Le but de ce travail était d'identifier les fonctions régulées par quorum-sensing (QS) chez la bactérie phytostimulatrice Azospirillum. Les effets phytobénéfiques in vitro des souches B518 et TVV3 (isolées du riz) ne sont pas altérées par l'inactivation des molécules signal impliquées dans le QS. La combinaison d'une approche ciblée et d'une approche globale par protéomique montre que le QS régule des fonctions liées à l'adaptation à la plante, notamment à la colonisation racinaire chez B518. Chez TVV3, aucune fonction régulée par QS n'a pu être identifiée mais les gènes impliqués dans le QS sont localisés dans un environnement atypique, constitué de gènes prophagiques. La mise en évidence d'un prophage chez TVV3 a conduit à la caractérisation de phages tempérés chez dix autres souches et au séquençage du premier génome d'un bactériophage isolé d'Azospirillum. Ce travail montre que la régulation de type QS est souche spécifique et révèle la prévalence des phages chez Azospirillum.

Codakia orbicularis est un mollusque bivalve appartenant à la famille des Lucinidae et établissant des symbioses avec des bactéries sulfo-oxydantes (symbiotes) au sein de ses branchies. Dans l’hypothèse où toute symbiose nécessite une régulation par des molécules de dialogue, une étude chimique exhaustive pourrait aboutir à la mise en évidence des métabolites impliqués. Le travail de ce manuscrit porte donc sur l'isolement de métabolites secondaires à partir des branchies de ce bivalve et sur l'évaluation de l'activité antibactérienne des molécules isolées. Douze composés ont été isolés des branchies de Codakia orbicularis et leurs structures ont été déterminées par les méthodes spectroscopiques usuelles. Parmi ces molécules, une seule est nouvelle et a été nommée orbicularisine. Elle présente un squelette indolone spirotetracyclique inédit. Parmi les molécules isolées, seules quatre d’entre elles présentent une activité antibactérienne à savoir le soufre S8, la 4-hydroxybenzaldéhyde et deux monoglycérolipides. L'orbicularisine s'est révélée inactive contre un panel de lignées cellulaires cancéreuses et de kinases. Le nouveau squelette de l’orbicularisine pourrait permettre d'aboutir à une nouvelle famille de molécules par synthèse organique et ainsi accroître la diversité moléculaire autour de ce motif inédit. Il sera également intéressant de déterminer l'origine des molécules isolées et de connaître leur(s) implication(s) dans la régulation des symbiotes du bivalve. Les résultats chimiques obtenus sur C. orbicularis et sur les Lucinidae en général sont intéressants puisque les espèces côtières appartenant aux bivalves ont été peu exploitées en chimie jusqu’à ce jour. / Codakia orbicularis is a bivalve mollusc belonging to the family Lucinidae and establishing symbiosis with sulfooxidizing bacteria (symbionts) within its gills. In the hypothesis that any symbiosis requires a regulation by molecules of dialogue, an exhaustive chemical study could lead to the demonstration of the metabolites involved. The work of this manuscript focuses on the isolation of secondary metabolites from the gills of this bivalve and on the evaluation of the antibacterial activity of the isolated molecules. Twelve compounds were isolated from the gills of Codakia orbicularis and their structures were determined by the usual spectroscopic methods. Of these molecules, only one is new and has been named orbicularisin. It presents an indolone spirotetracyclic skeleton unpublished. Among the isolated molecules, only four of them have antibacterial activity, namely sulfur S8, 4-hydroxybenzaldehyde and two monoglycerolipids. Orbicularisin has been shown to be inactive against a panel of cancer cell lines and kinases. The new skeleton of orbicularisin could lead to a new family of molecules by organic synthesis and thus increase the molecular diversity around this original motif. It will also be interesting to determine the origin of the isolated molecules and know their involvement (s) in the regulation of the bivalve symbionts. The chemical results obtained on C. orbicularis and on Lucinidae in general are interesting because the coastal species belonging to bivalves have been little exploited in chemistry to date.

L'environnement marin est constitué d'écosystèmes nombreux et variés, qui sont habités par des organismes appartenant aux trois domaines du vivant dont celui des bactéries. La coopération bactérienne est basée sur un mécanisme moléculaire appelé quorum sensing (QS). Ce système est dépendant de la densité cellulaire de la communauté, ce qui permet aux bactéries de synchroniser leur expression génétique, pour coordonner certaines de leurs activités physiologiques. Les bactéries produisent plusieurs types de molécules signal dont les acyl-homosérines lactones (AHLs ou AI-1) et le furanosyl diester borate (AI-2). La majorité des recherches dans le domaine du QS s'est portée sur des modèles bactériens d'intérêt biomédical ou agronomique. Cependant, l'importance du QS chez les bactéries marines reste mal connu. Ce travail de thèse a pour question: Quelle est la prévalence des AI chez les bactéries marines ? Pour aborder cette problématique : trois axes : Le criblage de la collection de bactéries marines MOLA, qui est basé sur des techniques de chimie des substances naturelles, et a permis de mettre en exergue des souches bactériennes originales comme Maribius sp MOLA 401, qui produisent un très grand nombre d'AHLs avec de nouvelles structures. Le second axe s'appuie sur des méthodes de bio-informatique pour réaliser le criblage du métagénome marin du Global Ocean Sampling pour la recherche de gènes luxI, ainS, hdtS et luxS. L'ensemble de ces données sur la diversité, l'abondance et la répartition biogéographique des AI-1 dans l'écosystème marin suggère une forte importance des mécanismes du QS à l'¿uvre dans les communautés bactériennes marines naturelles. / The marine environment is composed of many and varied ecosystems, which are inhabited by organisms belonging to the three domains of life including the bacteria. Bacterial cooperation is based on a molecular mechanism called quorum sensing (QS). This system is dependent on the cell density of the community, which allows bacteria to synchronize their gene expression, to coordinate some of their physiological activities. Bacteria produce several types of signal molecules with acyl-homoserines lactones (AHLs or AI-1) and the furanosyl borate diester (AI-2). The majority of research in the field of QS has focused on bacterial models for biomedical and agricultural interest. However, the importance of QS in marine bacteria remains unclear. This work has the question: What is the prevalence of AI in marine bacteria? To address this problem two axes: Screening the collection of marine bacteria MOLA, which is based on chemistry techniques of natural substances, and allowed to highlight original bacterial strains as Maribius sp MOLA 401, which produce very large number of AHLs with new structures. The second axis is based on the methods of bioinformatics to perform screening of metagenome marine Global Ocean Sampling for research luxI, ainS, luxS and hdtS genes,. All these data on diversity, abundance and biogeographical distribution of AI-1 in the marine ecosystem suggests a strong importance of QS mechanisms at work in the natural marine bacterial communities.

Depuis quelques décennies, les bactéries pathogènes multi-résistantes aux antibiotiques sont de plus en plus répandues dans le monde. Cette situation a suscité le besoin et l'intérêt de trouver des médicaments antibactériens avec de nouvelles cibles potentiels. La découverte des systèmes de communication de type quorum sensing (QS) régulant la virulence bactérienne représente une des cibles privilégiées pour contrôler les bactéries pathogènes autrement qu’en interférant avec leur croissance bactérienne. Dans l’écosystème naturel, un grand nombre d'organismes (Eucaryotes et Procaryotes) co-existent en synthétisant chacun de leur côté des métabolites secondaires. Les plantes, étant en permanence en contact avec des bactéries, synthétisent des métabolites secondaires capables d’inhiber l’expression des gènes de virulence chez les bactéries sans pour autant affecter ni leur croissance ni leur viabilité. Notre objectif a été de contribuer à la valorisation de la biodiversité malgache en identifiant des plantes et en y isolant les composés actifs présentant une capacité à perturber le mécanisme de QS chez P. aeruginosa PAO1, une bactérie pathogène opportuniste de l’homme, des animaux et des plantes. Dans ce but, nous avons tout d’abord réalisé un criblage d’activité anti-QS de différents flavonoïdes commerciaux. De ce criblage, la narigenine et la naringine ont été sélectionnées pour être les molécules de contrôle positif et négatif des tests d’activité anti-QS, respectivement. Par la suite, 4 espèces de Dalbergia endémique de Madagascar ont fait l’objet de criblage pour leur activité anti-QS. Ce travail a fait ressortir l’activité anti-QS très intéressante de l’écorce de D. trichocarpa à partir de laquelle nous avons isolée le composé actif nommé la coumarate de l’aldéhyde-oléanolique (OALC). Le contrôle naringénine et l’OALC ne présente aucun effets inhibiteurs sur la croissance bactérienne de P. aeruginosa PAO1 et sur l’expression du gène QS-indépendant aceA suggérant une activité d’inhibition spécifiquement liée au QS. Cependant, ces deux molécules présentent des spectres d’inhibition différente. En effet, les deux molécules diffèrent dans le sens que la naringenine n’inhibe pas l’expression du gène gacA et la motilité de type twitching contrairement à l’OALC. Ces résultats suggèrent que l’OALC et la naringénine représente des candidats potentiels pour des investigations in vivo quant à leur effet anti-QS et anti-biofilm sur des modèles infectieux d’organismes supérieurs. Par ailleurs, ils démontrent la richesse des plantes malgaches comme sources de nouvelles molécules anti-virulence ainsi que l’importance de telle investigation afin de renforcer notre arsenal thérapeutique en composé antibactérienne dans la lutte continuelle contre les bactéries pathogènes/Since few decades, multidrug resistant bacteria spread all over the world. This situation gives rise to the need and interest in finding antibacterial drugs with novel potent target. Discovery of communication system termed Quorum Sensing (QS) which regulate bacterial virulence factor represent privileged target in another way than interfering with bacterial growth. In natural ecosystem, many organisms (Eukaryotes and Prokaryotes) produce secondary metabolites. As plants are permanently in contact with bacteria, they have synthetized secondary metabolites which inhibit bacterial virulence gene expression without affecting bacterial viability. Our goal was to contribute to the valorization of Malagasy biodiversity and specifically to identify plants and isolate bioactive compound presenting ability to disrupt QS mechanism in P. aeruginosa, opportunistic pathogen bacteria in plants, animals and human. In this purpose, screening of commercial available flavonoids has been firstly carried out. From this screening, naringenin and naringin have been selected to be used as positive and negative QS inhibitor controls, respectively. Subsequently, Four Malagasy endemic Dalbergia species have been screened for their anti-QS activity. This work pointed out the interesting anti-QS activity of D. trichocarpa bark extract which led to the isolation of oleanolic aldehyde coumarate (OALC) as one major bioactive compound. At the concentration tested, naringenin and OALC did not affect P. aeruginosa PAO1 viability and didn’t reduce QS-independent aceA gene expression suggesting a specific anti-QS activity. However, these two compounds present different inhibition spectrum. Indeed, naringenin didn’t inhibit gacA gene expression and twitching motility contrarily to OALC. These results suggest that OALC and naringenin represent potent candidates for in vivo investigations in their anti-QS and anti-biofilm activity onto eukaryotes infectious model. Besides, this finding demonstrated the potent source for novel anti-virulence compounds of Malagasy flora and the importance of this kind of research to strengthen our antimicrobial therapeutic arsenal with the ongoing struggle against bacterial infection. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Plants are continuously confronted with a multitude attack either abiotic but also biotic in nature. Interestingly, despite the abundance of bacteria that plant has to face, only few are able to induce death or disease in the host plant. It is therefore likely that, in addition to secondary metabolites with antimicrobial properties, plants also synthesize secondary metabolites which are able to inhibit the expression of virulence genes in bacteria without affecting either growth or viability, which allows plants to host willingly or not bacterial populations. This work focuses on the identification of such metabolites in Malagasy plants (genera Dalbergia and Combretum) and the demonstration of their inhibitory effect on the expression of virulence genes in two different pathosystems: Rhodococcus fascians (a phytopathogen) and Pseudomonas aeruginosa (an opportunistic pathogen). Thus, two metabolites were isolated using a combination of chromatographic techniques coupled with tests that evaluate the expression of certain genes involved in the virulence mechanisms of these bacteria. The first is a new prenylated isoflavanone, named perbergin, isolated from the bark extract of D. pervillei. It was shown that the perbergin target attR gene expression, encoding a LysR-type transcriptional regulator that plays a key role in regulating the expression of virulence genes of R. fascians and the transition from an epiphytic to a pathogenic lifestyle. Therefore, we have also shown that the expression of all virulence genes known to date in R. fascians is also affected while the expression of genes involved in epiphytic fitness of the bacteria is not altered. In addition, the application of perbergin at the time of infection of plants susceptible to R. fascians shows that this molecule reduces in vivo the virulence of R. fascians, highlighting the potential of perbergin as an anti-infective agent. The second is a flavonoid known as catechin, isolated from the bark extract of C. albiflorum. Catechin significantly inhibits the expression of genes that regulate the mechanism of quorum sensing in P. aeruginosa such as lasI, LasR, rhlI and rhlR but also lasB and rhlA which expression depends on quorum sensing. Therefore, the production of virulence factors such as pyocyanin and elastase is significantly affected. Because of the limited number of our arsenal of antibiotics and their increasing ineffectiveness, the identification of these compounds create a path to an alternative in the fight against pathogenic bacteria and multidrug resistance of pathogenic bacteria to antibiotics. Our results also demonstrate the richness of Malagasy plants as (re)sources of new therapeutic molecules and the importance of widening the range of bacterial targets to be investigated to develop new strategies to fight within the endless war that we are waging against bacteria pathogens.<p><p>Les plantes sont continuellement confrontées à une multitude d’attaques qu’elles soient de nature abiotique ou surtout biotique. Il est intéressant de noter que malgré la multitude de bactéries auxquelles les plantes doivent faire face, seules quelques unes sont capables d’induire la mort ou une maladie chez la plante hôte. Il est dès lors fort probable que, outre les métabolites secondaires ayant des propriétés antimicrobiennes, les plantes synthétisent également des métabolites secondaires capables d’inhiber l’expression des gènes de virulence chez les bactéries sans toutefois affecter ni leur croissance ni leur viabilité, ce qui permet aux plantes de contenir les populations bactériennes qu’elles hébergent de gré ou de force. Ce travail porte sur l’identification de ce type de métabolites dans des plantes malgaches (genres Dalbergia et Combretum) et la démonstration de leurs effets inhibiteurs sur l’expression de gènes de virulence chez deux pathosystèmes différents: Rhodococcus fascians (un phytopathogène) et Pseudomonas aeruginosa (un pathogène opportuniste). Ainsi, deux métabolites ont été isolés en utilisant une combinaison de techniques chromatographiques couplées avec des tests qui évaluent l’expression de certains gènes impliqués dans les mécanismes de virulence de ces bactéries. Le premier est un nouvel isoflavanone prénylé, nommé perbergine, isolé à partir de l’extrait d’écorces de D. pervillei. Il a été montré que la perbergine cible l’expression du gène attR, codant un régulateur transcriptionnel de type LysR qui joue un rôle clé dans la régulation de l’expression des gènes de virulence de R. fascians et qui assure la transition entre un mode de vie épiphyte et le mode pathogène. En conséquence, nous avons également montré que l’expression de l’ensemble des gènes de virulence connu à ce jour chez R. fascians est également affectée alors que l’expression de gènes impliqués dans l’aptitude épiphyte de la bactérie n’est pas altérée. Par ailleurs, l’application de perbergine au moment de l’infection de plantes sensibles à R. fascians montre que cette molécule atténue la virulence de R. fascians in vivo, mettant en exergue le potentiel de la perbergine comme agent anti-infectieux. Le deuxième est un flavonoïde, connu sous le nom de catéchine, isolé de l’extrait d’écorces de C. albiflorum. La catéchine inhibe significativement l’expression des gènes régulateurs du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa tels que lasI, lasR, rhlI et rhlR et également lasB et rhlA dont l’expression dépend du quorum sensing. En conséquence, la production des facteurs de virulence tels que la pyocyanine et l’élastase est significativement affectée. Compte tenu de l’appauvrissement de notre arsenal d’antibiotiques et de leur inefficacité croissante, l’identification de ces composés ouvre une voie alternative de lutte contre les bactéries pathogènes et la multirésistance des bactéries pathogènes aux antibiotiques. Nos résultats démontrent également la richesse des plantes malgaches comme (res)sources de nouvelles molécules thérapeutiques et l’importance d’élargir le champ des cibles bactériennes à investiguer pour développer de nouvelles stratégies de lutte dans la guerre sans fin que nous menons contre les bactéries pathogènes. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished