Les métalloprotéinases matricielles (MMPs) jouent un rôle crucial dans le développement malin des tumeurs. Elles dégradent la matrice extracellulaire (MEC) permettant ainsi la migration des cellules cancéreuses vers d'autres foyers distants, un processus d'invasion tumorale appelé métastase. L'expression de la MMP-9, aussi appelée gélatinase B, est fortement associée à ce processus et corrèle avec l'agressivité des cellules tumorales. Son expression peut être régulée à différents niveaux via des voies de signalisation intracellulaires, notamment au niveau de l'expression du gène, de sa transcription, de la stabilité de son ARNm, de la traduction ou de la sécrétion de la protéine. Le développement d'agents anti-tumoraux pouvant cibler différentes étapes de la progression du cancer est présentement en cours. Le PCK3145, un peptide synthétique, dérivé de la PSP94, dirigé contre le cancer de la prostate avancé et métastasé est au stade d'essais cliniques en phase II. Les études cliniques jumelées à plusieurs autres travaux effectués dans des modèles in vivo murins, démontrent que ce peptide réduit la croissance et la progression tumorale en diminuant les concentrations plasmatiques de MMP-9. De par leurs diverses fonctions anti-tumorales, les catéchines du thé vert sont aussi reconnues pour leur potentiel inhibiteur des MMPs. Nos travaux visent donc à élucider in vitro les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation des fonctions de la MMP-9 par les effets anti-métastatiques du PCK3145 et des catéchines du thé vert. Dans un premier temps, nous avons étudié les processus d'interaction en surface cellulaire du PCK3145. Nos résultats montrent que l'effet anti-métastatique d'inhibition de la sécrétion de la MMP-9 par le PCK3145 est médié par les récepteurs de la laminine, particulièrement le récepteur à la laminine de 67kDa (67LR) localisé à la membrane plasmique. En second lieu, nous approfondissons le mécanisme intracellulaire par lequel l'interaction du PCK3145 avec les récepteurs de la laminine en surface cellulaire module la sécrétion de la MMP-9. Nous démontrons que cette interaction active la voie des MAPK/ERK et mène à l'inhibition de la sécrétion de la MMP-9 via une diminution de l'expression de HuR, une protéine intracytoplasmique stabilisatrice de l'ARNm de la MMP-9 liant les séquences riches en adénosine et uridine. Finalement, nous montrons que le mécanisme d'action de l'inhibition de la sécrétion de MMP-9 par les catéchines du thé vert est étroitement lié à celui du PCK3145. Les propriétés anti-métastatiques du PCK3145 et des catéchines du thé vert peuvent être dirigées contre plusieurs types de tumeurs liés à l'augmentation de l'expression de la MMP-9 et de la dégradation de la MEC associés au processus métastatique. De plus, l'identification des récepteurs de la laminine, particulièrement le 67LR pouvant moduler ces effets, permet d'envisager de cibler des cancers où l'expression ou les taux élevés de ce type de récepteur sont associés. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cancer, métastase, angiogénèse, matrice extracellulaire, laminine, récepteur à la laminine de 67kDa, MMP-9, HuR, ERK, PCK3145, catéchines du thé vert.

Le développement de thérapies de maintien et l’identification de nouveaux facteurs pronostiques sont des avenues pertinentes pour améliorer le pronostic des femmes atteintes d’un carcinome de l’ovaire (CO). Dans cette thèse, une revue systématique de la littérature a montré que 1) le thé vert (TVr) et ses composantes actives, les catéchines, diminuent l’expression de protéines impliquées dans le CO 2) la consommation de TVr réduirait l’incidence du CO; 3) dans une étude épidémiologique, la consommation de TVr améliorait le pronostic des femmes atteintes de CO. Un essai clinique de phase II a été mené pour évaluer l’efficacité d’un breuvage enrichi en catéchines, le TVr infusé deux fois (DBGT), comme thérapie de maintien chez les femmes avec un carcinome séreux ou endométrioïde de stade avancé (clinicaltrials.gov, NCT00721890). Cet essai clinique n’a pas démontré que le DBGT était une intervention de maintien prometteuse. Les cibles potentielles du TVr incluent la protéase de la matrice extracellulaire membranaire MMP14. Des micropuces tissulaires ont été utilisées pour évaluer si l’expression immunohistochimique de la MMP14, mesurée en microscopie virtuelle et par analyse d’image automatisée, pouvait prédire le décès et la progression chez les femmes atteintes de CO. Des niveaux élevés de MMP14 étaient associés avec des facteurs de bon pronostic et l’expression de la MMP14 était inversement associée à la progression chez les femmes avec un CO séreux (rapport de risque (HR) : 0,48; intervalle de confiance (IC) à 95% : 0,24-0,99). Un profil protéolytique associé au pronostic des femmes atteintes d’un CO (incluant les gènes des MMP9, ADAM10 et HE4) a été identifié par une micropuce d’oligonucléotides dédiée aux protéases. Dans une étude de cohorte menée pour valider l’effet de la protéine HE4 sur le pronostic des femmes atteintes de CO, les niveaux plasmatiques préopératoires élevés de HE4 étaient associés aux facteurs pronostiques standards d’agressivité du CO et prédisaient le décès (HR : 1,67; IC à 95% : 1,08-2,59). En conclusion, pour les femmes atteintes d’un CO, le DBGT ne semble pas une intervention de maintien prometteuse et les niveaux des MMP14 et HE4 ont été respectivement associés à la progression et au décès. / Developing maintenance therapies and identifying new prognostic factors are pertinent to the improvement of the poor prognostic of women diagnosed with ovarian carcinoma (OC). In this thesis, the effects