubes and the dentin demineralization was performed using the three different phosphoric acid concentrations tested in this study. After neutralization with NaOH, the samples were centrifuged. The supernatant was used for the spectrophotometrically quantification of calcium (Ca) released by the demineralization while the precipitate was re-suspended and incubated with a protein extraction buffer for 24h at 4ºC under agitation. The sample was centrifuged and the supernatant was used for the identification of MMP-2 and MMP-9 by western blot and for the evaluation of gelatinolytic activity by zymography. The pellet was lyophilized and 40 mg aliquots of the dentin powder (n=10) were incubated in artificial saliva for 24h at 37°C under agitation and hydrolysed in autoclave after incubation at 65°C for 40 min. The samples were analyzed spectrophotometrically to measure the hydroxyproline (HYP) released after collagen degradation. Slices of 0.3 mm of the dentine crown of the another tooth were obtained and demineralized in accordance with the concentrations of phosphoric acid used in this study for evaluating the enzymatic activity by the method of in situ zymography.The data were analyzed by ANOVA one-way or Kruskal-Wallis test for the identification of differences between the experimental groups. The means were analyzed by Student-Newmans-Keulss test (=0,05). Results: The MMP-2 enzymatic activity was statistically higher when the dentin was demineralized with 1% or 10% PA. The 37% phosphoric acid decreased the activity of such enzyme relative to PA 10% (<0,05). MMP-9 activity was not detected in any demineralization condition (1%, 10% or 37% PA). MMP-2 identification was confirmed by immunoblotting while MMP-9 was not observed in any condition. MMP-2 identification was higher when 1% or 10% PA were used while 37% PA showed lower MMP-2 identification. The use of 37% PA resulted in higher release of Ca, which was significantly higher when compared to other PA concentrations (<0,05). The highest HYP concentration was observed when 10% PA was used, followed by 1% PA. The lowest values were observed for 37% PA (<0,05). The HYP concentration according to the dentin weight used (40 mg) was also calculated. Highest concentrations of HYP per mg of dentin were observed for 10% and 1% PA, while 37% PA resulted in the lowest HYP concentration (<0,05). The use of 10% PA showed to be responsible for the highest exposed collagen degradation after demineralization (20,13%) when compared to 1% PA (11,34%) and 37% PA (0,68%). The analysis of images obtained after the realization of in situ zymography showed greater enzyme activity when the dentin was demineralized in PA10%. Conclusion: The use of 37% PA for dentin etching during the restorative procedure might minimize collagen degradation by host-derived proteases. On the other hand, studies that have been using 1% or 10% PA might have overestimated MMPs activity when compared to the clinical situation.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-07-25T13:03:15Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_OtimizacaoCondicoesExtracao.pdf: 1722029 bytes, checksum: 59578a223bee14a2a557497aee9d7518 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-25T13:03:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_OtimizacaoCondicoesExtracao.pdf: 1722029 bytes, checksum: 59578a223bee14a2a557497aee9d7518 (MD5) Previous issue date: 2016-08-24 / Os resíduos das indústrias de pesca apresentam facilidade de serem transformados em diversos produtos e ainda por apresentarem nutrientes de elevado valor biológico, ricos em proteínas (colágeno) e ácidos graxos, diante disso o trabalho teve como objetivo estudar o aproveitamento da pele de peixes Amazônicas para extração de gelatina. Os processos de extração a partir de pele de filhote (Brachyplathystoma filamentosum) e dourada (Brachyplathystoma rousseauxii) utilizando solução de hidróxido de sódio (NaOH) e hidróxido de cálcio (Ca (OH)2) foi otimizado e o produto foi caracterizado através das análises de rendimento, força de gel, cor, viscosidade, perfil de aminoácidos, microscopia eletrônica de varredura, ponto de fusão, capacidade de formar espuma e capacidade emulsificante. As condições otimizadas para a gelatina da espécie filhote, extraída com solução de NaOH, foram de 6 horas de extração na temperatura de 58ºC e as condições máximas de desejabilidade foram de 0,998, obtendo valor de rendimento e força do gel de 19,7% e 244,3 g, respectivamente. No método de calagem Ca (OH)2 as condições otimizadas foram definidas em 10 dias de pré-tratamento e temperatura de 50ºC. Para esta condição foi observada uma desejabilidade de 0,965 e valores de rendimento e força do gel de 20,24% e 221 g, respectivamente, ambos considerados aceitáveis para alimentos. Na espécie filhote a glicina foi o aminoácido majoritário, tanto na pele do peixe (23,77%), quanto na gelatina obtida com NaOH (23,39%) e Ca(OH)2 (24,97%). Para obtenção da gelatina da espécie dourada foi utilizado pré-tratamento com NaOH na temperatura de extração de 64ºC e tempo de extração de 6 horas. O pré tratamento com Ca (OH)2 foi por 12 dias e temperatura de extração de 64ºC por 6 horas. Ao comparar as características das gelatinas da dourada, a obtida com NaOH apresentou diferença (p < 0,05) e maior potencial tecnológico devido maior rendimento, maior quantidade de iminoácidos e melhores propriedades (força do gel, viscosidade, ponto de fusão, poder emulsificante), no entanto, a gelatina extraída com Ca (OH)2 apresentou géis fracos e menor ponto de fusão caracteristicas adequadas para produtos refrigerados e que são necessárias baixas temperaturas de gelificação. Conclui-se que todas as gelatinas obtidas podem ser utilizadas em diversos produtos dependendo da característica que se deseja obter. / Fish industry residues are used due to their easy transformation into several products and because they have nutrients with high biological value, being rich in proteins and fatty acids, the work was to study the use of the skin of Amazonian fish for gelatin extraction. The gelatin extraction process from the skin of kumakuma (Brachyplatystoma filamentosum) and gilthead bream (Brachyplathystoma rousseauxii) with sodium hydroxide (NaOH) and calcium hydroxide (Ca(OH)2) was optimized and the product was characterized through analyses of yield, gel strength, color, viscosity, amino acid profile, scanning electron microscopy, melting point, foaming capacity, and emulsifying capacity. The optimized conditions established in the process from the skin of kumakuma (Brachyplatystoma filamentosum) with NaOH were 6 h extraction at 58 °C, with yield and gel strength at 19.7% and 244.3 g, respectively. The metod with (Ca(OH)2 the optimized conditions were defined over ten days of pre-treatment at 50 °C. This condition resulted in desirability of 0.965 and yield and gel strength values of 20.24% and 221 g, respectively. Glycine was the main amino acid both in the fish skin (23.77%) and in the gelatin obtained (NaOH - 23,39% e Ca(OH)2 - 24,97%). Pre-treatment with sodium hydroxide (NaOH) and calcium hydroxide (Ca(OH)2) was used and the gelatin the skin of gilthead bream (Brachyplathystoma rousseauxii) with 64 ° C and 6 h extraction. The pretreatment with Ca (OH)2 was for 12 days and 64 °C extraction for 6 hours. When the characteristics of the gelatins obtained were compared, the one that used NaOH had greater (p < 0.05) technological potential due to higher yield, greater amount of imino acids, and better properties (gel strength, viscosity, melting point, emulsifying power). However, the gelatin extracted with Ca(OH)2 had weak gels and lower melting point, which is appropriate for refrigerated products that require low gelling temperatures. It is concluded that the two gelatins obtained can be used in several applications in products according with the characteristic desired.