La malaria, maladie causée par le protozoaire Plasmodium, tue chaque année plus d'un million de personnes. L'émergence de parasites résistants à plusieurs traitements anti-malariques ainsi que l'absence de vaccin efficace rendent la lutte contre le Plasmodium de plus en plus difficile. Afin de pouvoir identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d'optimiser l'efficacité des vaccins dans les zones endémiques, une meilleure compréhension des interactions hôte/parasite est nécessaire. Lors de la malaria, un état d'immunosuppression systémique est induit par le parasite. Cet état de suppression immunitaire pourrait être à l'origine de la persistance du parasite au sein de l'hôte ainsi que de la difficulté à obtenir une protection efficace contre la réinfection décrite dans les zones endémiques. Mieux comprendre comment le Plasmodium interfère avec la réponse immunitaire permettra de mettre en place des thérapies favorisant la résolution des infections par ce parasite. Dans ce sens, notre étude a pour but d'évaluer l'activation des cellules T régulatrices naturelles (TregN) ainsi que la modulation de la physiologie des macrophages (MP) lors des infections par Plasmodium. Une étude antérieure a suggéré que l'activation des cellules TregN lors des infections par Plasmodium yoelii l7XL (PyL) était impliquée dans le développement de l'immunosuppression et permettait au parasite d'échapper au système immunitaire. En utilisant un modèle alternatif d'infection par Plasmodium, nous avons démontré que l'activation des cellules TregN pouvait aussi représenter un mécanisme protecteur pour l'hôte. Lors des infections par Plasmodium chabaudi adami (Pca) chez les souris BALB/c, l'activation des cellules TregN permet de tempérer la réponse immunitaire afin d'éviter le développement d'une inflammation excessive sans toutefois affecter le contrôle du parasite. Ainsi, il semblerait que le rôle des cellules TregN lors des infections par Plasmodium dépende de l'espèce du parasite considérée. Les infections par Plasmodium sont associées à une diminution de la sécrétion d'interleukine 12 (IL-12) et de la viabilité des MP ayant vraisemblablement des répercussions sur le développement de la pathologie et le contrôle du parasite. Notre étude a démontré que l'hémine (HE), produite suite à l'oxydation de l'hème provenant de l'hémoglobine (Hb), pourrait être impliquée dans ces deux phénomènes. Lors des infections par Plasmodium, les MP entrent en contact avec et internalisent des quantités importantes de ce composé ferrique via la phagocytose de globules rouges (GR) parasités ou abimés ainsi que via l'ingestion d'Hb et/ou d'HE libérées dans le sang suite à la lyse des érythrocytes. In vitro, des doses physiologiques d'HE diminuent de manière significative la quantité d'IL-12 sécrétée par les MP dérivés de la moelle osseuse en réponse à une stimulation avec l'interféron gamma (IFN-y) et le lipopolysaccharide (LPS). L'HE agit principalement sur l'effet synergique de l'IFN-y et ceci d'une manière dépendante de l'interleukine 10 (IL-10), de la MAPK (de l'anglais "mitogen activated protein kinase") p38 et du stress oxydatif. D'autre part, l'utilisation de GR de souris infectées par le Pca ou de GR oxydés, permettant de stimuler une forte érythrophagocytose in vitro, a permis de démontrer que l'internalisation d'un nombre important de GR induisait l'apoptose des MP de la lignée J774A.1. La phagocytose des GR conduit à l'internalisation d'une quantité importante d'HE induisant un stress oxydatif impliqué dans la diminution de la viabilité des MP. Bien que l'activation des cellules TregN et l'inhibition des MP à la suite de l'ingestion d'HE puissent représenter des mécanismes permettant au Plasmodium d'échapper au système immunitaire, ces mécanismes immunosuppresseurs pourraient aussi permettre de limiter l'inflammation et la pathologie favorisant ainsi la survie de l’hôte lors de la malaria. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Plasmodium, immunosuppression, macrophages, interleukine 12, érythrophagocytose.