of green tea on OC have been examined in a systematic review of the literature: Green tea and its active components, the catechins, decrease the expression of several proteins involved in OC; Green tea intake has been associated with a decrease in the incidence of OC and, in one epidemiologic study, has been suggested to improve of the prognosis of women with OC. A phase II study was conducted to assess the effectiveness of a catechin-enriched tea, the double-brewed green tea (DBGT), as a maintenance treatment in women with advanced stage serous or endometrioid ovarian cancer (clinicaltrials.gov, NCT00721890). In this clinical trial, DBGT supplementation does not appear to be a promising intervention. The membrane type 1-matrix metalloproteinase MMP14 is a potential target of green tea in OC. Tissue microarrays have been used to evaluate if the immunohistochemical expression of MMP14, as assessed by virtual microscopy and by digital image analysis, could predict survival and progression in women with OC. Higher levels of MMP14 expression, as evaluated by both assessment methods, were associated with favourable standard prognostic factors of OC, and MMP14 expression was inversely associated with progression in women with serous OC (hazard ratio (HR): 0.48; 95% confidence interval (CI): 0.24-0.99). Comparing tumors from women with late recurrence to tumors from women with early recurrence, a proteolytic profile associated to the prognosis of women with OC (including genes encoding for MMP9, ADAM10 and HE4) has been identified using a protease-dedicated oligonucleotide microarray. In a cohort study conducted to confirm the effect of the protein HE4 on the prognosis of women with OC, high preoperative plasmatic levels of HE4 were associated with standard prognostic factors of OC aggressiveness and were independent predictors of death (HR: 1.67; 95% CI: 1.08-2.59). In conclusion, in women with OC, DBGT supplementation does not appear to be a promising maintenance intervention and the expression levels of MMP14 and HE4 have been associated to progression and death, respectively.

L’exposition à l’oxygène durant la croissance de bactéries probiotiques sensibles à ce composé et les conditions rencontrées au cours de la digestion d’aliments ou de suppléments contenant ces bactéries peut causer une diminution importante de leur viabilité. Le but du présent projet était d’étudier les effets de catéchines et d’un extrait de thé vert (ETV) riche en catéchines sur la croissance de microorganismes sensibles à l’oxygène et d’une co-encapsulation bactéries-ETV sur leur survie lors d’une exposition à des conditions gastrointestinales simulées. Il ressort des résultats obtenus que les catéchines n’ont pas eu d’effet significatif sur la croissance des souches étudiées mais que l’ETV a grandement stimulé, en présence d’oxygène, la croissance de la souche Lactobacillus helveticus R0052. De plus, des populations équivalentes de cette souche ont été obtenues, en présence ou absence d’oxygène, lors de fermentations dans un milieu de culture enrichi de 2000 µg/mL d’ETV. Une réduction du potentiel d’oxydo-réduction du milieu par addition d’ETV expliquerait en partie la stimulation de la croissance en présence d’oxygène observée. Des analyses spectroscopiques et par chromatographie en phase gazeuse ont aussi montré une augmentation de l’ordre lipidique et un changement important de la composition en acides gras des lipides de cellules exposées à 2000 µg/mL d’ETV en comparaison avec ceux de cellules ayant eu une croissance dans un milieu non enrichi. Ces effets combinés de l’ETV sur le milieu de culture et directement sur les lipides bactériens auraient limité les effets de l’oxygène sur cette souche. De plus, la microencapsulation de la souche L. helveticus et de 1000 µg/mL d’ETV dans des microparticules de pectine enrobées de protéines de lactosérum a permis une amélioration notable de la survie bactérienne dans des conditions gastrointestinales simulées en comparaison avec des cellules libres. Les microparticules créées ont donc protégé de façon efficace les bactéries sensibles à l’oxygène étudiées et pourraient permettre une livraison combinée de bactéries et d’ETV à la partie inférieure du tractus gastrointestinal. / Oxygen exposure during the growth of oxygen-sensitive probiotic bacteria and the conditions encountered during their passage through the upper part of the gastrointestinal tract can have an important impact on their viability. The aim of this project was to study the effects of catechins and of a green tea extract (GTE) rich in catechins on the growth, in the presence of oxygen, of oxygen-sensitive probiotic bacteria and of a co-encapsulation bacteria-GTE on their survival under simulated gastrointestinal conditions. Results showed that medium enrichment with catechins did not have a significant effect on growth of the strains tested but that GTE stimulated the growth, under aerobic conditions, of Lactobacillus helveticus R0052. Moreover, similar populations of this strain were obtained, in the presence and absence of oxygen when the culture medium was enriched with 2000 µg/mL GTE. The growth-promoting effect of GTE in the presence of oxygen could be due, in part, to the reduction of the initial oxido-reduction (redox) potential of the medium following GTE addition. Spectroscopic and gas chromatography analyses also showed changes in the order and in fatty acid composition of lipids of cells exposed to 2000 µg/mL GTE in comparison with those of cells grown in unsupplemented culture medium. The combined effects of GTE components on the growth medium and on bacterial lipids seemed to have limited the effect of oxygen during growth of the Lactobacillus cells in media supplemented with 2000 µg/mL GTE. Moreover, the co-encapsulation of L. helveticus cells with 1000 µg/mL GTE in whey protein-coated pectin microparticles significantly increased the cell survival rates in comparison with free cells when exposed to the conditions encountered in the gastrointestinal tract. Whey-protein coated pectin microparticles could be an interesting system for the combined delivery of viable probiotic cells and of GTE to the lower part of the gastrointestinal tract.