Orientadores: Carlos Francisco Sampaio Bonafé, Claudio Chrysostomo Werneck / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T01:47:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Norberto_DouglasRicardo_D.pdf: 1634322 bytes, checksum: 288f08df151602db46da98bf9d58476f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Ureia desnatura proteínas em diferentes concentrações, dependendo das condições experimentais e da proteína. A proteína monomérica soro albumina bovina (BSA) foi o principal modelo de investigação na presença de concentrações subdesnaturantes de ureia com base no modelo de equilíbrio de dois estados. A desnaturação induzida por alta pressão foi intensificada em concentrações de ureia ( [U] ) entre 3,5 M e 8,0 M, com variação de energia livre à pressão atmosférica (?Gº[U]) de +5,0 a -2,5 kJ/mol de BSA, e variação do volume de desnaturação (?V) de -30 a -36 mL/mol de BSA. Os parâmetros m apresentaram caráter bifásico, com valores de m1 e m2 de 0,92 e 2,35 kJ.mol-1.M-1, respectivamente. A partir de gráficos da variação de com relação à foram obtidos valores de , o coeficiente estequiométrico aparente do agente desnaturante, de 1,68 e 6,67 mol de ureia/mol de BSA, respectivamente v1 e v2, correspondentes à m1 e m2. Estes resultados foram comparados com os de outras proteínas monoméricas da literatura e com um conjunto de dados da SNase ?+PHS I92A e estequiometrias sistematicamente baixas foram observadas. No entanto, um valor de 140 mols de ureia/mol de BSA pode ser alcançado a partir de abordagem que considera a existência de uma população heterogênea com respeito a energia livre de desnaturação e aspectos moleculares da interação proteína-solvente puderam ser melhor interpretados / Abstract: Urea denatures proteins at different concentrations, depending on the experimental conditions and the protein. We investigated the pressure-induced denaturation of bovine serum albumin (BSA) as a model in the presence of subdenaturing concentrations of urea based on a two-state equilibrium model. Pressure-induced denaturation was enhanced at urea concentrations ([U]) of 3.5 M to 8.0 M, with the free energy of denaturation at atmospheric pressure (?Gº[U]) ranging from +5.0 to -2.5 kJ/mol of BSA while the volume change ranged from -30 to -36 mL/mol of BSA. The m values appeared to be biphasic, with m1 and m2 of 0.92 and 2.35 kJ.mol-1.M-1, respectively. Plots of ?Gº[U] versu ln[U] yielded values of v , the apparent stoichiometric coefficient, of 1.68 and 6.67 mol of urea/mol of BSA respectively for m1 and m2. These results were compared with the m and values of other monomeric proteins reported from the literature and of SNase ?+PHS I92A and the very low values of were systematically observed. However, a value of 140 moles of urea/mole of BSA could be reached by considering the existence of a heterogeneous molecular population with respect to the free energy of denaturation and the molecular binding aspects could be better interpreted / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Immunogenic cell death (ICD) is characterized by presence of specific molecules including surface exposed calreticulin (CRT) and the heat shock proteins HSP70 and HSP90. Release of ATP and high- mobility group box protein 1 (HMGB1) belongs to other typical characteristics. For induction of ICD in lung cancer cells high-hydrostatic pressure (HHP) was used. Treatment by HHP induces expression of immunogenic markers CRT, HSP70 and HSP90 on the cell surface. HHP also induces secretion of ATP to the extracellular milieu. Dendritic cells (DC) pulsed with HHP-treated tumor cells showed fenotypic maturation characterized by upregulation of maturation molecule CD83, costimulation molecules CD80 and CD86, chemokine receptor CCR7 and MHC class II molecule HLA-DR. Pulsed DCs have also higher rate of phagocytosis of HHP-treated tumor cells and they induce lower numbers of regulatory T cells compared to immature DCs. Moreover, activation of caspases (-8, -9, -3) and other proteins (phosphorylation of eIF2α) which are crucial in ER-stress mediated apoptotic pathway, was observed after HHP treatment. Using wide range of methods it was confirmed that HHP treatment is able to induce ICD in lung cancer cell lines, fenotypic and functional characteristics were described and the decreased induction of regulatory T-lymphocytes...

