L'encéphalopathie hypoxique ischémique néonatale (EHI) reste la cause principale de mortalité chez le nouveau-né à terme. Un tiers des survivants vont développer des séquelles neurologiques, dont la paralysie cérébrale (PC), l'épilepsie et un retard intellectuel. Afin d'améliorer leur pronostic, ces nouveau-nés sont soumis à l'hypothermie thérapeutique (HT) qui débute au plus tard 6 heures après la naissance, pour une durée totale de 72 heures, suivie d'un réchauffement graduel (0.5°C/h). Il a été démontré que cette thérapie à effet neuroprotecteur diminue considérablement l'étendue des lésions cérébrales et la fréquence des séquelles neurologiques. Or, des études animales suggèrent que l'hypothermie sans sédation avec opioïdes n'est pas bénéfique. Selon les observations qui ont été réalisées, les porcelets traités avec la thérapie, mais sans l’administration d’analgésique ont manifesté des signes d’instabilités et de tremblements exagérés. On ignorait jusqu’à présent dans quelle mesure ces résultats tirés des expérimentations animales pouvaient être généralisables au nouveau-né. Ainsi, mon projet de maîtrise vise à mieux comprendre les facteurs qui risquent de compromettre les effets bénéfiques de la thérapie de refroidissement, dans le but d’optimiser la neuroprotection et d’améliorer le développement des nourrissons atteints d’EHI. Nous avons comme objectif principal d’évaluer l’association entre les doses d’opioïdes consommées pendant l’HT, le degrée de tremblement, et l’évolution de l’index de discontinuité à l’EEG au fil des 72h de l’HT, du réchauffement et jusqu’à 12 heures post-HT. Pour répondre à l’objectif, nous avons conduit une étude chez 21 nouveau-nés avec EHI soumis à l’HT, et dont les principaux résultats ont montré des associations significatives entre les fortes doses d’opioïdes administrés à l’enfant (r = - 0.493, p = 0.023), les frissons réduits pendant l’HT (r = 0.513, p = 0.017) et l’amélioration du rythme cérébrale d’EEG. Ces résultats sont décrits de manière plus approfondie dans le Chapitre 2 qui présente la version de l’article soumis à la revue Journal of Pediatrics, et le Chapitre 3 qui présente un retour sur la littérature à la lumière de nos trouvailles. Quant au Chapitre 4, nous y élaborons les possibilités de perspectives futures et les retombées cliniques de nos résultats. À long terme, nous espérons que nos travaux permettront l’ouverture d’une nouvelle piste d’amélioration de la neuroprotection, en favorisant systématiquement une meilleure prise en charge de la douleur et du stress induit par le refroidissement. / Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) remains the leading cause of death and mortality in the term infant. A third of the survivors will develop neurological sequelae including cerebral palsy (CP), epilepsy and mental retardation. In order to improve their prognosis, these newborns undergo therapeutic hypothermia (TH), which begins no later than 6 hours after birth, maintained for a total duration of 72 hours and followed by gradual rewarming (0.5°C/h). This neuroprotective therapy has been shown to significantly decrease the extent of brain injury and the frequency of neurological sequelae. Results from animal studies revealed that ongoing hypothermia without proper anesthesia is not beneficial. Based on the observations that have been reported, piglets treated with TH with no analgesics have shown signs of instability and excessive tremors. Until now, the extent to which these results from animal experiments could be generalized to the newborn remained unknown. Thus, the purpose of my master’s project was to better understand the clinical factors that may compromise the beneficial effects of TH, in an attempt to optimize neuroprotection and improve the neurological outcome of HIE infants. Our main objective was to assess the associations between opioid doses consumed during TH, shivering recorded during TH, and the evolution of EEG discontinuity index over the course of TH, rewarming and up to 12 hours post-TH. To meet the objective, we conducted a study in 21 newborns with HIE undergoing TH, and the results have shown significant associations between high doses of opioid administered (r = - 0.493, p = 0.023), reduced shivering stress (r = 0.513, p = 0.017) and improved EEG background activity. The key findings of the study are described in more detail in Chapter 2, which presents the original manuscript submitted for publication to the “Journal of Pediatrics”, and Chapter 3, which presents a review of the literature in light of our results. In Chapter 4, we discuss future perspectives and the clinical significance of our results. At last, we hope that our study will open up new avenues for improving neuroprotection, by systematically promoting a better management of pain and cooling-induced stress.

Les légumineuses sont connues pour leurs capacités à établir une relation symbiotique avec des bactéries du sol fixatrices de l'azote atmosphérique. Cette interaction aboutit à la formation d'un nouvel organe au niveau des racines, la nodosité, au sein duquel le symbiote convertit l'azote atmosphérique (N2) en ammoniac, qui peut être directement consommé par les plantes. A l’intérieur de cette nodosité, la concentration en oxygène (O2) est maintenue à un très faible niveau car la réaction de réduction du N2 par l’enzyme bactérienne nitrogénase est inhibée par des traces d’oxygène. Un mécanisme de perception directe de l'O2 impliquant des membres de la famille des facteurs de transcription « Ethylene Responsive Factors » (ERFs) du groupe VII a récemment été découvert chez Arabidopsis thaliana. Ces facteurs de transcription (FT) possèdent une extrémité N-terminale caractéristique avec un résidu de cystéine à la seconde position. Dans des conditions normales d'O2, les FT sont conduit à la dégradation suivant une voie spécifique du protéasome. En condition de stress hypoxique, les TFs sont stabilisés et peuvent activer l’expression des gènes de réponse à l'hypoxie. Il a été démontré que la présence d’O2 et de NO était nécessaire pour déstabiliser ces protéines, et qu'une réduction de la disponibilité de l'un ou l'autre des gaz est suffisante pour protéger le résidu cystéine N-terminale de l'oxydation. L’objectif de cette thèse a été d'étudier le rôle de la famille ERF-VII dans la perception et l'adaptation au manque d'O2 chez M. truncatula. Des travaux ont aussi été menés pour déterminer l’importance du NO dans le fonctionnement en microoxie de la nodosité. Quatre gènes codant pour des facteurs de transcription de la famille ERF-VII ont été identifiés dans le génome de M. truncatula. La caractérisation de cette famille au niveau transcriptionnel a révélé que seul MtERF-B2.2 était induit par le stress hypoxique et au cours du développement des nodosités. Les trois autres, MtERF-B1.1, MtERF-B1.11 et MtERF-B2.3, sont constitutivement exprimés dans les feuilles, les racines et les nodosités. Pour étudier la stabilité de la protéine MtERF-B2.1, l’orthologue de RAP2.12 principal ERF-VII décrit dans la perception de l’O2 chez Arabidopsis, en fonction de la disponibilité de O2/NO, nous avons réalisé une protéine de fusion entre l’extrémité N-terminale de notre protéine et la protéine rapporteur luciférase. Les résultats obtenus sur des protoplastes d'Arabidopsis montrent l’implication la partie N-terminale de MtERF-B2.1 dans la régulation de la stabilité de la protéine, mais en contradiction avec les résultats obtenus en plantes composites de M. truncatula. La fonction de MtERF-B2.1 et MtERF-B2.11 a également été étudiée dans le cadre de la réponse au stress hypoxique et au cours du processus de nodulation en utilisant une stratégie d'interférence ARN. Des racines transgéniques dérégulées sur l’expression de MtERF-B2.1 et MtERF-B2.11 ont montré un défaut d’activation de plusieurs gènes de réponses à l'hypoxie tels que l’alcool déshydrogénase (ADH1) ou la pyruvate décarboxylase (PDC1). Ces racines transgéniques ARNi-MtERF-B2.1/B2.11 sont également affectées dans l'interaction symbiotique avec une réduction significative de la capacité de nodulation et de l'activité de fixation de l'azote dans les nodules matures. En conclusion, ces travaux révèlent que le mécanisme de détection d'O2 est médié par les ERF-VII dans les nodosités de M. truncatula et que ce mécanisme, associé aux cibles moléculaires régulées en aval, participe au développement de cet organe et au maintien de la capacité de fixatrice de celui-ci. De plus, les résultats indiquent que MtERF-B2.1/B2.11 sont des régulateurs positifs du métabolisme anaérobie et que les gènes associés au cycle hémoglobine-NO sont susceptibles d'activer d'autres voies de génération d'ATP. / Legume crops are known for their capacities to establish a symbiotic relationship with nitrogen fixing soil bacteria. This mutualism culminates in the formation of a new plant organ, the root nodule, in which the symbiont converts atmospheric nitrogen (N2) into ammonia, which can be directly consumed by plants. In nodules, bacterial nitrogenase enzyme is inhibited by traces of oxygen (O2) so different mechanisms maintain this organ at low O2 level. At the same time, nodules need to maintain a high ATP level to support the nitrogenase activity, which is highly energy demanding. Thus, a balance between a tight protection from O2 and an efficient energy production, referred as the “O2 paradox” of N2-fixing legume nodules, has to be reached. In Arabidopsis thaliana, a direct oxygen sensing mechanism has recently been discovered involving members of the ethylene responsive factors (ERFs) group VII. These transcription factors (TFs) possess a characteristic N-terminal amino acid with a cysteine residue at the second position that, under normal O2 conditions, leads to protein degradation following a specific pathway called the N-end rule pathway. Furthermore, it was shown that both O2 and nitric oxide (NO) are required to destabilize the ERFs VII and that a reduction in the availability of either gas is sufficient to stabilize these proteins. Therefore, the goal of this thesis was to investigated the role of ERF-VII family in O2 sensing and adaptation to hypoxia in M. truncatula, model plant for legumes, and to understand how NO interacts with O2 in hypoxic signalization in the microoxic environment that characterizes the nodule. We identified four genes belonging to the ERF-VII TF family in the M. truncatula genome, which present a strong similarity with ERF-VII of Arabidopsis. The characterization of this family at the transcriptional level revealed that only MtERF-B2.2 is up-regulated by hypoxia stress and during nodule development. The three others, MtERF-B1.1, MtERF-B1.11 and MtERF-B2.3 are found constitutively expressed in leaves, roots and nodules. To investigated the protein stability of MtERF-B2.1, the closest orthologous to AtRAP2.12 described as O2-sensors in Arabidopsis, in function of O2/NO availability, we realized a fusion protein with the luciferase reporter protein. Our results on Arabidopsis protoplasts indicated that the N-terminal part of MtERF-B2.1 drives its O2-dependent degradation by the N-end rule pathway. The function of MtERF-B2.1 and MtERF-B2.11 was also investigated both in response to hypoxia stress and during the nodulation process using an RNA interference strategy. Silencing of MtERFB2.1 and MtERF-2.11 showed a significant lower activation of several core hypoxia-responsive genes such as ADH1, PDC1, nsHb1 and AlaAT. These double knock-down transgenic roots were also affected in symbiotic interaction with a significant reduction of the nodulation capacity and nitrogen fixation activity in mature nodules. Overall, the results reveal that O2 sensing mechanism is mediated by ERF-VIIs in M. truncatula roots and nodules and that this mechanism, together with downstream targets, is involved in the organ development and ability to efficiently fix nitrogen. Furthermore, results indicated that MtERF-B2.1/B2.11 are positive regulator of the anaerobic metabolism and the Hb-NO cycle– related genes likely in order to activate alternative ATP generation pathways.

Ce travail a été consacré à l’étude non invasive de la circulation pulmonaire normale par mise en œuvre de l’échocardiographie Doppler. <p>En intégrant les mesures obtenues dans une approche physiopathologique, et en exploitant les nouvelles possibilités d’échocardiographes portables, techniquement performants, nous avons analysé les effets d’un inhibiteur de la phosphodiestérase-5 et d’une prostacycline, pour tenter d’en identifier d’éventuels effets introtropes intrinsèques, nous avons exploré le concept de réserve vasculaire pulmonaire comme facteur limitant de l’aptitude aérobie et indice potentiel d’une atteinte vasculaire pulmonaire précoce, et obtenu des résultats préliminaires permettant d’identifier une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) latente. Nos principaux résultats peuvent être résumés comme suit :<p>1. Chez le sujet sain, en normoxie ou dans un modèle expérimental d’HTAP induite par l’inhalation d’un mélange gazeux hypoxique, le sildenafil per os ou l’epoprostenol par voie intraveineuse, à des doses utilisées en clinique pour le traitement de l’HTAP, améliorent les indices de la fonction ventriculaire droite en proportion de leurs effets vasodilatatoires pulmonaires, sans effets inotropes intrinsèques détectables.<p>2. La consommation d’oxygène maximale du sujet sain augmente en raison directe de son volume capillaire pulmonaire (calculé à partir de sa capacité de diffusion pour l’oxyde nitrique et le monoxyde de carbone) et en raison inverse de sa résistance vasculaire pulmonaire, non seulement en altitude, mais aussi au niveau de la mer. Ce résultat suggère qu’une plus grande réserve vasculaire pulmonaire est propice aux efforts aérobiques intenses, probablement par moindre postcharge ventriculaire droite.<p>3. Des mesures réalisées chez un petit nombre de sujets suggèrent que la distensibilité vasculaire pulmonaire, calculée à partir d’une relation débit-pression vasculaire pulmonaire, est typiquement réduite chez des porteurs asymptomatiques de la mutation BMPR2, qui est actuellement le facteur de risque le plus élevé connu de l’HTAP. La mutation BMPR2 pourrait aussi être associée à une réactivité vasculaire pulmonaire accrue à l’hypoxie. <p>Nos résultats suggèrent indirectement que l’échocardiographie Doppler, de repos ou de stress, pourrait être davantage développée dans la mise au point de patients à risque d’HTAP./<p><p>Novel advances in echocardiography offer the opportunity to reliably characterize pulmonary circulation in terms of pressure-flow relationship, and to better understand the coupling of right ventricular (RV) function with normal and abnormal pulmonary hemodynamics. Moreover, when combined with the measurement of pulmonary capillary blood volume, this renewed methodological approach may help to understand the concept of pulmonary vascular reserve as a limiting factor of exercise capacity and potential sensitive marker of early vascular disease.<p><p>In the present work we used a model of hypoxic pulmonary vasoconstriction to analyse the effects of two targeted therapies of pulmonary arterial hypertension (PAH) on the RV function. We showed that the beneficial effects of these drugs are mainly driven by a decrease in RV afterload and not an enhanced myocardial inotropic state. Whether this is transposable to abnormal RV-arterial coupling in PAH patients remains to be investigated.<p><p>Echocardiography may be useful to explore the pulmonary vascular reserve as an important limiting factor of exercise capacity. We showed that a higher pulmonary vascular reserve, defined by a decreased PVR and increased lung diffusing capacity, allows for an improved aerobic exercise capacity (as assessed by a higher peak oxygen consumption), at a lower ventilatory cost, at sea level and at high altitude. <p><p>Stress echocardiography may detect an abnormal pulmonary vasoreactivity. We showed that asymptomatic relatives of patients suffering from idiopathic pulmonary arterial hypertension, and who carry a bone morphogenetic protein receptor type 2 mutation (BMPR2) present with a decreased pulmonary vascular distensibility and an enhanced pulmonary vasoreactivity to hypoxia, which are identifiable by echocardiography examination. However, the predictive value of these findings is not known. <p><p>Thus echocardiography may represent, in experienced and dedicated hands, a noninvasive, safe, widely available, applicable at the bed-side as well as in extreme environment (e.g. high altitudes), less expensive alternative for the evaluation of the pulmonary circulation, either by the interrogation of pressure-flow relationship (stress echocardiography), by the investigation of the right ventricle global and regional function in relation to its afterload (standard and Tissue Doppler Imaging), or by a combined approach with the measurement of lung diffusing capacity (DLNO / DLCO) to assess the pulmonary vascular reserve.<p><p>The present data are encouraging for further development and implementation of echocardiography for the detection, but also the diagnosis and follow-up of patients with pulmonary hypertension.<p><p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished