Les produits de contraste ultrasonore constituent un véritable apport pour l'imagerie échographique et sont aujourd'hui utilisés en clinique pour l'évaluation de la perfusion cardiaque ou encore la détection de tumeurs. Depuis quelques années, les transducteurs capacitifs micro-usinés (cMUTs) se présentent comme une alternative intéressante aux transducteurs piézoélectriques classiques et offrent certains avantages comme une large bande passante. Nous proposons dans cette thèse d'évaluer le potentiel de cette technologie pour l'imagerie de contraste. Dans un premier temps, notre étude s'est orientée vers l'adaptation des cMUTs à l'imagerie non linéaire. Ensuite, de nouvelles méthodes de détection de contraste, basées sur le comportement spécifique des microbulles, ont été développées pour exploiter les avantages de la technologie cMUT. Comparés aux méthodes conventionnelles, les résultats obtenus montrent une meilleure visualisation des agents de contraste par rapport aux tissus environnants. L'utilisation de cMUTs améliore l'efficacité de ces méthodes démontrant, ainsi, leur intérêt pour l'imagerie de contraste.

La myéline est une gaine formée par l’enroulement de la membrane plasmique de la cellule de Schwann autour de l’axone dans le nerf périphérique. Lorsque cette gaine est détruite, on parle de démyélinisation, cela provoque de nombreuses maladies, dont les maladies de Charcot Marie Tooth (CMT) de type 1. Les maladies CMT sont héréditaires et atteignent le système nerveux périphérique. Les symptômes communs incluent : une faiblesse musculaire, une démarche maladroite, des troubles de l’équilibre et des pieds très cambrés ou très plats. Le type le plus fréquent est la forme autosomique dominante CMT1A.Une duplication du bras court du chromosome 17 contenant le gène PMP22 (Peripheral Myelin Protein 22) induit la CMT1A. La PMP22, une petite protéine exprimée par les cellules de Schwann, est donc en excès et entraine une démyélinisation. Il existe un modèle de rats transgéniques PMP22 (ou rats CMT1A) mimant cette pathologie humaine. Les rats CMT1A surexpriment la pmp22 de souris de façon hétérozygote. Jusqu’à présent, aucun remède n’existe pour les maladies CMT. Un des traitements envisageables est la thérapie génique. Le but de mon projet de thèse était d’étudier la validité et l'efficacité de la thérapie génique chez les rats CMT1A. La stratégie consiste à réduire la surexpression de la protéine PMP22 chez le rat CMT1A à l’aide d’ARNsh anti-PMP22. Pour ne pas être détruits par l’organisme et maintenir une expression longue, ces ARN sh-PMP22 sont transférés chez le rat grâce à des vecteurs viraux dérivés de virus adéno-associés, ou AAV (pour adeno-associated virus). Nous avons donc injecté un des différents sérotypes d'AAV,l'AAV9 exprimant les ARN sh-PMP22 de souris ainsi que la GFP comme marqueur des cellules infectées dans les nerfs sciatiques de rats CMT1A à l’âge de 6 jours ou 7 jours.Nous avons d’abord confirmé que les virus thérapeutiques infectaient une très large proportion de cellules de Schwann dans le nerf sciatique de rat CMT1A et ensuite que l’infection de ces cellules par les virus exprimant les ARN sh-PMP22 induisait une diminution significative de l’expression de la protéine PMP22. L'analyse du phénotype moteur des rats CMT1A traités avec les AAV9 exprimant les ARN sh-PMP22 montre que les rats CMT1A traités ne développent pas la maladie observée dans les contrôles. Également, les rats CMT1A présentent une hypoalgésie, un phénotype qui n’apparait pas dans les CMT1A traités avec les vecteurs thérapeutiques. Le traitement par thérapie génique empêche la réduction de la vitesse de conduction nerveuse observé dans les rats malades. Concernant la biodistribution des virus, 2,5 mois après le traitement, en dehors des nerfs sciatiques ou les virus ont été injectés, le virus était présent dans les muscles qui entourent le nerf et aussi dans quelques ganglion dorsaux. Pour la réponse immunitaire,les rats injectés, à seulement 2 exceptions près, n’ont pas développé de facteurs neutralisants anti-AAV9. Cette thérapie génique pourrait être utilisée dans les essais cliniques.Avant de passer aux études cliniques pour le traitement de la maladie CMT1A à l’aide d’AAV9 exprimant des ARN sh-PMP22 humain, la dose d’expression de ce ARN sh-PMP22 doit être très soigneusement déterminée car si la PMP22 est trop réduite, une autre maladie peut se développer, la neuropathie héréditaire avec hypersensibilité à la pression. Il est aussi important d’avoir un outil bien adapté qui permet d’évaluer l’efficacité du traitement. Aucun existant n’est assez fiable pour mesurer la myéline du nerf périphérique. Pour remédier à ce manque, nous avons testé la technique d'imagerie Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) en caractérisant avec succès les défauts de la myéline. Par conséquent, le CARS est une technique prometteuse permettant d’évaluer l’avancement des maladies de la myéline et l’efficacité de nouvelles thérapies pour les neuropathies périphériques démyélinisantes. / Myelin, a tissue synthesized by Schwann cells, covers and protects nerves. If damaged, it causes many demyelinating diseases such as the inherited peripheral nervous system disorder Charcot Marie Tooth or CMT type 1. CMT neuropathies display a large variability from one patient to another. Nevertheless, the most common symptoms include muscle weakness, an awkward way of walking (gait), equilibrium problem and highly arched or very flat feet. The most common subtype of CMT is an autosomal dominant disorder known as CMT1A. CMT1A is caused by the duplication of the peripheral myelin protein 22 (PMP22) gene on the short arm of chromosome 17 (17p11.2) resulting in an excess of PMP22. This leads to demyelination. PMP22 is a small protein expressed by Schwann cells. There is still no cure for CMT diseases. One approach for a treatment is gene therapy. The aim of my thesis project was to deliver proof of principle for a gene therapy approach on a CMT1A rat model characterized by extra copies of mouse pmp22 gene (CMT1A rat). The treatment strategy consisted in reducing PMP22 overexpression in CMT1A rats with shRNA against PMP22. Viral vectors like adeno-associated virus (AAV having serotypes from1-10) are used to deliver shRNA in vivo so that they won’t be destroyed by the organism and for them to be long-lasting. Thus, we injected sciatic nerves of 6-7-day-old CMT1A rats with AAV9 expressing shRNA PMP22 with a GFP marker. We first confirmed that the virus highly transduced Schwann cells and that AAV9 shRNA PMP22 decreased PMP22 protein expression in CMT1A rats’ sciatic nerves. CMT1A rats treated with AAV9 shRNA PMP22 showed that they didn’t develop the motor phenotype seen in controls. Moreover, hypoalgesia observed in CMT1A rats was alleviated by treatment. In addition, gene therapy increased the reduced nerve conduction velocity found in CMT1A rats. Concerning safety, no viral off-targets were detected except in muscles close to the injection site (sciatic nerve) and in the dorsal root ganglions. Except for 2 rats, there was no immune response against AAV; no anti-AAV9 neutralizing factors. Consequently, this gene therapy could be used in clinical trials. Before moving to clinical studies, the minimal effective dosage should be very carefully defined because if PMP22 is completely deleted, another disease is caused: Hereditary Neuropathy with Pressure Palsies. It is also crucial to have a strong readout to evaluate the outcome of a treatment. However, no tool consistent enough exists for examining the peripheral nerve. Thus, we tested the label-free imaging technique Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and successfully characterized myelination defects. Consequently, CARS could be used as a consistent outcome measure for developing new therapies for demyelinating peripheral neuropathies.

Les produits de contraste ultrasonore constituent un véritable apport pour l’imagerie échographique et sont aujourd’hui utilisés en clinique pour l’évaluation de la perfusion cardiaque ou encore la détection de tumeurs. Depuis quelques années, les transducteurs capacitifs micro-usinés (cMUTs) se présentent comme une alternative intéressante aux transducteurs piézoélectriques classiques et offrent certains avantages comme une large bande passante. Nous proposons dans cette thèse d’évaluer le potentiel de cette technologie pour l’imagerie de contraste. Dans un premier temps, notre étude s’est orientée vers l’adaptation des cMUTs à l’imagerie non linéaire. Ensuite, de nouvelles méthodes de détection de contraste, basées sur le comportement spécifique des microbulles, ont été développées pour exploiter les avantages de la technologie cMUT. Comparés aux méthodes conventionnelles, les résultats obtenus montrent une meilleure visualisation des agents de contraste par rapport aux tissus environnants. L’utilisation de cMUTs améliore l’efficacité de ces méthodes démontrant, ainsi, leur intérêt pour l’imagerie de contraste. / Using ultrasound contrast agents, many clinical diagnoses have now been improved thanks to new contrast dedicated imaging techniques. Contrast agents are now used routinely in cardiology and in radiology to improve the detection and visualization of blood perfusion in various organs (e.g. tumors). Since a few years, Capacitive Micromachined Ultrasonic Transducers (cMUTs) have emerged as a good alternative to traditional piezoelectric transducer. cMUTs provide several advantages such as wide frequency bandwidth which could be further developed for nonlinear imaging. In this dissertation, we propose to exploit cMUT for contrast agent imaging. Firstly, the excitation signal was adapted to suppress the inherent nonlinear behavior of cMUT. Then, new detection methods based on specific acoustic properties of microbubbles have been developed and evaluated with a cMUT probe. Results show a good suppression from tissue responses whereas echoes from microbubbles are enhanced. Furthermore, the efficiency of each method is improved by the use of cMUT revealing the potential of this new transducer technology for contrast agent detection.

L’imagerie optique à travers des milieux diffusants, comme des milieux biologiques ou de la peinture blanche, reste un challenge car l’information spatiale portée par la lumière incidente est mélangée par les évènements multiples de diffusion. Toutefois, les modulateurs spatiaux de lumière (SLM) disposent de millions de degrés de liberté pour contrôler le profil spatial de la lumière en sortie du milieu, en forme de tavelure (speckle), avec des techniques de modulation du front d’onde. Cependant, si le laser génère une impulsion brève, le signal transmis s’allonge temporellement, car le milieu diffusant répond différemment pour les diverses composantes spectrales de l’impulsion. Nous avons développé, au cours de cette thèse, des méthodes de contrôle du profil spatiotemporel d’une impulsion brève transmise à travers un milieu diffusant. En mesurant la Matrice de Transmission Multi-Spectrale ou Résolue-Temporellement, la propagation de l’impulsion peut être totalement décrite dans le domaine spectral ou temporel. Avec des techniques de manipulation du front d’onde, les degrés de libertés spectraux/temporel peuvent être ajustés avec un unique SLM via la diversité spectrale du milieu diffusant. Nous avons démontré, de manière déterministe, la focalisation spatio-temporelle d’une impulsion brève après propagation dans un milieu diffusant, avec une compression temporelle proche de la durée initiale de l’impulsion, à différentes positions de l’espace-temps. Nous avons également démontré un façonnage contrôlé du profil temporel de l’impulsion, notamment avec la génération d’impulsions doubles. Nous exploitons cette focalisation spatio-temporelle pour exciter un processus optique non-linéaire, la fluorescence à deux photons. Cette approche ouvre des perspectives intéressantes pour le contrôle cohérent, l’étude de l’interaction lumière-matière ainsi que l’imagerie multi-photonique. / Optical imaging through highly disordered media such as biological tissue or white paint remains a challenge as spatial information gets mixed because of multiple scattering. Nonetheless, spatial light modulators (SLM) offer millions of degrees of freedom to control the spatial speckle pattern at the output of a disordered medium with wavefront shaping techniques. However, if the laser generates a broadband ultrashort pulse, the transmitted signal becomes temporally broadened as the medium responds disparately for the different spectral components of the pulse. We have developed methods to control the spatio-temporal profile of the pulse at the output of a thick scattering medium. By measuring either the Multispectral or the Time- Resolved Transmission Matrix, we can fully describe the propagation of the broadband pulse either in the spectral or temporal domain. With wavefront shaping techniques, one can control both spatial and spectral/temporal degrees of freedom with a single SLM via the spectral diversity of the scattering medium. We have demonstrated deterministic spatio-temporal focusing of an ultrashort pulse of light after the medium, with a temporal compression almost to its initial time-width in different space-time position, as well as different temporal profile such as double pulses. We exploit this spatio-temporal focusing beam to enhance a non-linear process that is two-photon excitation. It opens interesting perspectives in coherent control, light-matter interactions and multiphotonic imaging.

La microscopie multiphotonique est un outil essentiel d’investigation en biologie cellulaire et tissulaire. Son extension à l’endoscopie est l’objet d’intenses efforts de recherche pour des applications en neurosciences (imagerie cérébrale du petit animal) ou en clinique (diagnostic précoce, aide à la biopsie). Ce manuscrit porte sur le développement d’un endomicroscope multiphotonique présentant des performances inédites. Ce dispositif est alimenté par un oscillateur titane-saphir standard. Vient ensuite un module de pré-compensation des distorsions linéaires et non linéaires se produisant dans la fibre endoscopique. Ce module permet d’obtenir des impulsions compressées de 39 fs à la sortie d’une fibre microstructurée air-silice innovante à double gaine de 5 mètres de long qui est optimisée pour l’excitation multiphotonique (cœur central de 3,4 µm à maintien de polarisation) et la collection du signal produit par les cibles biologiques. A l’extrémité de la fibre, on trouve une sonde endoscopique, de 2,2 mm de diamètre pour 37 mm de long, composée d’un micro-scanner à fibre optique et d’un micro-objectif achromatique de distance de travail supérieure à 400 µm. La résolution spatiale de l’appareil vaut 0,83 µm et l’acquisition se fait en simultané sur deux canaux spectraux à 8 images/s. L’appareil a permis l’enregistrement d’images in vivo sans marquage des tubules et de la capsule rénale, respectivement par fluorescence à deux photons des flavines et par génération de second harmonique du collagène, avec 30 mW sur les tissus et jusqu’à 300 µm sous la surface de l’organe. / Multiphoton microscopy is an essential investigative tool in cell and tissue biology. Its extension to endoscopy is the subject of intensive research for applications in neuroscience (brain imaging of small animals) or clinical (early diagnosis, help for biopsy). This manuscript focuses on the development of an endomicroscope with multiphoton unprecedented performance. This device is powered by a standard titanium-sapphire oscillator. Then comes a pre-compensation module of linear and nonlinear distortions occurring in the endoscopic fiber. This module provides compressed pulses of 39 fs at the direct output of 5 meters long innovative double-clad air-silica microstructured fiber which is optimized for multiphoton excitation (polarization maintaining central core of 3.4 µm) and the collection of the signal produced by biological targets. At the end of the fiber, there is an endoscopic probe, 2.2 mm in diameter and 37 mm long, composed of a micro fiber scanning system and an achromatic micro-objective with a working distance greater than 400 µm. The spatial resolution of the device is 0.83 µm and the acquisition is done simultaneously on two spectral channels at 8 frames/s. The device has recorded in vivo images without label of the tubules and the renal capsule, respectively by two-photon excitation fluorescence of flavins and second harmonic generation of collagen, with 30 mW on the tissues and 300 µm below the surface of the organ.

Ce travail concerne tout d'abord deux techniques originales de caractérisation monocoup d'impulsions lumineuses brèves. un autocorrélateur à deux photons à fibre optique à coeur liquide fluorescent est tout d'abord présenté. La seconde méthode, nommée SPIRIT, s'appuie sur l'interférométrie spectrale à décalage résolue temporellement sans référence. Elle met en oeuvre une étape interférométrique suivie d'une étape non-linéaire d'échantillonnage temporel tout optique. Une évolution bi-dimensionnelle de SPIRIT profitant des dimensions spectrale et temporelle et également démontrée.<br />La seconde partie de ce travail concerne une technique d'acheminement d'impulsions femtosecondes énergétiques par fibre optique en vue d'une application à l'endomicroscopie non-linéaire. La mise en forme temporelle et spectrale du signal permet de pré-compenser la dipersion chromatique et l'automodulation de phase se produisant dans la fibre endoscopique constituée d'un faisceau de milliers de fibres optiques. L'endomicroscope non-linéaire a permis l'enregistrement d'images bi-photoniques de cellules de colon humain pour une puissance moyenne faible.