Les environnements profonds marins ou continentaux représentent la majorité des biotopes sur Terre. Ils sont colonisés par des organismes, appelés piézophiles, adaptés aux fortes pressions hydrostatiques du milieu, conditions qui sont inhibitrices pour la croissance des organismes de surface. Dans le cadre de ce travail, j'ai cherché à élucider les spécificités de l’adaptation aux hautes pressions hydrostatiques. Pour cela, j'ai étudié un micro-organisme piézophile issu d'une source hydrothermale profonde, la souche MP de Thermococcus barophilus, dont l'optimum de croissance est de 400 fois la pression atmosphérique. J'ai caractérisé l'adaptation particulière de deux cibles cellulaires parmi les plus sensibles à la pression : les membranes et le protéome.Mes résultats montrent que la souche MP accumule des molécules de stress en condition de faible pression hydrostatique, c'est-à-dire que le protéome de cette souche est adapté aux conditions de hautes pressions. Il s'agit de la première démonstration d'une adaptation structurale chez un piézophile, et la démonstration que cette souche est une piézophile vraie. Par ailleurs, j'ai pu démontrer les mécanismes d'adaptation de la membrane en réponse à la pression et à la température. J'ai montré que cette réponse correspond à une adaptation homéovisqueuse de la composition membranaire, et que celle-ci est unique, car elle met en jeu trois mécanismes différents : une régulation du ratio di-/tetraéthers, une régulation du niveau d'insaturation des lipides, et la présence de lipides neutres dans la structure de la membrane. Ceci m'a amenée à proposer un nouveau modèle de membrane pour la souche modèle piézophile T. barophilus. La généralisation de ces observations et la confirmation de leur lien avec la piézophilie passe par l'étude d'autres organismes piézophiles. / Deep marine and continental environments represent the major ecosystems on Earth. They are colonized by organisms named piezophiles, adapted to high pressures of the deep biosphere, conditions that inhibit the growth of surface organisms. My objectives were to elucidate the special features of adaptation to high hydrostatic pressures. My model of study was a piezophilic microorganism isolated from a deep-sea vent; Thermococcus barophilus strain MP, which grows optimally at a pressure of 400 times the atmospheric pressure. I characterized the specific adaptation of two cellular compartments amongst the most sensitive to pressure: membranes and proteome. My results show that strain MP accumulates stress molecules in conditions of low pressure, which mean T. barophilus proteome is adapted to high pressure conditions. This is the first demonstration of structural adaptation in a piezophile, and also shows that T. barophilus is a true piezophile. Besides, I proved membrane adaptation mechanisms in response to pressure and temperature. These mechanisms are based on homeoviscous adaptation of lipids composition. This adaptation is unique and involves three different mechanisms: the regulation of the di-/tetraether ratio, the modulation of lipid unsaturation, and the insertion of neutral lipids in the membrane structure. These results brought me to propose a new membrane model for the piezophilic strain T. barophilus. Before confirming these observations as a possible piezophilic trait of adaptation, this study needs to be extended to other piezophilic organisms.

Tesis por compendio / [EN] High Hydrostatic Pressure technology emerged several years ago in response to consumer interest for products having greater organoleptic and nutritional quality than those traditionally processed by heat. The food industry initially improved preservation processes developing continuous heat treatment HTST, UHT and aseptic packaging. However, despite these improvements foodstuffs preserved by heat still have quality losses. Although initially the application of High Hydrostatic Pressure in the field of food was focused towards preservation, with the development of technology and research around new applications raised that make it very interesting for the sector. In this context, the aim of this thesis has been the application of High Hydrostatic Pressure on the preservation of fresh cheese and the revalorization of by-products from cheese factories. For this, the effect of treatments by high hydrostatic pressure (HHP) on pathogenic microorganisms (S. aureus, L. monocytogenes) and spoilage microorganisms (Rhodotorula glutinis, aurantiogriseum Penicillium, Pseudomonas fluorescens) that are present in lactic products is evaluated as well as the effect of various factors (sodium chloride (NaCl), initial treatment temperature) on microbial inactivation. To study this effect peptone water at concentrations of 0; 0.1; 0.5; 0.8% NaCl was used as reference medium and fresh cheese as complex matrix containing 0.5% NaCl. Pressure ranges between 200 and 550 MPa (Mega Pascals) were used with short treatment times (in the order of seconds to several minutes), combined with a moderate initial temperature of 20 to 50 °C.The results of microbial inactivation were fitted to the mathematical model that best described the behavior of inactivation curves, allowing predicting the behavior of the microorganisms being treated by HHP under different environmental factors. Treatments by HHP of R. glutinis and P. aurantiogriseum around 350 - 400 MPa generated more than 5 log10 reductions on the initial contamination. The NaCl concentration present in the reference medium for these two microorganisms was an additional control factor. Regarding the effect of the substrate significant differences between the mean values obtained for the reference medium and the complex matrix (cheese) were observed, fresh cheese showed a lower reduction in the initial inoculated load. Due to the production processes of cheesemaking large amount of residual whey generated is a problem under the environmental point of view. In this thesis the use of residual liquid whey was also studied in conjunction with whey protein isolates (WPI) for the purpose of producing gels with a high biological value through various HHP processes. The various mixtures of whey and different percentages of WPI (5, 7, 11, 15% w/v) processed by HHP resulted in gels with different characteristics. The pH values, color (L * a * b *) vary slightly directly depending on the WPI concentration and the storage time. The hardness values and gumminess were modified depending on the liquid medium and the concentration of WPI. The use of cheese whey to gelation favored water retention, significantly reducing the syneresis under refrigeration. This study shows the potential of HHP as control measure, demonstrating the effectiveness of these treatments to prolong the shelf life of fresh cheeses and as unconventional technique to generate new textures that can have great industrial interest at the same time that revalorize some wastes. / [ES] La tecnología de las Altas Presiones Hidrostáticas (HHP) emergió hace varios años como respuesta al interés de los consumidores por disponer de productos de una mayor calidad organoléptica y nutricional que los tradicionalmente procesados por calor. La industria agroalimentaria inicialmente mejoró sus procesos de conservación por calor desarrollando los tratamientos continuos HTST, UHT y el envasado aséptico. Sin embargo, a pesar de estas mejoras los productos alimenticios conservados por calor siguen presentando pérdidas en su calidad final. Aunque al principio la aplicación de las Altas Presiones Hidrostáticas en el campo de la alimentación se enfocó hacia la conservación, con el desarrollo de la tecnología y la investigación alrededor de ella han surgido nuevas aplicaciones que la hacen muy interesante para el sector. En este contexto, el objetivo de la presente tesis doctoral ha sido la aplicación de las Altas Presiones Hidrostáticas en la conservación de queso fresco y en la revalorización de subproductos de queserías. Para ello, se evalúa el efecto de los tratamientos por Altas Presiones Hidrostáticas (HHP) sobre microorganismos patógenos (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes) y alteradores (Rhodotorula glutinis, Penicillium aurantiogriseum, Pseudomonas fluorescens) de productos lácteos y el efecto de diversos factores presentes en los alimentos (cloruro sódico (NaCl), temperatura inicial de tratamiento) sobre la inactivación microbiana. Para estudiar este efecto se utilizó como medio de referencia agua peptona a concentraciones de 0; 0,1; 0,5; 0,8% de NaCl y como matriz compleja queso fresco con un contenido de 0,5% de NaCl. Se utilizaron intervalos de presión entre 200 y 550 MPa (Mega Pascales) con tiempos de tratamiento cortos (en el orden de segundos a varios minutos), combinados con una temperatura inicial moderada de 20 a 50 °C. Los resultados de inactivación microbiana se ajustaron al modelo matemático que mejor describía el comportamiento de las curvas de inactivación, lo que permite predecir el comportamiento de los microorganismos frente a las HHP y bajo los diferentes factores. En cuanto a las HHP para R. glutinis y P. aurantiogriseum tratamientos en torno a los 350 - 400 MPa generaron más de 5 reducciones log10 de la carga inicial. La concentración de NaCl presente en el medio de referencia para estos dos microorganismos fue un factor adicional de control. Con respecto al efecto del medio de trabajo se observaron diferencias significativas (p<0,05) entre los valores medios obtenidos para el medio de referencia y la matriz compleja (queso fresco): el queso fresco presentó una menor reducción en la carga inicial inoculada.Debido a los procesos productivos de la fabricación del queso se genera gran cantidad de suero lácteo residual que es un problema bajo el punto de vista medioambiental. En esta tesis también se estudió la utilización del suero lácteo líquido residual en conjunto con aislados proteicos del suero (WPI) con la finalidad de producir geles con un elevado valor biológico mediante diversos procesos de HHP. Las diversas mezclas de suero de queso junto con los porcentajes de 5, 7, 11, 15% p/v de WPI procesadas por HHP dieron lugar a geles con diversas características. Los valores de pH, color (L*a*b*) variaron ligeramente dependiendo directamente tanto de la concentración de WPI como del tiempo de almacenamiento. Los valores de dureza y gomosidad sufrieron modificaciones dependiendo del medio líquido y la concentración de WPI. La utilización de suero de queso para la formación del gel favoreció la retención de agua, reduciendo significativamente la sinéresis en refrigeración.Este estudio muestra el potencial de las HHP como una medida de control, demostrándose la efectividad de estos tratamientos para prolongar la vida útil de los quesos frescos y como técnica no convencional para generar nuevas texturas que pueden tener gran inte / [CA] La tecnologia de les altes pressions hidrostàtiques va emergir fa diversos anys com a resposta a l'interés dels consumidors per disposar de productes d'una qualitat organolèptica i nutricional major que la dels processats per calor tradicionalment. La indústria agroalimentària inicialment va millorar els seus processos de conservació per calor desenvolupant els tractaments continus HTST, UHT i l'envasat asèptic. No obstant això, malgrat aquestes millores els productes alimentaris conservats per calor continuen presentant pèrdues en la seua qualitat final.Tot i que al principi l'aplicació de les altes pressions hidrostàtiques en el camp de l'alimentació es va enfocar cap a la conservació, amb el desenvolupament de la tecnologia i la investigació al voltant d'ella han sorgit noves aplicacions que la fan molt interessant per al sector. En aquest context, l'objectiu de la present tesi doctoral ha sigut l'aplicació de les altes pressions hidrostàtiques en la conservació del formatge fresc i en la revalorització de subproductes de formatgeries. Per a això, s'avalua l'efecte dels tractaments per altes pressions hidrostàtiques (HHP) sobre microorganismes patògens (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes) i alteradors (Rhodotorula glutinis, Penicillium aurantiogriseum, Pseudomonas fluorescens) de productes lactis i l'efecte de diversos factors presents als aliments (clorur sòdic (NaCl), temperatura inicial de tractament) sobre la inactivació microbiana. Per a estudiar aquest efecte es va utilitzar com a medi de referència aigua peptona a concentracions de 0; 0,1; 0,5; 0,8% de NaCl i com a matriu complexa formatge fresc amb un contingut de 0,5% de NaCl. Es van utilitzar intervals de pressió entre 200 y 550 MPa (Mega Pascals) amb temps de tractament curts (en l'orde de segons a diversos minuts), combinats amb una temperatura inicial moderada de 20 a 50 °C. Els resultats d'inactivació microbiana es van ajustar al model matemàtic que millor descrivia el comportament de les corbes d'inactivació, el que permet predir el comportament dels microorganismes front a les HHP i baix els diferents factors. En referència a les HHP per a R. glutinis i P. aurantiogriseum tractaments al voltant dels 350 - 400 MPa van generar més de 5 reduccions log10 de la càrrega inicial. La concentració de NaCl present en el medi de referència per a aquestos dos microorganismes va ser un factor addicional de control. Respecte a l'efecte del medi de treball es van observar diferències significatives (p<0,05) entre els valors mitjans obtinguts per al medi de referència i la matriu complexa (formatge fresc): el formatge fresc va presentar una menor reducció en la càrrega inicial inoculada. Degut als processos productius de la fabricació del formatge es genera gran quantitat de sèrum lacti residual que és un problema baix el punt de vista mediambiental. En aquesta tesi també es va estudiar la utilització del sèrum lacti líquid residual en conjunt amb aïllats proteics del sèrum (WPI) amb la finalitat de generar gels amb un elevat valor biològic mitjançant diversos processos de HHP. Les diverses mescles de sèrum de formatge juntament amb els percentatges de 5, 7, 11, 15% p/v de WPI processades per HHP van generar gels amb diverses característiques. Els valors de pH, color (L*a*b*) van variar lleugerament depenent directament tant de la concentració de WPI com del temps d'emmagatzematge. Els valors de duresa i gomositat van sofrir modificacions depenent del medi líquid i la concentració de WPI. La utilització del sèrum de formatge per a la formació del gel va afavorir la retenció d'aigua, reduint significativament la sinèresi en refrigeració.Aquest estudi mostra el potencial de les HHP com a una mesura de control, demostrant-s'hi l'efectivitat d'aquestos tractaments per a prolongar la vida útil dels formatges frescos i com a tècnica no convencional per a generar noves textures que poden tindre gran interés / Torres Bello, EF. (2016). Efecto del tratamiento por altas presiones hidrostáticas (HHP) en la calidad de queso fresco y en las proteínas de suero de queserías [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/72866 / Compendio