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie récessive causée par l'absence d'une protéine, la dystrophine. Notre laboratoire travaille sur un traitement potentiel qui consiste à remplacer la protéine manquante en transplantant des myoblastes normaux ou génétiquement modifiés dans le muscle du patient atteint. Par contre, cette technique comporte des limitations; la mort cellulaire précoce, la faible dispersion ainsi que le rejet immunitaire nuisent à son succès. Ce projet de maîtrise vise à améliorer la greffe de myoblastes grâce à l'utilisation de l'epigallocatechin-gallate (EGCG), une composante majeure du thé vert. Récemment, il a été rapporté que l'inhibition de RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-products) mène à une augmentation de la prolifération et de la migration et à une diminution de la différenciation et de la mort par apoptose des myoblastes [3]. L'EGCG, reconnu pour ces propriétés anti-oxydantes, pourrait en plus d'aider à réduire le stress oxydatif et l'inflammation causés lors de la transplantation, permettre une amélioration de la survie des myoblastes transplantés puisqu'elle pourrait avoir un effet sur l'expression du récepteur RAGE [4]. Nous nous sommes donc intéressés à l'effet de l'EGCG sur RAGE dans le contexte de la greffe de myoblastes. Notre hypothèse est donc que l'EGCG pourrait inhiber transitoirement l'expression de RAGE et augmenter la prolifération et la migration et diminuer la fusion et la mort par apoptose des myoblastes transplantés pour ainsi améliorer le succès de greffe. Nous avons confirmé que l'EGCG pouvait diminuer le niveau d'expression de RAGE dans les myoblastes et dans les muscles de souris. Nous avons obtenu une augmentation de la survie des myoblastes lorsque confrontés à un stress tel que la glucose oxydase. Nous avons aussi remarqué une diminution de la fusion des myoblastes in vitro mais malheureusement, nous ne pouvons confirmer l'augmentation du succès de greffe. Un test de migration pourrait être effectué pour vérifier l'effet de l'EGCG sur la migration des myoblastes ainsi qu'une autre expérience pour confirmer le succès de greffe.

L’identification de marqueurs susceptibles de mettre en évidence et quantifier l’altération du bois par différents agents de dégradation peut présenter un grand intérêt dans la mise au point de méthodes de contrôle du matériau. Dans la première partie de ce travail, la caractérisation et le dosage des composés extractibles de deux essences non durables, le hêtre et le chêne soyeux, exposées à différents champignons de pourritures blanches ou brunes préalablement traitées ou non avec du propiconazole a été effectué. L’évolution de la quantité et de la nature des extractibles dépend directement de la présence du biocide et permet de différencier clairement les éprouvettes en fonction du taux de dégradation de ces dernières. C’est le cas notamment de la catéchine présente dans les extraits de hêtre, qui disparaît rapidement lorsque le bois est exposé à un agent de pourriture et qui peut à ce titre constituer un marqueur de l’attaque du bois. Dans la seconde partie de ce travail, l’évolution de la composition chimique du bois traité par pyrolyse douce à 240°C sous azote a été étudiée. Bien que les résultats obtenus confirment en grande partie ceux décrits précédemment dans la littérature, le dosage des différentes fractions du bois (lignine et holocellulose) et l’analyse des monosaccharides constitutifs de la fraction holocellulose du bois ont permis de mettre en évidence un important phénomène de carbonisation rapporté jusqu’à présent pour des températures plus élevées. Ce phénomène confirmé par RMN13C peut être à l’origine de certaines des nouvelles propriétés du matériau. / The identification of markers able to highlight and quantify wood deterioration by different degradation agents can be of great interest in the development of material control methods. In the first part of this work, the characterization and the quantification of the two non durable wood species extractives, beech and silky oak, treated or not with propiconazole and exposed to various white rot or brown rot fungi were carried out. The evolution of the quantity and the nature of extractives depend directly on the presence of biocide and allowed to clearly differentiate degraded and non-degraded samples. This is particularly true in the case of catechin identified in the extracts of beech, which is rapidly degraded by rotting fungi constituting therefore a valuable marker of wood degradation. In the second part of this work, the evolution of the chemical composition of wood treated by mild pyrolysis at 240°C under nitrogen was investigated. Although the results mainly confirm those described previously in the literature, isolation of lignin and holocellulose fractions and analysis of monosaccharides constitutive of holocellulose fraction highlighted an important carbonization of wood reported up to now for higher temperatures. This phenomenon is confirmed by 13C NMR and could be at the origin of some of the new properties of the material.

