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The thesis introduces two developed methods to quantify extracellular vesicles (EVs) isolated from cancer cell lines and healthy human saliva by using capillary zone electrophoresis. In the first chapter, the importance of EVs, as well as the existing EV isolation, characterization, and quantification methods, are described. The general principle of capillary electrophoresis (CE) is explained for a better understanding of these two methods. Chapter II describes the idea and concepts of Extracellular Vesicles quantitative Capillary Electrophoresis (EVqCE). The method evolved from the previous study carried out in our research group for the quantification of viruses. After the isolation of EVs from different cell lines, the characterization and quantification of EVs were performed using nanoparticle tracking analysis (NTA) and flow cytometry. EVqCE consists of four steps for EV quantification. In this study, EVqCE was employed to know the concentrations of EVs in unknown samples, followed by calculation of the average mass of the RNA present in EVs. In the next chapter, one of the human body fluids, i.e., saliva, was chosen for the quantification of EVs. Salivary EVqCE was developed in a similar way as EVqCE for cell lines since the general theories and procedures are practically the same. However, human saliva contains an abundant amount of viscous proteins and ribonuclease (RNase), that were the major obstacles for salivary EVs detection and quantification. The method for the isolation of EVs from the saliva was optimized, and the quantification was performed successfully. The average mass of RNA in saliva EVs was also calculated and analyzed. The concentration of saliva EVs in unknown samples were compared with the results from NTA and flow cytometry to validate the salivary EVqCE. In the last chapter, I described the application of EVqCE to study the quality control of EVs. The method calculates the degradation level of EVs samples under different conditions, providing a potential way for real-time monitoring of the EVs status in the body fluid sample.

A saliva é um fluido biológico com importante papel nos fenômenos que ocorrem na cavidade bucal. O efeito da sua composição sobre as perdas de estruturas dentais de origem não cariosa, como o desgaste dental, tem sido estudado. No entanto, há conflitos nos resultados apresentados por esses estudos, mostrando uma dificuldade em identificar os fatores salivares que possam proteger ou intensificar a evolução do processo. Assim, o presente estudo se propôs a analisar as características clínicas, comportamentais e de alguns parâmetros salivares em dois grupos experimentais: pacientes que apresentam lesões cervicais não cariosas (LCNCs) (n=20) e um grupo controle (n=20). Foram coletados dados clínicos e comportamentais através de um exame clínico e de uma entrevista, a seguir amostras de saliva estimulada e não-estimulada foram coletadas e analisados: pH, capacidade tampão, fluxo salivar, concentração de proteínas totais, atividade da amilase salivar, concentração de ureia salivar e a concentração dos íons sódio, fósforo, potássio, magnésio e cálcio. A capacidade tampão foi medida pela titulação da saliva com uma solução de HCL 0,01N; o fluxo salivar se deu pela relação entre o volume de saliva e o tempo de coleta (ml/min); as concentrações de proteínas totais, ureia e a atividade da amilase foram determinadas por método colorimétrico; as concentrações dos íons cálcio, fósforo, magnésio, potássio e sódio foram determinadas por espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP-OES). Os resultados foram submetidos aos testes Qui-quadrado, teste t e Mann-Whitney (p<0,05). As características relacionadas aos hábitos de higiene dental, dieta ácida, hábitos parafuncionais, presença de distúrbios gástricos, secura bucal e prévio tratamento periodontal, não mostraram relação com a presença de lesões cervicais não cariosas. Os pacientes portadores de LCNCs se queixaram mais de sensibilidade dental (p=0,0014). Foi observado um maior número de lesões cervicais de pequena profundidade (79%), em formato de cunha (72%), apresentando hipersensibilidade dentinária (HD) (86%), localizados nos dentes posteriores (88,18%) e na maxila (66,14%), sendo os pré-molares os dentes mais afetados (56,69%). Os níveis de cálcio na saliva não-estimulada do grupo de pacientes com LCNCs foi significativamente maior em relação ao controle (p=0,041). A concentração de potássio na saliva estimulada foi significativamente maior no grupo controle (p=0,028). As variáveis fluxo salivar, pH, capacidade tampão, concentração de proteínas totais, ureia, amilase, sódio, magnésio e fósforo não mostraram diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos. Conclui-se que os fatores comportamentais não interferiram no aparecimento das lesões cervicais não cariosas. As LCNCs são pouco profundas, em formato de cunha, acometem mais dentes superiores e pré-molares e são acompanhadas de HD. As concentrações de cálcio e potássio podem interferir na formação das LCNCs. / Saliva is a biological fluid with an important role in the phenomena that occur in the oral cavity. The effect of salivary composition in loss of tooth structure with no carious origin, such as tooth wear, has been studied. However, there are conflicts in the results presented by studies showing a difficulty in identifying the salivary factors which may protect or intensify the development of tooth wear process. The aim of this study was to analyze the clinical, behavioral and some salivary parameters into two groups: patients with non-carious cervical lesions (NCCLs) (n=20) and a control group (n=20). Clinical and behavioral data were collected through a clinical examination and an interview. Saliva samples stimulated and unstimulated were collected and analyzed: pH, buffer capacity, flow rate, total protein, amylase activity, urea, sodium, phosphorus, potassium, magnesium and calcium. The buffer capacity was measured by titration of saliva samples using 0.01N HCl solution; flow rate was the relationship between the volume of saliva and the collection time (ml/min); the concentrations of total protein, urea and amylase activity were determined by colorimetric method; concentrations of calcium, phosphorus, magnesium, potassium and sodium were determined by inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES). The results were tested to the chi-square test, t-test and Mann-Whitney U test (p<0.05). The characteristics related to dental hygiene, acidic diet, parafunctional habits, presence of gastric disorders, dry mouth, and previous periodontal treatment did not show relationship to the presence of non-carious cervical lesions. Patients with non-carious cervical lesions complained over tooth sensitivity (p=0.0014). It observed an increased number of cervical lesions small depth (79%), wedge-shaped (72%), with dentin hypersensitivity (86%), located the posterior teeth (88,18%) and maxilla (66,14%), the premolars being the most affected teeth (56,69%). The concentration of calcium in unstimulated saliva of patients with NCCLs was significantly higher compared to control (p=0.041). The concentration of potassium was significantly higher in stimulated saliva in the control group (p=0.028). The results flow rate, pH, buffer capacity, total protein, urea, amylase, sodium, magnesium and phosphorus showed no significant differences between the two groups. It is concluded that behavioral factors do not interfere in the presence of non-carious cervical lesions. The NCCLs are shallow, wedge-shaped, affecting more maxilla and premolars and are accompanied by DH. The calcium and potassium concentrations may interfere with the formation of NCCLs.

A exposição ambiental ao chumbo é uma das questões mais sérias de contaminação de populações do ponto de vista de saúde pública. Mesmo em pequenas quantidades, o chumbo causa mudanças bioquímicas e neurológicas, convulsões e hiperatividade. No Brasil, não existe programa nacional para detecção de crianças contaminadas por este metal, as quais são mais sensíveis aos efeitos deletérios resultantes da exposição crônica a baixas concentrações de chumbo. A maioria dos trabalhos que comprovaram a associação entre exposição ambiental a chumbo no passado e problemas no desenvolvimento neurológico utilizou dentina de dentes decíduos como tecido marcador de exposição. Trabalhos do nosso grupo indicam que o esmalte superficial de dentes decíduos seria um bom marcador cumulativo da exposição passada ao chumbo, sendo que esse tecido apresenta consideráveis vantagens do ponto de vista de acesso e desenvolvimento de testes para monitoramento ambiental. Uma questão importante é verificar se as concentrações de chumbo encontradas no esmalte superficial decíduo variam ao longo do tempo em crianças de baixa exposição. Outra questão importante é verificar se há correlações entre as concentrações de chumbo no esmalte superficial e aquelas dos principais fluidos corporais a partir dos quais o chumbo seria acumulado no esmalte, que são sangue total, plasma e saliva. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar in vivo, por meio de testes em esmalte em dentes decíduos, se o chumbo acumulado nos primeiros micrometros do esmalte aumenta ao longo de três anos e se as concentrações de chumbo encontradas no esmalte apresentam correlação com aquelas encontradas no sangue total, plasma e saliva. A amostra inicial foi constituída por 50 crianças com idade de 2 a 3 anos procedentes de Ribeirão Preto que estavam recebendo atendimento odontológico na Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto USP e alunos da Creche Carochinha (USPRibeirão Preto). Obtiveram-se as seguintes amostras: primeira etapa (2009): 01 amostra de sangue total e 01 amostra de esmalte de um incisivo central superior; segunda etapa (2010): 01 amostra de sangue total, 01 amostra de plasma sanguíneo, 01 amostra de saliva e 01 amostra de esmalte do dente contralateral. terceira etapa (2011): 01 amostra de sangue total, 01 amostra de plasma sanguíneo, 01 amostra de saliva e 02 amostras de amostra de esmalte dos incisivos laterais. O fósforo foi determinado colorimetricamente, para calcular a profundidade dos testes de esmalte. As concentrações de chumbo no plasma, saliva e esmalte dental foram determinadas por espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICPMS) e no sangue total, por espectrometria de absorção atômica com forno de grafite. Muitas crianças ou seus responsáveis não permitiram a coleta de sangue em algum dos períodos, e assim ao longo dos 3 anos tivemos participação efetiva de 20 crianças. Em 2009, a concentração de chumbo no sangue total variou de 0,2 &mu;g/dL a 7,48 &mu;g/dL e teve como a mediana 0,26 &mu;g/dL. Apenas uma criança apresentou nível de chumbo no sangue 5 &mu;g/dL. Em 2010, a concentração de chumbo no sangue total variou de 0.2 &mu;g/dL a 3,8 &mu;g/dL e teve como a mediana 0,32 &mu;g/dL. Em 2011, a concentração de chumbo no sangue variou de 1,15 &mu;g/dL a 3,55 &mu;g/dL e teve como mediana 0,95 &mu;g/dL. Os dados de chumbo no sangue não apresentam diferenças estatisticamente significantes entre os grupos ao longo dos anos (p>0.05). Em 2010, valores de chumbo no plasma variaram de 0,29 3,20 &mu;g/L e a mediana foi 0,49. Em 2011, variaram de 0,38 1,60 &mu;g/L com mediana 0,52 &mu;g/L. A concentração de chumbo na saliva em 2010 variou de 0,02 3,00 &mu;g/L, com mediana de 0,34 &mu;g/L. Em 2011, esses valores variaram de 0,02 4,27 &mu;g/L e a mediana foi de 0,19 &mu;g/L. Para as concentrações de chumbo no plasma e na saliva, não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (Saliva 2010 x Saliva 2011; Plasma 2010 x Plasma 2011) (teste de Mann Whitney; p>0.05). No caso dos dados obtidos no esmalte dentário, os valores de chumbo foram recalculados para uma mesma profundidade, que foi de 3,4 &mu;m. Nenhum dos grupos (Esmalte 2009, Esmalte 2010 e Esmalte 2011) teve distribuição normal, e não houve diferença entre nas concentrações de chumbo encontradas ao longo dos anos, com medianas de 36, 35 e 38 &mu;g/g em 2009, 2010 e 2011, respectivamente (p=0,71, teste de Kruskal-Wallis). A análise de correlação foi feita após a transformação logarítmica (log10) de todos os valores. Mesmo após esta transformação, dois grupos ainda não apresentaram distribuição normal, o grupo Plasma 2011 e Esmalte 2010. As associações que envolviam estes grupos foram testadas utilizando-se a correlação de Spearman, enquanto todas as demais associações foram testadas utilizando-se o teste de correlação de Pearson. As correlações significativas positivas encontradas foram: entre Sangue Total 2009 e Sangue Total 2010 (rP = 0,64; p = 0,002) ; Sangue Total 2010 e Sangue Total 2011 (rP = 0,66; p = 0,002); Esmalte 2011 e Sangue Total 2009 (rP= 0,44; p=0,05) e entre Esmalte 2009 e Esmalte 2010 (rS = 0,45 e p=0,03). Houve uma associação inversa entre a Saliva 2010 e Esmalte 2011 (rP = - 0,55; p=0,013). Conclusão: Os valores de chumbo obtidos em todas as amostras ao longo de 3 anos caracterizam baixa exposição a chumbo no grupo estudado. As concentrações de chumbo no sangue, saliva, plasma e esmalte não variaram ao longo do tempo. Das 28 associações testadas, foram estatisticamente significantes e positivas aquelas entre o Sangue Total 2009 e o Esmalte 2011 e entre o Esmalte 2009 e Esmalte 2010. A associação entre Saliva 2010 e Esmalte 2011 foi inversa. Os resultados sugerem que o esmalte tenha associação com a exposição de chumbo passada, neste estudo caracterizado pelos valores de chumbo no sangue total. Os resultados sugerem que o esmalte possa ser um biomarcador fidedigno para avaliar o grau de exposição a chumbo em populações com baixa exposição a este metal, uma vez que o esmalte superficial de dentes decíduos não incorporou chumbo em quantidades significativas entre 2 e 5 anos de idade em crianças com baixa exposição e baixa atividade de cárie. / Environmental exposure to lead is one of the most serious contamination problems that affect public health. Even in small amounts, lead can cause neurological and biochemical changes, such as mental problems and hyperactivity. In Brazil, there is no program for the detection of children contaminated by this metal. Children are more sensitive to the deleterious effects of chronic lead exposure. Studies that proved association between environmental exposure to lead and neurological developmental problems used dentine of primary teeth as a marker of lead exposure. Studies by our group suggest that superficial enamel of deciduous teeth would be a good cumulative marker of past exposure to lead, and this tissue has considerable advantages regarding access and the perspective of development of tests for environmental monitoring