Septinas são proteínas pertencentes à família das GTPases que estão envolvidas em uma variedade de funções celulares. Verificamos através de análises bioinformáticas que Schistosoma mansoni, um dos principais agentes etiológicos da esquistossomose, possui quatro genes que codificam septinas (SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2). O objetivo deste trabalho foi a produção heteróloga das proteínas codificadas por estes genes, visando estudos estruturais e funcionais das mesmas. As septinas SmSEPT5 e SmSEPT10 foram expressas em sistema recombinante e foi possível a obtenção de formas solúveis destas proteínas. Experimentos de gel filtração e cross-linking mostraram que elas são diméricas em solução e estáveis em ampla faixa de pH, embora agregados proteicos tenham sido observados com o aumento da temperatura. Ambas as proteínas foram capazes de ligar GTP e GDP, embora apenas SmSEPT5 tenha apresentado atividade GTPásica. Mg2+ se mostrou essencial para a ligação de GTP a ambas as proteínas, enquanto a ligação do GDP foi independente da presença deste cofator. Ensaios de cristalização com o domínio GTPase de SmSEPT10 resultaram em cristais de ótima qualidade cuja difração resultou na obtenção da estrutura com melhor resolução alcançada até o momento para septinas: 1.9 Å para a forma ligada a GDP e 2.1 Å para a forma ligada a GTP. A análise da sobreposição das estruturas obtidas resultou na observação do deslizamento de uma fita β em relação às demais, que acreditamos estar envolvido com o mecanismo de associação destas proteínas à membranas. Um sistema de coexpressão foi construído em que SmSEPT5, SmSEPT10 e SmSEPT7.2 foram coexpressas e copurificadas, resultando na verificação da formação de hetero-oligômeros e filamentos por estas proteínas. Tratamento de diversas fases do ciclo de vida do parasito com um composto (FCF) que afeta a dinâmica de filamentos de septina, resultou em um fenótipo reversível de paralisia no parasito. Estudos de imunolocalização revelaram a colocalização de septinas e actina em fibras musculares do parasito, sugerindo que a interação entre filamentos de septina e actina pode ter um papel importante nas funções motoras do parasita. A imunolocalização revelou ainda a presença de septinas em placas epiteliais ciliadas de miracídios, células germinativas de miracídios e esporocistos e protonefrídios de cercárias. Os resultados apresentados aqui constituem a primeira descrição de septinas em platelmintos e nos possibilitam o estabelecimento de correlações estruturais e funcionais entre septinas de S. mansoni e complexos análogos de septinas de outros organismos, contribuindo para a elucidação da função desta família de proteínas. / Septins belong to the GTPase family of proteins and are involved in a variety of cellular processes. We have identified four genes encoding septins in Schistosoma mansoni, one of the main causative agents of schistosomiasis, these genes were named SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2. The aim of this study was to clone the cDNA of these genes in order to subject the resulting proteins to a set of biophysical and functional studies. Biophysical characterizations were undertaken with SmSEPT5 and SmSEPT10 because of the higher solubility of these proteins, which were dimeric in solution and stable over a wide range of pH, although increasing temperatures promoted the aggregation of these proteins. The nucleotide binding assays revealed that both were capable of binding GTP and GDP, although only SmSEPT5 presented GTPase activity. Mg2+ has shown to be essential for GTP binding in both proteins while GDP binding was independent of this cofactor. Crystallization assays with the GTPase domain of SmSEPT10 have resulted in crystals of high quality and consequently high resolution structures were obtained: 1.9 Å to the GDP bound form and 2.1 Å to the GTP bound form, the best resolution achieved to date for any septin member. The sobreposition of the structures obtained enabled us to observe a strand slippage in β3 strand suggesting that it might be part of an activation mechanism involved in the association of these proteins to membranes. A coexpression system was produced, in which SmSEPT5, SmSEPT10 and SmSEPT7.2 were coexpressed and copurified. These proteins were able to assemble into heterocomplexes that further polymerize into filaments. Functional studies performed with a drug (FCF) that affects the dynamics of septin filaments have resulted in a reversible paralysis phenotype in the parasite. Immunolocalization experiments revealed the colocalization of septins and actin in muscular structures of the parasite, suggesting that the interaction of septin and actin filaments might have an important role in the motor activity of the parasite. The immunolocalization also revealed the presence of septins in the ephitelial plates of miracidia, germ cells of miracidia and sporocysts and protonephridia of cercariae. The results presented here constitute the first description of septins in phatyhelmintes and enabled us the establishment of structural and functional relaltionships among septins from S. mansoni and analogous septin complexes in other organisms, contributing to elucidate the function of this family of proteins.