Initialement développés pour leur action inhibitrice sur les lymphocytes T, les immunosuppresseurs affectent aussi les cellules dendritiques (CD). Nous avons précédemment montré que l’acide mycophénolique (MPA) induisait une résistance des CD humaines à la maturation, néanmoins son mécanisme d’action sur les CD reste méconnu. Ce travail de thèse montre que le MPA inhibe l’activation de p38MAPK et que cette propriété entraîne l’inhibition de la maturation phénotypique induite par le facteur nécrotique tumoral a (TNFa), la diminution de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et de la capacité allostimulatrice induite par le TNFa ou le lipopolysaccharide suggérant que l’inhibition de la synthèse de cytokines inflammatoires serait déterminante pour inhiber la capacité allostimulatrice. Nous rapportons également que le MPA inhibe la phosphorylation de ERK induite par le TNFa. Ainsi, l’action du MPA sur les CD s’exerce différemment selon l’environnement dans lequel se trouvent les CD. / Immunosuppressive drugs, initially developed to inhibit T cell activation, are also known now to affect dendritic cell (DC) functions. Previous works from our laboratory showed that mycophenolic acid (MPA) induced a resistance to maturation in human DC, however its mechanism of action in DC, remains elusive. In this study, we found that MPA inhibited p38MAPK phosphorylation independently. This p38MAPK inhibition resulted in a decrease phenotypic maturation upon tumor necrosis factor-a (TNF-a) stimulation and in a decrease in the pro-inflammatory cytokine secretion upon either lipopolysaccharide or TNF-a activation. MPA also decreased allostimulatory ability after both stimuli suggesting that inflammatory cytokine inhibition was predominant over co-stimulation marker reduction to inhibit the DC allostimulatory ability. We also showed that MPA only inhibited the TNFa-induced ERK phosphorylation. Thus, the microenvironnement of the DC might influence its ability to response to MPA.

La plupart des virus ont développé des mécanismes de résistance ou de suppression du système immunitaire pour parvenir à infecter durablement leur hôte. Ces mécanismes demeurent encore imparfaitement connus. Un domaine immunosuppresseur (IS) a été identifié au niveau de la région transmembranaire des protéines d’enveloppe des rétrovirus endogènes ou infectieux. Ce domaine hautement conservé a été décrit par exemple comme inhibant l’activation lymphocytaire. Dans le laboratoire, il a été caractérisé en particulier via des expériences de rejet de cellules tumorales in vivo, ce qui a permis de définir des mutations inactivatrices. Afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance des rétrovirus au système immunitaire, mes travaux de thèse ont porté sur l’identification de la ou des protéines capables d’interagir avec le domaine IS. Plusieurs approches cellulaires et moléculaires ont été développées, basées pour la plupart sur l’utilisation de sondes fluorescentes obtenues par synthèse chimique, constituées des domaines IS provenant de différents rétrovirus. Dans un premier temps, les cellules du système immunitaire qui lient les protéines virales ont été identifiées : les lymphocytes B et les cellules myéloïdes (monocytes, cellules dendritiques et macrophages). Dans un second temps, des expériences de co-immunoprécipitation et de chromatographie d’affinité couplées à la spectrométrie de masse ont été réalisées dans le but d’identifier sur ces cellules les protéines membranaires responsables de ces liaisons. Plusieurs agents de couplages chimiques ont été utilisés afin de maintenir les liaisons domaine IS - protéine de faibles affinités. En raison de résultats non-reproductibles obtenus au cours de ces expériences, des tests de liaison du domaine IS sur des cellules transfectées avec des banques d’ADNc, ou lors d’expériences de double hybride ont été réalisées. Ces deux approches ont permis d’identifier des protéines membranaires potentiellement impliquées dans la liaison du domaine IS : les protéines X1 et X2. Les co-transfections de vecteurs d’expression du domaine IS et de X2 ont mis en évidence des interactions protéiques au cours d’expériences de co-immunoprécipitation et de microscopie confocale, en particulier avec le domaine IS du rétrovirus HIV-1. Concernant X1, sa transfection induit la liaison cellulaire des domaines IS de HERV-W et MLV. En revanche, aucune interaction directe entre X1 et le domaine IS n’a pu être démontrée, notamment dans des expériences de co-immunoprécipitation et de microscopie