A acetilação de histonas está envolvida na plasticidade sináptica e na memória, sendo uma reação reversível catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e revertida por histonas desacetilases (HDACs). A administração intraperitoneal de butirato sódico (NaB) - inibidor de histonas desacetilases (HDACi), na dose de 1,2 g/kg imediatamente após o treino na tarefa de reconhecimento de objeto novo (NOR), abrandou o prejuízo associado ao envelhecimento em ratos de 24 meses no teste 24 horas após o treino, memória de longa duração (LTM). A mesma dose de NaB administrada i.p. 6 horas após o treino de NOR não tem efeito na LTM em ratos de 18 meses, indicando que a melhora observada pelo HDACi seja temporalmente restrita à fase inicial da consolidação. A injeção de NaB imediatamente após o treino não teve efeito na LTM de NOR em ratos de 3 meses. Em camundongos treinados pelo protocolo de NOR que não induz per se a memória de curta ou longa duração, observou-se memória 24 horas e 7 dias após o treino quando receberam NaB i.p. após o aprendizado. Os animais treinados pelo protocolo de NOR de indução de memória 24 horas - mas não 7 dias - após aprendizado, não apresentam melhora no teste de 7 dias quando receberam NaB i.p. 1 hora antes do referido teste, sugerindo que a inibição de HDACs não tenha efeito na evocação. A administração i.p. de NaB após aquisição reverteu o déficit na memória dos camundongos com a proteína de ligação à CREB com mutação no sítio de ligação à CREB 7 dias após o treino de NOR, indicando que esse sítio não é necessário na melhora da memória de NOR por NaB. A infusão de tricostatina A - um HDACi - imediatamente após o treino na amígdala de camundongos melhorou a LTM de condicionamento aversivo ao contexto, mas não de condicionamento aversivo ao indício sonoro, indicando que o efeito gerado pela inibição de HDACs pode depender do tipo de memória analisada. Este estudo sugere que NaB abranda o prejuízo associado ao envelhecimento na memória de NOR e aumenta a persistência da memória. / Histone acetylation is involved in synaptic plasticity and memory. This reversible reaction is catalysed by histone acetyltransferases (HATs) and reversed by histone deacetylases (HDACs). Systemic administration of sodium butyrate (NaB), an inhibitor of histone deacetylases (HDACi), at 1.2 g/kg (i.p.) immediately after training on a novel object recognition task (NOR), ameliorated aging-related memory impairments in 24 month old rats. The same dose of NaB administred i.p. 6 hours after NOR training had no effect on long-term memory (LTM) in 18 month old rats, indicating that the HDACi memory enhancement is temporaly restricted to the initial phase of consolidation. NaB injection immediately after training had no effect on NOR memory in 3 month old rats. Mice trained in a NOR protocol that does not elicit neither short-term nor long-term memory by itself, when received NaB i.p. after learning, showed memory 24 hours and 7 days after acquisition. Mice trained in a NOR protocol in which memory is observed 24 hours - but not 7 days - after learning, did not show memory enhancement on the 7-day test when received i.p. NaB 1 hour before, suggesting that the HDACs inhibition had no effect on retrieval. Administration of NaB after training reversed the memory deficit at the 7-day test in mice with CREB binding protein mutated on its binding site to CREB, indicating that this site is not necessary for NaB enhancement of NOR memory. Intra-amygdala infusions of the HDACi trichostatin A immediately after training enhanced contextual, but not cued, fear conditioning LTM, indicating that the effect of HDAC inhibition may depend on the memory analysed. This study indicates that NaB ameliorated aging-related NOR memory impairments and produced an enhancement in memory persistence.

A acetilação de histonas está envolvida na plasticidade sináptica e na memória, sendo uma reação reversível catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e revertida por histonas desacetilases (HDACs). A administração intraperitoneal de butirato sódico (NaB) - inibidor de histonas desacetilases (HDACi), na dose de 1,2 g/kg imediatamente após o treino na tarefa de reconhecimento de objeto novo (NOR), abrandou o prejuízo associado ao envelhecimento em ratos de 24 meses no teste 24 horas após o treino, memória de longa duração (LTM). A mesma dose de NaB administrada i.p. 6 horas após o treino de NOR não tem efeito na LTM em ratos de 18 meses, indicando que a melhora observada pelo HDACi seja temporalmente restrita à fase inicial da consolidação. A injeção de NaB imediatamente após o treino não teve efeito na LTM de NOR em ratos de 3 meses. Em camundongos treinados pelo protocolo de NOR que não induz per se a memória de curta ou longa duração, observou-se memória 24 horas e 7 dias após o treino quando receberam NaB i.p. após o aprendizado. Os animais treinados pelo protocolo de NOR de indução de memória 24 horas - mas não 7 dias - após aprendizado, não apresentam melhora no teste de 7 dias quando receberam NaB i.p. 1 hora antes do referido teste, sugerindo que a inibição de HDACs não tenha efeito na evocação. A administração i.p. de NaB após aquisição reverteu o déficit na memória dos camundongos com a proteína de ligação à CREB com mutação no sítio de ligação à CREB 7 dias após o treino de NOR, indicando que esse sítio não é necessário na melhora da memória de NOR por NaB. A infusão de tricostatina A - um HDACi - imediatamente após o treino na amígdala de camundongos melhorou a LTM de condicionamento aversivo ao contexto, mas não de condicionamento aversivo ao indício sonoro, indicando que o efeito gerado pela inibição de HDACs pode depender do tipo de memória analisada. Este estudo sugere que NaB abranda o prejuízo associado ao envelhecimento na memória de NOR e aumenta a persistência da memória. / Histone acetylation is involved in synaptic plasticity and memory. This reversible reaction is catalysed by histone acetyltransferases (HATs) and reversed by histone deacetylases (HDACs). Systemic administration of sodium butyrate (NaB), an inhibitor of histone deacetylases (HDACi), at 1.2 g/kg (i.p.) immediately after training on a novel object recognition task (NOR), ameliorated aging-related memory impairments in 24 month old rats. The same dose of NaB administred i.p. 6 hours after NOR training had no effect on long-term memory (LTM) in 18 month old rats, indicating that the HDACi memory enhancement is temporaly restricted to the initial phase of consolidation. NaB injection immediately after training had no effect on NOR memory in 3 month old rats. Mice trained in a NOR protocol that does not elicit neither short-term nor long-term memory by itself, when received NaB i.p. after learning, showed memory 24 hours and 7 days after acquisition. Mice trained in a NOR protocol in which memory is observed 24 hours - but not 7 days - after learning, did not show memory enhancement on the 7-day test when received i.p. NaB 1 hour before, suggesting that the HDACs inhibition had no effect on retrieval. Administration of NaB after training reversed the memory deficit at the 7-day test in mice with CREB binding protein mutated on its binding site to CREB, indicating that this site is not necessary for NaB enhancement of NOR memory. Intra-amygdala infusions of the HDACi trichostatin A immediately after training enhanced contextual, but not cued, fear conditioning LTM, indicating that the effect of HDAC inhibition may depend on the memory analysed. This study indicates that NaB ameliorated aging-related NOR memory impairments and produced an enhancement in memory persistence.

A acetilação de histonas está envolvida na plasticidade sináptica e na memória, sendo uma reação reversível catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e revertida por histonas desacetilases (HDACs). A administração intraperitoneal de butirato sódico (NaB) - inibidor de histonas desacetilases (HDACi), na dose de 1,2 g/kg imediatamente após o treino na tarefa de reconhecimento de objeto novo (NOR), abrandou o prejuízo associado ao envelhecimento em ratos de 24 meses no teste 24 horas após o treino, memória de longa duração (LTM). A mesma dose de NaB administrada i.p. 6 horas após o treino de NOR não tem efeito na LTM em ratos de 18 meses, indicando que a melhora observada pelo HDACi seja temporalmente restrita à fase inicial da consolidação. A injeção de NaB imediatamente após o treino não teve efeito na LTM de NOR em ratos de 3 meses. Em camundongos treinados pelo protocolo de NOR que não induz per se a memória de curta ou longa duração, observou-se memória 24 horas e 7 dias após o treino quando receberam NaB i.p. após o aprendizado. Os animais treinados pelo protocolo de NOR de indução de memória 24 horas - mas não 7 dias - após aprendizado, não apresentam melhora no teste de 7 dias quando receberam NaB i.p. 1 hora antes do referido teste, sugerindo que a inibição de HDACs não tenha efeito na evocação. A administração i.p. de NaB após aquisição reverteu o déficit na memória dos camundongos com a proteína de ligação à CREB com mutação no sítio de ligação à CREB 7 dias após o treino de NOR, indicando que esse sítio não é necessário na melhora da memória de NOR por NaB. A infusão de tricostatina A - um HDACi - imediatamente após o treino na amígdala de camundongos melhorou a LTM de condicionamento aversivo ao contexto, mas não de condicionamento aversivo ao indício sonoro, indicando que o efeito gerado pela inibição de HDACs pode depender do tipo de memória analisada. Este estudo sugere que NaB abranda o prejuízo associado ao envelhecimento na memória de NOR e aumenta a persistência da memória. / Histone acetylation is involved in synaptic plasticity and memory. This reversible reaction is catalysed by histone acetyltransferases (HATs) and reversed by histone deacetylases (HDACs). Systemic administration of sodium butyrate (NaB), an inhibitor of histone deacetylases (HDACi), at 1.2 g/kg (i.p.) immediately after training on a novel object recognition task (NOR), ameliorated aging-related memory impairments in 24 month old rats. The same dose of NaB administred i.p. 6 hours after NOR training had no effect on long-term memory (LTM) in 18 month old rats, indicating that the HDACi memory enhancement is temporaly restricted to the initial phase of consolidation. NaB injection immediately after training had no effect on NOR memory in 3 month old rats. Mice trained in a NOR protocol that does not elicit neither short-term nor long-term memory by itself, when received NaB i.p. after learning, showed memory 24 hours and 7 days after acquisition. Mice trained in a NOR protocol in which memory is observed 24 hours - but not 7 days - after learning, did not show memory enhancement on the 7-day test when received i.p. NaB 1 hour before, suggesting that the HDACs inhibition had no effect on retrieval. Administration of NaB after training reversed the memory deficit at the 7-day test in mice with CREB binding protein mutated on its binding site to CREB, indicating that this site is not necessary for NaB enhancement of NOR memory. Intra-amygdala infusions of the HDACi trichostatin A immediately after training enhanced contextual, but not cued, fear conditioning LTM, indicating that the effect of HDAC inhibition may depend on the memory analysed. This study indicates that NaB ameliorated aging-related NOR memory impairments and produced an enhancement in memory persistence.

O exercício físico moderado e regular é considerado uma estratégia neuroprotetora promissora. Os mecanismos pelos quais o exercício físico altera a função cerebral não foram completamente esclarecidos. Nossa hipótese de trabalho foi que estas propriedades neuroprotetoras estejam relacionadas com o remodelamento da cromatina, especificamente alterando os níveis de acetilação de histonas através da modulação da atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). O objetivo do estudo foi investigar o efeito do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampo de ratos em diferentes tempos após o treinamento. Ratos Wistar machos adultos foram distribuídos em um grupo não-exercitado (sedentário) e um grupo exercitado em diferentes protocolos: sessão única de exercício (corrida de 20 min) e treinamento crônico de exercício (corrida de 20 min, uma vez por dia, durante duas semanas). Os efeitos do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram mensurados imediatamente, 1 h e 18 h após a sessão única ou após a última sessão do treinamento crônico de exercício, utilizando kits ELISA específicos. A sessão única de exercício reduziu a atividade da Histona Desacetilase (HDAC) e aumentou a atividade da Histona Acetiltransferase (HAT), bem como aumentou o balanço HAT/HDAC em hipocampos de ratos, imediatamente e 1 h após o exercício, indicando um estado de hiperacetilação de histonas. O treinamento crônico não alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). As atividades das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram influenciadas pelo ritmo circadiano, uma vez que o balanço HAT/HDAC foi significativamente menor durante o período da manhã em comparação ao período da tarde. O exercício físico alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampos de ratos Wistar, apresentando efeito de curta duração. / Regular and moderate exercise has been considered a promising neuroprotective strategy. The mechanisms by which physical exercise alters brain function are not completely clear. Our work hypothesis was that these neuroprotective properties could be related to chromatin remodeling, specifically altering the histone acetylation levels through modulation of Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzyme activities. The aim of the work was to investigate the effect of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities in rat hippocampus at different times after treadmill exercise. Adult male Wistar rats were assigned to a non-exercised (sedentary) group and an exercised group on different protocols: a single session of exercise (running for 20 min) and a chronic treadmill exercise (running once daily for 20 min, for 2 weeks). The effects of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities were measured immediately, 1 h and 18 h after the single session or the last session of chronic treadmill exercise using specific ELISA kits. The single session of exercise reduced the Histone Desacetylase (HDAC) activity and increased the Histone Acetyltransferase (HAT) activity, as well increased the HAT/HDAC balance in rat hippocampus, immediately and 1 h after exercise, indicative of histone hyperacetylation status. The chronic treadmill did not alter the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activity. The Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities were influenced by the circadian rhythm, since the HAT/HDAC ratio was significantly decreased in the early morning when compared to the afternoon. The physical exercise altered the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities in Wistar rats hippocampus, presenting short term effects.

O exercício físico moderado e regular é considerado uma estratégia neuroprotetora promissora. Os mecanismos pelos quais o exercício físico altera a função cerebral não foram completamente esclarecidos. Nossa hipótese de trabalho foi que estas propriedades neuroprotetoras estejam relacionadas com o remodelamento da cromatina, especificamente alterando os níveis de acetilação de histonas através da modulação da atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). O objetivo do estudo foi investigar o efeito do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampo de ratos em diferentes tempos após o treinamento. Ratos Wistar machos adultos foram distribuídos em um grupo não-exercitado (sedentário) e um grupo exercitado em diferentes protocolos: sessão única de exercício (corrida de 20 min) e treinamento crônico de exercício (corrida de 20 min, uma vez por dia, durante duas semanas). Os efeitos do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram mensurados imediatamente, 1 h e 18 h após a sessão única ou após a última sessão do treinamento crônico de exercício, utilizando kits ELISA específicos. A sessão única de exercício reduziu a atividade da Histona Desacetilase (HDAC) e aumentou a atividade da Histona Acetiltransferase (HAT), bem como aumentou o balanço HAT/HDAC em hipocampos de ratos, imediatamente e 1 h após o exercício, indicando um estado de hiperacetilação de histonas. O treinamento crônico não alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). As atividades das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram influenciadas pelo ritmo circadiano, uma vez que o balanço HAT/HDAC foi significativamente menor durante o período da manhã em comparação ao período da tarde. O exercício físico alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampos de ratos Wistar, apresentando efeito de curta duração. / Regular and moderate exercise has been considered a promising neuroprotective strategy. The mechanisms by which physical exercise alters brain function are not completely clear. Our work hypothesis was that these neuroprotective properties could be related to chromatin remodeling, specifically altering the histone acetylation levels through modulation of Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzyme activities. The aim of the work was to investigate the effect of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities in rat hippocampus at different times after treadmill exercise. Adult male Wistar rats were assigned to a non-exercised (sedentary) group and an exercised group on different protocols: a single session of exercise (running for 20 min) and a chronic treadmill exercise (running once daily for 20 min, for 2 weeks). The effects of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities were measured immediately, 1 h and 18 h after the single session or the last session of chronic treadmill exercise using specific ELISA kits. The single session of exercise reduced the Histone Desacetylase (HDAC) activity and increased the Histone Acetyltransferase (HAT) activity, as well increased the HAT/HDAC balance in rat hippocampus, immediately and 1 h after exercise, indicative of histone hyperacetylation status. The chronic treadmill did not alter the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activity. The Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities were influenced by the circadian rhythm, since the HAT/HDAC ratio was significantly decreased in the early morning when compared to the afternoon. The physical exercise altered the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities in Wistar rats hippocampus, presenting short term effects.

O exercício físico moderado e regular é considerado uma estratégia neuroprotetora promissora. Os mecanismos pelos quais o exercício físico altera a função cerebral não foram completamente esclarecidos. Nossa hipótese de trabalho foi que estas propriedades neuroprotetoras estejam relacionadas com o remodelamento da cromatina, especificamente alterando os níveis de acetilação de histonas através da modulação da atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). O objetivo do estudo foi investigar o efeito do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampo de ratos em diferentes tempos após o treinamento. Ratos Wistar machos adultos foram distribuídos em um grupo não-exercitado (sedentário) e um grupo exercitado em diferentes protocolos: sessão única de exercício (corrida de 20 min) e treinamento crônico de exercício (corrida de 20 min, uma vez por dia, durante duas semanas). Os efeitos do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram mensurados imediatamente, 1 h e 18 h após a sessão única ou após a última sessão do treinamento crônico de exercício, utilizando kits ELISA específicos. A sessão única de exercício reduziu a atividade da Histona Desacetilase (HDAC) e aumentou a atividade da Histona Acetiltransferase (HAT), bem como aumentou o balanço HAT/HDAC em hipocampos de ratos, imediatamente e 1 h após o exercício, indicando um estado de hiperacetilação de histonas. O treinamento crônico não alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). As atividades das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram influenciadas pelo ritmo circadiano, uma vez que o balanço HAT/HDAC foi significativamente menor durante o período da manhã em comparação ao período da tarde. O exercício físico alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampos de ratos Wistar, apresentando efeito de curta duração. / Regular and moderate exercise has been considered a promising neuroprotective strategy. The mechanisms by which physical exercise alters brain function are not completely clear. Our work hypothesis was that these neuroprotective properties could be related to chromatin remodeling, specifically altering the histone acetylation levels through modulation of Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzyme activities. The aim of the work was to investigate the effect of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities in rat hippocampus at different times after treadmill exercise. Adult male Wistar rats were assigned to a non-exercised (sedentary) group and an exercised group on different protocols: a single session of exercise (running for 20 min) and a chronic treadmill exercise (running once daily for 20 min, for 2 weeks). The effects of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities were measured immediately, 1 h and 18 h after the single session or the last session of chronic treadmill exercise using specific ELISA kits. The single session of exercise reduced the Histone Desacetylase (HDAC) activity and increased the Histone Acetyltransferase (HAT) activity, as well increased the HAT/HDAC balance in rat hippocampus, immediately and 1 h after exercise, indicative of histone hyperacetylation status. The chronic treadmill did not alter the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activity. The Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities were influenced by the circadian rhythm, since the HAT/HDAC ratio was significantly decreased in the early morning when compared to the afternoon. The physical exercise altered the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities in Wistar rats hippocampus, presenting short term effects.

At least eleven histone H1 variants exist in mammalian somatic cells that bind to the linker DNA and stabilize the nucleosome particle contributing to higher order chromatin compaction. In addition of playing a structural role, H1 seems to be involved in the activation and repression of gene expression. It is not well known whether the different variants have specific roles or regulate specific promoters. We have explored this by inducible shRNA-mediated knock-down of each of the H1 variants in a human breast cancer cell line. Rapid inhibition of each H1 variant was not compensated by changes of expression of other variants. A different, reduced subset of genes is altered in each H1 knock-down. Interestingly, H1.2 depletion represses expression of a number of cell cycle genes. This is concomitant with a G1 arrest phenotype observed in this cell line. In addition, H1.2 depletion caused decreased global nucleosome spacing. These effects are specific of H1.2 depletion as they are not complemented by overexpression of other variants and they do not occur in knock-downs for the other variants. Moreover, H1.4 depletion caused cell death in T47D, being the first report of the essentiality of an H1 variant for survival in a human cell type. In addition to this, we have also investigated specificities of H1 subtypes location in particular promoters of interest in our laboratory, as well as specific interactions with other factors by generating HA-tagged H1 variant expressing cell lines. / Al menos once variantes de la histona H1 han sido identificadas en mamíferos, todas ellas se unen al ADN entre nucleosomas contribuyendo así, a la estabilización de la partícula nucleosómica y a la compactación de la cromatina en estructuras de alto orden. Además de jugar un papel estructural, H1 parece estar implicada en la activación y represión de la expresión génica. Se desconoce si las diferentes variantes de H1 tienen funciones específicas o regulan promotores específicos. Con el objetivo de investigar esta hipótesis se han generado líneas celulares que inhiben de forma inducible, mediante la tecnología de ARN interferente, la expresión de cada una de las variantes de forma específica. La inhibición de cada una de las variantes no es compensada por cambios en la expresión del resto de subtipos. Distintos grupos de genes resultan alterados con la depleción de cada una de las variantes de H1. La inhibición de H1.2 reprime la expresión de una serie de genes de ciclo celular, correlacionando con un fenotipo de arresto celular en fase G1 observado en esta línea. Además, la inhibición de H1.2 causa una disminución global del espaciamiento entre nucleosomas. Todos estos efectos parecen ser específicos para la falta de H1.2 ya que no son complementados por la sobreexpresión de otras variantes. Por otro lado, la inhibición de H1.4 causa muerte celular en T47D. Ésta es la primera vez que se describe que una variante de H1 es esencial para la supervivencia de una línea celular humana.En un segundo plano, se han construido líneas celulares con expresión de las variantes de H1 fusionadas al péptido HA, con el objetivo de estudiar la especificidad de su localización en promotores de interés para el grupo, así como interacciones específicas con otros factores celulares.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-07T15:34:43Z No. of bitstreams: 1 2017_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 2680968 bytes, checksum: 8580b3b573218ef34ac470e14ff48768 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-06-04T21:08:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 2680968 bytes, checksum: 8580b3b573218ef34ac470e14ff48768 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-04T21:08:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 2680968 bytes, checksum: 8580b3b573218ef34ac470e14ff48768 (MD5) Previous issue date: 2018-06-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O sucesso da clonagem por transferência nuclear (TN) está diretamente relacionado ao status epigenético da célula doadora de núcleo. Quanto menos diferenciada a célula, mais fácil é a reprogramação nuclear a um estado embrionário. Da mesma forma, o uso de drogas que atuem nos mecanismos de regulação epigenética, tal como a Tricostatina A (TSA), ajudam nessa reprogramação. O objetivo desse trabalho foi realizar a caracterização epigenética de três tipos de células doadoras de núcleo, sendo elas células-tronco mesenquimais (CTM) provenientes de duas fontes: fluido amniótico (CTM-FA) e tecido adiposo (CTM-TA), e fibroblastos (FIB) da orelha de bovinos; testar o efeito de sua utilização na TN com e sem a adição de TSA; verificar a expressão de genes ligados à epigenética: KAT2A, HDAC1 e HDAC3. Para isso, foram coletas CTM-FA por amniocentese in vivo de dois bovinos (BOV 1 e BOV 2) da raça Gir durante a gestação. Após o nascimento, foram realizadas biópsias de tecido adiposo e pele para isolamento de CTM-TA e FIB, respectivamente. As células foram cultivadas em incubadora a 38,5°C, 5% de CO2 e umidade elevada. Após isolamento, as células foram utilizadas para caracterização de sua origem mesenquimal por meio de marcadores de superfície celular verificados por citometria de fluxo e capacidade de diferenciação em adipócitos, condrócitos e osteócitos. O DNA genômico de todos os tipos celulares foi extraído pelo método de salting out e os status de metilação e hidroximetilação global do DNA foram determinados utilizando os kits MethylFlashTM Methylated DNA Quantification (Colorimetric) e MethylFlashTM Hydroxymethylated DNA Quantification (Colorimetric) (Epigentek), respectivamente. Para a clonagem, ovários foram coletados de abatedouros-frigoríficos para isolamento de ovócitos, que foram submetidos a 18 horas de maturação in vitro. Após a maturação os ovócitos foram enucleados e a célula doadora foi inserida no espaço perivitelínico. Para incorporação da célula ao citoplasma ovocitário, foi realizada a eletrofusão e então, os citoplastos foram submetidos ao cultivo com 50 nM de TSA por 20 h ou em meio sem a TSA. Após sete e oito dias de cultivo a taxa de produção de embriões foi calculada e comparada pelo teste de Tukey (p < 0,05). As culturas celulares das células provenientes do tecido adiposo e do fluido amniótico exibiram os marcadores típicos de CTM na maior porcentagem das células. Observaram-se resultados opostos entre os animais para a metilação do DNA, pois no animal BOV1, as CTM mostraram-se mais metiladas que os FIB, ao contrário do animal BOV2 onde FIB foram mais metilados que as células-tronco. Já o resultado de hidroximetilação seguiu o mesmo padrão para todas as células nos animais BOV1 e BOV2, respectivamente, sendo que CTM-FA foram as menos hidroximetiladas (0,008 e 0,002%), seguidas de FIB (0,013 e 0,009%) e CTM-TA (0,072 e 0,03%). Ao analisar as taxas de produção de embriões com sete dias de desenvolvimento, para o animal BOV1 nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os tratamentos. Já para o animal BOV2, as CTM-FA produziram 44,92 ± 8,88% de blastocistos clonados quando os embriões foram expostos a 20 h com a TSA. Esse resultado foi superior a todos os outros tratamentos sem a TSA e semelhante ao tratamento com CTM-TA também com uso da TSA (37,96 ± 15,80%). Os embriões produzidos a partir das CTM-FA do BOV2 expressaram menos HDAC3 quando foram tratados com TSA, além disso, quando não foi utilizada TSA no cultivo, os embriões reconstruídos com FIB apresentaram menor expressão, semelhante aos embriões reconstruídos com CTM-TA. Por fim, a expressão de KTA2A foi maior em embriões tratados com TSA por 20 h quando foram utilizadas CTM, independente da fonte, como doadoras de núcleo. Estes resultados demonstram que quando as CTM foram menos metiladas que FIB, sua associação com TSA foi efetiva em aumentar a produção dos embriões bovinos clonados, entretanto, em contraste, quando as CTM foram mais metiladas sua associação com TSA gerou embriões numa proporção estatisticamente semelhante àquela obtida com CTM na ausência de TSA. Ademais, o uso da TSA foi efetivo em reduzir a expressão da HDAC3 quando CTM-FA foram utilizadas. / The success of cloning by Nuclear Transfer (NT) is directly related to the epigenetic status of the nucleus donor cell. The less differentiated is the cell, the easier is nuclear reprogramming to an embryonic state. Likewise, the use of drugs acting on mechanisms of epigenetic regulation, such as Trichostatin A (TSA), would aid in reprogramming. The objective of this work was to perform the epigenetic characterization of three types of donor nucleus cells, being mesenchymal stem cells (MSC) from two sources: amniotic fluid (MSC-AF) and adipose tissue (MSC-AT), and fibroblasts (FIB) of bovine ear; test the effect of its use on NT with and without the addition of TSA; to verify the expression of genes linked to epigenetics: KAT2A, HDAC1 and HDAC3. For this, MSC-AF samples were collected by amniocentesis in vivo of two Gyr cows (BOV 1 and BOV 2) during gestation. After birth, adipose tissue and skin biopsies were collected for isolation of MSC-AT and FIB, respectively. Cells were grown in incubator at 38.5°C, 5% CO2 and elevated humidity. After isolation, the cells were used to characterize their mesenchymal origin by means of cell surface markers verified by flow cytometry and differentiation capacity in adipocytes, chondrocytes and osteocytes. The genomic DNA of all cell types was extracted by the salting out method and the methylation and hydroxymethylation status of the DNA were determined using the MethylFlash ™ Methylated DNA Quantification (Colorimetric) and MethylFlash ™ Hydroxymethylated DNA Quantification (Colorimetric) (Epigentek) kits, respectively. For cloning, ovaries were collected from slaughterhouses to isolate oocytes, which were submitted to 18 hours of in vitro maturation. After maturation, the oocytes were enucleated and the donor cell was inserted into the perivitelinic space. For incorporation of the cell into the oocyte cytoplasm, electrofusion was performed and then the cytoplasts were cultured with 50 nM TSA for 20 h or in medium without TSA. After seven and eight days of culture the rate of embryo production was calculated and compared by Tukey's test (p <0.05). Cellular cultures of cells from adipose tissue and amniotic fluid exhibited typical MSC markers in the highest percentage of cells. Opposite results were observed among the animals for DNA methylation, because in the BOV1, the MSC were more methylated than the FIB, unlike the BOV2 where FIB were more methylated than the MSC. The hydroxymethylation result followed the same pattern for all cells: MSC-AF were the least hydroxymethylated (0.008 and 0.002%), followed by FIB (0.013 and 0.009%) and MSC-AT (0.072 and 0.03%), respectively for BOV1 and BOV2. When analyzing the production rates of embryos with seven days of development, for the BOV1 no significant difference was found between the treatments. For the BOV2, the MSC-AF produced 44.92 ± 8.88% of cloned blastocysts when the embryos were exposed at 20 h with TSA. This result was superior to all other treatments without TSA and similar to treatment with MSC-AT also using TSA (37.96 ± 15.80%). Embryos produced from the BOV2 with MSC-AF expressed less HDAC3 when treated with TSA; in addition, when TSA was not used in the culture, the embryos reconstructed with FIB presented lower expression, similar to embryos reconstructed with MSC-AT. Finally, KTA2A expression was higher in TSA treated embryos for 20 h when MSC, regardless of source, were used as donor nuclei. These results demonstrate that when MSC was less methylated than FIB, its association with TSA was effective in increasing the production of cloned bovine embryos, however, in contrast, when MSC was more methylated its association with TSA generated embryos in a ratio statistically similar to that obtained with MSC in the absence of TSA. In addition, the use of TSA was effective in reducing the expression of HDAC3 when MSC-AF were used.

O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença altamente letal e agressiva. Alteração no perfil de acetilação das histonas envolvendo desacetilases de histonas (HDAC), assim como modificações da expressão de miRNAs podem levar ao desenvolvimento tumoral. Neste estudo, foi avaliada a expressão das HDAC1, HDAC2, HDAC3 e HDAC7 em ADP e amostras de tecido pancreático não tumoral (TN) usando análises experimentais e de banco de dados. Os níveis de expressão foram correlacionados com características clínico-patológicas dos pacientes e foi realizada uma investigação in silico de miRNAs reguladores de efeito das HDACs. Os níveis de expressão das HDACs foram avaliadas por qRT-PCR a partir de 25 amostras de ADP e 23 amostras de TN e a análise da expressão diferencial (ED) e correlação entre HDACs e miRNAs em ADP foi realizada utilizando perfis de expressão de seis microarranjos do Gene Expression Omnibus. Potenciais relações miRNA-HDACs foram coletadas em bases de dados de interação de miRNAs. Um valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Encontramos expressão reduzida em ADP comparado com TN para todas as HDACs analisadas, com P<0,05 para HDAC1, 2 e 3. Entretanto, os fold-changes foram muito baixos e provavelmente sem relevância biológica, e a expressão da HDAC2 e HDAC7 foi correlacionada com a idade ao diagnóstico. Nenhuma outra correlação entre a expressão das HDACs e características clínico-patológicas foi identificada. Análises de ED sugeriram significativa superexpressão das HDAC1, 2 e 7 e subexpressão da HDAC3, contudo todas apresentaram fold-changes pequenos. As análises dos bancos de dados identificaram 728 miRNAs como reguladores das HDACs. Interseções entre os conjuntos de miRNAs (GSE41369 e GSE43796) e aqueles recuperados da análise de expressão diferencial indicaram cinco miRNAs que influenciam a HDAC1 (miR-188-5p, miR-539, miR-708, miR -4269 e miR-3616-3p) e três que influenciam a HDAC2 (miR-4307, miR-944 e miR-195). A expressão das HDACs provavelmente não é um biomarcador de prognóstico robusto para o ADP, uma vez que a expressão diferencial entre os grupos é sutil. Ainda, este e estudos anteriores indicam nenhuma ou pouca associação entre a expressão HDACs e características clínico-patológicas relacionadas com o prognóstico. Finalmente, miRNAs provavelmente não estão exercendo um papel central na regulação da HDACs no ADP. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly lethal and aggressive disease. The disruption of histone acetylation through histones deacetylases (HDACs) and expression regulation by miRNAs can lead to tumor development. In this study we assessed HDAC1, HDAC2, HDAC3 and HDAC7 expression in PDAC and non-tumoral tissue (NT) samples using experimental and databases analysis, correlated their expression levels with clinical and pathological features in patients and performed in silico investigation of HDACs regulation by miRNAs. Expression levels of HDACs were measured by qRT-PCR from 25 PDAC and 23 NT. An analysis of differential expression (DE) and correlation of HDACs and miRNAs in PDAC was performed using six Gene Expression Omnibus microarray datasets. Potential miRNA-HDACs relationships were collected from miRNA interaction databases. A P<0.05 was considered statistically significant. We found reduced expression in PDAC compared with NT for HDAC1, HDAC2 and HDAC3, with P<0.05. Expression levels of HDAC7 did not significantly differ between groups. However, fold-changes were very small and probably not biologically relevant. Only HDAC2 and HDAC7 were associated with age at diagnosis and no other associations between HDAC expression and clinical features were identified. DE analysis suggested significant up-regulation of HDAC1, HDAC2 and HDAC7, and down-regulation of HDAC3, albeit all of them associated with small fold changes. Databases analysis identified 728 miRNAs that could be HDACs regulators. Intersections among the set of miRNAs found in differential expression analysis of GSE41369 and GSE43796 and those retrieved from target prediction identified five miRNAs targeting HDAC1 (miR-188-5p, miR-539, miR-708, miR-4269 and miR-3616-3p) and three targeting HDAC2 (miR-4307, miR-944 and miR-195). HDACs expression is likely not a robust prognostic biomarker in PDAC since differential expression between groups is subtle. Also, this and previous studies indicate no or only very few associations between HDACs expression and clinicopathological features related to prognosis. Finally, miRNAs are probably not exerting a central role in HDAC regulation in PDAC.

Para investigar los cambios de composición y estructura de la cromativa en las distintas fases de la espermatogénesis, se han puesto a punto para el testículo de gallo las técnicas de obtención de suspensiones celulares por disociación tríptica del tejido y separación de las células a gravedad unidad. Los resultados obtenidos indican que a medida que progresa la espermiogénesis se detectan cantidades crecientes de protamina y decrecientes de histonas. Coincidiendo con esta transición nucleohistona-nucleoprotamina, las histonas resultan hieracetiladas y se da un incremento en la biosíntesis y niveles de poliaminas. Experimentos "in vitro" indican que la protamina galina es capaz de desensamblar totalmente a las histonas de nucleosomas a una relación arg./ nucleótido dentro del rango fisiológico. A través de clonar y secuencias parte del gen de la protamina galina, se ha determinado la secuencia de la región 3' del gen y parte de la secuencia de la región C-terminal codificante. Existen 2 poblaciones de ARN mensajero codificante para la galina (460 y 480 bases aproximadamente) siendo la población de 460 bases mayoritaria en las espermátidas alargadas.