Septinas são proteínas pertencentes à família das GTPases que estão envolvidas em uma variedade de funções celulares. Verificamos através de análises bioinformáticas que Schistosoma mansoni, um dos principais agentes etiológicos da esquistossomose, possui quatro genes que codificam septinas (SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2). O objetivo deste trabalho foi a produção heteróloga das proteínas codificadas por estes genes, visando estudos estruturais e funcionais das mesmas. As septinas SmSEPT5 e SmSEPT10 foram expressas em sistema recombinante e foi possível a obtenção de formas solúveis destas proteínas. Experimentos de gel filtração e cross-linking mostraram que elas são diméricas em solução e estáveis em ampla faixa de pH, embora agregados proteicos tenham sido observados com o aumento da temperatura. Ambas as proteínas foram capazes de ligar GTP e GDP, embora apenas SmSEPT5 tenha apresentado atividade GTPásica. Mg2+ se mostrou essencial para a ligação de GTP a ambas as proteínas, enquanto a ligação do GDP foi independente da presença deste cofator. Ensaios de cristalização com o domínio GTPase de SmSEPT10 resultaram em cristais de ótima qualidade cuja difração resultou na obtenção da estrutura com melhor resolução alcançada até o momento para septinas: 1.9 Å para a forma ligada a GDP e 2.1 Å para a forma ligada a GTP. A análise da sobreposição das estruturas obtidas resultou na observação do deslizamento de uma fita β em relação às demais, que acreditamos estar envolvido com o mecanismo de associação destas proteínas à membranas. Um sistema de coexpressão foi construído em que SmSEPT5, SmSEPT10 e SmSEPT7.2 foram coexpressas e copurificadas, resultando na verificação da formação de hetero-oligômeros e filamentos por estas proteínas. Tratamento de diversas fases do ciclo de vida do parasito com um composto (FCF) que afeta a dinâmica de filamentos de septina, resultou em um fenótipo reversível de paralisia no parasito. Estudos de imunolocalização revelaram a colocalização de septinas e actina em fibras musculares do parasito, sugerindo que a interação entre filamentos de septina e actina pode ter um papel importante nas funções motoras do parasita. A imunolocalização revelou ainda a presença de septinas em placas epiteliais ciliadas de miracídios, células germinativas de miracídios e esporocistos e protonefrídios de cercárias. Os resultados apresentados aqui constituem a primeira descrição de septinas em platelmintos e nos possibilitam o estabelecimento de correlações estruturais e funcionais entre septinas de S. mansoni e complexos análogos de septinas de outros organismos, contribuindo para a elucidação da função desta família de proteínas. / Septins belong to the GTPase family of proteins and are involved in a variety of cellular processes. We have identified four genes encoding septins in Schistosoma mansoni, one of the main causative agents of schistosomiasis, these genes were named SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2. The aim of this study was to clone the cDNA of these genes in order to subject the resulting proteins to a set of biophysical and functional studies. Biophysical characterizations were undertaken with SmSEPT5 and SmSEPT10 because of the higher solubility of these proteins, which were dimeric in solution and stable over a wide range of pH, although increasing temperatures promoted the aggregation of these proteins. The nucleotide binding assays revealed that both were capable of binding GTP and GDP, although only SmSEPT5 presented GTPase activity. Mg2+ has shown to be essential for GTP binding in both proteins while GDP binding was independent of this cofactor. Crystallization assays with the GTPase domain of SmSEPT10 have resulted in crystals of high quality and consequently high resolution structures were obtained: 1.9 Å to the GDP bound form and 2.1 Å to the GTP bound form, the best resolution achieved to date for any septin member. The sobreposition of the structures obtained enabled us to observe a strand slippage in β3 strand suggesting that it might be part of an activation mechanism involved in the association of these proteins to membranes. A coexpression system was produced, in which SmSEPT5, SmSEPT10 and SmSEPT7.2 were coexpressed and copurified. These proteins were able to assemble into heterocomplexes that further polymerize into filaments. Functional studies performed with a drug (FCF) that affects the dynamics of septin filaments have resulted in a reversible paralysis phenotype in the parasite. Immunolocalization experiments revealed the colocalization of septins and actin in muscular structures of the parasite, suggesting that the interaction of septin and actin filaments might have an important role in the motor activity of the parasite. The immunolocalization also revealed the presence of septins in the ephitelial plates of miracidia, germ cells of miracidia and sporocysts and protonephridia of cercariae. The results presented here constitute the first description of septins in phatyhelmintes and enabled us the establishment of structural and functional relaltionships among septins from S. mansoni and analogous septin complexes in other organisms, contributing to elucidate the function of this family of proteins.