A cinomose canina, causada pelo vírus Canine Distemper (CDV), é uma doença de grande importância não só no Brasil como no mundo. Isto se deve principalmente à sua vasta ocorrência, facilitada pelo tipo de transmissão que pode ser por contato com secreções respiratórias, oculares, por fezes e urina. Detectar rapidamente o vírus em animais contaminados é de extrema importância para que o controle aconteça de forma rápida e adequada, evitando o agravamento da doença, a disseminação e o aumento da mortalidade. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver uma plataforma diagnóstica imunocromatográfica que possibilite a detecção rápida de biomoléculas relacionadas com esta doença. Os testes imunocromatográficos são por natureza plataformas de baixo custo e que fornecem resultados rápidos sem a necessidade de equipamentos para a interpretação. Essas plataformas são compostas por regiões diferentes de papéis ou membranas, constituídos de fibra de vidro (sample pad e conjugate pad), material celulósico (sample pad e absorbent pad) e nitrocelulose (região de detecção). Nesse trabalho, com o intuído de diminuir ainda mais o custo da plataforma, foi avaliada a possibilidade de substituição das diferentes regiões somente pelo do papel de filtro Whatman nº 1. Para isso, foi necessário a otimização de diversos reagentes e tratamentos que fossem capazes de modificar a estrutura do papel, deixando-o mais reativo frente às proteínas imobilizadas na região de detecção, como o periodato de sódio, divinilsulfona e tampão carbonato; e menos reativos, quando utilizado em outras regiões. Antes de iniciar os ensaios com o papel, os anticorpos foram avaliados por immunoblotting para verificar o funcionamento dos mesmos, em relação à sensibilidade e especificidade. Após a avaliação, os anticorpos foram imobilizados com sucesso no papel de filtro através do uso de tampão carbonado como reagente sensibilizador da celulose, levando à construção das regiões teste e controle. No conjugate pad o tratamento mais eficiente foi com a utilização de 5% de sacarose, 1% de BSA e 0,5% de Tween-20 em PBS, que garantiu a liberação satisfatória dos conjugados para a região de detecção. / Canine distemper, caused by the Canine Distemper virus (CDV), is a disease of great importance not only in Brazil, but also in the world. This is due mainly to its vast occurrence, facilitated by the transmission pathways, which may occur through contact with respiratory and/or ocular secretions, feces and urine. Rapid detection of the virus in contaminated animals is extremely important so that control takes place quickly and properly, avoiding disease worsening, its dissemination and mortality increase. The present work aimed in developing an immunochromatographic diagnostic platform that allows rapid detection of biomolecules related to this disease. Immunochromatographic tests are naturally low-cost platforms that provide fast results without need for equipment for interpretation. These platforms are composed by different regions of paper or glass fiber membranes (sample pad and conjugate pad), cellulosic material (sample pad and absorbent pad), and nitrocellulose (detection region). In this work, with the intention of further platform\'s cost reduction, the possibility of replacing the different regions was evaluated by using only the Whatman nº 1 filter paper. For this, it was necessary to optimize several reagents and treatments that were capable of modifying the paper structure, making it more reactive to the proteins immobilized in the detection region, such as sodium periodate, divinylsulfone, and carbonate buffer; and less reactive paper when used in other regions. Before initiating the paper assays, the antibodies were evaluated by immunoblotting for verifying their function, regarding sensitivity and specificity. With the results obtained within this test, new strategies had and have been drawn and will be followed in future experiments. After the evaluation, the antibodies were successfully immobilized on the filter paper with the use of carbonate buffer as the cellulose sensitizer reagent, leading to the construction of the test and control regions. In the conjugate pad the most efficient treatment was the use of 5% sucrose, 1% BSA and 0.5% Tween-20 in PBS, which ensured the satisfactory release of the conjugates to the detection region.

A cinomose canina, causada pelo vírus Canine Distemper (CDV), é uma doença de grande importância não só no Brasil como no mundo. Isto se deve principalmente à sua vasta ocorrência, facilitada pelo tipo de transmissão que pode ser por contato com secreções respiratórias, oculares, por fezes e urina. Detectar rapidamente o vírus em animais contaminados é de extrema importância para que o controle aconteça de forma rápida e adequada, evitando o agravamento da doença, a disseminação e o aumento da mortalidade. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver uma plataforma diagnóstica imunocromatográfica que possibilite a detecção rápida de biomoléculas relacionadas com esta doença. Os testes imunocromatográficos são por natureza plataformas de baixo custo e que fornecem resultados rápidos sem a necessidade de equipamentos para a interpretação. Essas plataformas são compostas por regiões diferentes de papéis ou membranas, constituídos de fibra de vidro (sample pad e conjugate pad), material celulósico (sample pad e absorbent pad) e nitrocelulose (região de detecção). Nesse trabalho, com o intuído de diminuir ainda mais o custo da plataforma, foi avaliada a possibilidade de substituição das diferentes regiões somente pelo do papel de filtro Whatman nº 1. Para isso, foi necessário a otimização de diversos reagentes e tratamentos que fossem capazes de modificar a estrutura do papel, deixando-o mais reativo frente às proteínas imobilizadas na região de detecção, como o periodato de sódio, divinilsulfona e tampão carbonato; e menos reativos, quando utilizado em outras regiões. Antes de iniciar os ensaios com o papel, os anticorpos foram avaliados por immunoblotting para verificar o funcionamento dos mesmos, em relação à sensibilidade e especificidade. Após a avaliação, os anticorpos foram imobilizados com sucesso no papel de filtro através do uso de tampão carbonado como reagente sensibilizador da celulose, levando à construção das regiões teste e controle. No conjugate pad o tratamento mais eficiente foi com a utilização de 5% de sacarose, 1% de BSA e 0,5% de Tween-20 em PBS, que garantiu a liberação satisfatória dos conjugados para a região de detecção. / Canine distemper, caused by the Canine Distemper virus (CDV), is a disease of great importance not only in Brazil, but also in the world. This is due mainly to its vast occurrence, facilitated by the transmission pathways, which may occur through contact with respiratory and/or ocular secretions, feces and urine. Rapid detection of the virus in contaminated animals is extremely important so that control takes place quickly and properly, avoiding disease worsening, its dissemination and mortality increase. The present work aimed in developing an immunochromatographic diagnostic platform that allows rapid detection of biomolecules related to this disease. Immunochromatographic tests are naturally low-cost platforms that provide fast results without need for equipment for interpretation. These platforms are composed by different regions of paper or glass fiber membranes (sample pad and conjugate pad), cellulosic material (sample pad and absorbent pad), and nitrocellulose (detection region). In this work, with the intention of further platform\'s cost reduction, the possibility of replacing the different regions was evaluated by using only the Whatman nº 1 filter paper. For this, it was necessary to optimize several reagents and treatments that were capable of modifying the paper structure, making it more reactive to the proteins immobilized in the detection region, such as sodium periodate, divinylsulfone, and carbonate buffer; and less reactive paper when used in other regions. Before initiating the paper assays, the antibodies were evaluated by immunoblotting for verifying their function, regarding sensitivity and specificity. With the results obtained within this test, new strategies had and have been drawn and will be followed in future experiments. After the evaluation, the antibodies were successfully immobilized on the filter paper with the use of carbonate buffer as the cellulose sensitizer reagent, leading to the construction of the test and control regions. In the conjugate pad the most efficient treatment was the use of 5% sucrose, 1% BSA and 0.5% Tween-20 in PBS, which ensured the satisfactory release of the conjugates to the detection region.

Biological material is a common type of evidence found at a crime scene, and body fluid identification is an essential process in crime scene investigation. One of the most common types of body fluids found is blood. After a stain has been presumptively identified as blood through the use of a colorimetric chemical test, additional testing may be necessary to better characterize the stain. SERATEC PMB Test is a relatively new lateral flow immunochromatographic assay that targets human hemoglobin and D-dimer simultaneously in order to distinguish peripheral blood and menstrual blood at the same time. Elevated levels of D-dimer, a fibrin degradation product, are found in menstrual blood, thrombosis formation and as part of the postmortem process. A previous study investigated levels of D-dimer in menstrual, peripheral and postmortem blood using the SERATEC PMB Test. In this study, all postmortem blood samples showed positive results for both hemoglobin and D-dimer; all peripheral bloodstain samples from living individuals showed positive results for hemoglobin detection, and negative results for D-dimer detection; and most menstrual bloodstain samples showed positive D-dimer results. The results suggest that this assay could be considered a presumptive test for both postmortem blood and menstrual blood. However, as D-dimer concentrations vary between individuals, additional testing is necessary to conclusively distinguish postmortem blood, menstrual blood and peripheral blood from living individuals with especially high D-dimer levels.

In the medical and veterinary diagnostic fields there is an ongoing need for stable and specific antibodies. There is also a requirement for simple, robust and cost-effective diagnostic assays to be used in the developing world. Recombinant antibodies from phage displayed libraries are economical to produce and can often be engineered to improve affinity, avidity and stability. While recombinant antibody fragments are useful in immunoassays, they are not strictly comparable to normal immunoglobulins and may under-perform in certain assays. Converting monovalent single-chain antibody fragments (scFvs) to bivalent immunoglobulin-like formats could conceivably provide a more suitable molecular scaffold for use in immunoassays. Two scFvs that recognised the 65 kDa heat-shock protein (HSP65) of Mycobacterium bovis were used in this study. They were originally derived from the Nkuku® repertoire, a phage displayed antibody library based on the immune repertoire of the chicken, Gallus gallus. The genes coding for these scFvs were subcloned in expression vectors containing chicken IgY constant-heavy domains, to create bivalent constructs which were designated ‘gallibodies’. Expression of these constructs was attempted in three heterologous systems. While they were successfully produced in adherent mammalian cell cultures, the growth requirements of these cultures complicated subsequent purification. Bacteria and yeasts were investigated as alternative expression systems, but antibodies were not produced in either system. The gallibodies were compared to their monovalent scFv counterparts for stability as well as their applicability in ELISAs and gold-conjugated immunochromatographic lateral-flow assays. As gallibodies, both retained their functionality after exposure to different conditions and they were capable of immunocapture in ELISA. This was in contrast to their performance as scFvs. Furthermore, these antibody-like molecules could be stably conjugated to colloidal gold and used in lateral flow tests where positive and specific signals were obtained. This confirmed that recombinant single-chain monomeric antibody fragments could be reconstituted as bivalent immunoglobulin-like molecules and that they are a potentially useful platform for developing practical, robust immunodiagnostic reagents. It appeared from these experiments that the antibodies could act as a pair in which one captures, and the other detects HSP65. To find out whether they recognised discrete regions on the protein, their epitopes were mapped using a phage displayed peptide library in combination with computer-based algorithms. The presumptive epitope of one was mapped to residues 350 to 370 on HSP65 of M. bovis. The sequences selected from the peptide library by the other corresponded to three separate regions on the target protein. These recombinant antibody recognition sites are analogous to some of those that have been mapped by others using traditional monoclonal antibodies. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2008. / Veterinary Tropical Diseases / unrestricted

A brucelose causada pela B. canis constitui uma infecção sistêmica e zoonótica que acomete principalmente os cães, causando problemas reprodutivos. O diagnóstico da infecção é difícil, sendo necessária a associação do diagnóstico clínico aos métodos laboratoriais diretos e indiretos para sua confirmação. Um dos problemas relativos ao diagnóstico laboratorial está relacionado à ausência de marcadores que possibilitem a identificação acurada de cães em ausência de bacteremia. A partir do exposto, foi realizado um estudo com o objetivo de avaliar o desempenho de testes laboratoriais diretos e indiretos como marcadores da infecção por B. canis em cães e determinar a combinação de testes que possibilite o diagnóstico da brucelose canina com maiores valores de sensibilidade e especificidade. Foram coletadas amostras de sangue, soro e aspirado de linfonodo de 92 cães, sem distinção de sexo, idade ou raça, incluindo cães reprodutores e não reprodutores. A hemocultura e a reação em cadeia pela polimerase (PCR) foram previamente realizadas nas amostras de sangue e, com base nos resultados, os 92 animais foram divididos em dois grupos: infectados (n=37) e não infectados (n= 55). Em seguida, as amostras de aspirado de linfonodo foram submetidas à PCR e ao cultivo microbiológico e as amostras de soro foram testadas por um ensaio imunocromatográfico (EIC). A partir dos resultados obtidos, a sensibilidade e especificidade diagnóstica dos testes foram calculadas utilizando os grupos infectados e não infectados, respectivamente. O coeficiente Kappa foi usado para calcular a concordância entres os testes laboratoriais e suas combinações. A proporção de resultados positivos foi de 40,2% (37/92) para os testes diretos em amostras de sangue, 29% (27/92) e 25% (23/92) para PCR e cultivo em amostras de aspirado de linfonodo, respectivamente, e 43% (40/92) para o EIC. A concordância entre os testes variou de moderada a quase perfeita. A sensibilidade e especificidade diagnóstica foram, respectivamente, 65% e 95% para PCR em amostras de aspirado de linfonodo, 62% e 100% para o cultivo microbiológico em amostras de aspirado de linfonodo e 92% e 89% para o EIC. A PCR em amostras de aspirados de linfonodos apresentou maior sensibilidade em relação ao cultivo aplicado a estas amostras, sendo uma alternativa ao diagnóstico microbiológico. A associação entre os testes de PCR em amostras de aspirados de linfonodos e de sangue e o EIC possibilitou um aumento da sensibilidade diagnóstica, por possibilitar a identificação de cães na ausência e na presença de bacteremia, com maior rapidez. / Brucellosis caused by B. canis is a systemic and zoonotic infection characterized by prolonged bacteremia that affects mainly dogs causing reproductive problems. The diagnosis of the infection is quite difficult, being necessary the association of the clinical diagnosis with direct and indirect laboratory methods to confirm the infection. The main drawback regarding the laboratory diagnosis relies on the lack of markers that allow the accurate identification of non bacteremic dogs. From the above, a study was carried out to evaluate the performance of direct and indirect laboratory tests as markers for B. canis infection in dogs and to determine the combination of tests that allows the diagnosis of the infection with higher values of sensitivity and specificity. Samples of blood, serum and lymph node aspirates were collected from 92 dogs, regardless the sex, age or breed, including pet and breeding dogs. All the dogs were tested using culturing and the polymerase chain reaction (PCR) in blood samples and, based on the results, they were divided into two groups: infected (n = 37) and non-infected (n = 55). Lymph node aspirates were tested through PCR and microbiological culturing, and serum samples using an immunochromatographic assay (EIC). The infected and uninfected groups were used to calculate, respectively, the sensitivity and specificity of the tests. The agreement between the tests was calculated using Kappa coefficient. The proportion of positive results was 40.2% (37/92) for the direct tests in blood samples, 29% (27/92) and 25% (23/92) for PCR and lymph node culturing, respectively, and 43% (40/92) for the EIC. The agreement between the tests ranged from moderate to near perfect. The sensitivity and specificity was, respectively, 65% and 95% for PCR in lymph node aspirates, 62% and 100% for lymph node culturing, and 92% and 89% for EIC. The PCR in lymph node aspirates showed a higher sensitivity when compared to the lymph node culturing, being an alternative to the microbiological diagnosis. The association between PCR in blood and lymph node aspirates and the EIC enabled an increased sensitivity in the diagnosis with the identification of non-bacteremic dogs more rapidly.

Cryptosporidium is a genus of apicomplexan unicellular epicellular parasite with worldwide distribution causing watery diarrhea in humans and animals. The life cycle is completed in one host, where Cryptosporidium parasitizing epithelial cells of gastrointestinal tract and in birds can cause disease of respiratory or urogenital tract. Course of disease depends on condition of immune system. For immunodeficient individuals could be life threatening. One of problems especially in developing countries is early and correct diagnostic, particularly no effective treatment currently exist. The aim of this thesis was to compare efficiency of immunochromatographic tests in samples stored under different conditions. The comparison of sensitivity and specificity of these tests with molecular and microscopic techniques was also performed. Additionaly, suitability of immunochromatographic tests for detection of active infection during prepatent period was evaluated. The theoretic part includes general information about Cryptosporidium. Its taxonomy, cycle of evolution or transmission and course of disease. Using of immunochromatographic test is also mentioned. No differences in sensitivity of used immunochromatographic tests was observed in this thesis. The detection rate for most of tests was 200 oocyst per sample. The presence of coproantigen is depend upon presence of oocysts in a sample. False negative results of immunochromatographic assays was caused by i) low concentration of oocysts in a sample (sensitivity) or ii) antibodies in used test don´t react with antigen of Cryptosporidium spp. (specificity). Results of this thesis show that combination of immunochromatographic tests and other techniques is convenient. During prepatent period is not possible to detect specific DNA, antigen or oocysts of Cryptosporidium. The active infection could not be distinguish from passage of oocysts using of immunochromatographic assays even if PCR is also used.

A brucelose causada pela B. canis constitui uma infecção sistêmica e zoonótica que acomete principalmente os cães, causando problemas reprodutivos. O diagnóstico da infecção é difícil, sendo necessária a associação do diagnóstico clínico aos métodos laboratoriais diretos e indiretos para sua confirmação. Um dos problemas relativos ao diagnóstico laboratorial está relacionado à ausência de marcadores que possibilitem a identificação acurada de cães em ausência de bacteremia. A partir do exposto, foi realizado um estudo com o objetivo de avaliar o desempenho de testes laboratoriais diretos e indiretos como marcadores da infecção por B. canis em cães e determinar a combinação de testes que possibilite o diagnóstico da brucelose canina com maiores valores de sensibilidade e especificidade. Foram coletadas amostras de sangue, soro e aspirado de linfonodo de 92 cães, sem distinção de sexo, idade ou raça, incluindo cães reprodutores e não reprodutores. A hemocultura e a reação em cadeia pela polimerase (PCR) foram previamente realizadas nas amostras de sangue e, com base nos resultados, os 92 animais foram divididos em dois grupos: infectados (n=37) e não infectados (n= 55). Em seguida, as amostras de aspirado de linfonodo foram submetidas à PCR e ao cultivo microbiológico e as amostras de soro foram testadas por um ensaio imunocromatográfico (EIC). A partir dos resultados obtidos, a sensibilidade e especificidade diagnóstica dos testes foram calculadas utilizando os grupos infectados e não infectados, respectivamente. O coeficiente Kappa foi usado para calcular a concordância entres os testes laboratoriais e suas combinações. A proporção de resultados positivos foi de 40,2% (37/92) para os testes diretos em amostras de sangue, 29% (27/92) e 25% (23/92) para PCR e cultivo em amostras de aspirado de linfonodo, respectivamente, e 43% (40/92) para o EIC. A concordância entre os testes variou de moderada a quase perfeita. A sensibilidade e especificidade diagnóstica foram, respectivamente, 65% e 95% para PCR em amostras de aspirado de linfonodo, 62% e 100% para o cultivo microbiológico em amostras de aspirado de linfonodo e 92% e 89% para o EIC. A PCR em amostras de aspirados de linfonodos apresentou maior sensibilidade em relação ao cultivo aplicado a estas amostras, sendo uma alternativa ao diagnóstico microbiológico. A associação entre os testes de PCR em amostras de aspirados de linfonodos e de sangue e o EIC possibilitou um aumento da sensibilidade diagnóstica, por possibilitar a identificação de cães na ausência e na presença de bacteremia, com maior rapidez. / Brucellosis caused by B. canis is a systemic and zoonotic infection characterized by prolonged bacteremia that affects mainly dogs causing reproductive problems. The diagnosis of the infection is quite difficult, being necessary the association of the clinical diagnosis with direct and indirect laboratory methods to confirm the infection. The main drawback regarding the laboratory diagnosis relies on the lack of markers that allow the accurate identification of non bacteremic dogs. From the above, a study was carried out to evaluate the performance of direct and indirect laboratory tests as markers for B. canis infection in dogs and to determine the combination of tests that allows the diagnosis of the infection with higher values of sensitivity and specificity. Samples of blood, serum and lymph node aspirates were collected from 92 dogs, regardless the sex, age or breed, including pet and breeding dogs. All the dogs were tested using culturing and the polymerase chain reaction (PCR) in blood samples and, based on the results, they were divided into two groups: infected (n = 37) and non-infected (n = 55). Lymph node aspirates were tested through PCR and microbiological culturing, and serum samples using an immunochromatographic assay (EIC). The infected and uninfected groups were used to calculate, respectively, the sensitivity and specificity of the tests. The agreement between the tests was calculated using Kappa coefficient. The proportion of positive results was 40.2% (37/92) for the direct tests in blood samples, 29% (27/92) and 25% (23/92) for PCR and lymph node culturing, respectively, and 43% (40/92) for the EIC. The agreement between the tests ranged from moderate to near perfect. The sensitivity and specificity was, respectively, 65% and 95% for PCR in lymph node aspirates, 62% and 100% for lymph node culturing, and 92% and 89% for EIC. The PCR in lymph node aspirates showed a higher sensitivity when compared to the lymph node culturing, being an alternative to the microbiological diagnosis. The association between PCR in blood and lymph node aspirates and the EIC enabled an increased sensitivity in the diagnosis with the identification of non-bacteremic dogs more rapidly.

Sendo uma patologia prevenível e tratável, o importante na toxoplasmose congênita é o diagnóstico precoce, fundamental para intervenção terapêutica imediata. Em Cascavel-PR a soroepidemiologia da toxoplasmose foi avaliada em 334 soros de gestantes, com prevalência de 54% e risco de 2,5%aa de infecção aguda. Para monitorar e instrumentar o pré-natal através da triagem de gestantes soronegativas por acompanhamento mensal foi desenvolvido um teste imunocromatográfico para detecção de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii. (TIC-toxo). Conjugados de ouro coloidal com diferentes extratos antigênicos do agente e os reagentes controle e teste da reação foram preparados e avaliados por imunofiltração e controles intraexperimentais, incluindo microscopia eletrônica, sendo. selecionados na padronização o conjugado de ouro de 6nm recoberto com 2,5 ug/A 540nm de ouro de extrato antigênico alcalino de T. gondii, na linha teste da membrana, a Proteína A de S.aureus e na linha controle, o anticorpo anti-T. gondii,. No ensaio foram testadas 70 amostras de soro em duplicata, sendo 35 reagentes e 35 não reagentes, comparando com ELISA comercial, ELISA in house e IFI. Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e eficiência do TIC-Toxo foram, respectivamente: 88,6% (IC 72,3-96,3), 80,0% (IC 62,5-90,9), 81,6% (IC 65,1-91,7), 87,5% (IC 70,1-95,9) e 0,8429, havendo concordância e reprodutibilidade (Kappa=0,712171) entre o TIC-toxo e os métodos clássicos. O teste desenvolvido é rápido, de baixo custo, de fácil execução em única etapa para uso ambulatorial, precedendo a confirmação laboratorial, na triagem de gestantes ou grupos específicos, permitindo especialmente, o manejo adequado das gestantes de Cascavel em risco de toxoplasmose congênita. / As preventable and treatable condition, the main goal in congenital toxoplasmosis is early diagnosis, essential for adequate therapy. We study seroepidemiology of toxoplasmosis in 344 sera samples from pregnant women of Cascavel, PR, Brazil. By consistent serology, we demonstrate 54% prevalence and a 2.5% risk of acute infection/year, using several approaches. For supply the antenatal office care, it would be important a quick immunochromatographic assay for detection of anti T.gondii</I. IgG antibodies (TIC-Toxo), to be applied in the follow up of pregnant women at risk of infection. To develop the TIC-Toxo assay, we evaluate and standardize the gold particle conjugate adsorbed with several types of tachyzoite extracts, aside to specific reagents for the control and test area of the strip test, by immunofiltration assays, with several quality control steps including electron microscopy. Those analysis provide data for defining the reagents for mass production of TIC-Toxo, constructed with 6 nm colloidal gold conjugate recovered with 2.5ug/A540 of alcaline extract from T.gondii tachyzoites, with S.aureus Protein A at test dot and anti-T.gondii antiserum at control dot. Seventy sera samples were blind tested, 35 positive and 35 negative, comparing to ELISA and IFA assays. Sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and accuracy were respectively: 88,6% (IC 72,3-96,3), 80,0% (IC 62,5-90,9), 81,6% (IC 65,1-91,7), 87,5% (IC 70,1-95,9) e 0,8429, with good agreement of TIC-Toxo and other assays (Kappa=0,712171), with good intra and inter test reproducibility. This TIC-Toxo is a quick, low cost, one step assay and easily performed, to be used for prenatal ambulatory diagnosis of toxoplasmosis, preceding the laboratorial confirming diagnosis and allowing adequate care of pregnant women or others selected groups at risk of acute toxoplasmosis and fetal congenital disease, specially at Cascavel-Pr.

Sendo uma patologia prevenível e tratável, o importante na toxoplasmose congênita é o diagnóstico precoce, fundamental para intervenção terapêutica imediata. Em Cascavel-PR a soroepidemiologia da toxoplasmose foi avaliada em 334 soros de gestantes, com prevalência de 54% e risco de 2,5%aa de infecção aguda. Para monitorar e instrumentar o pré-natal através da triagem de gestantes soronegativas por acompanhamento mensal foi desenvolvido um teste imunocromatográfico para detecção de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii. (TIC-toxo). Conjugados de ouro coloidal com diferentes extratos antigênicos do agente e os reagentes controle e teste da reação foram preparados e avaliados por imunofiltração e controles intraexperimentais, incluindo microscopia eletrônica, sendo. selecionados na padronização o conjugado de ouro de 6nm recoberto com 2,5 ug/A 540nm de ouro de extrato antigênico alcalino de T. gondii, na linha teste da membrana, a Proteína A de S.aureus e na linha controle, o anticorpo anti-T. gondii,. No ensaio foram testadas 70 amostras de soro em duplicata, sendo 35 reagentes e 35 não reagentes, comparando com ELISA comercial, ELISA in house e IFI. Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e eficiência do TIC-Toxo foram, respectivamente: 88,6% (IC 72,3-96,3), 80,0% (IC 62,5-90,9), 81,6% (IC 65,1-91,7), 87,5% (IC 70,1-95,9) e 0,8429, havendo concordância e reprodutibilidade (Kappa=0,712171) entre o TIC-toxo e os métodos clássicos. O teste desenvolvido é rápido, de baixo custo, de fácil execução em única etapa para uso ambulatorial, precedendo a confirmação laboratorial, na triagem de gestantes ou grupos específicos, permitindo especialmente, o manejo adequado das gestantes de Cascavel em risco de toxoplasmose congênita. / As preventable and treatable condition, the main goal in congenital toxoplasmosis is early diagnosis, essential for adequate therapy. We study seroepidemiology of toxoplasmosis in 344 sera samples from pregnant women of Cascavel, PR, Brazil. By consistent serology, we demonstrate 54% prevalence and a 2.5% risk of acute infection/year, using several approaches. For supply the antenatal office care, it would be important a quick immunochromatographic assay for detection of anti T.gondii</I. IgG antibodies (TIC-Toxo), to be applied in the follow up of pregnant women at risk of infection. To develop the TIC-Toxo assay, we evaluate and standardize the gold particle conjugate adsorbed with several types of tachyzoite extracts, aside to specific reagents for the control and test area of the strip test, by immunofiltration assays, with several quality control steps including electron microscopy. Those analysis provide data for defining the reagents for mass production of TIC-Toxo, constructed with 6 nm colloidal gold conjugate recovered with 2.5ug/A540 of alcaline extract from T.gondii tachyzoites, with S.aureus Protein A at test dot and anti-T.gondii antiserum at control dot. Seventy sera samples were blind tested, 35 positive and 35 negative, comparing to ELISA and IFA assays. Sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and accuracy were respectively: 88,6% (IC 72,3-96,3), 80,0% (IC 62,5-90,9), 81,6% (IC 65,1-91,7), 87,5% (IC 70,1-95,9) e 0,8429, with good agreement of TIC-Toxo and other assays (Kappa=0,712171), with good intra and inter test reproducibility. This TIC-Toxo is a quick, low cost, one step assay and easily performed, to be used for prenatal ambulatory diagnosis of toxoplasmosis, preceding the laboratorial confirming diagnosis and allowing adequate care of pregnant women or others selected groups at risk of acute toxoplasmosis and fetal congenital disease, specially at Cascavel-Pr.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camila Giuberti de Souza.pdf: 3430450 bytes, checksum: ab482e56c375b400885fedb71acbcd32 (MD5) Previous issue date: 2012-05-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Atualmente, a Organização Mundial da Saúde considera a dengue como a mais importante doença viral transmitida por mosquitos e estima em 50 milhões o número de novas infecções a cada ano no mundo. A expansão mundial dessa doença e a demanda por testes diagnósticos rápidos, específicos e de execução simples, aumentaram o número de novos testes disponíveis no mercado. Sabe-se que, para uma melhor utilização dessas ferramentas, é fundamental sua avaliação nos diversos cenários clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. Este trabalho teve por objetivo avaliar sete testes laboratoriais para o diagnóstico de dengue. As sensibilidades encontradas para os testes imunocromatográficos baseados na detecção de NS1 encontradas foram: 24,5% [16,2-34,4] para o Dengue Duo(Bioeasy) e 29,8% [20,8-40,1] Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad). Para os testes ELISA NS1 as sensibilidades encontradas foram 43,6% [33,4-54,2] para Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy), e 54,3% [43,7-64,6] para PlateliaTM Dengue NS1 Ag-ELISA (BioRad). O teste NS1 que apresentou maior sensibilidade na fase aguda da doença foi o PlateliaTM (54,3%). Para todos os testes NS1 observou-se maior sensibilidade para o sorotipo 1 quando comparado com os demais sorotipos e, para o PlateliaTM, a presença de IgG influenciou negativamente na sensibilidade do teste. As sensibilidades dos testes para anticorpos IgM, variaram entre 27,1% [15,3-41,9] a 52,1% [37,2-66,7] em amostra de fase aguda, e 72,9% [53,8-81,3] a 97,9% [88,9-99,9] em fase convalescente. Todos os testes IgM apresentaram sensibilidades superiores em amostras de fase convalescente. Dentre todos os testes avaliados, o Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy) em amostra de fase convalescente foi o que apresentou o melhor desempenho. Em amostra de fase aguda, o melhor desempenho foi obtido quando combinamos os testes PlateliaTM Dengue NS1 Ag-ELISA (BioRad) e Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy) (76,6% [66,7-84,7]). Os resultados sugerem que testes de detecção de NS1 podem exibir sensibilidades diferentes, de acordo com o sorotipo viral e com a presença de anticorpos IgG. Além disso, nossos resultados reforçam o fato de que os estudos de avaliação de testes diagnósticos para a dengue e sua utilização devem levar em consideração o perfil epidemiológico da população / Currently, the World Health Organization considers dengue the most important viral disease transmitted by mosquitoes and it is estimated that 50 million new infections occur each year worldwide. The global spread of dengue and the demand for rapid, specific and easy to perform diagnostic tests has increased the marketing of new tests. For a better use of these tools it is essential to evaluate them in different clinical, epidemiological and laboratory settings. The aim of this study was to evaluate the sensitivity of seven laboratory tests for dengue diagnosis. The sensitivities for the NS1 immunochromatographic tests were: 24,5% [16,2 to 34,4] for Dengue Duo (Bioeasy) and 29,8% [20,8 to 40,1] for Dengue NS1 Ag strip (Bio-Rad). The sensitivities of the NS1 ELISA tests were: 43,6% for Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy) [33,4 to 54,2] and 54,3% [43,7 to 64,6] for PlateliaTM Dengue NS1 Ag-ELISA (BioRad). The NS1 test that demonstrated greatest sensitivity in acute phase samples was PlateliaTM (54,3%). For all NS1 tests greater sensitivity was observed for serotype 1, when compared to the others serotypes. The sensitivity of PlateliaTM (BioRad) was negatively influenced by the presence of IgG. The sensitivity of the ELISA IgM tests ranged from: 27,1% [15,3 to 41,9] to 52,1% [37,2 to 66,7] in acute phase samples and from 72,9% [53,8 to 81,3] to 97,9% [88,9 to 99,9] in convalescent phase samples. Among all the tests evaluated, Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy), in convalescent phase samples, showed the best performance. The sensitivity in acute phase samples was 76,6% [66,7 to 84,7] when Dengue NS1 Ag test PlateliaTM ELISA (BioRad) and Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy) were combined. Our results suggest that NS1 tests may have different sensitivities, according to the viral serotypes, and in the presence of IgG antibodies. Furthermore, our results emphasize that the epidemiological profile of the population must be considered in the use and evaluation of dengue diagnostic tests