La première étape de ce travail visait à caractériser l’impact du calcium sur les interactions entre la β-lactoglobuline (β-lg) et l’epigallocatéchine-3-gallate (EGCG). Il a été démontré que le calcium avait un impact important sur la taille des agrégats formés et leur potentiel-zêta (ζ). De plus, l’analyse de la composition de ces complexes a démontré un impact important du calcium sur la rétention d’EGCG par ces particules. Différents types d’interactions entre la protéine, la catéchine et le calcium (par exemple. électrostatiques, hydrophobes et hydrogènes) sont suggérés comme étant responsables des caractéristiques observées. La deuxième étape visait à déterminer l’impact de différentes concentrations de calcium sur les interactions entre la β-lg et l’EGCG. Cette deuxième étape a permis de démontrer que l’effet du calcium sur l’augmentation de la taille de particule ainsi que sur le changement de potentiel-ζ était seulement possible en présence d’EGCG. Cet effet serait principalement dû à la formation de ponts calciques (EGCG/calcium/EGCG) pouvant créer un réseau responsable de l’augmentation de la taille des particules. La troisième et dernière étape de ce travail visait à déterminer si les complexes formés par la β-lg, l’EGCG et le calcium pouvaient améliorer la réponse glycémique chez des souris C57BL/6 soumis à un test oral de tolérance au glucose. Il a pu être démontré que la β-lactoglobuline seule avait un effet bénéfique sur la glycémie postprandiale. L’ensemble de ces résultats démontre que la présence du calcium a un effet important sur les interactions entre la protéine laitière et la catéchine du thé vert et sur la taille des agrégats résultants. Par ailleurs, la protéine seule semblait avoir le plus grand effet sur la réponse métabolique indiquant que des interactions avec l’EGCG et le calcium n’avaient que peu d’effet sur l’activité métabolique de la β-lg. / The first step of this work aimed to determine the impact of calcium on the interactions between β-lactoglobulin (β-lg) and epigallocatechin-3-gallate (EGCG) and it was shown that calcium had an important impact on particle size and zeta(ζ)-potential values. Moreover, the analysis of the formed complexes’ composition revealed that the presence of calcium could greatly influence the quantity of EGCG retained by the complexes. Various interactions between the protein, the catechin and calcium (eg. electrostatic, hydrophobic, and hydrogen) are suggested as being responsible for the characteristics of the complexes observed. The second step aimed to determine the impact of various calcium concentrations on the interactions between β-lg and EGCG. This second step allowed us to demonstrate that the impact of calcium on particle size and ζ-potential was only possible when in the presence of EGCG. This effect would primarily be due to the formation of calcium bridging capable of creating a large network responsible for the increased particle size. The third and last step of this work aimed to determine if the formed complexes between β-lg, EGCG and calcium reduce the glycemic response of C57BL6 mice. It was demonstrated that β-lg alone had a beneficial effect on postprandial glycaemia. Together, these results demonstrate that the presence of calcium has an important effect on the interactions between the milk protein and green tea catechins. However, these interactions do not appear to modulate the metabolic response associated with the consumption of β-lg.

L’hépatite C est une maladie affectant aujourd’hui 170 millions d’individus dans le monde. Cette maladie est causée par le virus de l'hépatite C (VHC). Les nouveaux traitements récemment mis sur le marché, visant à soigner l’hépatite C, sont très onéreux et donc inaccessibles pour les pays du Sud. De plus, l’utilisation de ces nouvelles molécules engendre l’apparition de mutation de résistance virale responsable de l’échec des traitements pour 5 à 10% des patients. La découverte de nouveaux antiviraux est donc toujours indispensable. Les plantes utilisées en médecine traditionnelle depuis des siècles sont une source de composés bio-actifs très intéressante. L’utilisation de ces plantes ou de composés naturels en complément des molécules utilisées en thérapie classique, permettrait de réduire significativement le coût de ces traitements et de les rendre accessibles à davantage de patients.L’epigallocatéchine-3-gallate (EGCG) et la delphinidine sont des molécules naturelles issues respectivement du thé vert et des fruits rouges. Ces deux molécules inhibent l’étape d’entrée du VHC dans les cellules hépatocytaires. Nous avons montré que l'EGCG et la delphinidine inhibent cette étape virale dans les hépatocytes en déformant les particules et bloquant ainsi leur attachement à la surface cellulaire. Nous nous sommes ensuite intéressés au processus engendrant cette déformation qui est probablement lié à l’agrégation des glycoprotéines d’enveloppe virale.Nous avons procédé au criblage d’extraits bruts de plantes extrêmophiles tunisiennes et mis en évidence que l’extrait brut de rhizome de Juncus maritimus inhibait l’étape de réplication du VHC. Le J. maritimus est une plante fortement présente dans les sols arides en Tunisie mais également sur les côtes françaises. En collaboration avec le laboratoire de Pharmacognosie de Lille et grâce à un fractionnement bioguidé, le principe actif a pu être isolé. Il s’agit du déhydrojuncusol qui inhibe la réplication virale avec une concentration effective médiane de 1,31 µM. De plus, nous avons montré que le déhydrojuncusol pouvait inhiber la réplication de virus présentant des mutations de résistance aux traitements actuels ciblant la protéine virale NS5A. Nous avons cherché à identifier la cible virale du déhydrojuncusol et il semblerait que ce soit également la protéine NS5A.Les résultats obtenus dans cette thèse confortent l’hypothèse que des molécules naturelles pourraient être utilisées dans le traitement de l’hépatite C. / Hepatitis C is a liver disease affecting 170 million people worldwide. This disease is caused by hepatitis C virus (HCV). New treatments, recently marketed, against HCV are very expensive and not really accessible for most-infected patients especially in low-income countries. Moreover, the use of these new molecules generates the emergence of HCV resistant variants responsible for treatment failure for 5 to 10% of the patients. Therefore, the discovery of new antiviral molecules is always needed. Since centuries, plants are used in traditional medicine. They are a very attractive source of bio-active compounds. Plant extracts or natural molecules used in combination with actual therapy, could significantly reduce the cost of these new treatments and render them accessible to more patients.Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) and delphinidin are natural molecules derived respectively from green tea and red berries. These two molecules inhibit HCV entry into hepatocyte cells. We have shown that this inhibition is due to a deformation of viral particles by the molecules inducing a blockade of virus attachment to the cell surface. We further investigated the process leading to this deformation, and conclude that it might be related to aggregation of viral envelope glycoproteins.We screened extracts of extremophile plants from Tunisia and showed that the crude extract of Juncus maritimus rhizome inhibited HCV replication step. J. maritimus is a plant present in arid soils in Tunisia but also in French coasts. In collaboration with the Pharmacognosy laboratory of Lille and thanks to a bioguided fractionation, the active compound present in this plant could be isolated. It was identified as dehydrojuncusol, which inhibits viral replication with a half maximal effective concentration of 1.31 μM. We have also shown that dehydrojuncusol is able to inhibit replication of viruses with resistance mutations to current treatments targeting the viral protein NS5A. We have also tried to identify the viral target of dehydrojuncusol, and it seems that the target might also be the NS5A protein.The results obtained in this thesis confirm the hypothesis that natural molecules could be used in the treatment of hepatitis C.

Les extrémités des chromosomes eucaryotes ressemblent à une cassure double brin et, en tant que telles, peuvent conduire à l'activation indésirable de la réponse aux dommages de l'ADN. Les télomères sont une structure ribonucléoprotéique qui coiffe les extrémités des chromosomes et les protège contre l'activation indésirable de la réparation des dommages à l'ADN. Après chaque division cellulaire, on observe un raccourcissement progressif des télomères, ce qui limite leur potentiel prolifératif. Une enzyme spécialisée, la télomérase, reconstitue les télomères pour contrebalancer leur érosion. La télomérase est régulée à la baisse dans la plupart des cellules somatiques. Cependant, l'activité de la télomérase est détectée dans la plupart des cellules souches adultes, bien qu'à de faibles niveaux. Le déficit en télomérase a été associé à un groupe de "troubles de la biologie des télomères" (ou téloméropathies), englobant des maladies de vieillissement prématuré, des syndromes d'insuffisance de la moelle osseuse, des fibroses pulmonaires et des