Intramyocellular lipid (IMCL), an ectopic fat depot found within skeletal muscle fibers, is highly associated with obesity and strongly correlated with insulin resistance. IMCL accumulation in sedentary individuals may contribute to insulin resistance by interfering with insulin signaling in skeletal muscle, leading to inadequate glucose uptake by the cell. Lipid peroxidation is also associated with both obesity and insulin resistance, and with IMCL, but a relationship has yet to be established among all of these variables. The purpose of this project is to study for the first time the relationships among lipid peroxidation, IMCL content, and glucose uptake in skeletal muscle. Nine insulin-sensitive adults (IS), 13 insulin-resistant adults (IR), 10 diabetic (DB) and 8 subjects pre- and post- 12-week intervention with insulin-sensitizing thiazolinedione (TZD) were assessed for soleus IMCL with nuclear magnetic resonance, insulin sensitivity by both hyperinsulinemic-euglycemic clamp (GDR) and homeostasis model assessment index (HOMA1), and anthropometrics, including body mass index (BMI), percent fat by DEXA scan, and waist circumference. Vastus lateralis biopsies of all subjects were homogenized and analyzed by immunoblotting for post-translational protein modifications occurring from lipid-peroxidation (HNE). GDR and HOMA were significantly different among IS, IR, and DB groups, as expected, as were waist circumference and BMI. IMCL was significantly higher in DB than in IS and IR. HNE was also higher in DB than in IS, although it did not differ from IR. HNE was significantly correlated to GDR, HOMA1, and BMI, but not to IMCL, WAIST, or percent fat measures. IMCL showed a strong, negative correlation with GDR and was the primary, independent predictor of GDR in stepwise multiple regression. HNE was the primary, independent predictor of HOMA in stepwise multiple regression. Paired t-tests revealed improvements in insulin sensitivity measures after 12 weeks of TZD intervention, but no significant differences were observed in IMCL or HNE after intervention. These data show that skeletal muscle HNE and IMCL are both determinants of insulin resistance in obese, sedentary adults. HNE and IMCL are not related and therefore impact insulin resistance independently. These results reveal, for the first time, a negative relationship between skeletal muscle HNE and insulin sensitivity in sedentary individuals and underscore the importance of lipid peroxidation in insulin resistance.

TRPA1 channels are sensors for noxious stimuli in a subset of nociceptive neurons. TRPA1 channels are also expressed in cells of the mammalian inner ear, but their function in this tissue remains unknown given that Trpa1–/– mice exhibit normal hearing, balance and sensory mechanotransduction. Here we show that non-sensory (supporting) cells of the hearing organ in the cochlea detect tissue damage via the activation of TRPA1 channels and subsequently modulate cochlear amplification through active cellshape changes. We found that cochlear supporting cells of wild type but not Trpa1–/– mice generate inward currents and robust long-lasting Ca2+ responses after stimulation with TRPA1 agonists. These Ca2+ responses often propagated between different types of supporting cells and were accompanied by prominent tissue displacements. The most prominent shape changes were observed in pillar cells which here we show possess Ca2+-dependent contractile machinery. Increased oxidative stress following acoustic overstimulation leads to the generation of lipid peroxidation byproducts such as 4-hydroxynonenal (4-HNE) that could directly activate TRPA1. Therefore, we exposed mice to mild noise and found a longer-lasting inhibition of cochlear amplification in wild type than in Trpa1–/– mice. Our results suggest that TRPA1-dependent changes in pillar cell shape can alter the tissue geometry and affect cochlear amplification. We believe this novel mechanism of cochlear regulation may protect or fine-tune the organ of Corti after noise exposure or other cochlear injuries.

