Os manguezais são ecossistemas encontrados na transição entre os ambientes terrestre e marinho apresentando uma biodiversidade funcional única e conseqüentemente flora e fauna específica. Por se tratar de um ambiente inóspito e pouco explorado é de grande importância o estudo desta comunidade a fim de se obter isolado com potencial biotecnológico. Sabe-se que tecidos vegetais são habitados por microrganismos denominados endofíticos, cuja interação com a planta hospedeira pode conferir características vantajosas ao mesmo. Este trabalho teve como objetivo estudar a comunidade bacteriana endofítica cultivável de manguezais, além de determinar a produção enzimática e a utilização de isolados na promoção de crescimento vegetal. Para tanto, foram coletadas amostras de ramo das espécies vegetais Rhizophora mangle, Avicenia nitida, Laguncularia racemosa para o isolamento de bactérias endofíticas. Os locais e épocas amostrados foram manguezais do litoral paulista em Bertioga (local com e sem impacto ambiental) e em Cananéia (local considerado preservado) durante o verão e inverno de 2007 e 2008. Foi obtido grande número de isolados em todos os locais e épocas avaliados, porém a análise estatística não apresentou diferença significativa entre as variáveis avaliadas, com exceção da planta L. rancemosa no período do verão em Bertioga impactado a qual apresentou baixa freqüência. Dentre os isolados obtidos selecionou-se para estocagem aproximadamente 1000 isolados os quais foram submetidos a testes enzimáticos in vitro a fim de realizar uma triagem inicial. Destes, 75% apresentaram atividade para pelo menos uma das enzimas avaliadas. Selecionou-se então isolados com atividade enzimática para no mínimo três ou mais enzimas para testes mais específicos chegando a um número de 115 isolados. A identificação dos isolados foi realizada por seqüênciamento parcial do gene 16S rDNA. Dentre os isolados identificados, os gêneros mais freqüentes foram: Alcaligenes, Bacillus, Brevundimonas, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Erythrobacter, Exiguobacterium, Novosphingobium, Ochrobactrum, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Xanthomonas entre outros. Os resultados demonstraram que dos isolados avaliados: 69% são produtores de fosfatase, 69% de protease, 60% de endoglicanase, 58% de lípase, 43% de amilase e 21% de esterase. Além destes resultados, dos 115 isolados avaliados, 35% apresentou a capacidade de sintetizar AIA (ácido indol acético) e 45% a capacidade de fixar nitrogênio atmosférico. Os isolados com os melhores resultados quanto a fixação de nitrogênio e síntese de AIA foram inoculados em plântulas de cana-de-açúcar e monjoleiro. Os experimentos foram desenvolvidos em casa de vegetação e em viveiro respectivamente. As bactérias selecionadas não promoveram o crescimento de cana-de-açúcar, sendo inclusive observado um crescimento superior da testemunha em relação aos tratamentos com inoculação bacteriana. Já com monjoleiro foi observado que o isolado de Enterobacter sp. apresentou aumento na massa da matéria fresca e seca da parte aérea e da raiz. Assim, os dados apresentados demonstraram potencial de aplicação das bactérias endofíticas isoladas dos manguezais brasileiro, tanto na busca de novos compostos, como enzimas, para aplicação industrial, quanto no desenvolvimento de inoculantes visando a promoção de crescimento de espécies vegetais utilizadas na agricultura e reflorestamento / The mangrove is an ecosystem of transition between the terrestrial and marine environments, featuring a unique functional biodiversity, providing consequently a specific flora and fauna. Due to its inhospible characteristics, few study explore its very importance the study of this community to get isolated with biotechnological potencial. It is known that the plant tissues are inhabited by microorganisms known as endophytes and this interaction may confer advantageous for both. The aiming of this work was the evaluation of the potencial of the mangrove endophytic bacteria to enzymatic production as well their potencial to plant growth promotion. The bacterial endophytic isolades were obtained from branches from Rhizophora mangle, Avicenia nitida and Laguncularia rancemosa mangrove species. The vegetal samples were colleted in the mangroves at Bertioga (with and without environmental impact) and Cananeia (a preserved area) during two different time, summer a winter on 2007 and 2008. We obtained large numbers of isolates in all areas and times evaluated, but the statistical analysis showed no significant difference between the variables, except the plant L. rancemosa in the summer, Bertioga impacted area, that presented low frequency of isolation. Arbitrarily, 1000 were stored and all those evaluated to enzymatic production. Of these, 75% presented activity for at least one of the evaluated enzymes. It was selected 115 isolates that showed activity for at least three or more enzymes. The molecular identification of these isolates were performed by partial sequencing of the 16S rDNA. The predominant identified genera were: Alcaligenes, Bacillus, Brevundimonas, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Erwinia, Erythrobacter, Exiguobacterium, Novosphingobium, Ochrobactrum, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Xanthomonas and others. Among the evaluated isolates: 69% produce phosphatase, 69% produce protease, 60% produce endoglucanase, 58% produce lipase, 43% produce amylase and 21% produce esterase. Even, 35% and 45% are able to produce IAA and nitrogen fixation respectively. Isolates that showed good characteristics to IAA and nitrogen fixation were inoculated with sugar cane and monjoleiro (Acacia polyphylla) seedlings. All experiments were conducted in greenhouse. None selected bacteria promoted the sugar cane growther, being the development of control treatment better than bacterial inoculation. It was observed an increase in their fresh and dried biomass. Thus, the results show the huge potential of endophytic bacteria from mangrove to the discovery news compounds, as enzymes, to industrial application and to the development of new inoculants aiming the plant growth promotion of agriculture and reforestation

Les biofilms en industries agroalimentaires (IAA) représentent un problème récurrent aux conséquences économiques et de sécurité sanitaire. Le développement de surfaces photoactives aux propriétés antibactériennes pourrait faciliter leur élimination. Une solution serait de déposer une couche mince de dioxyde de titane (TiO2) sur des matériaux rencontrés dans les IAA. Les objectifs de cette thèse ont donc été d’optimiser des couches minces de TiO2 aux propriétés antibactériennes et d’étudier les mécanismes impliqués dans la photocatalyse. Les dépôts sont réalisés par pulvérisation cathodique radiofréquence dans différentes conditions (température, PO2, durée), d’abord sur substrat de verre puis sur acier inoxydable 316La caractérisation des couches minces par microscopie à balayage, diffraction des rayons X, a montré des différences dues au changement de substrat. Les différentes optimisations ont conduit à l’obtention de couches minces possédant une activité photocatalytique et des propriétés antibactériennes sur des souches représentatives de la flore retrouvée dans les IAA de la filière « viande » : L. monocytogenes, Y. enterocolitica et P. fragi. Des diminutions de la population bactérienne entre 1,5Log et 3Log ont été observées. La production d’espèces réactives de l’oxygène (H2O2, ¿OH, O2-¿) a été étudiée par des méthodes spectrocolorimétriques. L’H2O2 à la surface de la couche mince serait converti en ¿OH. L’étude des mécanismes de réponse de L. monocytogenes face à la photocatalyse des couches minces a été initiée par une approche transcriptomique, en suivant l’exp / Biofilms in food industries represent a recurrent problem with economic and health safety implications. The development of photoactive surfaces with antibacterial properties could facilitate their elimination. One solution would be to deposit a thin layer of titanium dioxide (TiO2) on conventional materials used in food plants. The objectives of this thesis were the optimization of thin films of TiO2 with antibacterial properties and to study the mechanisms involved in photocatalysis. Deposits were made by radio-frequency sputtering under different conditions (temperature, oxygen partial pressure, duration), first on a glass substrate and then on 316 stainless steel. Characterization of thin layers by scanning microscopy, diffraction of X-ray, showed differences due to substrate changeTiO2 thin layers obtained either on glass or stainless steel showed photocatalytic and antibacterial properties on representative strains of the flora found in the meat industry: Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica and Pseudomonas fragi. Decreases in the bacterial population between 1.5Log and 3Log were observed. The production of reactive oxygen species (ROS) was studied by spectrocolorimetric methods. It seems that H2O2 on the surface is converted in another ROS, ¿OH. Finally, the study of the bacterial response mechanisms to photocatalysis, especially for L. monocytogenes, was initiated by a transcriptomic approach by following the expression of genes involved in the response to oxidative stress. However, the method used requires an optimization in order to be used for the bac

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana _Matter.pdf: 980208 bytes, checksum: 39b0f232a5a4474d2605637e0dc10ea5 (MD5) Previous issue date: 2015-04-28 / Chemical fertilizers management in agriculture is the main source of nutrients for crops development aiming at increasing yield. Thus, phosphorus, among other nutrients, is required by plants since it is the most limiting mineral on yield crops of commercial interest, because of its low availability and immobility in soil, as it also gets unavailable to absorption by the plants. Studies have shown that phosphate solubilization up from bacteria inoculation can improve agricultural production. Many bacteria can take part on the dissolution process through different mechanisms and promote plant growth either by dissolving phosphates or determining nitrogen (N) and indole acetic acid production (IAA). Due to the isolation of these microorganisms, they can be inoculated and make the fixed phosphorus available, reducing the use of fertilizers or readjusting excessive percentages of this element in their formulas to improve a development of sustainable agricultural yield. According to this theme, it was possible to apply a methodology for the isolation of subtropical soil bacteria with maize cropping from different soil fertilization managements. After isolating the micro-organisms, they were submitted to endurance tests after pricking, phosphatase production ability, IAA production with and without L-tryptophan and identification method by rDNA extraction technique. A greater diversity of mineralizing bacteria was found in treatment 1 soil (no fertilization). The results related to the largest percentage increase in Calcium phytate can be justified by the fact that bacterial communities can produce enzymes. The stability of the solubilizing function was greater in calcium phytate when compared to the other culture media that have been used. The study has indicated that soil microbiota keeps a similarity in which Ochrobactrum gender has prevailed and under different management situations, its diversity slightly varies, but it is able to produce metabolites promoters of plant growth; while the isolates of Treatment 2 (mineral fertilization) have kept the best acid phosphatase production. The IAA production, without L-tryptophan addition in T1, suggests that the microbiota uses metabolic pathways for different purposes, since the studied soil is poor in minerals, thus it affects the production of plant growth promoters. It differs from Treatment 3 that received fertilization with swine wastewater, and diversified IAA production for its isolates with stronger values. With this study it was possible to identify genera of bacteria with high phytate mineralization capacity. At last, according to the study results, it was possible to identify the bacteria genera with high capacity to mineralize phytate and produce IAA, indicating the promotion of vegetal growth capacity. / A utilização de fertilizantes químicos na agricultura constitui-se como a principal fonte de nutrientes para o desenvolvimento das culturas visando ao aumento da produtividade. O fósforo, dentre outros nutrientes, é o mais requerido pelas plantas e o que mais limita a produtividade nas culturas de interesse comercial em virtude da sua baixa disponibilidade e imobilização no solo, haja vista ficar indisponível para absorção pelo vegetal. Estudos comprovam que a solubilização de fosfatos a partir da inoculação de bactérias pode ajudar na melhoria da produção agrícola. Muitas bactérias realizam processos de dissolução a partir de diferentes mecanismos e promovem crescimento vegetal tanto pela dissolução de fosfatos como na fixação de nitrogênio (N) e produção de ácido indol acético (AIA). Com o isolamento desses microrganismos, é possível inoculá-los e disponibilizar o fósforo fixado, reduzir o uso de fertilizantes ou readequar as porcentagens excessivas desse elemento em suas fórmulas, visando ao desenvolvimento da produção agrícola sustentável. A partir desta temática, foi utilizada metodologia para isolamento de bactérias de solo subtropical sob cultivo de milho com diferentes históricos de adubação. Além do isolamento, os microrganismos foram submetidos a testes de resistência após repicagem, produção de fosfatases, produção de AIA com e sem L- triptofano e identificação por técnica de extração de rDNA. Uma maior diversidade de bactérias mineralizadores foi encontrada no solo Tratamento 1 (sem adubação). Os resultados relacionados à maior porcentagem de crescimento em fitato de cálcio podem ser justificados pelo fato de as comunidades bacterianas serem capazes de produzir enzimas. A estabilidade da função solubilizadora foi maior em fitato de cálcio do que nos outros meios usados. O estudo indicou que a microbiota do solo mantém similaridade onde prevalece o gênero Ochrobactrum e que, em diferentes situações de manejo, pouco varia sua diversidade, mas apresenta capacidade para produzir metabólitos promotores de crescimento de plantas. Os isolados do Tratamento 2 (adubação mineral) mantiveram a produção de fosfatase ácida mais acentuada. A produção de AIA sem a adição de L-triptofano no tratamento T1 sugere que a microbiota utiliza vias metabólicas distintas para tal, visto que o solo estudado é pobre em minerais. Isso afeta a produção de promotores de crescimento de plantas, contrapondo-se ao Tratamento 3, o qual recebeu adubação com água residuária de suinocultura e diversificou a produção de AIA por seus isolados com valores mais robustos. Finalmente, de acordo com os resultados do presente estudo, foi possível a identificação de gêneros de bactéria com elevada capacidade de solubilização de fitatos e produção de AIA, indicando capacidade de promoção de crescimento vegetal.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana _Matter.pdf: 980208 bytes, checksum: 39b0f232a5a4474d2605637e0dc10ea5 (MD5) Previous issue date: 2015-04-28 / Chemical fertilizers management in agriculture is the main source of nutrients for crops development aiming at increasing yield. Thus, phosphorus, among other nutrients, is required by plants since it is the most limiting mineral on yield crops of commercial interest, because of its low availability and immobility in soil, as it also gets unavailable to absorption by the plants. Studies have shown that phosphate solubilization up from bacteria inoculation can improve agricultural production. Many bacteria can take part on the dissolution process through different mechanisms and promote plant growth either by dissolving phosphates or determining nitrogen (N) and indole acetic acid production (IAA). Due to the isolation of these microorganisms, they can be inoculated and make the fixed phosphorus available, reducing the use of fertilizers or readjusting excessive percentages of this element in their formulas to improve a development of sustainable agricultural yield. According to this theme, it was possible to apply a methodology for the isolation of subtropical soil bacteria with maize cropping from different soil fertilization managements. After isolating the micro-organisms, they were submitted to endurance tests after pricking, phosphatase production ability, IAA production with and without L-tryptophan and identification method by rDNA extraction technique. A greater diversity of mineralizing bacteria was found in treatment 1 soil (no fertilization). The results related to the largest percentage increase in Calcium phytate can be justified by the fact that bacterial communities can produce enzymes. The stability of the solubilizing function was greater in calcium phytate when compared to the other culture media that have been used. The study has indicated that soil microbiota keeps a similarity in which Ochrobactrum gender has prevailed and under different management situations, its diversity slightly varies, but it is able to produce metabolites promoters of plant growth; while the isolates of Treatment 2 (mineral fertilization) have kept the best acid phosphatase production. The IAA production, without L-tryptophan addition in T1, suggests that the microbiota uses metabolic pathways for different purposes, since the studied soil is poor in minerals, thus it affects the production of plant growth promoters. It differs from Treatment 3 that received fertilization with swine wastewater, and diversified IAA production for its isolates with stronger values. With this study it was possible to identify genera of bacteria with high phytate mineralization capacity. At last, according to the study results, it was possible to identify the bacteria genera with high capacity to mineralize phytate and produce IAA, indicating the promotion of vegetal growth capacity. / A utilização de fertilizantes químicos na agricultura constitui-se como a principal fonte de nutrientes para o desenvolvimento das culturas visando ao aumento da produtividade. O fósforo, dentre outros nutrientes, é o mais requerido pelas plantas e o que mais limita a produtividade nas culturas de interesse comercial em virtude da sua baixa disponibilidade e imobilização no solo, haja vista ficar indisponível para absorção pelo vegetal. Estudos comprovam que a solubilização de fosfatos a partir da inoculação de bactérias pode ajudar na melhoria da produção agrícola. Muitas bactérias realizam processos de dissolução a partir de diferentes mecanismos e promovem crescimento vegetal tanto pela dissolução de fosfatos como na fixação de nitrogênio (N) e produção de ácido indol acético (AIA). Com o isolamento desses microrganismos, é possível inoculá-los e disponibilizar o fósforo fixado, reduzir o uso de fertilizantes ou readequar as porcentagens excessivas desse elemento em suas fórmulas, visando ao desenvolvimento da produção agrícola sustentável. A partir desta temática, foi utilizada metodologia para isolamento de bactérias de solo subtropical sob cultivo de milho com diferentes históricos de adubação. Além do isolamento, os microrganismos foram submetidos a testes de resistência após repicagem, produção de fosfatases, produção de AIA com e sem L- triptofano e identificação por técnica de extração de rDNA. Uma maior diversidade de bactérias mineralizadores foi encontrada no solo Tratamento 1 (sem adubação). Os resultados relacionados à maior porcentagem de crescimento em fitato de cálcio podem ser justificados pelo fato de as comunidades bacterianas serem capazes de produzir enzimas. A estabilidade da função solubilizadora foi maior em fitato de cálcio do que nos outros meios usados. O estudo indicou que a microbiota do solo mantém similaridade onde prevalece o gênero Ochrobactrum e que, em diferentes situações de manejo, pouco varia sua diversidade, mas apresenta capacidade para produzir metabólitos promotores de crescimento de plantas. Os isolados do Tratamento 2 (adubação mineral) mantiveram a produção de fosfatase ácida mais acentuada. A produção de AIA sem a adição de L-triptofano no tratamento T1 sugere que a microbiota utiliza vias metabólicas distintas para tal, visto que o solo estudado é pobre em minerais. Isso afeta a produção de promotores de crescimento de plantas, contrapondo-se ao Tratamento 3, o qual recebeu adubação com água residuária de suinocultura e diversificou a produção de AIA por seus isolados com valores mais robustos. Finalmente, de acordo com os resultados do presente estudo, foi possível a identificação de gêneros de bactéria com elevada capacidade de solubilização de fitatos e produção de AIA, indicando capacidade de promoção de crescimento vegetal.

Over the past several decades, gene therapy technologies have been developed for a diverse number of applications ranging from DNA-based vaccines to gene silencing with RNAi. While all are powerful tools, a common limitation for these technologies is the need for effective and safe delivery to target sites within the body. Such delivery vectors are necessary for retention of bioactivity and stability, while also providing a method of cellular and tissue uptake and distribution, which may require endosomal escape. Although, viral and lipid-based technologies have shown promise as nucleic acid delivery vectors, both have inherent issues such as cytoxicity, oncogenicity, and immunogenicity. Thus, the development of polymer-based non-viral vectors has been an area of great focus over the past decade. While many polymeric vectors have been developed for plasmid DNA (pDNA) delivery, very few have shown effective delivery of short interfering RNA (siRNA), a powerful tool for gene silencing via the RNA interference mechanism. Furthermore, very few prospective delivery vectors have shown versatility for the administration of siRNA through multiple routes of administration. The overall goal of this research was to develop a biocompatible non-viral delivery system for the delivery of plasmid DNA, siRNA, and contrast agents through the modification of the natural biopolymer chitosan. We have synthesized an imidazole modified chitosan (chitosan-IAA) by conjugation of imidazole acetic acid to chitosan. Extensive evaluation and characterization of the modified polymer demonstrates enhanced solubility and buffering capacity within the physiological and endosomal pHs, thus providing enhanced endosomal escape by exploiting the "proton sponge" effect. We have demonstrated effective in vitro gene expression and gene silencing with chitosan-IAA mediated delivery of pDNA and siRNA, respectively. Furthermore, we have demonstrated in vivo gene silencing by delivery of siRNA through both intranasal and intravenous routes of delivery with chitosan-IAA/siRNA nanocomplexes. We have also demonstrated delivery of contrast agents up to 45 nm in size through mucosal tissue following treatment with chitosan and no contrast agent modification in both human and animal tissue. In conclusion, we have successfully developed a versatile and highly effective delivery vector for both nucleic acids and contrast agents. / text

Submitted by Nivaldo Melo (nivaldo.melo@ufvjm.edu.br) on 2015-11-30T17:13:26Z No. of bitstreams: 2 nathale_rodrigues_pinheiro.pdf: 3567634 bytes, checksum: 502f3816acde8f2f1b1ee7fe24e188f1 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-12-03T16:14:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 nathale_rodrigues_pinheiro.pdf: 3567634 bytes, checksum: 502f3816acde8f2f1b1ee7fe24e188f1 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-03T16:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 nathale_rodrigues_pinheiro.pdf: 3567634 bytes, checksum: 502f3816acde8f2f1b1ee7fe24e188f1 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do estado de Minas Gerais (FAPEMIG) / O sistema ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy) ? uma terapia antitumoral que envolve a ativa??o catal?tica de um pr?-f?rmaco, nas proximidades do s?tio tumoral, por uma enzima conjugada a um anticorpo monoclonal com afinidade para ant?genos espec?ficos das c?lulas tumorais. O sistema composto pela enzima Horseradish peroxidase (HRP) e ?cido indol-3-ac?tico (IAA) tem sido estudado para o emprego na terapia ADEPT, e associado ? indu??o de apoptose de c?lulas tumorais. A 2,4-pentanodiona (PD) tamb?m atua como substrato da HRP sendo oxidada por ela atrav?s de uma rea??o cuja cin?tica ? semelhante ? da cat?lise do IAA e, portanto, pode representar uma alternativa para essa terapia. Este trabalho teve como objetivo realizar uma avalia??o da citotoxicidade mediada pelos produtos provenientes da oxida??o da PD pela HRP frente a diferentes linhagens celulares, utilizando para isso diferentes metodologias que determinam a viabilidade celular como o azul de Trypan, MTT e vermelho neutro assim, como a an?lise microsc?pica das altera??es celulares induzidas por esses sistemas; estabelecer uma compara??o com a citotoxicidade mediada pela oxida??o do IAA catalisada pela mesma enzima; verificar a incid?ncia de morte celular por apoptose mediada pelos sistemas IAA/HRP/O2 e PD/HRP/O2; al?m de verificar a produ??o e os tipos de esp?cies reativas de oxig?nio (ERO) produzidas pelos dois sistemas. Os experimentos permitiram evidenciar que as combina??es PD/HRP/O2 e IAA/HRP/O2 levam a forma??o de ERO, sendo as esp?cies provavelmente formadas pela oxida??o da PD o radical ?nion super?xido e o per?xido de hidrog?nio (H2O2) e pela oxida??o do IAA o H2O2. Foi observado, somente para o IAA, um aumento na forma??o de ERO com o uso de uma maior concentra??o do substrato. Quanto ao estudo de viabilidade celular, esse permitiu evidenciar, atrav?s das tr?s metodologias, o efeito citot?xico dos sistemas PD/HRP/O2 e IAA/HRP/O2, no entanto, o ensaio do MTT mostrou-se mais sens?vel para esse estudo. A oxida??o do IAA pela HRP induziu apoptose, contudo n?o foi poss?vel identificar o tipo de morte celular mediada pelo sistema PD/HRP/O2, provavelmente devido a um problema t?cnico durante algumas an?lises em citometria de fluxo, o Quenhcing. Apesar de o sistema IAA/HRP/O2 ter apresentado uma destrui??o celular mais expressiva, o substrato IAA quando testado na aus?ncia da enzima mostrou-se t?xico, o que n?o foi visto para a PD quando testada nas concentra??es de 1; 1,5 e 2 mM, o que a torna um bom substrato para o emprego na terapia ADEPT. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-gradua??o em Ci?ncias Farmac?uticas, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2014. / ABSTRACT The system ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy) is an antitumor therapy that involves catalytic activation of a prodrug near the tumor site by an enzyme conjugated to a monoclonal antibody with affinity for specific antigens of tumor cells. The system composed by horseradish peroxidase (HRP) enzyme and indole-3-acetic acid (IAA) has been studied for the use in ADEPT therapy, and associated with apoptosis induction on tumor cells. The 2,4-pentanedione (PD) also acts as a substrate for HRP and being oxidized through a reaction whose kinetics is similar to the catalysis of IAA and, therefore, might represent an alternative to this therapy. This study aimed to conduct a evaluation of the cytotoxicity mediated by products from the oxidation of PD by HRP against different cell lines, using different methodologies that determine cell viability as Trypan blue, MTT and Neutral Red, as well as morphologic changes of the cell induced by these systems; establish a comparison with the cytotoxicity mediated by the oxidation of IAA catalyzed by the same enzyme; verify the incidence of apoptosis mediated by IAA/HRP/O2 and PD/HRP/O2 systems; besides verifying the production and types of reactive species oxygen (ROS) produced by the two systems. The experiments allowed to show that PD/HRP/O2 and IAA/HRP/O2 combinations lead to the formation of ROS, being the species probably formed by oxidation of PD the radical superoxide anion and hydrogen peroxide (H2O2) and by the oxidation of IAA the H2O2. It was observed only for the IAA, an increase in ROS production using a higher concentration of the substrate. Regarding the study of cell viability, this allowed to evidence, through the three methodologies, the cytotoxic effect of PD/HRP/O2 and IAA/HRP/O2 systems, however, the MTT assay proved more sensitive for this study. The oxidation of the IAA by HRP induced apoptosis, but could not identify the type of cell death mediated by PD/HRP/O2 system, The oxidation of by HRP the IAA induced apoptosis, but could not identify the type of cell death mediated by PD/HRP/O2 system, probably due to a technical problem for a few flow cytometric analyzes, the Quenching. Although IAA/HRP/O2 system have presented a more significant cell destruction, the IAA substrate when tested in the absence of enzyme was toxic, what has not seen for PD when tested in the concentrations of 1, 1.5, and 2 mM, making it a good substrate for employment in ADEPT therapy.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-19Bitstream added on 2014-06-13T19:33:25Z : No. of bitstreams: 1 inui_rn_me_jabo.pdf: 573335 bytes, checksum: 56d99ae5d640b68032476e6b74cf679f (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A cultura da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) apresenta grande importância econômica para o Brasil. Dessa forma, para propiciar boas condições de desenvolvimento e produtividade, deve-se dar grande importância ao suprimento de fósforo. Bactérias solubilizadoras de fósforo (BSF) vêm sendo utilizadas como biofertilizantes comerciais, trazendo benefícios à agricultura. A seleção de bactérias com capacidade de solubilização do fósforo pode ser feita através de caracterizações genotípicas. Os objetivos deste trabalho foram isolar e caracterizar bactérias solubilizadoras de fosfato provenientes de solos sob cultivo de cana-de-açúcar por meio do sequenciamento do gene 16S rRNA e da região BOX-A1R. Além disso, foi realizada avaliação da atividade microbiana sobre a solubilização das fontes de fosfato até 168 horas. O sequenciamento permitiu identificar gêneros como Burkholderia e Enterobacteriaceae, conhecidos quanto à solubilização. Os isolados identificados como Arthrobacter e Labrys apresentam capacidade para biodegradação de compostos tóxicos ao ambiente. O fosfato de cálcio foi a fonte mais solubilizada. Os isolados Burkholderia sp. (A5I55), Candidatus B. verschuerenii (A9IG), Enterobacter sp. (USC8) e E. hormaechei subsp. steigerwaltii (USC7) apresentaram resultados semelhantes a B. ferrariae. As bactérias-padrão obtiveram os melhores resultados para a solubilização das fontes fosfatadas. Candidatus B. verschuerenii (A9IG) e Burkholderia sp. (A3I14) e B. gladioli (A6I8) apresentaram os melhores valores para solubilização das rochas fosfatadas. Além disso, foi detectada a produção de AIA pelos isolados do gênero Enterobacter (USC7 e USC8) Labrys portucalensis (A5I42) e Burkholderia sp. (A5I55).Assim estes isolados poderiam ser indicados em testes para solubilização em culturas de campo. / The culture of sugarcane (Saccharum spp.) has a great economic importance to Brazil. Thus, providing good conditions for development and productivity should be given great importance to phosphorus supply. Phosphate solubilizing bacteria - PSB, have been used as biofertilizers, bringing benefits to agriculture. Selection of phosphorus solubilizing bacteria can be done by genetic characterization. The aim of this work is to isolate and characterize PSB from sugarcane productive soils through the sequencing of 16S rRNA gene and BOX-A 1R genomic regions. Furthermore, the microbial activity of phosphate source was assessment until 168 hours. The sequencing has identified genus as Burkhloderia and Enterobacteriaceae, known as PSB. The isolates identified as Arthrobacter and Labrys have the capacity to biodegradation of toxic compounds in the environment. The calcium phosphate was the source more soluble. Isolates Burkholderia sp. (A5I55), Candidatus B. verschuerenii (A9IG), Enterobacter sp. (USC8) and E. hormaechei subsp. steigerwaltii (USC7) showed results similar to B. ferrariae. The bacteria-standards showed the best results for phosphates sources solubilization. Candidatus B. verschuerenii (A9IG) and Burkholderia sp. (A3I14) and B. gladioli showed the best values for solubilization of rock phosphate. Furthermore, the production of AIA was detected by Enterobacter (USC7 and USC8), Labrys portucalensins (A5I42) and Burkholderia sp. (A5I55). Therefore these isolates could be recommended for phosphorus solubilization tests and auxin producing in fieldcrops.

Os manguezais são ecossistemas encontrados na transição entre os ambientes terrestre e marinho apresentando uma biodiversidade funcional única e conseqüentemente flora e fauna específica. Por se tratar de um ambiente inóspito e pouco explorado é de grande importância o estudo desta comunidade a fim de se obter isolado com potencial biotecnológico. Sabe-se que tecidos vegetais são habitados por microrganismos denominados endofíticos, cuja interação com a planta hospedeira pode conferir características vantajosas ao mesmo. Este trabalho teve como objetivo estudar a comunidade bacteriana endofítica cultivável de manguezais, além de determinar a produção enzimática e a utilização de isolados na promoção de crescimento vegetal. Para tanto, foram coletadas amostras de ramo das espécies vegetais Rhizophora mangle, Avicenia nitida, Laguncularia racemosa para o isolamento de bactérias endofíticas. Os locais e épocas amostrados foram manguezais do litoral paulista em Bertioga (local com e sem impacto ambiental) e em Cananéia (local considerado preservado) durante o verão e inverno de 2007 e 2008. Foi obtido grande número de isolados em todos os locais e épocas avaliados, porém a análise estatística não apresentou diferença significativa entre as variáveis avaliadas, com exceção da planta L. rancemosa no período do verão em Bertioga impactado a qual apresentou baixa freqüência. Dentre os isolados obtidos selecionou-se para estocagem aproximadamente 1000 isolados os quais foram submetidos a testes enzimáticos in vitro a fim de realizar uma triagem inicial. Destes, 75% apresentaram atividade para pelo menos uma das enzimas avaliadas. Selecionou-se então isolados com atividade enzimática para no mínimo três ou mais enzimas para testes mais específicos chegando a um número de 115 isolados. A identificação dos isolados foi realizada por seqüênciamento parcial do gene 16S rDNA. Dentre os isolados identificados, os gêneros mais freqüentes foram: Alcaligenes, Bacillus, Brevundimonas, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Erythrobacter, Exiguobacterium, Novosphingobium, Ochrobactrum, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Xanthomonas entre outros. Os resultados demonstraram que dos isolados avaliados: 69% são produtores de fosfatase, 69% de protease, 60% de endoglicanase, 58% de lípase, 43% de amilase e 21% de esterase. Além destes resultados, dos 115 isolados avaliados, 35% apresentou a capacidade de sintetizar AIA (ácido indol acético) e 45% a capacidade de fixar nitrogênio atmosférico. Os isolados com os melhores resultados quanto a fixação de nitrogênio e síntese de AIA foram inoculados em plântulas de cana-de-açúcar e monjoleiro. Os experimentos foram desenvolvidos em casa de vegetação e em viveiro respectivamente. As bactérias selecionadas não promoveram o crescimento de cana-de-açúcar, sendo inclusive observado um crescimento superior da testemunha em relação aos tratamentos com inoculação bacteriana. Já com monjoleiro foi observado que o isolado de Enterobacter sp. apresentou aumento na massa da matéria fresca e seca da parte aérea e da raiz. Assim, os dados apresentados demonstraram potencial de aplicação das bactérias endofíticas isoladas dos manguezais brasileiro, tanto na busca de novos compostos, como enzimas, para aplicação industrial, quanto no desenvolvimento de inoculantes visando a promoção de crescimento de espécies vegetais utilizadas na agricultura e reflorestamento / The mangrove is an ecosystem of transition between the terrestrial and marine environments, featuring a unique functional biodiversity, providing consequently a specific flora and fauna. Due to its inhospible characteristics, few study explore its very importance the study of this community to get isolated with biotechnological potencial. It is known that the plant tissues are inhabited by microorganisms known as endophytes and this interaction may confer advantageous for both. The aiming of this work was the evaluation of the potencial of the mangrove endophytic bacteria to enzymatic production as well their potencial to plant growth promotion. The bacterial endophytic isolades were obtained from branches from Rhizophora mangle, Avicenia nitida and Laguncularia rancemosa mangrove species. The vegetal samples were colleted in the mangroves at Bertioga (with and without environmental impact) and Cananeia (a preserved area) during two different time, summer a winter on 2007 and 2008. We obtained large numbers of isolates in all areas and times evaluated, but the statistical analysis showed no significant difference between the variables, except the plant L. rancemosa in the summer, Bertioga impacted area, that presented low frequency of isolation. Arbitrarily, 1000 were stored and all those evaluated to enzymatic production. Of these, 75% presented activity for at least one of the evaluated enzymes. It was selected 115 isolates that showed activity for at least three or more enzymes. The molecular identification of these isolates were performed by partial sequencing of the 16S rDNA. The predominant identified genera were: Alcaligenes, Bacillus, Brevundimonas, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Erwinia, Erythrobacter, Exiguobacterium, Novosphingobium, Ochrobactrum, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Xanthomonas and others. Among the evaluated isolates: 69% produce phosphatase, 69% produce protease, 60% produce endoglucanase, 58% produce lipase, 43% produce amylase and 21% produce esterase. Even, 35% and 45% are able to produce IAA and nitrogen fixation respectively. Isolates that showed good characteristics to IAA and nitrogen fixation were inoculated with sugar cane and monjoleiro (Acacia polyphylla) seedlings. All experiments were conducted in greenhouse. None selected bacteria promoted the sugar cane growther, being the development of control treatment better than bacterial inoculation. It was observed an increase in their fresh and dried biomass. Thus, the results show the huge potential of endophytic bacteria from mangrove to the discovery news compounds, as enzymes, to industrial application and to the development of new inoculants aiming the plant growth promotion of agriculture and reforestation

Orientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva / Banca: Miguel Luiz Menezes Freitas / Resumo: A conservação da biodiversidade, implica em cultivar espécies arbóreas nativas que possam ser utilizadas em projetos de reflorestamento, recuperação de áreas degradadas e com o objetivo de obter produtos secundários importantes como madeira e produtos medicinais. O uso de rizobactérias promotoras de crescimento em plantas, vem sendo muito estudado em culturas de importância econômica, devido a sua aplicabilidade em beneficiar o desenvolvimento destas. Neste trabalho foram escolhidas quatro espécies arbóreas nativas, leguminosas não nodulantes: Pterogyne nitens (Amendoim-bravo), Albizia hasslerii (Farinha-seca), Copaifera langsdorffii (Copaíba), e Stryphnodendron adstringens (Barbatimão). O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro as diferentes bactérias isoladas destas espécies florestais que possam ter efeito benéfico no crescimento e desenvolvimento inicial das plantas e caracterizálas pelo sequenciamento do gene 16S rRNa e perfil eletroforético do gene BOX-A 1R. As bactérias foram isoladas da rizosfera e da raiz de mudas de cada espécie, em meio de cultura NFb. No total, 29 isolados foram cultivados em meio de cultura DYGS enriquecido com triptofano. A estimativa colorimétrica do Ácido Indolacético (AIA) foi feita no espectrofotômetro, utilizando o sobrenadante da cultura de células e solução de Salkowski, com resultado positivo para o isolado Pn 6 Sphingobium chlorophenolicum com 61,69 μg.mL-1. Os isolados também foram testados para a eficiência de solubilização de fosfato de cálcio que foi realizado e contabilizado até o 15° dia após a inoculação em placas de Petri com meio de cultura NBRIP sólido, onde 27 isolados apresentaram resultados positivos. A caracterização genética permitiu a diferenciação em gêneros e também em espécies de um mesmo gênero. Os isolados que deram resultados positivos para AIA e solubilização de fosfato... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The biodiversity conservation implies cultivating native forest species that can be used in reforestation projects, recovery of degraded areas as well as getting others like wood and medicinal products. The plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) use is being studied in cultures of economic importance. In this work four native forest species, no nodulating leguminous had been chosen: Pterogyne nitens, Albizia hasslerii, Copaifera langsdorffii, and Stryphnodendron adstringens. The aim of this work was the in vitro evaluation of the different isolates from those forest species with beneficial effects in growth and initial development of the plants and characterizes them by 16S rRNA gene sequencing and BOX-A 1R. The bacteria had been isolated from the rhizosphere and from the roots (endophytic) of each species seedlings on NFb growth media. A total of 29 isolates had been cultivated in growth media DYGS enriched with tryptophan. The indolacetic acid (IAA) production was estimated by colorimetric test in the spectrophotometer, using the supernatant of the cells culture and Salkowski's reagent, with positive result for the isolated Pn 6 Sphingobium chlorophenolicum with 61,69 μg.mL-1. Isolates had been also tested for the efficiency of P- solubilizing that was carried through and measured until the 15 º day after the inoculation in Petri plates with solid growth media NBRIP, where 27 isolates had presented positive results. The genetic characterization allows us to differentiate by the genus and species from the same genus. The isolates that had positive results for IAA and P-solubilizing had not matched between itself, what suggests nursery tests with combinations between them to evaluate the isolate efficiency as a possible PGPRs. / Mestre

In this study, four anion transporter (AT) blockers, DIDS (4, 4′-diisothiocyanatostilbene-2, 2′-disulfonic acid), 9-AC (anthracene-9-carboxylic acid), NPPB (5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid), and IAA-94 (indanyloxy acetic acid) were selected to evaluate ATs as potential target sites for insect and nematode control. All the AT blockers showed slowly developing toxicity against second-stage larvae of <i>Meloidogyne incognita</i> (Kofoid and White 1919) Chitwood 1949 and adults of <i>Caenorhabditis elegans</i> Maupas 1900 but not against third-stage larvae of <i>Heterorhabditis bacteriophora</i> Poinar 1975 even at 200 ppm. Symptoms of AT blocker toxicity observed in <i>C. elegans</i> adults were increased pharyngeal muscle contractions and decreased locomotion. Exposure of <i>C. elegans</i> as fourth-stage larvae to double-stranded RNA (dsRNA) of <i>ceclc-1</i> and <i>ceclc-2</i> (VGCC genes coding for CeClC-1 and CeClC-2, respectively) either alone or together for 24 h decreased their expression in F1 progeny in a time-dependent manner. Reduction in expression of <i>ceclc-2</i> alone or together with <i>ceclc-1</i> significantly increased pharyngeal contractions and decreased locomotion in significantly higher percentage of F1 progeny. The above findings suggested AT blockers nematicidal activity primarily comes from inhibition of CeClC-2 channels, while inhibition of CeClC-1 channels may enhance this activity. All the AT blockers showed slowly developing toxicity against adults of a susceptible strain (Oregon-R) of <i>Drosophila melanogaster</i> Meigen 1830, while DIDS, was equally toxic to dieldrin-resistant rdl flies. All AT blockers, except 9-AC, at 100 µM showed significant excitatory effect on desheathed central nervous system (CNS) of third-instar larvae of <i>Drosophila</i>, while DIDS showed a modest excitatory effect on ascending peripheral nerves. Feeding adult flies on 10% sugar solution mixed with 100 ppm of DIDS for 6 h decreased the midgut pH by 2 units approximately. All the AT blockers inhibited the growth of larvae (in weight), increased the developmental time, and decreased survival when <i>Ostrinia nubilalis</i> (Hübner 1796) second-instar larvae were fed for seven days. All the AT blockers decreased the midgut alkalinity and inhibited chloride ion transport from midgut lumen into epithelia in fifth-instar larvae when fed for 3 h on treated diet. Positive correlations observed among growth, midgut alkalinity, and midgut chloride transport in AT blocker-fed larvae suggested that inhibition of chloride/bicarbonate exchangers by AT blockers may have contributed to midgut alkalinity decrease affecting the digestion and resulting in observed lethal and sublethal effects. / Ph. D.