confocale.La découverte des protéines membranaires qui interagissent avec le domaine IS demeure un enjeu critique pour la compréhension des voies de signalisation et de transcription qui permettent aux rétrovirus d’exercer leur effet sur le système immunitaire, l’objectif de ces travaux étant d’identifier à terme des nouvelles cibles thérapeutiques.En conclusion, même si des travaux complémentaires demeurent nécessaires, les protéines X1 et X2 pourraient contribuer à l’immunosuppression rétrovirale. / Most viruses have developed mechanisms of resistance or suppression of the immune system to achieve lasting infection of their host. These mechanisms are still imperfectly known. An immunosuppressive (IS) domain has been identified in the transmembrane region of envelope proteins of endogenous or infectious retroviruses. This highly conserved domain has been described, for example, as inhibiting lymphocyte activation. In the laboratory, it has been characterized by tumor cell rejection experiments in vivo, which has made it possible to define inactivating mutations. In order to better understand the mechanisms of resistance of retroviruses to the immune system, my thesis focused on the identification of the protein(s) interacting with the IS domain. Several cellular and molecular approaches have been developed, based for the most part on the use of fluorescent probes obtained by chemical synthesis, consisting of IS domains from different retroviruses. At first, immune system cells that bind viral proteins have been identified: B cells and myeloid cells (monocytes, dendritic cells and macrophages). In a second step, co-immunoprecipitation and affinity chromatography coupled to mass spectrometry were performed to identify on these cells the membrane proteins responsible for these bonds. Several chemical coupling agents have been used to prevent detachment of low affinity binding between proteins and the IS domain. Due to non-reproducible results obtained during these experiments, IS domain binding assays on cells transfected with cDNA libraries, or in double hybrid experiments were performed. These two approaches made it possible to identify membrane proteins potentially involved in the binding of the IS domain: the X1 and X2 proteins. Co-transfections of IS domain and X2 expression vectors demonstrated protein interactions in co-immunoprecipitation and confocal microscopy experiments, particularly with the IS domain of the HIV-1 retrovirus. Concerning X1, its transfection induces binding of the IS domains of HERV-W and MLV on cells membrane. On the other hand, no direct interaction between X1 and the IS domain could be demonstrated, especially in co-immunoprecipitation and confocal microscopy experiments.The discovery of membrane proteins that interact with the IS domain remains a critical issue for understanding the signaling and transcription pathways that allow retroviruses to exert their effect on the immune system, the aim of this work being to identify new therapeutic targets.In conclusion, although further work is still needed, the X1 and X2 proteins may contribute to retroviral immunosuppression.

Les produits naturels (PNs) englobent une énorme diversité chimique qui a conduit à la découverte de médicaments révolutionnaires contre le cancer, contre les maladies infectieuses et contre d'autres maladies. La majorité des médicaments actuellement approuvés sont des dérivés de PNs, où nombre d’entre eux engagent des cibles considérées comme non thérapeutiques. Malgré ces avantages, les PNs posent des problèmes au niveau de l’isolement, de la déréplication, du réapprovisionnement et de la traçabilité chimique. Compte tenu du besoin urgent de découvrir de nouvelles molécules bioactives contre de nouvelles cibles pour tous les types de maladies, des stratégies innovantes sont nécessaires pour revigorer la découverte de médicaments à partir des PNs. Nous avons développé une plateforme utilisant Saccharomyces cerevisiae pour la production hétérologue de molécules similaire aux PNs, appelée « produits naturels synthétiques » (PNSs). Nous avons synthétisé une vaste bibliothèque de gènes impliqués dans la biosynthèse de PNs (GBSs) provenant de plantes, de champignons et de bactéries, pour lesquels leur contenu en GC et leurs codons ont été optimisés pour l’expression dans S. cerevisiae. Ces gènes sont assemblés en chromosomes artificiels de levure pour générer de vastes bibliothèques combinatoires de BSG pour la production de molécules similaires aux PNs. Les bibliothèques de PNSs peuvent