Die moderne Gefäßchirurgie bedient sich bei hohen Stadien der pAVK, spezieller Gefäßrekonstruktionen in Form von distalen End-zu-Seit-Gefäßanastomosen. Das langfristige Versagen der Gefäßanastomose hängt primär von der Entstehung einer subendothelialen Intimahyperplasie (IH) ab. Diese IH-Gebiete befinden sich je nach Anastomosengeometrie im Gebiet der Hauben- und Fersenzone sowie am Boden der Anastomose. // Mit Hilfe der Particle Image Velocimetry-Technik wird eine Taylor-Patch-, eine Miller-Cuff-Anastomose und eine femoro-crurale Patch-Prothese bezüglich ihrer Flussmuster sowie ihrer hämodynamischen Eigenschaften wie Geschwindigkeit, Scherstress und Rotation in z-Richtung (Vorticity) untersucht. // In einem hydrodynamischen Kreislaufmodell werden elastische, transparente Silikonmodelle der Anastomosen hergestellt und mit einem blutanalogen Newtonschen Fluid (Glycerol-Wasser-Gemisch) unter Simulation der femorocruralen Druckkurve, pulsatil bei Variation der Strömungsbedingung perfundiert. Der periphere Widerstand beträgt 0,5 mmHg/ml/min (PRU) und die Phasenverschiebung -12 Grad (zwischen Druck- und Flusskurve). // Die Flussmuster variieren zwischen den unterschiedlichen Ausstromverhältnissen erheblich. Bei den unterschiedlichen Flussstärken hingegen ähneln sich die Flussmuster. Alle drei Modelle zeigen ausgeprägte Flussseparationszonen im Hauben- und Fersengebiet sowie geometrieabhängig auch eine Stagnationszone am Boden. Diese Bereiche wiesen die geringsten Fluidgeschwindigkeiten, deutlich unter normalem Wandscherstressniveau liegende Scherstressverhältnisse sowie geringe Vorticitywerte auf. Im Bereich der Übergangszonen finden sich hohe Scherstress- sowie Vorticitywerte. Geschwindigkeitsunterschiede des Fluids zeigten sich im Bereich der Ausstromsegmente. Variable Stressverteilungen zeigen sich auch innerhalb der Separationszonen. Eine Erklärung für die unterschiedlich beschriebenen Offenheitsraten der drei Anastomosenformen wird durch diese Arbeit nicht gefunden. / Modern vascular surgery uses special termino-lateral anastomoses for treating high levels of peripheral arterial disease (PAD). Long term stenoses and occlusions of vascular anastomoses mostly depend on the development of subendothelial myointimal hyperplasia (MIH). There are characteristic areas within the anastomoses, where this process can be examined: The heel, the tow and the floor zone. // This examination observes local hemodynamics like velocity, shear stress and vorticity (rotation in z-direction) and flow patterns of a Taylor-Patch-, a Miller-Cuff-Anastomosis and a feroro-crural patch prothesis (FCPP) with the usage of a Particle Image Velocimetry. In a hydrodynamic circulation model various elastic, transparent silicon phantoms of termino-lateral anastomoses are perfused with a Newton fluid blood analogon (glycerol-water mixture) while simulating the femorocrural pressure curve in a pulsatile manner under variation of the flow conditions. The outflow resistance is 0.5 mmHg/ml/min (PRU, peripheral resistance units) and a phase shift of -12° between flow and pressure curve is simulated. // The flow patterns differed extremely in accordance of the various outflow ratios. Using different flow intensity, the flow patterns are very similar. // All three anastomoses show characteristic heel and toe separation zones. In the FCPP centre a stagnation zone on the floor can not be examined. Shear stress inside the flow separations was significantly lower than normal wall shear stress. High shear stress levels were found inside the transition zones between flow separation and high velocity mainstream. An explanation for the different stenoses and occlusions time of the three different anastomoses can not be found.

L’hyperplasie bilatérale macronodulaire des surrénales (HBMS) conduit au développement de nodules corticosurrénaliens bilatéraux entraînant un syndrome de Cushing diagnostiqué souvent au cours de la cinquième décennie. L’étiologie de cette maladie n’était que partiellement connue mais le caractère bilatéral de l’atteinte surrénalienne et l’observation de cas familiaux suggéraient, au début de ce travail, une origine génétique. L’analyse de l’ADN tumoral et leucocytaire d’une série de 33 patients opérés a permis de mettre en évidence chez 25% des patients une perte d’hétérozygotie neutre en nombres de copies (LOH) de tout le bras court du chromosome 16 (16p) au niveau du tissu surrénalien. Un séquençage complet du génome de 5 patients (ADN germinal et tumoral) a permis de mettre en évidence une mutation du gène ARMC5 localisé en 16p pour 4 patients. Le séquençage direct des parties codantes d’ARMC5 à partir de l’ADN somatique et germinal de l’ensemble des patients opérés de la cohorte a montré qu’au total, 55% des patients avaient une mutation d’ARMC5. L’inactivation du gène se fait selon la théorie de Knudson (un événement germinal inactivant le premier allèle associé à un autre événement somatique inactivant le second allèle) ce qui laisse supposer qu’ARMC5 est un gène suppresseur de tumeur. L’analyse de la cohorte d’HBMS de nos collaborateurs américains au National Institute Health (laboratoire de CA. Stratakis, Bethesda, USA) a permis de confirmer que les mutations d’ARMC5 étaient un événement fréquent. Des variants de ce gène sont aussi associés à l’hypertension à rénine basse chez les patients noirs-américains. Afin de déterminer des corrélations génotype-phénotype, notre cohorte initiale a été élargie pour constituer une série consécutive de 98 cas index de patients présentant des formes légères à sévères de la maladie, opérées ou non. Vingt-quatre patients (25%) présentaient une altération d’ARMC5. Par ailleurs, 31 nodules surrénaliens de 19 patients ont été analysés en somatique. Le second événement était une mutation dans 68% des cas et une LOH du locus pour les 32% restant. Chez un même patient, le second événement était différent dans chaque nodule présenté. Les patients mutés avaient un syndrome de Cushing plus sévère cliniquement et biologiquement par rapport aux patients non mutés. La taille de leurs surrénales étaient plus grandes avec un plus grand nombre de nodules. Les patients mutés étaient aussi plus jeunes au diagnostic et plus souvent hypertendus. Ces patients étaient ainsi plus souvent opérés. La fonction de la protéine ARMC5 n’était pas connue lors de son identification comme gène de l’HBMS. In vitro, la surexpression du gène sauvage induit l’apoptose. La surexpression des mutants faux-sens et du mutant p.F700del retrouvés chez les patients entraîne moins d’apoptose qu’ARMC5 sauvage. La protéine ARMC5 contient des domaines Armadillo et BTB, connus pour être impliqués dans l’interaction protéine-protéine. En physiologie, l’ACTH stimule la production d’AMPc et la voie de la protéine kinase A (PKA) est impliquée dans différentes pathologies corticosurrénaliennes. Nous avons pu montrer qu’ARMC5 interagissait avec la sous-unité catalytique alpha de la PKA. L’invalidation d’ARMC5 conduit in vitro à une diminution de l’expression d’enzymes de la stéroïdogénèse, de la production de cortisol et une diminution de l’activité PKA. Ainsi, l’hypothèse pour expliquer les HBMS liées à une inactivation d’ARMC5 est que la perte d’apoptose conduit à une hyperplasie nodulaire du tissu corticosurrénalien et que, même si la production de cortisol est diminuée à l’échelle unicellulaire, l’effet de masse global conduit au total à un hypercortisolisme. Nos travaux ont donc identifié et caractérisé un premier gène causal, ARMC5, fréquemment impliqué dans l’HBMS et associé à des formes plus sévères de la maladie. Cette découverte ouvre des perspectives pour le diagnostic familial et la prise en charge des patients. (...) / Primary bilateral macronodular adrenal hyperplasia (PBMAH) is a rare cause of adrenal Cushing’s syndrome and bilateral adrenal tumors. We suspected a genetic origin of the disease on the basis of the report of some familial cases and the involvement of both adrenal glands. The aim of this study was to find a genetic cause of non syndromic PBMAH. To look at chromosomal abnormalities, we use single-nucleotide polymorphism (SNP) arrays and microsatellite markers analysis in a first series of 33 patients all operated for PBMAH. We realize whole genome sequencing of 5 patients (blood and tumor DNAs matched). Then we genotyped by Sanger sequencing the gene Armadillo Repeat Containing 5 (ARMC5) in this first series and 66 additional patients. Clinical data were collected to establish genotype-phenotype correlation. In addition, the cohort of patients of our collaborators at the National Institute Health (Dr. Stratakis, Bethesda, USA) was studied. The effects of ARMC5 inactivation and overexpression and the partners of the protein were sought in cell-culture models. The most frequent somatic alteration was a loss of heterozygosity at 16p observed in tumors of 25% of the patients. The gene ARMC5, located at 16p11.2, was the most frequently mutated by whole genome sequencing: a mutation was found in 4/5 patients. 55% of the patients of the first cohort (33 patients treated by adrenalectomy for PBMAH) had ARMC5 alteration. One patient presented with germline microdeletion of the locus identified by SNP array. Every patient had two events: either a mutation or a deletion at the germline level, either a second mutation or a LOH at the somatic level. We showed that the two events were present on different alleles suggesting that ARMC5 is a tumor suppressor gene. In addition, we showed for several patients that the second hit was different in each adrenal nodules of a same patient. This first cohort included only operated patients with serious forms of the disease. The study of the American cohort and the analysis of the total cohort of our lab including non-operated patients and milder forms showed an alteration of ARMC5 in about 25% of the patients. Genotype-phenotype correlation showed that ARMC5 defects are associated with younger age at the diagnosis, higher hypercortisolism, bigger adrenals and higher number of nodules. In addition, a mutation of ARMC5 was shown in a patient with a PBMAH secreting both aldosterone and cortisol. Analysis of a series of patient affected by primary hyperaldosteronism suggested that ARMC5 may be associated with hypertension especially in African-American subjet. Overexpression of ARMC5 leads in vitro to cell apoptosis. We showed that this apoptosis was reduced when transfecting vector harboring missense mutations or single amino-acid deletion found in our cohort. Invalidation of ARMC5 leads to a decreased steroidogenic enzymes expression, cortisol production and reduced protein kinase A (PKA) activity. We showed that ARMC5 interacts with the calaytic subunit alpha of the PKA dissociated from the cAMP-bound regulatory subunits. More than one quarter of sporadic PBMAH patients present a pathogenic germline ARMC5 defect and these index cases present a more severe disease. Systematic genotyping of ARMC5 may help for early diagnosis of PBMAH, familial counseling, and patients’ management. ARMC5 appears to be a new regulator of PKA and might represent a new target for the development of pharmacological agents controlling PKA function and cortisol production.

Die fokale noduläre Hyperplasie (FNH) ist der zweithäufigste gutartige Lebertumor. Die sonografischen Befunde von 161 Patienten mit FNH wurden retrospektiv ausgewertet. Die FNH erschien lobuliert (94%) und scharf abgrenzbar (85%). In 96% der Fälle war ein zentraler Narbenstern nachzuweisen. Bei Verfettung des umgebenden Leberparenchyms zeigte sich die Raumforderung überwiegend reflexarm. Ein echoarmes Halo wurde in 22% beobachtet; intratumorale Verkalkungen traten in 15% der Fälle auf. Im nativen Doppler erschien die FNH zu 97% als gefäßreicher Herd. Die Tumorarterien wiesen im Mittel einen geringen Widerstand (RI 0,42+/-0,11) bei niedriger Pulsatilität auf (PI 0,57+/-0,20). Die mittlere Differenz zwischen den RI der Tumorarterien und dem der Arteria hepatica communis betrug 0,34+/-0,13. In einer weiteren Studie wurde das Verhalten von 138 FNH unter Einsatz eines Echosignalverstärkers mit der Power-Doppler-Sonographie und 2nd Harmonic Imaging untersucht. Bei 26 Läsionen war die Diagnose von vornherein gesichert, 112 wurden prospektiv als Raumforderung unklarer Dignität untersucht. Die retrospektive Untersuchung zeigte, dass ein charakteristischer Ablauf der Tumorkontrastierung auftritt. Entsprechend dem niedrigen Gefäßwiderstand begann der Mikroblaseneinstrom in die Läsion sehr frühzeitig. In der früharteriellen Phase kontrastierte sich das zuführende Gefäß mit zentrifugaler Auffüllung radspeichenartig angordneter Tumorarterien entlang der Narbensepten. In der Kapillarphase war die Läsion scharf und signalintensiv abzugrenzen. Das Kontrastierungsmaximum lag in der Portalphase. In der prospektiven Untersuchung von 112 unklaren Raumforderungen gelang die Diagnose der FNH nach diesen Kriterien in 94% der Fälle. In den übrigen 6% wurde zumindest eine bösartige Neubildung ausgeschlossen. Die FNH kann unter Einsatz eines Echosignalverstärkers sonographisch ausreichend sicher diagnostiziert werden. Beim Nachweis der kontrastspezifischen Kriterien ist die Biopsie nicht notwendig. Voraussetzung ist ein erfahrener Untersucher. Neben weit geringerer Kosten bei einfacher Handhabung und vertretbarem technischen Aufwand stellt die Vermeidung der Strahlenbelastung durch CT oder Szintigraphie einen Gewinn für die Patienten dar. Ein abwartendes Verhalten bei einer FNH ist gerechtfertigt, da tumorbedingte Beschwerden selten und Komplikationen der Neoplasie rar sind. Zusätzlich kann in der zweiten Hälfte des Lebens von einer spontanen Regression der fokalen nodulären Hyperplasien ausgegangen werden. / Focal nodular hyperplasia (FNH) is the secondmost of the benign liver tumors. The sonografic findings of 161 patients with FNH were retrospectively evaluated. The FNH appeared lobulated (94%) and sharply definable (85%). In 96% of the cases there was to be proven a central starlike scar. In case of a fatty surrounding liverparenchyma the tumor was presented reflex-poor. An echo-poor halo was observed in 22%; intratumorale calcification was present in 15%. In the native Doppler the FNH appeared hypervascular in 97%. The arteries of the tumor pointed on the average a slight resistance (RI 0,42+/-0,11) with low pulsatility (PI 0,57+/-0,20). The difference between the RI of the arteries of the tumor and that of the Arteria hepatica communis amounted 0,34+/-0,13. In a further study the behavior was examined by 138 FNH under employment of a contrastenhancer with the power Doppler sonografie and 2nd Harmonic Imaging. With 26 lesions the diagnosis was from the beginning secured, while 112 tumors of unclear dignity were examined prospektivly. The retrospective investigation showed that a characteristic operational sequence of the tumor contrasting arises. According to the low resistance the micro blister influx began into the lesion very fast. In the early arterial phase the tumor feeding artery contrasted with centrifugal filling and a spokewheel like sign along the fibrotic central scar. In the capillary phase the lesion was to be defined sharply and signal-intensively. The contrast maximum lay in the portal phase. In the prospektive investigation of 112 unclear tumors the diagnosis of the FNH succeeded according to these criteria in 94%. In the other 6% at least a malign new formation was excluded. The FNH can be diagnosed sonografically sufficient under employment of a contrastenhancer. With the proof of the contrast-specific criteria the biopsy is not necessary. An experienced examiner is necessary. Beside far smaller costs with simple handling and justifiable technical expenditure the avoidance of the radiation dose represents a profit by CT or Szintigraphie for the patients. A cautious behavior with a FNH is justified, because tumor-conditioned complaints and complications of neoplasia are rare. Further on a spontaneous involution of focal nodular hyperplasias can be proceeded in the second half of the life.

L'expression anormale de récepteurs hormonaux couplés aux protéines Gs (RCPG) a été mise en évidence dans des tumeurs cortico-surrénaliennes. Ces récepteurs contrôlent la sécrétion du cortisol, mais leur rôle dans la formation tumorale n'a pas été démontré. Nous avons utilisé un modèle de tumorigenèse cortico-surrénalienne permettant l'expression des gènes de deux récepteurs, le GIPR et le LHR, dont l'implication dans les manifestations cliniques d'hypercortisolisme a été bien établie. La formation de tissus hyperprolifératifs et hyperfonctionnels, d'aspect tumoral bénin, démontre pour la première fois que l'expression ectopique d'un seul gène de RCPGs (le GIPR ou le LHR) a un rôle initiateur de la tumorigenèse cortico-surrénalienne. Nous avons également caractérisé in vivo et in vitro un cas clinique de syndrome de Cushing sensible aux catécholamines, secondaire à une hyperplasie surrénalienne où nous avons démontré la surexpression du récepteur β2-adrénergique. La sécrétion de cortisol était aussi dépendante d'autres médiateurs tels que la 5-HT, l'AVP et l'ACTH sécrété localement de façon ectopique. En conclusion, l'expression d'un RCPG suffit pour induire la formation d'une tumeur bénigne cortico-surrénalienne. Des anormalités mixtes peuvent être présentes dans ce type de tumeur. Ce modèle permettra d'étudier les étapes de progression tumorale cortico-surrénalienne ainsi que l'effet d'autres types de GPCR et les alternatives thérapeutiques dans ce type de pathologie.

Der PTEN/PI3K/AKT-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Proliferation, Migration und Apoptose. Mäuse mit Defekten innerhalb dieses Signalweges weisen multiple Veränderungen in B- und T-Zell- Homöostase auf, welche zu Thymushyperplasie, Lymphadenopathie, Auto- immunität und Lymphomen führen können. Die Entwicklung und der Erhalt von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen ist vom PTEN/PI3K/AKT-Signalweg abhängig. Die immunologischen Konsequenzen von PTEN-Defekten beim Menschen sind bisher nicht verstanden. Aufgrund dieser Tatsache wurden sechs Patienten mit PTEN-Hamartom-Tumor-Syndrom auf immunologische Veränderungen unter- sucht. Die gefundenen Dysregulationen beinhalteten Thymushyperplasie, Tonsillenhypertrophie und ausgedehnte lymphoide Hyperplasien des oberen und unteren Gastrointestinaltraktes. Eine erhöhte Anzahl von naiven Lymphozyten zirkuliert im peripheren Blut und akkumuliert in lymphoiden Organen. Intestinale lymphoide Hyperplasien waren mit einer gesteigerten Phosphorylierung von AKT assoziiert, zeigten jedoch normale Proliferation in T-Zell-Zonen sowie eine normale Verteilung CD3+Foxp3+ T-Zellen. Foxp3+ T-Zellen zeigten jedoch eine gesteigerte Proliferation und Aktivierung des mTORC1-Pfades in situ, was auf einen Schwelleneffekt für PTEN-Aktivität hinweisen könnte. Auffällig war eine reduzierte Apoptose bei gleichzeitig gesteigerter Proliferation und erhöhter mTOR- Aktivität bei CD20+CD10+ B-Zellen des Keimzentrums. Diese Daten zeigen, dass ein Verlust von PTEN-Aktivität auch beim Menschen mit Defekten in B- und T-Zell- Homöostase assoziiert ist. Dies führt zur Akkumulation von Lymphozyten und intestinaler lymphoider Hyperplasie bei weitgehend erhaltener Immunkompetenz.

Les bones morphogenetic protein (Bmp) sont des morphogènes qui jouent des rôles sur la prolifération et la différenciation cellulaire. La perte de signalisation dans cette voie est associée à la polypose juvénile familiale et à un risque accru de cancer gastrique. Elle est aussi associée avec l’inflammation et la guérison des tissus. Il est montré qu’au niveau de l’estomac, les ligands et les récepteurs de la signalisation des Bmp sont exprimés dans les compartiments épithéliaux et mésenchymateux. Les différents modèles animaux développés ont confirmé l’importance de cette signalisation dans la carcinogenèse gastrique. Cependant, ces modèles causent une perte de signalisation dans l’ensemble de la muqueuse gastrique et ne réussissent pas à montrer un mécanisme. Parallèlement, notre laboratoire a montré qu’une perte de signalisation de la voie des Bmp, exclusivement dans le compartiment épithélial, ne développe pas les phénotypes associés à la progression du cancer gastrique. Ce résultat suggère que les cellules mésenchymateuses pourraient être la clé de l’importance de la signalisation des Bmp dans l’estomac. Afin de mettre en lumière le rôle de la signalisation des Bmp dans le compartiment mésenchymateux, des souris qui perdent de façon spécifique le récepteur de type 1a des Bmp dans ce compartiment ont été généré (Bmpr1aMES). Il semble que la perte de signalisation des Bmp induit au niveau du mésenchyme une modification du comportement et une activation des fibroblastes en myofibroblastes. Cette modification produit également un microenvironnement (matrices, facteurs de croissance, cytokines, interleukines) propice au développement du cancer et induire des modifications importantes de l’épithélium et un appel de cellules immunitaires. Cet environnement semble être suffisant pour réduire de façon importante le nombre de cellules endocriniennes et de cellules pariétales dans l’épithélium gastrique. Il semble que la perte mésenchymateuse de signalisation des Bmp au niveau gastrique entraîne le développement d’une métaplasie au niveau de l’estomac des souris, une hyperplasie atypique qui évolue jusqu'à une dysplasie accompagnée d’une desmoplasie importante. Mes travaux ont également démontré que, dans ce contexte, une mutation oncogénique, comme la perte de Trp53, pourrait devenir maligne. En conclusion, au sein du mésenchyme, la signalisation des Bmp est importante pour le maintien de celui-ci dans un état sain. Il est probable qu’elle joue un rôle important dans le retour à l’état normal suivant les gastrites. Sa perte rend l’estomac des souris fragile au développement d’adénomes. / Abstract : Bone morphogenetic proteins (Bmp) play roles in the proliferation and differentiation. It is also associated with inflammation and tissue repair. Disruption of signaling in this pathway is associated with familial juvenile polyposis and an increase risk of gastric cancer. It has been shown that in the stomach, Bmp signaling is bidirectional. Meaning that ligands and receptors are expressed in both the epithelial and stromal compartments. Gastric abrogation animal models of the Bmp signaling pathway have confirmed the importance of this signaling in gastric carcinogenesis. However these models cause a loss of signaling in both compartments of the gastric mucosa, and the mechanism of action for this has yet been undefined. Previous work by a student in our laboratory provided a model of loss of the Bmp signaling pathway exclusively in the epithelial compartment. This model does not develop phenotypes associated with the progression of gastric cancer, suggesting, that the stromal compartment is the key in tumorigenesis by Bmp signaling in the stomach. To further test this hypothesis, we generated mice with a stromal compartment-specific loss of type1a BMP receptor (Bmpr1aMES). It appears that this deletion in the stroma induced behavior alteration with activation of fibroblasts into myofibroblasts. This change also produces a microenvironment (matrix, growth factors, cytokines, and interleukins) that is conducive to the development of cancer and induces significant modifications of the epithelium as well as a recruitment of immune cells. This microenvironment seems to be sufficient to significantly reduce the number of endocrine cells and parietal cells in the gastric epithelium. It seems that the loss of stromal Bmp signaling in the mice’s stomachs causes development of metaplasia; atypical hyperplasia that progresses to dysplasia accompanied by a significant desmoplasia. My work also shows that in this environment an oncogenic mutation such as the loss of Trp53 may become malignant. In conclusion, in the stromal compartment, Bmp signaling is important for maintaining a healthy state. It is probably involved in the return to the normal state following gastritis, and its loss makes the mouse stomach susceptible to adenoma development.

Le déficit en 21-hydroxylase est la cause la plus fréquente des hyperplasies congénitales des surrénales. Un grand nombre de nouvelles mutations a été trouvé dans le laboratoire qui centralise la plus grande cohorte de familles au niveau international et l’évaluation de leur sévérité était primordiale pour optimiser la prise en charge des patients (thérapeutique, conseil génétique). Grâce à l’analyse approfondie du phénotype des patients et au développement d’études fonctionnelles (in vitro, in silico), nous avons pu évaluer le retentissement de la plupart des 85 nouvelles mutations ; nous avons choisi comme témoins des mutations fréquentes de sévérité connue et nous avons comparé nos résultats avec ceux de la littérature. L’analyse plus approfondie d’une quinzaine de mutations rares a confirmé l’existence de bonnes corrélations phénotype-génotype comme ceci est décrit dans cette pathologie. Par ailleurs, les études structurales que nous avons développées ont permis d’améliorer les connaissances sur les relations structure-fonction des cytochromes P450 en général. / Steroid 21-hydroxylase deficiency is the most common enzymatic defect causing congenita ladrenal hyperplasia. A large number of new mutations has been detected in the laboratory, which centralizes the biggest cohort of families in the world, and evaluation of their severity wasessential to optimize the care of the patients (treatment, genetic counselling). Thanks to detailed analysis of the patients phenotype and to the development of functional studies (in vitro, in silico), we were able to evaluate the severity of most of the 85 novel mutations; we decided touse as controls frequent known mutations and to compare our results with those of literature. Themore detailed analysis of about fifteen rare mutations confirmed the existence of goodcorrelations phenotype-genotype as this is described in this pathology. Moreover, the structural studies we developed led to improve the knowledge on structure-function relationship of theP450 cytochromes family.

Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is an autosomal recessive disease that causes a disorder of steroidogenesis in the adrenal cortex. This disease is a part of a panel of diseases searched in preclinical nationwide neonatal screening. The methodology is based on measuring the concentration of 17-hydroxyprogesterone (17-OHP) in a dried blood spot using fluorescence immunoassay (FIA). However, this determination is not entirely specific and generates a high rate of false positive results (up to 4.3 %). In this diploma thesis the LC-MS / MS method was developed. This method measures selected steroid hormones involved in cortisol metabolism with respect to the diagnosis of CAH disease. The method was validated and applied to clinical samples, it identified CAH patients from negative controls and significantly reduced the false positivity of neonatal screening results. Compared to the FIA results, the LC-MS / MS method reduced false positivity up to 50 % by evaluating the concentration of 17-OHP. Moreover, by extending the diagnostic algorithm with other measured markers, the reduction was enhanced up to 98%. The developed method is also applicable for the measurement of serum and plasma samples, respectively, and has become a part of the confirmation tests for suspected CAH screening findings. Key...

Der PTEN/PI3K/AKT-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Proliferation, Migration und Apoptose. Mäuse mit Defekten innerhalb dieses Signalweges weisen multiple Veränderungen in B- und T-Zell- Homöostase auf, welche zu Thymushyperplasie, Lymphadenopathie, Auto- immunität und Lymphomen führen können. Die Entwicklung und der Erhalt von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen ist vom PTEN/PI3K/AKT-Signalweg abhängig. Die immunologischen Konsequenzen von PTEN-Defekten beim Menschen sind bisher nicht verstanden. Aufgrund dieser Tatsache wurden sechs Patienten mit PTEN-Hamartom-Tumor-Syndrom auf immunologische Veränderungen unter- sucht. Die gefundenen Dysregulationen beinhalteten Thymushyperplasie, Tonsillenhypertrophie und ausgedehnte lymphoide Hyperplasien des oberen und unteren Gastrointestinaltraktes. Eine erhöhte Anzahl von naiven Lymphozyten zirkuliert im peripheren Blut und akkumuliert in lymphoiden Organen. Intestinale lymphoide Hyperplasien waren mit einer gesteigerten Phosphorylierung von AKT assoziiert, zeigten jedoch normale Proliferation in T-Zell-Zonen sowie eine normale Verteilung CD3+Foxp3+ T-Zellen. Foxp3+ T-Zellen zeigten jedoch eine gesteigerte Proliferation und Aktivierung des mTORC1-Pfades in situ, was auf einen Schwelleneffekt für PTEN-Aktivität hinweisen könnte. Auffällig war eine reduzierte Apoptose bei gleichzeitig gesteigerter Proliferation und erhöhter mTOR- Aktivität bei CD20+CD10+ B-Zellen des Keimzentrums. Diese Daten zeigen, dass ein Verlust von PTEN-Aktivität auch beim Menschen mit Defekten in B- und T-Zell- Homöostase assoziiert ist. Dies führt zur Akkumulation von Lymphozyten und intestinaler lymphoider Hyperplasie bei weitgehend erhaltener Immunkompetenz.

Les glucocorticoïdes (GC), généralement sécrétés par le cortex surrénalien, exercent de très nombreuses fonctions dans l’organisme, via leur liaison au récepteur des glucocorticoïdes (GR). Les rares mutations inactivatrices du GR déjà décrites, sont responsables d’un syndrome de résistance aux GC et peuvent conduire à une hypertension artérielle (HTA), une hyperplasie surrénalienne (HBS), un hirsutisme et une obésité. Dans ce travail, nous avons caractérisé fonctionnellement 13 variants hétérozygotes du GR (expression, transactivation, localisation subcellulaire,...). Six variants du GR, découverts par séquençage à haut débit (NGS) ne sont pas pathogènes alors que 7 mutations hétérozygotes originales délétères ont été identifiées dans le cadre du protocole hospitalier de recherche clinique (Muta-GR). Ce PHRC a permis de préciser une prévalence à 5% de mutations inactivatrices du GR dans une cohorte de 100 patients avec HBS associée à une HTA et/ou un hypercortisolisme biologique sans signe clinique de Cushing.Une haploinsuffisance du GR, démontrée par la diminution d’induction par la déxamethasone du gène cible FKBP5, a été mise en évidence dans les fibroblastes cutanés de certains patients porteurs de mutations inactivatrices du GR. Ces patients présentent souvent un hypercorticisme avec hypokaliémie, aldostérone et rénine basse, signant un pseudohyperaldostéronisme. Nous avons démontré que le gène HSD11B2 codant pour l’enzyme 11β-HSD2, assurant l’inactivation des GC, est une cible directe du GR comme démontré par transfection transitoire de gène-rapporteur, RT-qPCR, LC/MSMS et ChIP. L’établissement des modèles de knock-in de mutations GR par stratégie Crispr/cas9 dans des lignées cellulaires préadipocytaires ou corticosurrénaliennes humaines s’est soldé par un échec. Ce travail devrait faciliter la sélection des patients chez qui la recherche de mutation inactivatrice du GR doit être faite et invite à un suivi régulier de ces patients. / Glucocorticoids (GC) regulate many essential biological functions by activating the glucocorticoid receptor (GR). GR loss-of function mutations are responsible for GC resistance syndrome, often associated with high blood pressure, hirsutism, bilateral adrenal hyperplasia (BAH) and obesity. Herein, functional characterization of 13 GR variants is presented (expression and binding studies, transactivation assays, subcellular localization) 6 variants were discovered with next-generating sequencing and had no functional impact on GR signaling while 7 GR loss-of-function mutations were mainly discovered during the National Clinical Hospital Research Program, Muta-GR. This PHRC discloses a 5% prevalence of GR loss-of-function mutations in a cohort of 100 patients with BAH, biological hypercortisolism and/or hypertension without Cushing signs. A GR haploinsuffisiency was demonstrated by a reduced dexamethasone-induced FKBP5 expression in skin fibroblasts of some patients harbouring GR loss-of-function mutations. These patients often presented with hypercorticism, hypokalemia, low renin and aldosterone levels, consistent with a pseudohypermineralocorticism. We showed that HSD11B2 encoding the 11β-HSD2 enzyme inactivating GC, is a direct GR target gene by transient transfection of reporter gene, RT-qPCR, LC/MSMS and ChIP. We failed to introduce GR loss-of-function mutations in human preadipocytes and adrenocortical cells by Crispr/Cas 9 technology. This work should facilitate selection of patients in whom GR mutation may be search, enabling an appropriate follow-up.