La viande rouge est un facteur de risque du cancer colorectal, considérée comme probablement cancérigène chez l'Homme. Le lien entre la viande rouge et le cancer colorectal impliquerait la lipoperoxydation induite par le fer héminique, aboutissant à la formation d'aldéhydes cytotoxiques présents dans les eaux fécales des rats ayant consommé de l'hème, dont le 4-hydroxynonénal (HNE). Ces eaux fécales ont préférentiellement induit la mort cellulaire dans des cellules coliques murines normales plutôt que dans des cellules coliques murines mutées pour le gène APC (adenomatous polyposis coli), considérées comme prénéoplasiques. Cette résistance des cellules prénéoplasiques est associée à une activité plus élevée du Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived)-like 2) par rapport aux cellules normales, mise en evidence par l'invalidation du Nrf2. Afin de valider l'importance des aldéhydes néoformés derives de la lipoperoxydation, nous avons optimisé la depletion des composes carbonyls dans les eaux fécales qui a aboli le différentiel de mortalité entre les cellules normales et prénéoplasiques. En utilisant des cellules épithéliales coliques humaines (CECH) afin de se rapprocher de la physiologie humaine, nous avons confirmé que le HNE et les eaux fécales des rats ayant consommé de l'hème ont aussi induit une mortalité plus élevée dans les CECHs normales que dans celles invalidées pour APC ; et qu'une activité de Nrf2 plus élevée est aussi observée dans ces dernières. L'autophagie, dont le niveau est plus élevé dans les CECHs invalidées pour APC, exercerait des effets protecteurs contre la toxicité du HNE et des eaux fécales en activant Nrf2. Globalement, nos résultats suggèrent que le Nrf2 et l'autophagie seraient impliqués dans la résistance des cellules prénéoplasiques suite à une exposition aux eaux fécales des rats ayant consommé de l'hème. Ce différentiel de résistance pourrait expliquer l'effet promoteur de la viande rouge sur la cancérogenèse colorectale, en établissant une sélection positive des cellules prénéoplasiques au détriment des cellules normales. / Red meat is a factor risk for colorectal cancer, considered as probably carcinogenic to humans. Red meat is associated to colorectal cancer through the oxidative properties of heme iron released in the colon. This latter is a potent catalyst for lipid peroxidation, resulting in the neoformation of deleterious aldehydes present in the fecal water of heme-fed rats, including 4-hydroxynonenal (HNE). Fecal water of heme-fed rats preferentially induced mortality in mouse normal colon epithelial cells than in those harboring mutation on APC (adenomatous polyposis coli) gene, considered as preneoplastic. This relative resistance of preneoplastic cells to fecal water of heme-fed rats was associated with their higher activity of Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) compared to normal cells, as evidenced by Nrf2 invalidation. To investigate the importance of secondary aldehydes derived from lipid peroxidation, depletion of carbonyl compounds in the fecal water was optimized and this turned out to abolish the difference of mortality between normal and preneoplastic cells. By using human colon epithelial cell (HCEC) lines to approach human physiology, we confirmed that HNE and fecal water of heme-fed rats also induced higher mortality in normal HCECs compared to APC-invalidated HCECs, and that higher Nrf2 activity in APC-invalidated HCECs was also associated with such a difference. Furthermore, autophagy, found to be up-regulated in APC-invalidated HCECs, was suggested to exert protective effects against HNE and fecal water toxicity by activating Nrf2. Taken together, these findings suggest that Nrf2 and autophagy were potentially involved in the resistance of preneoplastic cells upon exposure to HNE or fecal water of heme-fed rats. This different resistance could explain the promoting effect of red meat and heme-enriched diet on colorectal cancer, by initiating positive selection of preneoplastic cells over normal cells.

Le 4-hydroxy-2-nonénal (HNE), un aldéhyde --insaturé, produit secondaire de la peroxydation des acides gras polyinsaturés en n-6 qui est cytotoxique et génotoxique in vitro. Cet aldéhyde a été largement étudié dans divers états pathologiques dans lesquels sa formation est la conséquence d’un stress oxydant associé à un état inflammatoire. Cependant, outre sa formation endogène, le HNE peut également être formé à partir des lipides alimentaires, entraînant sa présence dans les aliments mais également sa néoformation dans le tractus digestif. Ainsi, le rôle du HNE est suspecté dans la cancérogénèse colorectale induite par le fer héminique. L’effet promoteur du fer héminique, présent en grande quantité dans la viande rouge, a été démontré dans des modèles animaux, aux stades prénéoplasique et tumoral et a également été associé à la lipoperoxydation luminale. Ce travail a eu pour vocation la caractérisation du métabolisme du HNE alimentaire et l’étude de son rôle dans la cancérogénèse colorectale associée à la consommation de viande rouge, en explorant un possible effet proinflammatoire. Au préalable, nous avons démontré expérimentalement l’effet initiateur du fer héminique dans la cancérogénèse colorectale en plus de l’effet promoteur déjà validé. Concernant l’étude de métabolisme, nous avons identifié et caractérisé les métabolites du HNE présents dans l’urine suite à une exposition par voie orale chez le rat grâce à une méthode de suivi isotopique. Les voies majeures de métabolisation du HNE ont été identifiées et quantifiées. De plus, de nouveaux métabolites urinaires tel que des conjugués thiométhyles et glucuronides ont été mis en évidence pour la première fois. Les études de cancérogénèse ont porté sur les effets co-initiateurs ou promoteurs des régimes. De plus, les liens entre l’inflammation et le cancer du côlon étant souvent évoqués dans la littérature, nous avons également testé les effets du HNE sur l’inflammation colique. Au cours d’études court terme chez le rat F344, nous avons démontré l’absence d’effet du HNE sur l’inflammation et la perméabilité colique. Dans l’étude de co-initiation testant l’effet d’un régime alimentaire contenant du fer héminique ou du HNE pendant 15 jours suivi d’une initiation chimique par l’azoxyméthane, nous avons démontré pour la première fois un effet co-initiateur du fer héminique mais pas du HNE sur la cancérogénèse colorectale, au stade prénéoplasique. Dans l’étude de promotion de la cancérogénèse colorectale sur rats chimio-induits, nous avons également démontré une absence d’effet au stade prénéoplasique d’un régime riche en HNE donné pendant 100 jours après la chimio-induction. En conclusion, cette thèse apporte : (i) une description précise des métabolites urinaires du HNE absorbé par voie orale, (ii) une première démonstration expérimentale de l’effet co-initiateur du fer héminique sous forme hémine, (iii) une démonstration de l’absence d’effet du HNE seul et aux doses testées sur la cancérogénèse colorectale et l’inflammation colique. / This thesis focuses on 4-hydroxynonenal (HNE), an --unsaturated aldehyde by-product of polyunsaturated fatty acids n-6 peroxidation, which is demonstrated to be cytotoxic and genotoxic in vitro. This aldehyde has been extensively studied in various pathological conditions in which its formation is the result of oxidative stress associated to inflammation. However, in addition to its endogenous formation, the HNE can also be formed from dietary fats, leading to its presence in food but also to its new formation in the digestive tract. The role of HNE is suspected in heme iron induced colorectal carcinogenesis. Indeed, it has been experimentally shown that heme iron, found in large amounts in red meat, increases the incidence of preneoplastic lesions in animal models concomitantly with luminal lipoperoxidation. This work aims at characterizing the metabolism of dietary HNE and at studying its role in colorectal carcinogenesis associated with red meat consumption, because HNE is suspected to be one of reactive intermediates between heme iron and the development of this cancer. Suspected pro-inflammatory effects have also been tested. Beforehand, we have experimentally validated the initiating effect of heme iron in colorectal carcinogenesis in addition to its promoting effect already demonstrated. Regarding the metabolism study, we identified and characterized HNE metabolites in urine following oral exposure in rats using a stable isotope tracking method. The major routes of metabolism of HNE were identified as oxidation of carbons 1 and 9 (ALDH and P450 CYP 4A), - oxidation and mercapturic acids derivatives. In addition, new urinary metabolites such as glucuronide conjugates and thiomethyl were highlighted for the first time. Regarding carcinogenicity studies on the co-initiating or promoting effect of diet, we used doses of heme iron or HNE that are representative of a diet rich in meat or of a highly peroxidized diet. Furthermore, as the links between inflammation and colon cancer are often mentioned in the literature, we also tested the effects of HNE on colonic inflammation. First of all, during 2 short term studies of 2 and 3 weeks in F344 rats, we demonstrated the lack of effect of HNE on colonic inflammation and permeability. In the co-initiation study in which rats where fed for 15 days with a diet rich in heme iron or HNE, followed by chemical initiation azoxymethane, we demonstrated a co-initiating effect of heme iron but not of HNE on colorectal carcinogenesis. In the promotion study, we also have shown the lack of effect of a diet rich in HNE given for 100 days using a chemically-induced carcinogenesis model in rats. In conclusion, this thesis provides: (i) a precise description of urinary metabolites of HNE absorbed orally, (ii) a first experimental demonstration of the co-initating effect of heme iron in hemin form, (iii) a demonstration of the lack of effect of HNE on colorectal carcinogenesis and inflammation.

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Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

OBJECTIF: Récemment, nous avons démontré que la modification du collagène type II (Col II) par le 4-hydroxynonénal (HNE), un produit de la peroxydation lipidique, est augmentée dans le cartilage arthrosique sans qu’on sache la signification de cette augmentation dans la pathogenèse de l’arthrose. L’objectif de cette étude vise à démontrer que cette modification affecte l’interaction chondrocytes/matrice extracellulaire (MEC) et en conséquence induit des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules. METHODES: Des plaques de culture ont été préalablement cotées avec du Col II puis traitées avec du HNE (0.1-2 mM) excepté le puits contrôle. Les chondrocytes ont été ensuite ensemencés puis incubés pendant 48 heures. La viabilité des cellules est évaluée par le test MTT. Le Western blot est utilisé pour mesurer l’expression des molécules d’adhésion (l’ICAM-1 et l’intégrine α1β1), de la cyclooxygenase-2 (COX-2), du Col II ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-κB-p65. La RT-PCR en temps réel est utilisée pour mesurer l’expression de l’ARNm de l’ICAM-1, des intégrines α1β1, de la COX-2 et de la métalloprotéinases-13 (MMP-13). La détermination de l’expression de l’ICAM-1 à la surface des cellules est réalisée par cytométrie de flux. Des kits commerciaux ont servi pour mesurer le niveau de la MMP-13, de la prostaglandine E2 (PGE2), de l’activité de la caspase-8 et de la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-κB-p65. RESULTATS: La modification du Col II par 0.2 mM HNE induit significativement l’expression des molécules d’adhésion telles que l’ICAM-1 et l’intégrine α1β1, de la MMP-13 sans avoir un effet sur la morphologie, la survie et le phénotype cellulaires. Nos résultats montrent aussi une forte augmentation de la phosphorylation de la p38 MAPK, d’ERK1/2 et de NF-κB-p65. Cependant, la modification du Col II par 2 mM HNE affecte la morphologie et la viabilité cellulaires et induit l’activité de la caspase-8. Elle inhibe fortement l’expression des integrines α1β1 et du Col II ainsi que la phosphorylation de l’ERK1/2 et de NF-κB-p65, mais par contre, induit significativement la production de la COX-2 et son produit la PGE2 ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK. Fait intéressant, le prétraitement des complexes HNE/Col II par 0.1 mM de carnosine empêche les changements phénotypiques et fonctionnels des chondrocytes. CONCLUSION : Ces nouveaux résultats suggèrent le rôle important de la modification du Col II par le HNE dans l’arthrose, en affectant le phénotype et le fonctionnement cellulaires des chondrocytes. La carnosine, par sa capacité de neutraliser le HNE, a révélé d’être un agent promoteur dans le traitement de l’arthrose. / OBJECTIVE: The regulation of cell phenotype and function by the surrounding environment is deeply altered by the oxidative modifications of extracellular matrix (ECM) components that modify their structural and functional properties. This modification may be one cause involved in cartilage degradation in osteoarthritis (OA). Type II collagen (Col II) was reported to be targeted for 4-hydroxynonenal (HNE) binding, a very reactive product of lipid peroxydation. In the present study, we investigated whether HNE-binding to Col II affects OA chondrocytes phenotype and function and then, we determined the protective role of carnosine treatment in preventing these changes. METHODS: Isolated human OA chondrocytes were seeded in control wells and in HNE/Col II adducts-coated plates and incubated afterwards for 48 hours. Adhesion molecules at protein and mRNA levels were determined by Western blotting, flow cytometry and real-time RT-PCR. Commercial kits were used to evaluate cell death, caspase-8 activity and levels of prostaglandin E2 (PGE2), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), MAPK and NF-κB-p65. Col II, cyclooxygenase-2 (COX-2), MAPK and NF-κB-p65 levels were assessed by Western blotting. RESULTS: After 48 hours of incubation, the modification of Col II by 0.2 mM HNE induced strongly the expression of ICAM-1, integrin α1β1, MMP-13 and slightly COX-2 as well as PGE2 release without affecting cell morphology and viability as well as Col II expression. However, the modification of Col II with 2 mM HNE induced shape changes of cells from typical chondrocyte-like polygon shape to round semi-detached, affecting cells viability and inducing caspase-8 activity. It inhibited the expression of ICAM-1, integrin α1β1 and Col II, but in contrast, induced strongly PGE2 release and COX-2 expression. All these effects were prevented by 0.1 mM carnosine treatment, an HNE trapping drug. Carnosine was added to HNE-modified, Col II-coated plates 1h before cell seeding. Upon examination of different signalling pathways involved in these responses, we found that modified Col II with 2 mM HNE inhibited strongly the phosphorylation of ERK1/2 and NF-κB-p65 but induced strongly p38 MAPK. In contrast, the results indicated that MAPK and NF-κB-p65 were activated when cells were incubated with modified Col II by 0.2 mM HNE. CONCLUSION: The interaction between chondrocytes and collagen-bound HNE modulates different signalling pathways via adhesion molecules regulation and consequently leads to the expression of catabolic and inflammatory factors. Carnosine was shown to be an efficient HNE trapping agent able to counteract these effects.

OBJECTIF: Récemment, nous avons démontré que la modification du collagène type II (Col II) par le 4-hydroxynonénal (HNE), un produit de la peroxydation lipidique, est augmentée dans le cartilage arthrosique sans qu’on sache la signification de cette augmentation dans la pathogenèse de l’arthrose. L’objectif de cette étude vise à démontrer que cette modification affecte l’interaction chondrocytes/matrice extracellulaire (MEC) et en conséquence induit des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules. METHODES: Des plaques de culture ont été préalablement cotées avec du Col II puis traitées avec du HNE (0.1-2 mM) excepté le puits contrôle. Les chondrocytes ont été ensuite ensemencés puis incubés pendant 48 heures. La viabilité des cellules est évaluée par le test MTT. Le Western blot est utilisé pour mesurer l’expression des molécules d’adhésion (l’ICAM-1 et l’intégrine α1β1), de la cyclooxygenase-2 (COX-2), du Col II ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-κB-p65. La RT-PCR en temps réel est utilisée pour mesurer l’expression de l’ARNm de l’ICAM-1, des intégrines α1β1, de la COX-2 et de la métalloprotéinases-13 (MMP-13). La détermination de l’expression de l’ICAM-1 à la surface des cellules est réalisée par cytométrie de flux. Des kits commerciaux ont servi pour mesurer le niveau de la MMP-13, de la prostaglandine E2 (PGE2), de l’activité de la caspase-8 et de la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-κB-p65. RESULTATS: La modification du Col II par 0.2 mM HNE induit significativement l’expression des molécules d’adhésion telles que l’ICAM-1 et l’intégrine α1β1, de la MMP-13 sans avoir un effet sur la morphologie, la survie et le phénotype cellulaires. Nos résultats montrent aussi une forte augmentation de la phosphorylation de la p38 MAPK, d’ERK1/2 et de NF-κB-p65. Cependant, la modification du Col II par 2 mM HNE affecte la morphologie et la viabilité cellulaires et induit l’activité de la caspase-8. Elle inhibe fortement l’expression des integrines α1β1 et du Col II ainsi que la phosphorylation de l’ERK1/2 et de NF-κB-p65, mais par contre, induit significativement la production de la COX-2 et son produit la PGE2 ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK. Fait intéressant, le prétraitement des complexes HNE/Col II par 0.1 mM de carnosine empêche les changements phénotypiques et fonctionnels des chondrocytes. CONCLUSION : Ces nouveaux résultats suggèrent le rôle important de la modification du Col II par le HNE dans l’arthrose, en affectant le phénotype et le fonctionnement cellulaires des chondrocytes. La carnosine, par sa capacité de neutraliser le HNE, a révélé d’être un agent promoteur dans le traitement de l’arthrose. / OBJECTIVE: The regulation of cell phenotype and function by the surrounding environment is deeply altered by the oxidative modifications of extracellular matrix (ECM) components that modify their structural and functional properties. This modification may be one cause involved in cartilage degradation in osteoarthritis (OA). Type II collagen (Col II) was reported to be targeted for 4-hydroxynonenal (HNE) binding, a very reactive product of lipid peroxydation. In the present study, we investigated whether HNE-binding to Col II affects OA chondrocytes phenotype and function and then, we determined the protective role of carnosine treatment in preventing these changes. METHODS: Isolated human OA chondrocytes were seeded in control wells and in HNE/Col II adducts-coated plates and incubated afterwards for 48 hours. Adhesion molecules at protein and mRNA levels were determined by Western blotting, flow cytometry and real-time RT-PCR. Commercial kits were used to evaluate cell death, caspase-8 activity and levels of prostaglandin E2 (PGE2), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), MAPK and NF-κB-p65. Col II, cyclooxygenase-2 (COX-2), MAPK and NF-κB-p65 levels were assessed by Western blotting. RESULTS: After 48 hours of incubation, the modification of Col II by 0.2 mM HNE induced strongly the expression of ICAM-1, integrin α1β1, MMP-13 and slightly COX-2 as well as PGE2 release without affecting cell morphology and viability as well as Col II expression. However, the modification of Col II with 2 mM HNE induced shape changes of cells from typical chondrocyte-like polygon shape to round semi-detached, affecting cells viability and inducing caspase-8 activity. It inhibited the expression of ICAM-1, integrin α1β1 and Col II, but in contrast, induced strongly PGE2 release and COX-2 expression. All these effects were prevented by 0.1 mM carnosine treatment, an HNE trapping drug. Carnosine was added to HNE-modified, Col II-coated plates 1h before cell seeding. Upon examination of different signalling pathways involved in these responses, we found that modified Col II with 2 mM HNE inhibited strongly the phosphorylation of ERK1/2 and NF-κB-p65 but induced strongly p38 MAPK. In contrast, the results indicated that MAPK and NF-κB-p65 were activated when cells were incubated with modified Col II by 0.2 mM HNE. CONCLUSION: The interaction between chondrocytes and collagen-bound HNE modulates different signalling pathways via adhesion molecules regulation and consequently leads to the expression of catabolic and inflammatory factors. Carnosine was shown to be an efficient HNE trapping agent able to counteract these effects.

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