être directement criblées contre des microorganismes ou des cibles spécifiques dans des essais à haut débit. J'ai effectué le criblage de bibliothèques de PNSs contre une variété de cibles bactériennes et humaines. L'un de ces criblages a conduit à la découverte de PNSs ayant une activité antimicrobienne contre un groupe de pathogènes cliniquement pertinents. Récemment, certaines équipes scientifiques, dont la nôtre, ont découvert que l'hyperactivation de la protéase mitochondriale humaine CLPP par les composés anticancéreux ONC201 et ONC212, qui sont présentement en phase préclinique, provoque la mort cellulaire par protéolyse mitochondriale incontrôlée. Cependant, j'ai trouvé que ONC201/212 activent également la version bactérienne de ClpP et ils pourraient donc perturber le microbiome. J'ai donc développé des essais génétiques de substitution dans la levure pour les protéases ClpP afin de cribler pour des activateurs plus spécifiques. Ensuite, j'ai adapté mon approche dans la levure pour le criblage d’inhibiteurs de la protéase principale (Mpro) et de l'endoribonucléase (NendoU) de SRAS-CoV-2, afin de répondre au besoin pour des thérapies antivirales efficaces afin de traiter les personnes atteintes de la forme grave de la COVID-19. Enfin, une autre variante de mon approche dans la levure a également été développée pour le criblage de stabilisateurs de l'interaction entre FKBP12 et calcineurine dans le but d'identifier de nouveaux immunosuppresseurs qui présentent moins d'effets secondaires. Le criblage de ces différents essais m’a permis d’identifier des candidats potentiels pour chaque cible. Bien que les tests faits dans la levure soient utilisés dans le contexte de criblages traditionnels, l’utilisation de la plateforme PNS permet d’explorer un espace chimique inaccessible auparavant afin de favoriser la découverte de médicaments, le tout de manières économique, modulable et durable. / Natural products (NPs) encompass enormous chemical diversity, leading to revolutionary medicines in cancer, infectious disease, and other indications. The majority of currently approved drugs are derived from NPs, with many of them engage targets otherwise viewed as undruggable. Despite these advantages, NPs pose problems in isolation, dereplication, resupply and chemical tractability. Given the pressing need to discover bioactive chemical matter against new targets in all disease areas, innovative strategies are required to reinvigorate NP-based drug discovery. We have developed a Saccharomyces cerevisiae platform for heterologous production of NP-like chemical matter, termed Synthetic Natural Products (SynNPs). We synthesized an extensive library of codon- and GC-content optimized NP biosynthetic genes (BSGs) from plants, fungi and bacteria. These genes are then assembled into programmable yeast artificial chromosomes (YAC) to generate vast combinatorial BSG libraries that produce NP-like molecules. SynNP libraries can be directly screened in high-throughput in either cell- or target-based assays. I constructed and screened SynNP libraries in yeast-based surrogate genetic assays against a variety of bacterial and human targets. One of these screens led to the discovery of SynNPs with antimicrobial activity against a panel of clinically relevant pathogens. Recently, we and others discovered that hyperactivation of the human mitochondrial caseinolytic protease proteolytic subunit (CLPP) by the preclinical anti-cancer compounds ONC201 and ONC212 causes cell death by rampant mitochondrial proteolysis. However, I found that ONC201/212 also activates bacterial ClpP and could therefore disrupt the microbiome. I thus developed yeast-based surrogate genetic assays for ClpP proteases to screen for more specific activators. Then, I adapted my yeast-based approach to screen for inhibitors of SARS-CoV-2 main protease (Mpro) and endoribonuclease (NendoU) to address the need for efficacious antiviral therapies to mitigate the COVID-19 pandemic. Finally, I developed another variant of my yeast-based approach to screen for stabilizers of the interaction between FKBP12 and calcineurin to identify novel candidate immunosuppressants. Screens with these various assay formats allowed me to identify candidate hits for each target. In summary, the SynNP platform allows the exploration of new-to-nature NP-like chemical space for drug discovery in a cost-effective, scalable and sustainable manner, and yeast-based surrogate genetic assays can be used to screen both existing chemical libraries and SynNP libraries.