Listeria monocytogenes est l'un des meilleurs organismes modèles pour l'étude des interactions bactérie-hôte. Ce pathogène intracellulaire facultatif peut infecter, survivre et se répliquer dans le cytoplasme des cellules eucaryotes, démontrant la co-évolution étroite de Listeria avec son hôte. Le style de vie intracellulaire de ce pathogène implique la manipulation de divers composants de la cellule hôte, dont l'un est la chromatine. En induisant des modifications de la chromatine au niveau des histones, Listeria peut influencer le programme transcriptionnel de l'hôte. Ce projet de thèse porte sur une modification spécifique des histones, la désacétylation de la lysine 18 de l'histone H3, induite par la désacétylase de l'hôte Sirtuin 2 (SIRT2) lors de sa relocalisation du cytoplasme vers le noyau pendant l'infection. Le détournement de SIRT2 par Listeria fournit un système idéal pour étudier les mécanismes de la localisation subcellulaire de SIRT2, qui est mal comprise, et c'est le but de cette thèse. En utilisant la spectrométrie de masse, nous avons identifié une nouvelle modification posttraductionnelle de SIRT2, la phosphorylation de la sérine 25 (S25), ciblée spécifiquement par l'infection, et essentielle pour l'association de SIRT2 à la chromatine. Nous avons caractérisé le complexe moléculaire impliqué dans la déphosphorylation de SIRT2-S25 et nous montrons que cette modification est essentielle pour contrôler la fonction de SIRT2 en tant que répresseur transcriptionnel, et est nécessaire pour une infection efficace. Notre approche protéomique a aussi permis la caractérisation d'un interactome de SIRT2. De nombreuses protéines ont été identifiées et quelques-unes ont été confirmées et étudiées pour leur rôle dans le transport nucléo-cytoplasmique de SIRT2. De plus, une collaboration au laboratoire a mis au jour un mécanisme de subversion de la réponse aux dommages de l'ADN de l'hôte par Listeria. Dans son ensemble, ce travail a contribué à la compréhension de mécanismes originaux de l’interaction entre les bactéries et la chromatine et a révélé un processus cellulaire contrôlant la localisation subcellulaire et la fonction de la protéine de l’hôte SIRT2. / One of the best model organisms for the study of bacterial-host interactions is Listeria monocytogenes. This facultative intracellular pathogen can infect, survive, and replicate in the cytoplasm of eukaryotic cells, demonstrating the close co-evolution of Listeria with itshost. The intracellular life style of this pathogen involves manipulation of various host cellcomponents, one of which is chromatin. By inducing chromatin modifications at the level of histones, Listeria can influence the transcriptional program of the host. This thesis focuses on one specific histone modification, deacetylation of histone H3 of lysine 18, which is induced by the host deacetylase Sirtuin 2 (SIRT2) upon its relocalization from the cytoplasmto the nucleus during infection. Hijacking of SIRT2 by Listeria provides an ideal system tostudy the mechanisms of SIRT2 subcellular localization, which is poorly understood, and is the purpose of this thesis. By using mass spectrometry we have identified a novel posttranslational modification of SIRT2, Serine 25 (S25) phosphorylation, specifically targeted byinfection, and essential for SIRT2 chromatin association. We have characterized themolecular complex involved in dephosphorylating SIRT2-S25 and we show that this modification is essential for controlling SIRT2 function as a transcriptional repressor andnecessary for productive infection. Our proteomic approach further allowed the characterization of a SIRT2 interactome. Many proteins were identified and a few wereconfirmed and studied for their role in nucleo-cytoplasmic shuttling of SIRT2. In addition, a laboratory collaboration uncovered a mechanism for subversion of the host DNA DamageResponse by Listeria. As a whole, this work has contributed to the understanding of original mechanisms of chromatin-bacteria cross talk, and has revealed a cellular process controlling subcellular localization and function of the host protein SIRT2.

Includes bibliography / v, 147 leaves, [31] leaves of plates : ill ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Biochemistry, 1987

Bibliography: leaves 113-126. / v, 126, [113] leaves, [10] leaves of plates : ill. ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Studies the biological significance of the mouse Listone variant H2A.Z. Describes the isolation and characterisation of H2A.Z genomic clones from different mouse genomic libraries; H2A.Z gene targeting in mouse E14 embryonic stem cells; and an attempt to generatae ES cell lines and mice which lack the functional H2A.Z protein to investigate H2A.Z function in vitro and in vivo. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Biochemistry, 1995?

Au cours de la spermiogenèse, une réorganisation très importante de la chromatine se produit : la quasi-totalité des histones sont progressivement enlevées et remplacées par des protéines de transition puis par des protamines. Mon travail de thèse a alors consister à caractériser l'organisation finale de cette chromatine dans les spermatozoïdes ainsi que les mécanismes mis en jeu. Nos résultats montrent pour la première fois l'existence, dans les spermatides condensées de souris, de structures nucléoprotéiques contenant l'histone testiculaire TH2B ainsi que de nouveaux variants d'histones identifiés au laboratoire. De plus, ces structures organisent de manière préférentielle l'hétérochromatine péricentromérique de ces cellules. Cette réorganisation impliquerait la protéine chaperonne NAP1L4, qui pourrait être ciblée sur la chromatine en interagissant avec les queues N-terminales des histones H3. D'autres régions particulières du génome pourraient être la cible de la réorganisation différentielle de la chromatine par ces structures, permettant de les différencier du reste du génome et constituant ainsi le support d'une information épigénétique mâle transmise lors de la fécondation. L'analyse des protéines présentes dans les cellules germinales nous a également permis d'identifier deux autres protéines, HMGB4 et FYTTD1, qui ne semblent pas impliqués dans le processus de réorganisation de la chromatine dans les stades tardifs de la spermiogénèse. Néanmoins, le rôle potentiel de FYTTD1 dans le phénomène de maturation des ARN, ces derniers pouvant être un autre support de l'information épigénétique, pourrait s'avérer être un nouveau champ d'investigations très intéressant.

Le p300/CBP acétyltransférase est un co-activateur transcriptionnel très important qui est impliqué dans la régulation d'un grand nombre de processus biologiques, comme la transcription d'ADN, le développement et l'immunité innée. Jusqu'à présent, le rôle de p300/CBP dans la régulation de l'expression des gènes a été largement étudiée, mais les mécanismes qui régulent son activité enzymatique sont encore peu connus. Des études ont montré que le dysfonctionnement de p300/CBP est associé à plusieurs formes de cancer et de maladies neurodégénératives. Dés lors, chaque progrès concernant les mécanismes de régulation de p300/CBP est devenu primordial pour le développement de nouvelles thérapies. Le 'noyau' de p300/CBP contient deux domaines pour la reconnaissance des modifications post-traductionnelles (MPTs), un bromodomaine et un PHD finger (le module BP), adjacent à un domaine HAT (ou domaine histone acétyltransférase). Plusieurs enzymes, modifiant la chromatine, contiennent des domaines de reconnaissance des MPTs. Fréquemment des groupements particuliers de ces domaines sont très conservés et liés, au sein de la même protéine ou du même complexe protéique, suggérant qu'ils réalisent des fonctions coordonnées. Ces domaines adjacents peuvent agir en concertation dans la reconnaissance simultanée de différents MPTs ou peuvent exercer des fonctions différentes de celles qui sont effectuées par ces deux domaines particuliers, tels que les fonctions de régulation enzymatique. Plusieurs études suggèrent que les cycles acétylation/désacétylation dans la boucle d'auto-inhibition, à l'intérieur du domaine HAT, jouent un rôle important dans la régulation de l'activité enzymatique de p300/CBP. La proximité du module BP et du domaine HAT suggère que la spécificité de liaison, appartenant au module BP, peut être intrinsèquement liée à la régulation de l'activité du domaine HAT. L'objectif de ma thèse est de déterminer le rôle du module BP dans la régulation de l'activité du domaine HAT. Je propose que le module BP soit impliqué dans la régulation de p300/CBP de deux façons. La première consiste à établir un lien avec le domaine HAT qui stabilise la conformation auto-inhibée de l'enzyme. La deuxième exige que le module BP joue un rôle dans le choix des substrats de p300/CBP. J'ai été en mesure de montrer que BP peut se lier au domaine HAT et à la chromatine modifiée et qu'il peut reconnaître les modifications effectuées par p300/CBP lui-même. Les données obtenues indiquent que le module BP peut être impliqué dans la régulation de l'activité de p300/CBP et dans son ciblage à la chromatine.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2006. / Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

The aim of this study was to gain more information about the interactions between DNA and the histone octamer during the process of transcription. This work used a pUC8 plasmid derivative that contained the core promoter region of the RNA polymerase I of Acanthamoeba castellanii, placed upstream of four repeats of the 5S rDNA nucleosome positioning sequence from the sea urchin, Lytechinus variegatus. The plasmid was reconstituted into chromatin via addition of chicken erythrocyte histone octamers, using polyglutamic acid as a nucleosome assembly factor. The positioning of nucleosomes on the insert was monitored by restriction enzyme digestion. Proper nucleosome positioning was shown to be dependent on the presence of preassembled transcription complexes on the promoter region. The absence of preformed transcription complexes on the promoter region prior to nucleosome reconstitution perturbed the distribution of histone octamers on the repeats of the 5S rDNA. This "mispositioning" effect was related to the location of the RNA polymerase I promoter region upstream of the four repeats of the 5S rDNA fragment. Band shift assays in polyacrylamide gel electrophoresis were used to determine the relative efficiency of nucleosome formation on the promoter-containing fragment, on 5S rDNA and finally on nucleosome core particle DNA. The results indicate that the promoter fragment forms a nucleoprotein complex at lower concentration of histone than the 5S positioning sequence. This complex may not be a nucleosomal structure. The reconstituted plasmid was then used to investigate the transcriptional elongation by RNA polymerase I using the chromatin-like template containing positioned nucleosomes as compared to transcription on improperly positioned nucleosomes and on free DNA. The efficiency of transcription was related to the proper positioning of nucleosomes with regard to the tandemly repeated 208-bp 5S rDNA. The presence of phased nucleosomes in the path of the transcription complex seemed not to inhibit nor to significantly slow down the elongation as compared to free DNA. Furthermore, nucleosome positioning, as assayed by restriction endonuclease digestion, did not change after passage of the polymerase I transcription complex. / Graduation date: 1993

En aquest treball es caracteritzen les proteïnes espermàtiques bàsiques (PEB) que condensen el DNA de l'espermatozoide de diferents grups de deuteròstoms, tant procordats (tunicats o urocordats i cefalocordats) com vertebrats (agnats, peixos cartilaginosos i peixos ossis), fent especial èmfasi en el cas dels peixos ossis. L'objecte d'aquesta anàlisi ha estat l'intent d'obtenir més informació sobre l'evolució molecular de les PEB en els deuteròstoms, ja que no hi havia informació fins al moment referent als urocordats, cefalocordats i agnats.Concretament, dins dels tunicats s'han estudiat extensivament dues espècies del gènere Styela (classe Ascidiacea) així com 7 espècies més pertanyents també a aquesta classe i una pertanyent a la classe Thaliacea. Els resultats mostren que la PEB característica dels ascidiads és la proteïna que hem anomenat PI, apareixent en el gènere Styela una proteïna específica adicional P2. Aquestes proteïnes (PI, P2), malgrat ser totes dues altament bàsiques (50-70%), presenten característiques diferents tant en la mida, mobilitat electroforètica, composició i estructura. L'estudi de la PI à'Styela alicata mostra que es tracta d'una proteïna relacionada amb la histona HI o proteïnes afins; així presenta un nucli resistent a la tripsina la composició aminoacídica del qual és molt similar al d'aquesta família de proteïnes. Igualment, l'estudi de la seqüència parcial d'aquesta proteïna (extrem N-terminal, zona globular central i part de l'extrem C-terminal) mostra una estreta relació entre ambdós tipus de proteïnes. Una peculiaritat de la PI és el presentar un braç Nterminal extraordinàriament reduït, consistent només en dues arginines. Per la seva banda, la P2 es mostra com una molècula més especialitzada, de mida menor, menor diversitat aminoacídica i major basicitat (per un major acúmul d'Arg). La composició de la P2 recorda molt la de la PI, fet que fa pensar en un possible origen d'aquesta proteïna a partir de la PI.L'única espècie estudiada d'entre els cefalocordats, Branchiostoma floridae, mostra al nucli del seu espermatozoide una proteïna molt especialitzada que substitueix pràcticament la totalitat de les histones al llarg de l'espermiogènesi. Aquesta proteïna consta només de 6 tipus diferents d'aminoàcids destacant-ne els aminoàcids bàsics (24.7% de Lys, 25.3% d'Arg). Hem estudiat la seqüència aminoacídica parcial de l'extrem N-terminal d'aquesta proteïna descobrint la presència del motiu alternant Arg-Ser (que es troba també en altres PEB de grups no relacionats).Durant l'espermiogènesi de Petromyzon marinus (agnat cefalaspidomorf) les histones no es veuen substituïdes per cap altra proteïna específica de l'espermatozoide sinó que es mantenen com a úniques proteïnes responsables de la condensació de la cromatina del nucli espermàtic.Dins dels peixos cartilaginosos, hem estudiat les PEB d'Hydrolagus colliei (condricti de la línia dels holocèfals) i hem vist que malgrat el "model" de contingut de proteïnes espermàtiques bàsiques és el mateix (una proteïna no queratinosa més dues de queratinoses), les característiques de les molècules en sí difereixen substancialment. Així, l'estudi de la seqüència parcial de la proteïna no queratinosa R3 d'aquesta espècie mostra diferències importants respecte a la corresponent proteïna trobada als elasmobranquis i amb la protamina típica dels peixos ossis, amb qui sovint se l'ha relacionada.Entre els osteïctis hem estudiat les PEB de 32 espècies representants de 24 famílies corresponents a 9 ordres diferents de teleostis. Es disposa de la caracterització electroferètica de totes, l'anàlisi composicional de 16, i s'han estudiat les estructures primàries de dues espècies més. En aquest grup hem trobat una gran varietat de continguts de proteïnes espermàtiques bàsiques: a) protamines típiques; b) histones sense cap altra proteïna addicional; c) histones somàtiques amb un increment de l'Hi; d) histones amb proteïnes específiques addicionals; e) proteïnes específiques diferents de les protamines típiques (però que també substitueixen les histones). La distribució d'aquests diferents tipus de continguts no mostra una relació amb la classificació filogenètica de les espècies implicades (no obstant, el model de PEB presentat és consistent dins de cada família). Tenint en compte aquesta distribució, així com consideracions de tipus funcional, es discuteixen les posibles explicacions d'aquesta "esporadicitat" observada.Hem seqüenciat les PEB de dos peixos representants dels dos casos generals de substitució de les histones al nucli espermàtic que hem trobat. Així, hem seqüenciat completament la PEB de Dicentrarchus labrax (protamina típica) i parcialment la de Mullus surmuletus (proteïna específica de l'espermatozoide diferent de les protamines típiques). Aquesta última proteïna es mostra relacionada amb la família de les histones HI o afins. Així, consta d'uns extrems N i C-terminals enriquits en aminoàcids bàsics i una zona central resistent a la tripsina on s'acumulen els residus hidrofòbics. Tant l'anàlisi de la seva estructura primària parcial (extrem N-terminal, zona globular i part de l'extrem C-terminal) com de l'estructura secundària predida mostren una gran similitud amb les corresponents de les histones HI, especialment en la zona globular central, que és el domini més conservat en les His.Hem classificat les diferents PEB trobades als grups estudiats en dos tipus generals de molècules: a) proteïnes relacionades amb histones (generalment l'Hi); i b) proteïnes especialitzades. Les primeres correspondrien a molècules grans amb una zona més hidrofòbica resistent a la tripsinització, i un o dos extrems molt bàsics i no resistents (ex. PI dels ascidiacis, PEB del Mullus ï altres proteïnes específiques addicionals trobades en peixos ossis). Les molècules que anomenem especialitzades correspondrien a proteïnes menors i amb baixa proporció o sense aminoàcids hidrofòbics, sent l'Arg i la Lys els aminoàcids que constitueixen la major part de la molècula (ex. P2 d'Sty ela, P de l'amfiox, R3 d'H. colliei, protamines típiques dels peixos ossis).No sembla existir una relació d'homologia entre les proteïnes bàsiques del nucli de l'espermatozoide trobades en cada un dels grups de deuteròstoms estudiats sinó que més aviat es tracta de solucions a un mateix problema adoptades amb independència (encara que per camins similars en alguns casos).

Epstein-Barr Virus (EBV) has two states of infection, latent and lytic. During the latent state the viral genome remains stable in cells as episomes and replicates with cellular DNA. During the lytic cycle the viral DNA becomes amplified and packaged in newly formed virions. An unsolved problem is whether newly replicated EBV DNA produced upon lytic cycle activation is associated with histones, and if so, whether these histones are acetylated. This question has biological significance as knowing the chromatin structure of genes is important in determining their function and expression profile. Our hypothesis is that newly synthesized EBV lytic DNA is associated with histones and the histone tails are selectively acetylated. To investigate our hypothesis we performed chromatin immunoprecipitation (ChIP) in HH514-16 cells, a Burkitts Lymphoma cell line, during latent and lytic replication. We used quantitative PCR (qPCR) to detect the relative concentration of DNA among the different samples. We tested three different variables: type of inducing agent, duration of treatment, and different regulatory regions in the genome of Epstein-Barr Virus. We found that in cells induced into the lytic cycle with Trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor (HDACi), association of newly replicated EBV DNA with acetylated histone 3 (H3) increased ~ 6-10 fold. This increase in association was greatest 72 hrs after treatment. Furthermore, activation of lytic viral replication in HH514-16 cells using a different inducing agent, Azacytidine (AZC), which is known to function as a DNA methyltransferase inhibitor, increased binding of H3 with viral DNA ~8 fold. However, unlike TSA, AZC increased the acetylation state of histones bound to newly synthesized viral DNA only ~ 2 fold. Changing the regulatory region of the EBV genome analyzed in qPCR did not affect our results. Our results suggest that newly replicated viral DNA is associated with histones, a fraction of which are acetylated. The degree of acetylation likely depends on the agent used to induce the lytic cycle. H3 is highly acetylated when an HDACi is used and less acetylated when AZC is used. Our study provides new insight on the epigenetic profile of newly replicated viral DNA during the lytic cycle. It remains to be determined whether histones are packaged together with viral genomes into virions and whether the chromatin state of virion DNA affects gene expression after the virus enters uninfected cells.

Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, Department of Molecular Genetics and Cell Biology, 2001. / Includes bibliographical references. Also available on the Internet.