of children. An important question is whether the concentrations of lead found in deciduous enamel surface vary over time in children with low exposure and if there are correlations between the concentrations of lead in the enamel surface and those of the main body fluids from which the lead was accumulated in the enamel, which are whole blood, plasma and saliva. The aims of this study was to investigate in vivo, by testing lead concentration in deciduous enamel of primary teeth, if the lead accumulated in the first micrometers of enamel increases along three years and if the concentrations of lead found in enamel surface were correlated with those found in whole blood, plasma and saliva. The initial sample consisted of 50 children aged 2 to 3 years from Ribeirão Preto, who were receiving dental care at Children\'s Clinic of the Faculty of Dentistry of Ribeirão Preto - USP and students of Nursery Carochinha (USP-Ribeirão Preto). The following samples were obtained: first stage (2009): 01 sample of whole blood and 01 sample of enamel of a central upper incisor, second stage (2010): 01 sample of whole blood, 01 sample of blood plasma, 01 sample of saliva and 01 sample of enamel from the contralateral tooth; third stage (2011): 01 sample of whole blood, 01 sample of blood plasma, 01 sample of saliva and 02 enamel samples of lateral upper incisors. Phosphorus was determined by a colorimetric method, in order to calculate the depth of enamel tests. Lead concentrations in plasma, saliva and enamel were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS) and whole blood by atomic absorption spectrometer with graphite furnace. Many children or their guardians did not allow the collection of blood in any of the periods, and thus, over the three years, we had the enrollment of only 20 children. In 2009, the concentration of lead in whole blood varied from 0.2 &mu;g / dL to 7.48 &mu;g /dL and the median was 0.26 &mu;g/dL. Only one child had a blood lead level 5 &mu;g/ dL. In 2010, the concentration of lead in whole blood ranged from 0.2 &mu;g/dL to 3.8 &mu;g/dL and the median was 0.32 &mu;g/dL. In 2011, the concentration of lead in blood ranged from 1.15 &mu;g/dL to 3.55 &mu;g/dL and the median was 0.95 &mu;g/dL. The blood lead data do not show statistically significant differences over the years (p> 0.05). In 2010, values of lead in plasma ranged from 0.29 to 3.20 &mu;g/L and the median was 0.49 &mu;g/L. In 2011, lead levels in plasma ranged from 0.38 to 1.60 &mu;g/L with median 0.52 &mu;g/L. The lead concentration in Saliva 2010 ranged from 0.02 to 3.00&mu; g/L, median 0.34 &mu;g/L. In 2011, these values ranged from 0.02 to 4.27 &mu;g/L and the median was 0.19 &mu;g/L. For lead concentrations in plasma and saliva, there were no statistically significant differences between groups (Saliva 2010 x Saliva 2011; Plasma 2010 x Plasma 2011)(Mann-Whitney test, p> 0.05). To analyze enamel samples, the values of lead were recalculated so they would reflect the lead found in one same depth, which was 3.4 micrometers. None of the groups (enamel from 2009, enamel from 2010 and enamel from 2011) presented normal distribution. There was no statistically significant difference between these three groups (p=0.71, Kruskal-Wallis). A correlation analysis was performed after logarithmic transformation (log10) of all values. Even after this transformation, two groups still did not exhibit normal distribution, which were Plasma 2011 & Enamel 2010. The associations that involved these two groups were tested using the Spearman correlation test, while all other associations were tested using the Pearson correlation test. The significant positive correlations found were: Whole Blood 2009 and Whole Blood 2010 (rP = 0,64; p = 0,002) ; Whole Blood 2010 and Whole Blood 2011 (rP = 0,66; p = 0,002); between Enamel 2011 and Whole Blood 2009 (rP= 0.44, p = 0.05) and between Enamel 2009 and Enamel 2010 (rS= 0.45, p= 0.03). There was an inverse association between Saliva 2010 and Enamel 2011 (rP= - 0,55; p = 0,013). Conclusion: The lead values obtained in all samples over three years characterized low exposure to lead by the group studied. Lead concentrations in blood, saliva, plasma and enamel did not vary over time. Of the 28 associations tested, the ones between Whole Blood 2009 and 2011 and between Enamel 2009 and 2010 were positive and significant. The association between Saliva 2010 and Enamel 2011 was negative and significant. The results suggest that the lead found in the enamel is correlated with past exposure to lead characterized in this study by the yearly whole blood lead data. The results further suggest that the dental enamel can be a reliable marker to assess the degree of exposure to lead of populations, since the primary teeth´s enamel surface did not incorporate lead in substantial quantities between 2 and 5 years in children with low exposure to this metal and low caries activity.

A exposição ambiental ao chumbo é uma das questões mais sérias de contaminação de populações do ponto de vista de saúde pública. Mesmo em pequenas quantidades, o chumbo causa mudanças bioquímicas e neurológicas, convulsões e hiperatividade. No Brasil, não existe programa nacional para detecção de crianças contaminadas por este metal, as quais são mais sensíveis aos efeitos deletérios resultantes da exposição crônica a baixas concentrações de chumbo. A maioria dos trabalhos que comprovaram a associação entre exposição ambiental a chumbo no passado e problemas no desenvolvimento neurológico utilizou dentina de dentes decíduos como tecido marcador de exposição. Trabalhos do nosso grupo indicam que o esmalte superficial de dentes decíduos seria um bom marcador cumulativo da exposição passada ao chumbo, sendo que esse tecido apresenta consideráveis vantagens do ponto de vista de acesso e desenvolvimento de testes para monitoramento ambiental. Uma questão importante é verificar se as concentrações de chumbo encontradas no esmalte superficial decíduo variam ao longo do tempo em crianças de baixa exposição. Outra questão importante é verificar se há correlações entre as concentrações de chumbo no esmalte superficial e aquelas dos principais fluidos corporais a partir dos quais o chumbo seria acumulado no esmalte, que são sangue total, plasma e saliva. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar in vivo, por meio de testes em esmalte em dentes decíduos, se o chumbo acumulado nos primeiros micrometros do esmalte aumenta ao longo de três anos e se as concentrações de chumbo encontradas no esmalte apresentam correlação com aquelas encontradas no sangue total, plasma e saliva. A amostra inicial foi constituída por 50 crianças com idade de 2 a 3 anos procedentes de Ribeirão Preto que estavam recebendo atendimento odontológico na Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto USP e alunos da Creche Carochinha (USPRibeirão Preto). Obtiveram-se as seguintes amostras: primeira etapa (2009): 01 amostra de sangue total e 01 amostra de esmalte de um incisivo central superior; segunda etapa (2010): 01 amostra de sangue total, 01 amostra de plasma sanguíneo, 01 amostra de saliva e 01 amostra de esmalte do dente contralateral. terceira etapa (2011): 01 amostra de sangue total, 01 amostra de plasma sanguíneo, 01 amostra de saliva e 02 amostras de amostra de esmalte dos incisivos laterais. O fósforo foi determinado colorimetricamente, para calcular a profundidade dos testes de esmalte. As concentrações de chumbo no plasma, saliva e esmalte dental foram determinadas por espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICPMS) e no sangue total, por espectrometria de absorção atômica com forno de grafite. Muitas crianças ou seus responsáveis não permitiram a coleta de sangue em algum dos períodos, e assim ao longo dos 3 anos tivemos participação efetiva de 20 crianças. Em 2009, a concentração de chumbo no sangue total variou de 0,2 &mu;g/dL a 7,48 &mu;g/dL e teve como a mediana 0,26 &mu;g/dL. Apenas uma criança apresentou nível de chumbo no sangue 5 &mu;g/dL. Em 2010, a concentração de chumbo no sangue total variou de 0.2 &mu;g/dL a 3,8 &mu;g/dL e teve como a mediana 0,32 &mu;g/dL. Em 2011, a concentração de chumbo no sangue variou de 1,15 &mu;g/dL a 3,55 &mu;g/dL e teve como mediana 0,95 &mu;g/dL. Os dados de chumbo no sangue não apresentam diferenças estatisticamente significantes entre os grupos ao longo dos anos (p>0.05). Em 2010, valores de chumbo no plasma variaram de 0,29 3,20 &mu;g/L e a mediana foi 0,49. Em 2011, variaram de 0,38 1,60 &mu;g/L com mediana 0,52 &mu;g/L. A concentração de chumbo na saliva em 2010 variou de 0,02 3,00 &mu;g/L, com mediana de 0,34 &mu;g/L. Em 2011, esses valores variaram de 0,02 4,27 &mu;g/L e a mediana foi de 0,19 &mu;g/L. Para as concentrações de chumbo no plasma e na saliva, não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (Saliva 2010 x Saliva 2011; Plasma 2010 x Plasma 2011) (teste de Mann Whitney; p>0.05). No caso dos dados obtidos no esmalte dentário, os valores de chumbo foram recalculados para uma mesma profundidade, que foi de 3,4 &mu;m. Nenhum dos grupos (Esmalte 2009, Esmalte 2010 e Esmalte 2011) teve distribuição normal, e não houve diferença entre nas concentrações de chumbo encontradas ao longo dos anos, com medianas de 36, 35 e 38 &mu;g/g em 2009, 2010 e 2011, respectivamente (p=0,71, teste de Kruskal-Wallis). A análise de correlação foi feita após a transformação logarítmica (log10) de todos os valores. Mesmo após esta transformação, dois grupos ainda não apresentaram distribuição normal, o grupo Plasma 2011 e Esmalte 2010. As associações que envolviam estes grupos foram testadas utilizando-se a correlação de Spearman, enquanto todas as demais associações foram testadas utilizando-se o teste de correlação de Pearson. As correlações significativas positivas encontradas foram: entre Sangue Total 2009 e Sangue Total 2010 (rP = 0,64; p = 0,002) ; Sangue Total 2010 e Sangue Total 2011 (rP = 0,66; p = 0,002); Esmalte 2011 e Sangue Total 2009 (rP= 0,44; p=0,05) e entre Esmalte 2009 e Esmalte 2010 (rS = 0,45 e p=0,03). Houve uma associação inversa entre a Saliva 2010 e Esmalte 2011 (rP = - 0,55; p=0,013). Conclusão: Os valores de chumbo obtidos em todas as amostras ao longo de 3 anos caracterizam baixa exposição a chumbo no grupo estudado. As concentrações de chumbo no sangue, saliva, plasma e esmalte não variaram ao longo do tempo. Das 28 associações testadas, foram estatisticamente significantes e positivas aquelas entre o Sangue Total 2009 e o Esmalte 2011 e entre o Esmalte 2009 e Esmalte 2010. A associação entre Saliva 2010 e Esmalte 2011 foi inversa. Os resultados sugerem que o esmalte tenha associação com a exposição de chumbo passada, neste estudo caracterizado pelos valores de chumbo no sangue total. Os resultados sugerem que o esmalte possa ser um biomarcador fidedigno para avaliar o grau de exposição a chumbo em populações com baixa exposição a este metal, uma vez que o esmalte superficial de dentes decíduos não incorporou chumbo em quantidades significativas entre 2 e 5 anos de idade em crianças com baixa exposição e baixa atividade de cárie. / Environmental exposure to lead is one of the most serious contamination problems that affect public health. Even in small amounts, lead can cause neurological and biochemical changes, such as mental problems and hyperactivity. In Brazil, there is no program for the detection of children contaminated by this metal. Children are more sensitive to the deleterious effects of chronic lead exposure. Studies that proved association between environmental exposure to lead and neurological developmental problems used dentine of primary teeth as a marker of lead exposure. Studies by our group suggest that superficial enamel of deciduous teeth would be a good cumulative marker of past exposure to lead, and this tissue has considerable advantages regarding access and the perspective of development of tests for environmental monitoring of children. An important question is whether the concentrations of lead found in deciduous enamel surface vary over time in children with low exposure and if there are correlations between the concentrations of lead in the enamel surface and those of the main body fluids from which the lead was accumulated in the enamel, which are whole blood, plasma and saliva. The aims of this study was to investigate in vivo, by testing lead concentration in deciduous enamel of primary teeth, if the lead accumulated in the first micrometers of enamel increases along three years and if the concentrations of lead found in enamel surface were correlated with those found in whole blood, plasma and saliva. The initial sample consisted of 50 children aged 2 to 3 years from Ribeirão Preto, who were receiving dental care at Children\'s Clinic of the Faculty of Dentistry of Ribeirão Preto - USP and students of Nursery Carochinha (USP-Ribeirão Preto). The following samples were obtained: first stage (2009): 01 sample of whole blood and 01 sample of enamel of a central upper incisor, second stage (2010): 01 sample of whole blood, 01 sample of blood plasma, 01 sample of saliva and 01 sample of enamel from the contralateral tooth; third stage (2011): 01 sample of whole blood, 01 sample of blood plasma, 01 sample of saliva and 02 enamel samples of lateral upper incisors. Phosphorus was determined by a colorimetric method, in order to calculate the depth of enamel tests. Lead concentrations in plasma, saliva and enamel were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS) and whole blood by atomic absorption spectrometer with graphite furnace. Many children or their guardians did not allow the collection of blood in any of the periods, and thus, over the three years, we had the enrollment of only 20 children. In 2009, the concentration of lead in whole blood varied from 0.2 &mu;g / dL to 7.48 &mu;g /dL and the median was 0.26 &mu;g/dL. Only one child had a blood lead level 5 &mu;g/ dL. In 2010, the concentration of lead in whole blood ranged from 0.2 &mu;g/dL to 3.8 &mu;g/dL and the median was 0.32 &mu;g/dL. In 2011, the concentration of lead in blood ranged from 1.15 &mu;g/dL to 3.55 &mu;g/dL and the median was 0.95 &mu;g/dL. The blood lead data do not show statistically significant differences over the years (p> 0.05). In 2010, values of lead in plasma ranged from 0.29 to 3.20 &mu;g/L and the median was 0.49 &mu;g/L. In 2011, lead levels in plasma ranged from 0.38 to 1.60 &mu;g/L with median 0.52 &mu;g/L. The lead concentration in Saliva 2010 ranged from 0.02 to 3.00&mu; g/L, median 0.34 &mu;g/L. In 2011, these values ranged from 0.02 to 4.27 &mu;g/L and the median was 0.19 &mu;g/L. For lead concentrations in plasma and saliva, there were no statistically significant differences between groups (Saliva 2010 x Saliva 2011; Plasma 2010 x Plasma 2011)(Mann-Whitney test, p> 0.05). To analyze enamel samples, the values of lead were recalculated so they would reflect the lead found in one same depth, which was 3.4 micrometers. None of the groups (enamel from 2009, enamel from 2010 and enamel from 2011) presented normal distribution. There was no statistically significant difference between these three groups (p=0.71, Kruskal-Wallis). A correlation analysis was performed after logarithmic transformation (log10) of all values. Even after this transformation, two groups still did not exhibit normal distribution, which were Plasma 2011 & Enamel 2010. The associations that involved these two groups were tested using the Spearman correlation test, while all other associations were tested using the Pearson correlation test. The significant positive correlations found were: Whole Blood 2009 and Whole Blood 2010 (rP = 0,64; p = 0,002) ; Whole Blood 2010 and Whole Blood 2011 (rP = 0,66; p = 0,002); between Enamel 2011 and Whole Blood 2009 (rP= 0.44, p = 0.05) and between Enamel 2009 and Enamel 2010 (rS= 0.45, p= 0.03). There was an inverse association between Saliva 2010 and Enamel 2011 (rP= - 0,55; p = 0,013). Conclusion: The lead values obtained in all samples over three years characterized low exposure to lead by the group studied. Lead concentrations in blood, saliva, plasma and enamel did not vary over time. Of the 28 associations tested, the ones between Whole Blood 2009 and 2011 and between Enamel 2009 and 2010 were positive and significant. The association between Saliva 2010 and Enamel 2011 was negative and significant. The results suggest that the lead found in the enamel is correlated with past exposure to lead characterized in this study by the yearly whole blood lead data. The results further suggest that the dental enamel can be a reliable marker to assess the degree of exposure to lead of populations, since the primary teeth´s enamel surface did not incorporate lead in substantial quantities between 2 and 5 years in children with low exposure to this metal and low caries activity.

A saliva é um fluido biológico com importante papel nos fenômenos que ocorrem na cavidade bucal. O efeito da sua composição sobre as perdas de estruturas dentais de origem não cariosa, como o desgaste dental, tem sido estudado. No entanto, há conflitos nos resultados apresentados por esses estudos, mostrando uma dificuldade em identificar os fatores salivares que possam proteger ou intensificar a evolução do processo. Assim, o presente estudo se propôs a analisar as características clínicas, comportamentais e de alguns parâmetros salivares em dois grupos experimentais: pacientes que apresentam lesões cervicais não cariosas (LCNCs) (n=20) e um grupo controle (n=20). Foram coletados dados clínicos e comportamentais através de um exame clínico e de uma entrevista, a seguir amostras de saliva estimulada e não-estimulada foram coletadas e analisados: pH, capacidade tampão, fluxo salivar, concentração de proteínas totais, atividade da amilase salivar, concentração de ureia salivar e a concentração dos íons sódio, fósforo, potássio, magnésio e cálcio. A capacidade tampão foi medida pela titulação da saliva com uma solução de HCL 0,01N; o fluxo salivar se deu pela relação entre o volume de saliva e o tempo de coleta (ml/min); as concentrações de proteínas totais, ureia e a atividade da amilase foram determinadas por método colorimétrico; as concentrações dos íons cálcio, fósforo, magnésio, potássio e sódio foram determinadas por espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP-OES). Os resultados foram submetidos aos testes Qui-quadrado, teste t e Mann-Whitney (p<0,05). As características relacionadas aos hábitos de higiene dental, dieta ácida, hábitos parafuncionais, presença de distúrbios gástricos, secura bucal e prévio tratamento periodontal, não mostraram relação com a presença de lesões cervicais não cariosas. Os pacientes portadores de LCNCs se queixaram mais de sensibilidade dental (p=0,0014). Foi observado um maior número de lesões cervicais de pequena profundidade (79%), em formato de cunha (72%), apresentando hipersensibilidade dentinária (HD) (86%), localizados nos dentes posteriores (88,18%) e na maxila (66,14%), sendo os pré-molares os dentes mais afetados (56,69%). Os níveis de cálcio na saliva não-estimulada do grupo de pacientes com LCNCs foi significativamente maior em relação ao controle (p=0,041). A concentração de potássio na saliva estimulada foi significativamente maior no grupo controle (p=0,028). As variáveis fluxo salivar, pH, capacidade tampão, concentração de proteínas totais, ureia, amilase, sódio, magnésio e fósforo não mostraram diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos. Conclui-se que os fatores comportamentais não interferiram no aparecimento das lesões cervicais não cariosas. As LCNCs são pouco profundas, em formato de cunha, acometem mais dentes superiores e pré-molares e são acompanhadas de HD. As concentrações de cálcio e potássio podem interferir na formação das LCNCs. / Saliva is a biological fluid with an important role in the phenomena that occur in the oral cavity. The effect of salivary composition in loss of tooth structure with no carious origin, such as tooth wear, has been studied. However, there are conflicts in the results presented by studies showing a difficulty in identifying the salivary factors which may protect or intensify the development of tooth wear process. The aim of this study was to analyze the clinical, behavioral and some salivary parameters into two groups: patients with non-carious cervical lesions (NCCLs) (n=20) and a control group (n=20). Clinical and behavioral data were collected through a clinical examination and an interview. Saliva samples stimulated and unstimulated were collected and analyzed: pH, buffer capacity, flow rate, total protein, amylase activity, urea, sodium, phosphorus, potassium, magnesium and calcium. The buffer capacity was measured by titration of saliva samples using 0.01N HCl solution; flow rate was the relationship between the volume of saliva and the collection time (ml/min); the concentrations of total protein, urea and amylase activity were determined by colorimetric method; concentrations of calcium, phosphorus, magnesium, potassium and sodium were determined by inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES). The results were tested to the chi-square test, t-test and Mann-Whitney U test (p<0.05). The characteristics related to dental hygiene, acidic diet, parafunctional habits, presence of gastric disorders, dry mouth, and previous periodontal treatment did not show relationship to the presence of non-carious cervical lesions. Patients with non-carious cervical lesions complained over tooth sensitivity (p=0.0014). It observed an increased number of cervical lesions small depth (79%), wedge-shaped (72%), with dentin hypersensitivity (86%), located the posterior teeth (88,18%) and maxilla (66,14%), the premolars being the most affected teeth (56,69%). The concentration of calcium in unstimulated saliva of patients with NCCLs was significantly higher compared to control (p=0.041). The concentration of potassium was significantly higher in stimulated saliva in the control group (p=0.028). The results flow rate, pH, buffer capacity, total protein, urea, amylase, sodium, magnesium and phosphorus showed no significant differences between the two groups. It is concluded that behavioral factors do not interfere in the presence of non-carious cervical lesions. The NCCLs are shallow, wedge-shaped, affecting more maxilla and premolars and are accompanied by DH. The calcium and potassium concentrations may interfere with the formation of NCCLs.

L’objectif de cette étude est d’étudier le rôle de la salive dans la libération des molécules odorantes, par deux approches, in vitro et in vivo. L’effet des protéines salivaires sur la libération de 10 molécules odorantes (5 esters et 5 cétones, de longueur de chaîne hydrophobe variable) a été étudié in vitro dans des systèmes modèles composés de salives artificielles et humaine. Les salives artificielles contiennent les protéines majoritairement présentes dans la salive (mucine et alpha-amylase), seules et en mélange. Les quantités de chaque molécule odorante présentes dans la phase gazeuse à l’équilibre thermodynamique ont été mesurées par une analyse headspace en mode statique couplée à la chromatographie en phase gazeuse (SH-GC). Les coefficients de partage entre l’air et chacun des systèmes modèles ont été calculés pour chacune des molécules. Cette approche in vitro nous a permis de démontrer une diminution des coefficients de partage air/salive artificielle en présence de mucine et d’alpha-amylase, par un effet hydrophobe. Aucun effet cumulatif n’est observé lorsque les deux protéines sont mises ensemble en solution. En présence de salive humaine, une diminution des coefficients de partage est également observée, les esters étant plus affectés par la présence de salive humaine que les cétones. Cette observation est due à une activité des estérases de la salive, qui augmente avec l’hydrophobicité des esters. La libération in vivo du propanoate d’éthyle et de l’hexanoate d’éthyle a été suivie sur 10 sujets par spectrométrie de masse à ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI-MS) dans des conditions physiologiques différentes : au repos, après stimulation et après élimination du film salivaire résiduel. La salive de chaque sujet a été caractérisée dans les différentes conditions physiologiques testées. De grandes variations de flux, viscosité et de composition salivaire ont été mises en évidence entre les sujets, ainsi qu’entre les conditions physiologiques pour un même sujet. Les différences observées sur les paramètres de libération in vivo des molécules odorantes sont discutées en regard de ces paramètres physiologiques. Nous avons ainsi observé qu’une viscosité salivaire élevée diminue la quantité de molécules odorantes libérées sur un temps donné. Dans le même temps, la présence d’une quantité importante d’alpha amylase dans la salive augmente de façon significative le temps de libération de la molécule la plus hydrophobe, l’hexanoate d’éthyle. Nous avons ainsi mis en évidence que la rétention des molécules hydrophobes par les protéines salivaires peut induire une modification de leur cinétique de libération en conditions réelles de consommation et pourrait intervenir dans la persistance aromatique. / The aim of this work is to give a deeper understanding of the impact of the salivary composition on aroma release, by two approaches, an in vitro and an in vivo approach. The impact of salivary proteins on the release of 10 aroma compounds (5 esters and 5 ketones, varying in their hydrophobic chain length) was first investigated by in vitro model systems composed of artificial and human saliva. Artificial salivas were composed of the main salivary proteins, mucins and alpha amylase, alone and in mixture.The amount of aroma released in the vapor phase at equilibrium was analyzed by Static Headspace Gas Chromatography analysis. Air/system partition coefficients have been calculated. This in vitro approach allowed us to demonstrate the ability of both mucin and alpha-amylase to decrease the release of aroma compounds by hydrophobic effect (increase of retention with aroma hydrophobicity). Interestingly, no cumulative effect was observed when both proteins were mixed together in solution. The release of ketones in presence of human saliva is lower than in water and slightly higher than in the presence of artificial saliva. Esters are more affected by the presence of human saliva than ketones. This observation is due to an esterase activity of saliva, which increases with the hydrophobicity of esters. The in vivo release of ethyl propanoate and ethyl hexanoate was followed on ten subjects by Atmospheric Pressure Chemical Ionization mass spectrometry (APCI-MS) under different physiological conditions: at rest, after stimulation and after removing the superficial salivary coat. The saliva was characterized for each subject and each physiological condition. Great variations were observed between the subjects on the salivary flow, viscosity, composition and for each subject between the physiological conditions. The differences observed on in vivo release parameters are discussed as a function of physiological parameters. We observed that subjects with a more viscous saliva present a lower amount of aroma released. The presence of higher amounts of alpha-amylase increased the time needed to release the more hydrophobic compound, ethyl hexanoate. Our results suggest that the retention of hydrophobic aroma compounds by salivary proteins induces a modification of the kinetics of aroma release in real consumption conditions, and could be responsible for aroma persistence.