maladies du foie. À l'inverse, dans le cancer, environ 85 % des types de tumeurs sont positifs à la télomérase. Par conséquent, l'inhibition de la télomérase est depuis longtemps considérée comme une cible attrayante pour le traitement du cancer. Dans la présente étude, nous avons cherché à découvrir les facteurs qui affectent la fonction de la télomérase humaine et d'autres protéines associées aux télomères ou à la télomérase. Tout d'abord, nous nous sommes concentrés sur l'identification de nouveaux inhibiteurs de la télomérase à partir de composés naturels. Une nouvelle catéchine a été identifiée dans les extraits végétaux de Burkea africana. Les catéchines sont une classe de molécules que l'on trouve couramment dans le thé vert. La catéchine isolée a inhibé la télomérase humaine recombinante in vitro avec un IC50 de 16,19 μM. Dans un deuxième chapitre, nous avons utilisé un criblage d'édition de bases CRISPR dans une lignée cellulaire humaine pour étudier des mutations cliniquement pertinentes dans 22 gènes importants pour l'homéostasie des télomères. Nous avons identifié des variantes qui affectent négativement l'aptitude cellulaire, y compris certaines variantes précédemment annotées comme variantes de signification incertaine. Nous avons également détecté pour la première fois des variantes hTERT qui confèrent une résistance à la petite molécule BIBR1532, un inhibiteur de la télomérase. Nous avons montré que ces allèles résistants aux médicaments permettent l'immortalisation cellulaire et ont un potentiel tumorigène accru. L'ensemble de ces études souligne l'importance de la télomérase humaine pour le maintien des télomères et la santé cellulaire, contribuant ainsi à une meilleure compréhension du rôle de la télomérase dans le cancer et les troubles de la biologie des télomères. / The extremities of eukaryotic chromosomes resemble a double-stranded break and, as such, can lead to the unwanted activation of the DNA damage response. Telomeres are a ribonucleoprotein structure that caps the ends of the chromosomes and protects them from the unwanted activation of DNA damage recognition and repair processes. After each cellular division, progressive telomere shortening is observed, limiting cellular proliferative potential. A specialized enzyme called telomerase replenishes telomeres to counterbalance telomere erosion. Telomerase is downregulated in most somatic cells. However, telomerase activity is detected in most adult stem cells, although at low levels. Telomerase deficiency has been linked to a group of “Telomere Biology Disorders” (or telomeropathies), encompassing premature aging diseases, bone marrow failure syndromes, pulmonary fibrosis and liver diseases. Conversely, in cancer, around 85% of tumour types are telomerase-positive. Therefore, telomerase inhibition has long been considered an attractive target for cancer therapy. In the present study, we aimed to uncover factors that affect the function of human telomerase and other telomere or telomerase-associated proteins. Firstly, we focused on identifying new telomerase inhibitors from natural compounds. A new catechin was identified in the plant extracts from Burkea africana. Catechins are a class of molecules commonly found in green tea. The isolated catechin inhibited recombinant human telomerase in vitro with an IC50 of 16.19 μM. In the second chapter, we employed a CRISPR base editing screen in a human cell line to investigate clinically-relevant mutations in 22 genes important for telomere homeostasis. We identified variants that negatively affected cell fitness, including some variants previously annotated as variants of uncertain significance. Also, we uncovered hTERT variants that confer resistance to the small molecule BIBR1532, a telomerase inhibitor. We showed that these drug-resistant alleles permit cellular immortalization and exhibit tumorigenic potential at levels comparable to wild-type telomerase. Combined, these studies highlight the importance of human telomerase for telomere maintenance and cell fitness, thereby furthering our understanding of the role of telomerase in cancer and telomere biology disorders.

La dysfonction endothéliale vasculaire constitue un marqueur précoce des maladies cardiovasculaires car l’endothélium est l’une des premières cibles des facteurs de risque cardiovasculaire. La présence d'un stress chronique engendré par les facteurs de risque cardiovasculaire sollicite les mécanismes de défense endogènes, tels que les enzymes antioxydantes, qui servent au maintien de la fonction endothéliale. L’environnement vasculaire auquel l’endothélium est exposé a un effet direct sur son fonctionnement à long terme. Certaines habitudes de vie sont ainsi associées à une bonne santé cardiovasculaire. Par exemple, la diète méditerranéenne et/ou la pratique régulière de l’exercice physique aident à maintenir une fonction endothéliale adéquate et à réduire l’incidence des maladies cardiovasculaires. D'autre part, certains gènes clés, comme le gène suppresseur de tumeurs p53, régulent plusieurs voies métaboliques importantes pour préserver l’intégrité des cellules endothéliales. Nous posons l’hypothèse que l’environnement vasculaire post-natal influence la mise en place de mécanismes de défenses endogènes tels que les enzymes antioxydantes afin de faire face à des stress plus tard dans la vie. Notre objectif global était d’évaluer les impacts d’interventions post-natales bénéfiques et d’une diminution endogène du gène suppresseur de tumeurs p53, sur la fonction endothéliale vasculaire et sur sa capacité à faire face à un stress métabolique. Dans une première étude, nous avons soumis des souris saines C57Bl/6 dès leur sevrage et jusqu’à l’âge de 9 mois, à un programme d’exercice physique volontaire (course dans une roue) ou à un antioxydant (catéchine), comparé à un groupe de souris sédentaires et sans antioxydant. Puis les interventions ont été stoppées et une diète riche en gras a été introduite, ou non, pour une période de 3 mois; les souris ont été sacrifiées à l'âge de 9 ou 12 mois. Nous avons observé que l’exercice a protégé les cellules endothéliales des effets délétères induits par la diète riche en gras en préservant la fonction endothéliale par le maintien d’un profil rédox sain et en évitant la hausse de l’inflammation. La catéchine a maintenu la fonction endothéliale aortique, mais n’a pas prévenu le profil inflammatoire en présence de la diète riche en gras. Finalement, chez les souris sédentaires, la fonction endothéliale a été détériorée en présence de la diète riche en gras, sans indice d’inflammation vasculaire. Dans une seconde étude, des souris partiellement déficientes en p53 (p53+/-) et contrôles C57Bl/6 ont été exposées à la même diète riche en gras à partir de 3 mois et ce jusqu’à l’âge de 6 mois. Notre raisonnement était basé sur la démonstration que p53 est un régulateur de l’expression des enzymes antioxydantes in vitro. Chez les souris p53+/-, les cellules endothéliales ont été protégées du stress induit par l’hypercholestérolémie engendrée par la diète riche en gras. Cependant, chez les souris p53+/- cette protection pourrait être secondaire à un métabolisme accru des acides biliaires, qui en prévenant la hausse de cholestérol, protègerait indirectement l'endothélium. Nous avons donc pu démontrer l’importance de l’environnement vasculaire sur la fonction endothéliale. La diète riche en gras a stimulé certains mécanismes de défense vasculaires tels que la voie des EDHF et la superoxyde dismutase afin de maintenir la fonction endothéliale malgré les conditions pro-athérosclérotiques. Nous avons observé que l’exercice et la catéchine influencent différemment l’endothélium malgré leurs capacités antioxydantes. Ces études soulignent la sensibilité de l’endothélium aux changements dans l’environnement vasculaire. En accord avec le vieillissement de la population et la progression des maladies cardiovasculaires, la proportion de personnes ayant une dysfonction endothéliale augmente. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes ou d’interventions qui permettent le maintien de la fonction endothéliale à long terme s’avère utile. / Endothelial dysfunction is an early marker of atherosclerosis and cardiovascular diseases. Cardiovascular risk factors generate a chronic stress, challenging endogenous defense mechanisms that are critical to maintain endothelial function, such as antioxidant enzymes. The vascular environment impacts the integrity and long-term function of endothelial cells. Thus, a healthy lifestyle is beneficial for cardiovascular health: regular physical training and/or a Mediterranean diet are associated with the maintenance of endothelial function and a lower incidence of cardiovascular diseases. On the other hand, some key genes such as tumor suppressor gene p53, are known to regulate numerous cellular functions that are necessary to maintain endothelial cells integrity. We hypothesized that the post-natal vascular environment impacts the development of endogenous cellular defense mechanisms such as antioxidant enzymes, in order to protect against vascular stress that will occur later in life. Our major goal was to evaluate the impact of post-natal interventions and endogenous reduction of p53 expression on vascular endothelial function and its capacity to resist against a metabolic stress. In our first study, healthy C57Bl/6 mice were exposed from weaning to the age of 9 months to physical voluntary training (running wheel) or to the antioxidant catechin, and were compared to physically inactive mice that did not receive catechin. Then, exercise and catechin were stopped and mice were subjected to a regular or a high fat diet for 3 months; mice were sacrificed either at the age of 9 or 12 months. In trained mice, we observed that exercise prevented endothelial dysfunction and inflammation induced by the high fat diet. In catechin-treated mice, aortic endothelial function was maintained despite exposure to the high fat diet, but an inflammatory profile was observed. In physically inactive mice, the high fat diet induced endothelial dysfunction without inflammation. In our second study, mice partially deficient in p53 (p53+/-) were exposed to the same high fat diet from 3 to 6 months of age. Our rationale was based on the discovery that in vitro, p53 regulates antioxidant enzymes gene expression. In p53+/- mice, endothelial cells were protected from the stress of hypercholesterolemia induced by the high fat diet. However, this endothelial protection could be linked with an unexpected enhanced bile acid metabolism in p53+/- mice: low endogenous expression of p53 prevents the rise in plasma total cholesterol when fed a high fat diet, indirectly protecting the endothelium. In summary, we were able to demonstrate the importance of the vascular environment on endothelial function. The pro-atherosclerotic environment induced by the high fat diet stimulated vascular defense mechanisms, as observed by the activation of the compensatory EDHF pathway and superoxide dismutase activity, to maintain an adequate endothelial function. We observed that exercise and catechin had a different impact on the endothelium despite their antioxidant properties. These studies demonstrate the sensitivity of the endothelium to changes within the vascular environment. As the population is aging and the incidence of cardiovascular diseases is increasing, endothelial dysfunction will be more frequent. Therefore, a better comprehension of mechanisms or interventions that can protect endothelial function can only be beneficial.

Plants are continuously confronted with a multitude attack either abiotic but also biotic in nature. Interestingly, despite the abundance of bacteria that plant has to face, only few are able to induce death or disease in the host plant. It is therefore likely that, in addition to secondary metabolites with antimicrobial properties, plants also synthesize secondary metabolites which are able to inhibit the expression of virulence genes in bacteria without affecting either growth or viability, which allows plants to host willingly or not bacterial populations. This work focuses on the identification of such metabolites in Malagasy plants (genera Dalbergia and Combretum) and the demonstration of their inhibitory effect on the expression of virulence genes in two different pathosystems: Rhodococcus fascians (a phytopathogen) and Pseudomonas aeruginosa (an opportunistic pathogen). Thus, two metabolites were isolated using a combination of chromatographic techniques coupled with tests that evaluate the expression of certain genes involved in the virulence mechanisms of these bacteria. The first is a new prenylated isoflavanone, named perbergin, isolated from the bark extract of D. pervillei. It was shown that the perbergin target attR gene expression, encoding a LysR-type transcriptional regulator that plays a key role in regulating the expression of virulence genes of R. fascians and the transition from an epiphytic to a pathogenic lifestyle. Therefore, we have also shown that the expression of all virulence genes known to date in R. fascians is also affected while the expression of genes involved in epiphytic fitness of the bacteria is not altered. In addition, the application of perbergin at the time of infection of plants susceptible to R. fascians shows that this molecule reduces in vivo the virulence of R. fascians, highlighting the potential of perbergin as an anti-infective agent. The second is a flavonoid known as catechin, isolated from the bark extract of C. albiflorum. Catechin significantly inhibits the expression of genes that regulate the mechanism of quorum sensing in P. aeruginosa such as lasI, LasR, rhlI and rhlR but also lasB and rhlA which expression depends on quorum sensing. Therefore, the production of virulence factors such as pyocyanin and elastase is significantly affected. Because of the limited number of our arsenal of antibiotics and their increasing ineffectiveness, the identification of these compounds create a path to an alternative in the fight against pathogenic bacteria and multidrug resistance of pathogenic bacteria to antibiotics. Our results also demonstrate the richness of Malagasy plants as (re)sources of new therapeutic molecules and the importance of widening the range of bacterial targets to be investigated to develop new strategies to fight within the endless war that we are waging against bacteria pathogens.<p><p>Les plantes sont continuellement confrontées à une multitude d’attaques qu’elles soient de nature abiotique ou surtout biotique. Il est intéressant de noter que malgré la multitude de bactéries auxquelles les plantes doivent faire face, seules quelques unes sont capables d’induire la mort ou une maladie chez la plante hôte. Il est dès lors fort probable que, outre les métabolites secondaires ayant des propriétés antimicrobiennes, les plantes synthétisent également des métabolites secondaires capables d’inhiber l’expression des gènes de virulence chez les bactéries sans toutefois affecter ni leur croissance ni leur viabilité, ce qui permet aux plantes de contenir les populations bactériennes qu’elles hébergent de gré ou de force. Ce travail porte sur l’identification de ce type de métabolites dans des plantes malgaches (genres Dalbergia et Combretum) et la démonstration de leurs effets inhibiteurs sur l’expression de gènes de virulence chez deux pathosystèmes différents: Rhodococcus fascians (un phytopathogène) et Pseudomonas aeruginosa (un pathogène opportuniste). Ainsi, deux métabolites ont été isolés en utilisant une combinaison de techniques chromatographiques couplées avec des tests qui évaluent l’expression de certains gènes impliqués dans les mécanismes de virulence de ces bactéries. Le premier est un nouvel isoflavanone prénylé, nommé perbergine, isolé à partir de l’extrait d’écorces de D. pervillei. Il a été montré que la perbergine cible l’expression du gène attR, codant un régulateur transcriptionnel de type LysR qui joue un rôle clé dans la régulation de l’expression des gènes de virulence de R. fascians et qui assure la transition entre un mode de vie épiphyte et le mode pathogène. En conséquence, nous avons également montré que l’expression de l’ensemble des gènes de virulence connu à ce jour chez R. fascians est également affectée alors que l’expression de gènes impliqués dans l’aptitude épiphyte de la bactérie n’est pas altérée. Par ailleurs, l’application de perbergine au moment de l’infection de plantes sensibles à R. fascians montre que cette molécule atténue la virulence de R. fascians in vivo, mettant en exergue le potentiel de la perbergine comme agent anti-infectieux. Le deuxième est un flavonoïde, connu sous le nom de catéchine, isolé de l’extrait d’écorces de C. albiflorum. La catéchine inhibe significativement l’expression des gènes régulateurs du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa tels que lasI, lasR, rhlI et rhlR et également lasB et rhlA dont l’expression dépend du quorum sensing. En conséquence, la production des facteurs de virulence tels que la pyocyanine et l’élastase est significativement affectée. Compte tenu de l’appauvrissement de notre arsenal d’antibiotiques et de leur inefficacité croissante, l’identification de ces composés ouvre une voie alternative de lutte contre les bactéries pathogènes et la multirésistance des bactéries pathogènes aux antibiotiques. Nos résultats démontrent également la richesse des plantes malgaches comme (res)sources de nouvelles molécules thérapeutiques et l’importance d’élargir le champ des cibles bactériennes à investiguer pour développer de nouvelles stratégies de lutte dans la guerre sans fin que nous menons contre les bactéries pathogènes. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished