La hipòxia és un factor clau per al desenvolupament tumoral, i correlaciona amb l'estat del tumor, amb una menor supervivència dels pacients i amb la resistència al tractament anti-tumoral convencional com és la quimioteràpia o la radioteràpia.La majoria d'estudis es centren en l'estudi de la hipòxia a llarg termini, i en HIF-1, factor de transcripció clau per a la resposta cel.lular a aquest estrés.En aquest treball, i mitjançant una aproximació per electroforesi bidimensional de proteïnes lligada a especrometria de masses s'han estudiat els canvis proteics produits després d'una hipòxia de 30 minuts, i s'han analitzat aquestes proteïnes com a possibles dianes per a la teràpia anti-tumoral. / Hypoxia is a key factor for tumor development, and it correlates with tumor stage, diminished survival and with resistance to conventional anti-tumor treatment, as chemotherapy or radiotherapy.Most of studies focus on long-term hypoxia and HIF-1, key transcription factor for the cell response to the stress.Through a 2D-gel electrophoresis aproach, linked to mass spectrometry, we have studied protein changes after a 30 min hypoxia, and these proteins have been analyzed as putative targets for anti-tumor therapy.

IntroducciónDurante la ventilación unipulmonar puede aparecer hipoxemia severa. La modulación farmacológica del flujo pulmonar es una atractiva estrategia de manejo. El óxido nítrico inhalado (iNO) es un vasodilatador pulmonar selectivo de las zonas ventiladas que produce redistribución del flujo pulmonar hacia éstas mejorando la relación ventilación/perfusión y el intercambio de gases. Estos efectos pueden verse potenciados por los inhibidores de la síntesis de las prostaglandinas y del NO endógeno que causan una vasoconstricción pulmonar más intensa en condiciones de hipoxia. ObjetivosLos objetivos fueron: 1) establecer una curva dosis-respuesta al iNO en un modelo experimental de ventilación unipulmonar. 2) estudiar los efectos del iNO, la L-NAME (30 mg.kg-1) y la indometacina (5 mg.kg-1). 3) Determinar si la L-NAME o la indometacina potencian los efectos del iNO inhalado.Material y métodosSe estudiaron 26 ovejas anestesiadas sometidas a ventilación unipulmonar izquierda. Se registraron los parámetros hemodinámicos pulmonares y sistémicos, el flujo pulmonar izquierdo y los gases en sangre arterial y venosa mixta. En la primera fase se estableció una curva dosis-respuesta en 7 animales administrando en orden aleatorio 4 concentraciones de iNO de 10, 20, 40 y 80 ppm. En la segunda fase 14 animales inhalaron NO durante 10 minutos, a continuación se dividieron aleatoriamente en dos grupos que recibieron L-NAME o indometacina y después de 30 minutos inhalaron nuevamente NO. Paralelamente se estudió un grupo control de 5 animales. Para el análisis estadístico se utilizaron el tesst T de Student para datos apareados, T de Student de significación, T de Student para muestras independientes y análisis de la varianza para medidas repetidas.ResultadosLa instauración de la ventilación selectiva izquierda causó un aumento de la mezcla venosa (54%) e hipoxemia severa (PaO2 media de 60 mmHg). Todas las dosis de iNO estudiadas causaron un aumento de la PaO2 y el flujo pulmonar izquierdo. No se pudo demostrar un efecto dosis dependiente del iNO, pero la dosis de 40 ppm de NO presentó menor variabilidad interindividual. El iNO disminuyó la presión pulmonar media (PAPM) un 11% (p<0,01), aumentó el flujo pulmonar izquierdo (FPI) en 0,35 l.min-1 (p<0,01), aumentó la PaO2 un 13% (p<0,01) y disminuyó la mezcla venosa un 12% (p<0,01). La L-NAME aumentó la PAPM un 53% (p<0,01) disminuyó el gasto cardíaco (GC) un 30% (p<0,01), mejoró la distribución del flujo pulmonar (31%, p<0,01) y disminuyó la mezcla venosa un 20% (p<0,01). La combinación de iNO y L-NAME causó un efecto sinérgico en la distribución del pulmonar izquierdo (65%, p<0,01), el aumento de la PaO2 (77%, p<0,01) y en la disminución de la mezcla venosa (44%, p<0,01). La indometacina no tuvo efectos significativos en la distribución de flujo ni en el intercambio de gases. Tampoco su combinación con iNO potenció los efectos del mismo.ConclusionesEn este modelo experimental de ventilación unipulmonar con hipoxemia severa, el iNO produce vasolilatación pulmonar selectiva, aumento de flujo al pulmón ventilado y mejora el intercambio de gases. La L-NAME produce intensos cambios hemodinámicos con poca repercusión en el intercambio de gases, pero su combinación con iNO da lugar a una importante redistribución del flujo y una gran mejoría de la oxigenación. La indometacina no tiene efectos significativos en el flujo ni en la oxigenación y tampoco potencia el efecto del iNO. / "EFFECTS OF INHALED NITRIC OXIDE IN AN EXPERIMENTAL MODEL OF ONE LUNG VENTILATION"Background:Inhaled nitric oxide (iNO) causes vasodilation and redistribution of pulmonary blood flow (PBF) to ventilated areas in the lung, and this effect can be enhanced by treatments that increase pulmonary hypoxic vasoconstriction (PHV). We hypothesized that during one lung ventilation (OLV) iNO, and the combination of iNO with L-NAME or indomethacine would increase (PBF) to ventilated lung and ameliorate gas exchange.Methods:Twenty six anesthetized adult sheep were included. Lambs were instrumented with a femoral artery catheter, pulmonary artery catheter, electromagnetic blood flow probe in left pulmonary artery and a tracheotomy. After initial measurements left lung ventilation was established. A dose response curve to iNO at 10, 20, 40 and 80 ppm concentrations was first established in seven animals. In the experimental protocol 14 sheep inhaled NO for ten minutes, then they were randomized to receive either L-NAME (30 mg.kg-1) or indomethacine (5 mg.kg-1) i.v. and after a 30 minutes period iNO was administered again. Five animals were followed as a control group. Hemodynamic parameters, PBF in the ventilated lung and arterial and mixed venous gases were obtained before and after each intervention.Results:OLV caused severe hypoxemia in this model (PaO2 60 more/less 9 mmHg).All doses of iNO increased PBF to ventilated lung and oxygenation without dose-response relationship, however more animals responded to the 40 ppm dose. INO at 40 ppm caused selective pulmonary vasodilation, increased both PBF to ventilated lung (11%, p<0.01) and oxygenation (13%, p<0.01). L-NAME severely decreased cardiac output (-30%, p<0.01), increased pulmonary pressure (53%, p<0.01) redistributed PBF and decreased venous admixture (-20%, p<0.01). Combination of iNO and L-NAME caused a synergistic effect in PBF redistribution (65%, p<0.01) and oxygenation improvement (77%, p<0.01). Indomethacine alone caused pulmonary hypertension (22%, p<0.01) without any effect on PBF and gas exchange and did not potentiated the effects of iNO in these parameters.Conclusions: Inhaled nitric oxide improves PBF distribution and oxygenation during severe hypoxemia in this experimental model of OLV. L-NAME administration enhanced PHV in non ventilated lung and clearly potentiated the effects of iNO although high doses of L-NAME cause intense hemodynamic changes.

La exposición humana a grandes altitudes puede provocar diversos grados de deterioro funcional y orgánico, presentando el sistema nervioso una gran sensibilidad frente a cambios en la presión parcial de oxígeno.Mediante una historia clínica especialmente confeccionada, exploración física neurológica y resonancia magnética (RMI) craneal se estudió a varios grupos de alpinistas de élite que hubieran escalado por encima de los 7.000 m. de altitud en utilizar equipos de oxígeno en una ocasión como mínimo. Éstos fueron comparados (en diferentes fases de estudio) contra ellos mismos, con un grupo de nativos del Himalaya de la etnia Sherpa que poseían un historial excepcional en cuanto al número de ascensos a montañas mayores de 8.000 m. y con un grupo control que nunca había sobrepasado los 2.500 m. de altitud.Mientras todas las exploraciones físicas fueran normales, prácticamente todos los alpinistas presentaron clínica de orden neuropsicológico a gran altitud y el 44-58% también tras las expediciones, mostrando el 46-61% alteraciones RMI cerebrales (atrofia cortical y/o leucoaralosis preferentemente posteriores). En ningún sujeto del grupo control se detectó cambios RMI y tan sólo el 14% de Sherpas presentó clínica neurológica y cambios RMI similares. Las diferencias respeto a la aparición de alteraciones RMI cerebrales fueron altamente significativas entre haber o no sido expuesto a grandes altitudes, así como entre ser nativo del Himalaya o de nivel del mar. No hubo correlación estadísticamente significativa entre las imágenes RMI patológicas y la edad, la sintomatología, el número de ascensiones superiores a 7.000 y 8.000 m., el tiempo de exposición a gran o extrema altitud y la máxima cota alcanzada. No obstante, parece haber una relación entre la tolerancia a la altitud extrema y a la aparición de alteraciones RMI, entre el tiempo transcurrido desde la última escalada superior a 8.000 m. y la presentación de atrofia cortical, entre el sexo femenino y la menor frecuencia de RMI alteradas. Ascender a grandes alturas, no necesariamente extremas, provoca la aparición de sintomatología neuropsicológica y alteraciones en la imagen de la estructura cerebral en un elevado porcentaje de humanos de nivel de mar pero no en los nativos del Himalaya estudiados. Esta supuesta protección étnica frente a la hipoxia ambiental puede justificarse por la existencia de peculiares adaptaciones, especialmente del metabolismo aeróbico, derivadas de una permanencia crónica bajo presiones barométricas notablemente reducidas. Los hallazgos detectados por RMI sugieren la presencia de lesión degenerativa, no obstante, permanece desconocido su predominio cerebral posterior, así como su evolución e implicación clínica a largo plazo. / Exposure to high-altitude may induce functional and organic disturbances in humans. Central nervous system showing the highest sensibility to changes in oxygen pressure. Three groups of elite European mountaineers, who ascended over 7000 m. without oxygen supplement, were studied by magnetic resonance (MRI) of the brain and evaluated by a complete clinical history and neurological testing. These groups were compared with themselves before and after a single climb, with an outstanding group of Himalayan Sherpa climbers and with a healthly control group which had never been exposed to above 2500 m. While almost all of European climbers suffered neuropsychological symptoms during high-altitude exposure, 44-58% during post-expeditions and 46-61% showed MRBI brain abnormalities (cortical atrophy and/or leuko-araiosis), only 14% of highlanders showed MRI brain changes. In a high percentage of lowlanders, ascend to extreme altitude may produce neurological disorders and structural brain abnormalities, when after only one exposure to a hypoxic environment. The severity of this impact appears to be much smaller in Himalayan natives who may have a cerebral protection associated with special adaptations to chronic hypoxia. The type of MRI changes observed in these sportsmen suggest a degenerative brain damage, although its evolution and long-term clinical repercussion remain unknown, and deserves further investigation.

La presencia de glucógeno en las neuronas ha sido motivo de controversia durante las pasadas décadas. Sin embargo, está aceptado que las neuronas expresan la maquinaria necesaria para sintetizar glucógeno, pero no para degradarlo. La presencia de la glucógeno sintasa (GS) en las neuronas es un misterio y no existe ningún estudio que analice cuál es su función fisiológica en este tipo neuronal. Recientemente se ha establecido un paralelismo entre la GS neuronal y el caballo de Troya, ya que múltiples estudios han demostrado que una hiper-activación de la GS y la consecuente acumulación de glucógeno desencadenan la entrada en apoptosis. A pesar de ello, la neurona gasta energía para su transcripción y traducción, lo que hace pensar que su presencia en la neurona es importante para su correcto funcionamiento. Los objetivos de esta tesis doctoral son los siguientes: 1. Caracterización del metabolismo de glucógeno y de su presencia en neuronas. 2. Estudio de la maquinaria de degradación de glucógeno en neuronas y su regulación en hipoxia 3. Análisis de la síntesis de glucógeno en neuronas expuestas a hipoxia. 4. Evaluación de la función biológica de la GS en neuronas bajo condiciones de hipoxia. Los resultados de esta tesis revelan que las neuronas tienen una síntesis de glucógeno activa, y, además, lo acumulan en condiciones basales. Además, poseen la maquinaria necesaria para la degradación de glucógeno y degradan sus propias reservas en condiciones de hipoxia. La capacidad neuronal de degradación de glucógeno está presente en una situación in vivo, ya que las neuronas del modelo Drosophila melanogaster movilizan sus reservas en condiciones de hipoxia, y las neuronas de Purkinje en el ratón lo hacen tras una anoxia post-mortem prolongada. La maquinaria de degradación del polisacárido, desconocida hasta el momento, está mediada por la expresión de la glucógeno fosforilasa (GP). Las neuronas expresan la isoforma cerebral del enzima, pero no la muscular, como en el caso de los astrocitos. Esta isoforma está presente tanto en neuronas en cultivo como en neuronas procedentes de cortes de cerebro de ratón adulto. La hipoxia causa la defosforilación y activación de la GS. La GS sintetiza glucógeno activamente, aunque los niveles netos del polisacárido disminuyen en hipoxia. Por tanto, está teniendo lugar un ciclo aparentemente fútil en donde la síntesis y degradación se encuentran activas. Finalmente se ha demostrado que el metabolismo del glucógeno forma parte de la maquinaria de protección que activa la neurona para resistir a la hipoxia. En consecuencia, las neuronas que carecen la GS tienen una mortalidad más elevada que aquellas que sí que expresan el enzima. En el modelo de la mosca, el metabolismo del glucógeno neuronal también juega un papel en la tolerancia a la hipoxia y moscas con niveles reducidos de GS específicamente en la neurona muestran un empeoramiento en la respuesta tras un período de bajo oxígeno. En conclusión, esta tesis presenta evidencias de que las neuronas poseen un metabolismo activo de glucógeno que, además, juega un papel clave en la tolerancia de estas células a condiciones de hipoxia. / The presence of glycogen in neurons has been a matter of debate for the past decades. However, it is accepted that neurons express the necessary machinery to synthesize glycogen, but not for degrading it. The presence of Glycogen Synthase (GS) in neurons is a mystery and there is no study which approaches its physiological function in this cellular type. Recently a parallelism has been drawn between GS and the Trojan horse, since several studies have shown that an over-activation of GS and an accumulation of glycogen cause apoptosis in the neurons. Nevertheless, neurons waste energy for transcribing and synthesizing the protein, which suggests that its presence might be important for the normal functioning of the neurons. The aims of the thesis are the follows 1) Characterization of glycogen metabolism and its presence in neurons 2) Study of the glycogen degradation machinery in neurons and its regulation in hypoxia 3) Analysis of the synthesis of glycogen in neurons exposed to hypoxia 4) Evaluation of the biological function of GS in neurons under hypoxia conditions The results of this thesis reveal that there is an active glycogen synthesis under normal conditions. In addition, they express the necessary machinery to degrade the polysaccharide and degrade it under hypoxia conditions. The neuronal capacity of glycogen degradation is present in the in vivo situation, both in neurons from Drosophila melanogaster and from mice. The glycogen degradation machinery is mediated through the expression of glycogen phosphorylase (GP). Neurons express the brain isoform of the enzyme, but not the muscle, as astrocytes do. This isoform is present in neuronal cultures, as well as in neurons from adult mice brain slices. Hypoxia causes the dephosphorylation and activation of GS. GS actively synthesizes glycogen, although the global glycogen levels diminished in hypoxia. Indeed, an apparent futile cycle is taking place under hypoxia, where both synthesis and degradation are activated. Finally, we have demonstrated that glycogen metabolism is part of the protection machinery the neuron activates for tolerating the hypoxia conditions. Consequently, neurons without GS have a higher mortality rate that these who actively express the enzyme. In Drosophila melanogaster, flies with reduced GS levels specifically in neurons have an impaired phenotype in their reponse to hypoxic conditions. In conclusion, this thesis presents evidences that show neurons have an active glycogen metabolism which plays a key role in the neuronal response to hypoxia.

El remodelat vascular es un procés crític que present en el desenvolupament de patologies cardiovasculars com l’aterosclerosi i l’aneurisma d’aorta abdominal (AAA). La Lisil Oxidasa (LOX) i la Fibulina-5 (FBLN5) són dues proteïnes de matriu extracel•lular essencials en la formació i manteniment de les fibres elàstiques. Ambdues participen en processos fisiopatològics caracteritzats per l’alteració de l’equilibri síntesi/destrucció de la matriu extracel•lular i han estat involucrades en el remodelat vascular. Estudis en models experimentals han proporcionat indicis sobre la possible vinculació d’aquestes proteïnes en el desenvolupament d’aterosclerosi i d’AAA, si bé existeixen molts aspectes de la biologia d’aquestes proteïnes que haurien de ser analitzats en profunditat. Un aspecte crític en el remodelat vascular associat a la progressió de la lesió ateroscleròtica és l’aparició de regions d’hipòxia. L’estrès hipòxic és característic d’alguns processos fisiològics, però també de patologies com el càncer, els trastorns isquèmics, la inflamació crònica i l’aterosclerosi. Les cèl•lules endotelials són els sensors primaris d’aquest estrés hipòxic, i la seva adaptació a la hipòxia es produeix a través d’una complexa resposta finament regulada que afecta múltiples aspectes de la seva biologia, com la supervivència cel•lular, el control del to i la permeabilitat vascular, l’angiogènesi i el remodelat de la matriu extracel•lular. No obstant, no s’ha establert si la hipòxia pot regular la expressió de la LOX i la FBLN5 en cèl•lules endotelials ni la repercussió fisiològica que podria tenir. Les investigacions desenvolupades pel nostre grup indiquen que la LOX és un enzim clau en el manteniment de la integritat de l’endoteli i de la funció endotelial. La capacitat d’aquest enzim de controlar l’expressió gènica, en base a la seva activitat al nucli, així com l’activitat de factors de creixement fonamentals en l’homeòstasi vascular com el bFGF i el PDGF, suggereix que aquest enzim controla funcions cel•lulars que poden ser determinants en el desenvolupament de malalties cardiovasculars. En base a aquests antecedents, ens hem plantejat com a hipòtesis de treball que la LOX i la FBLN5 són proteïnes clau en l’homeòstasi vascular, que participen en la resposta adaptativa de les cèl•lules vasculars a la hipòxia, i que contribueixen al desenvolupament de patologies vasculars com l’aterosclerosi i l’aneurisma d’aorta abdominal. Els nostres resultats han demostrat que en artèries coronàries humanes, la LOX s’expressa principalment a l’endoteli i a l’adventícia, i que és la isoforma més expressada en cèl•lules vasculars, juntament amb la LOXL2. En cèl•lules endotelials, l’expressió de LOX i FBLN5 s’incrementa en resposta a hipòxia a través de mecanismes transcripcionals, si bé amb clares diferències entre ambdues proteïnes. Així, el factor HIF-1 juga un paper secundari en la regulació de la LOX per hipòxia en cèl•lules endotelials, una resposta en la que estan involucrades proteïnes de la família Smad i l’estrès oxidatiu. Per contra, HIF-1 és el principal responsable de la inducció de la FBLN5 en cèl•lules endotelials, en les quals hem demostrat que aquesta proteïna contribueix a la resposta adaptativa a l’estrès hipòxic. Finalment, hem observat que la sobre-expressió de LOX en cèl•lules endotelials mitjançant un sistema lentiviral indueix canvis en l’expressió gènica que afecten la senyalització i la comunicació cèl•lula-cèl•lula, d’entre els quals en destaca la inhibició de l’α2-macroglobulina. / Vascular remodeling is a critical process in the development of cardiovascular diseases such as atherosclerosis and abdominal aorta aneurysm (AAA). Lysyl oxidase (LOX) and Fibulin-5 (FBLN5) are two extracellular matrix proteins essential for the elastic fiber development and maintenance, and they both have an active role in physiological processes in which vascular remodeling is involved. By using different animal models, these proteins have been suggested to be involved with atherosclerosis and AAA. A critical aspect of the vascular remodeling in the atherosclerotic lesion is the apparition of hypoxic areas. Endothelial cells are primary sensors to the hypoxic stress, responding to it in a complex but subtly regulated way that affects multiple aspects of its biology. Nevertheless, it has not been established if the hypoxic stimulus can modulate LOX and FBLN5 expression, nor its possible physiological repercussions. Research made in our group shows the importance of LOX in the endothelial activity and vascular function. LOX can control the genetic expression as well as the activity of growth factors essential for the vascular homeostasis, suggesting that this enzyme may control cellular functions essential for the development of cardiovascular diseases. Based on these results, we have considered as working hypothesis that LOX and FBLN5 are key proteins in the vascular homeostasis, that they take part of the vascular response to hypoxia, and that they contribute to the development of vascular diseases like atherosclerosis and the AAA. Our results show that hypoxia transcriptionally induces LOX and FBLN5 in endothelial cells. While HIF-1 plays a secondary role in the regulation of LOX, being also involved in this modulation Smad proteins and oxidative stress, it is the main factor responsible for the FBLN5 induction. We also demonstrate that the modulation of FBLN5 in endothelial cells contributes to their adaptive response to hypoxia. Moreover, we have observed that overexpressing LOX in endothelial cells downregulates α2-macroglobulin expression.