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-27T14:35:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoAtividadeImunolocalizacao.pdf: 1867557 bytes, checksum: 77ff96d87954f2519ef1c983d7f73eb0 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-04-11T14:07:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoAtividadeImunolocalizacao.pdf: 1867557 bytes, checksum: 77ff96d87954f2519ef1c983d7f73eb0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T14:07:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoAtividadeImunolocalizacao.pdf: 1867557 bytes, checksum: 77ff96d87954f2519ef1c983d7f73eb0 (MD5) Previous issue date: 2014-10-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / INCT/BEB - Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Biologia Estrutural e Bioimagem / As leishmanioses são protozoonoses causadas por parasitos do gênero Leishmania e estão distribuídas por diversas partes do mundo. Essa patologia se manifesta sobre diversas formas clínicas: Leishmaniose visceral (LV), Leishmaniose cutânea (LC) e Leishmaniose cutaneomucosa (LM). O parasito Leishmania apresenta duas formas evolutivas: a forma promastigota, de vida livre, e a forma amastigota, intracelular obrigatório, presente principalmente nas células fagocíticas mononucleadas. A inibição do crescimento ou destruição dos parasitos dentro da célula hospedeira é um mecanismo fundamental para erradicar a infecção. A inibição dos efeitos leishmanicidas do macrófago parece estar relacionada com a capacidade de algumas espécies em inibir a produção de óxido nítrico (NO). Estudos recentes têm mostrado que algumas espécies de Leishmania possuem a capacidade de produzir NO a partir de uma forma constitutiva da enzima Óxido Nítrico Sintase (cNOS). Este trabalho tem como objetivo detectar e localizar a enzima cNOS presente em promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Para isto, o presente estudo utilizou citometria de fluxo, a qual permitiu quantificar a produção de NO nos parasitos, evidenciando a maior atividade da enzima cNOS em Leishmania (L.) amazonensis quando comparada com a espécie Leishmania (V.) braziliensis. Foi realizada a imunomarcação das formas promastigotas com o anticorpo anti-cNOS para observar a localização ultraestrutural da enzima por microscopia eletrônica de transmissão (MET), posteriormente a co-marcação com os anticorpos anti-cNOS e anti-GAPDH para confirmar a provável compartimentalização desta enzima em organelas glicossomais. Os resultados sugerem que a produção de NO por diferentes espécies de Leishmania é um processo localizado em organelas glicossomais com a captura do aminoácido L-arginina da célula hospedeira, o sequestro deste substrato priva o hospedeiro de sintetizar o NO exógeno danoso ao parasito. Esta modulação sugere mais um mecanismo de escape que os protozoários tripanossomatídeos apresentam durante a complexa interação parasito-hospedeiro. / The Leishmaniasis is an infectious disease caused by parasites of the Leishmania genus and are distributed in different parts of the world. This pathology manifests in several clinical forms: Visceral leishmaniasis (VL), cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL). The Leishmania parasite presents two evolutionary forms: promastigote form, free life parasite, and amastigotes, intracellular binding, present mainly in the mononuclear phagocytic cells. The growth inhibition or destruction of parasites within the host cell is an essential to break the infection mechanism. Inhibition of macrophage leishmanicidal effect appears to be related to the ability of some species to inhibit the nitric oxide (NO) production. Recent studies have shown that some species of Leishmania have the ability to produce NO by the constitutive form of nitric oxide synthase (cNOS). This work aims to detect and locate the cNOS enzyme present in Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania (Viannia) braziliensis promastigotes. For this reason, this study used flow cytometry, which allowed to quantify NO production in parasites, indicating the increased activity of the cNOS enzyme in Leishmania (Leishmania) amazonensis compared with Leishmania (Viannia) braziliensis species. We performed immunostaining of promastigotes with anti-cNOS antibody to watch the ultrastructural localization of the enzyme by transmission electron microscopy (TEM), then co-labeling with anti-cNOS and anti-GAPDH antibody to confirm the probable compartmentalization this enzyme in glycossomal organelles. The results suggest that NO production by different strains of Leishmania is a process located in the glycossomal organelles capturing L-arginine from the host cell, the substrate depletion deprives the host to synthesize the harmful exogenous NO to the parasite. This modulation suggests another escape mechanism that trypanosomatid protozoa present in the complex host-parasite interaction.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-05-05T11:46:16Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AnaliseImunohistologicaDesenvolvimento.PDF: 2859553 bytes, checksum: 2230002045f35242ef2d2c221a773945 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-05-09T21:47:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AnaliseImunohistologicaDesenvolvimento.PDF: 2859553 bytes, checksum: 2230002045f35242ef2d2c221a773945 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-09T21:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AnaliseImunohistologicaDesenvolvimento.PDF: 2859553 bytes, checksum: 2230002045f35242ef2d2c221a773945 (MD5) Previous issue date: 2014-12-11 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi estudar a foliculogênese ovariana de Saimiri sciureus. Para tanto, foi avaliada a expressão de fatores intra-ovarianos ligados ao desenvolvimento, inibição folicular e proliferação celular, além da investigação dos efeitos do pré-tratamento com o análogo da vitamina E, Trolox®, sobre a viabilidade e funcionalidade folicular, índice de apoptose, proliferação celular, vascularização e fibrose, após o auto-transplante do tecido ovariano fresco. Foi possível imunolocalizar pela primeira vez a expressão das proteínas: fator crescimento e diferenciação-9 (GDF-9), c-Kit/Kit Ligante e Ki-67 e confirmar a expressão do hormônio anti-mülleriano (AMH) em diferentes fases do desenvolvimento folicular de macaco de cheiro. No que diz respeito a pré-incubação com o antioxidante Trolox®, pôde-se observar uma melhora na sobrevivência folicular após o autotransplante, diminuição da taxa de apoptose em células do estroma, porém, aumento nas áreas de fibrose no tecido. Os nossos resultados sugerem que o tecido ovariano fresco pode ser incubado e enxertado sem grande impacto sobre o crescimento folicular precoce e a morfologia após auto-transplante subcutâneo por curto período. Acreditamos que nossos resultados oferecem uma contribuição importante para a compreensão do processo de foliculogênese em macacos neotropicais. Este conhecimento é uma ferramenta importante para avaliar a viabilidade folicular e funcionalidade após a criopreservação, transplante de tecido ovariano e cultivo in vitro de folículos pré-antrais, em especial para os animais com risco de extinção e às mulheres com risco de perda de fertilidade devido à quimioterapia e radioterapia. / The main objective of the present work was to study ovarian folliculogenesis in Saimiri sciureus. Therefore, we evaluated the expression of intra-ovarian factors related with the follicular development, inhibition and cell proliferation, as well as investigation the effects of pretreatment with vitamin E analogue, Trolox, on the viability and follicular function, apoptosis index, cell proliferation, vascularization and fibrosis after auto-transplanted of fresh ovarian tissue. It was possible for the first time imuno localize proteins expressed as: growth and differentiation factor -9 (GDF -9), c- kit/Kit Ligand and Ki-67 and confirm the expression of anti-Mullerian Hormone (AMH) in different stages of follicular development in squirrel monkey ovary. Regarding pre-incubation with the Trolox antioxidant, it can improves follicular survival after autotransplantation, decrease apoptosis rates in stromal cells, although increase areas of fibrosis after graft. Our results suggest that fresh ovarian tissue can be grafted and incubated without major impact on early follicular growth and morphology after subcutaneous autotransplantation for a short-term. We believe that our results provide an important contribution to understanding the process of folliculogenesis in neotropical monkeys. This knowledge is an important tool to evaluate follicular viability and functionality after cryopreservation of ovarian tissue transplantation and in vitro culture of early follicles, especially for animals at risk of extinction and women that are undergoing to chemotherapy and radiation with risk of loss fertility.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-11T13:29:19Z No. of bitstreams: 1 micheliaantoniadonascimentogusmao.pdf: 2029497 bytes, checksum: 4ab5e6f5d64e0b6010c2ea583d1ed036 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-20T18:43:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 micheliaantoniadonascimentogusmao.pdf: 2029497 bytes, checksum: 4ab5e6f5d64e0b6010c2ea583d1ed036 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T18:43:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 micheliaantoniadonascimentogusmao.pdf: 2029497 bytes, checksum: 4ab5e6f5d64e0b6010c2ea583d1ed036 (MD5) Previous issue date: 2013-03-06 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A esquistossomose é uma doença que acomete cerca de 200 milhões de pessoas no mundo causando grande morbidade. Devido à falta de vacina para essa doença, muitos antígenos são pesquisados. Um domínio antigênico B (r156-195) da ATPDase 2 de Schistosoma mansoni foi previamente descrito, e dois peptídeos sintéticos (SmB1LJ, r155-176; SmB2LJ, r175-194) derivados deste domínio foram obtidos com o objetivo de avaliar a imunogenicidade dessa proteía. O inóculo de cada peptídeo em camundongos BALB/c induziu atividade imunoestimulatória significativa, elevando os níveis de anticorpos IgG1 e IgG2, como detectado por ELISA. Os anticorpos policlonais anti-SmB1LJ e anti-SmB2LJ, quando imobilizados em Proteína A-Sepharose, imunoprecipitaram aproximadamente 42-96% da atividade ADPásica da preparação de verme adulto. Por “Western blots” do complexo imunoprecipitado, três bandas de 76, 63 e 55 kDa foram identificadas pelos dois soros imunes, confirmando a identidade da ATPDase 2, e sugerindo que esta proteína está sujeita a vários processamentos pós-tradução, tais como glicosilação e proteólise, resultando finalmente em uma proteína secretada de 55 kDa. Adicionalmente, anticorpos policlonais anti-SmB2LJ inibiram 62% e 37% das atividades ATPásica e ADPásica, respectivamente, enquanto anticorpos policlonais anti-SmB1LJ inibiram ADPase (92%), mas não atividade ATPásica, sugerindo que o domínio B da ATPDase 2 do S. mansoni está envolvido na regulação catalítica da enzima, sendo um novo alvo para o desenho de inibidores. Imunomarcação com anticorpos policlonais anti-SmB2LJ de cortes de fígado de camundongo infectado revelaram reações positivas na superfície externa do miracídio no ovo de S. mansoni. Fluorescência intensa foi detectada na região entre o miracídio e o lado interno da casca do ovo, localizada no envelope de von Lichtenberg, a qual é uma região de produção de componentes imunogênicos. Fluorescência foi também detectada no lado de fora da casca do ovo, aprisionada pelos microespinhos de superfície, confirmando que esta proteína, como no verme adulto, é também secretada de ovos de S. mansoni. Nenhuma reatividade foi observada nos tecidos granulomatosos circundantes. Amostras de plasmas de camundongos Swiss infectados com S. mansoni foram testadas por ELISA usando SmB1LJ or SmB2LJ como antígeno. Reatividade significativamente maior de anticorpos IgG, IgG1 ou IgG2a foi detectada com SmB1LJ, enquanto somente anticorpo IgG1 foi altamente reativo com SmB2LJ. A reatividade de amostras de plasma (diluídas 1:200) de camundongos Swiss previamente inoculados com apirase de batata ou r-potDomínio B, um polipeptídio com cauda de hexahistidina derivado do domínio B (r78-117) da apirase de batata, e homólogo ao domínio B da ATPDase 2, foi também testada por ELISA usando os peptídeos como antígenos. Anticorpos policlonais IgG e IgG1 anti-apirase de batata reagiram significativamente com SmB1LJ, enquanto somente IgG1 reagiu com SmB2LJ. Anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B não reagiram significativamente com SmB2LJ. Comparado aos controles, amostras de plasma (diluídas 1:200) destes animais pré-imunizados com apirase de batata ou r-potDomínio B e desafiados com S. mansoni não reagem significativamente com os peptídeos. Os resultados confirmaram que o domínio B da ATPDase 2 está potencialmente envolvido na resposta imune do hospedeiro, e os peptídeos SmB1LJ e SmB2LJ podem ser usados em estudos da esquistossomose. / Schistosomiasis is a disease that affects approximately 200 million people worldwide causing great morbidity. Due to lack of vaccine for this disease, many antigens are searched. An antigenic domain B (r156-195) from the Schistosoma mansoni ATPDase 2 isoform was previously described, and two synthetic peptides (SmB1LJ, r155-176; SmB2LJ, r175-194) belonging to this domain were obtained. Inoculation of each peptide in healthy BALB/c mice induced significant immunostimulatory activity, increasing the IgG1 and IgG2a antibody levels, as detected by ELISA. The polyclonal anti-SmB1LJ and anti-SmB2LJ antibodies, when immobilized on Protein A-Sepharose, immunoprecipitated approximately 42-96% of the ADPase activity from the adult worm preparation. By Western blots of immunoprecipitated complex, three bands of 76, 63 and 55 kDa were identified by the two immune sera, confirming the ATPDase 2 identity, and suggesting that this protein is subject to several posttranslational processing, such as glycosylation and proteolysis, resulting finally in a secreted protein of 55 kDa. Additionally, polyclonal anti-SmB2LJ antibodies inhibited 62% and 37% of the ATPase and ADPase activities, respectively, whereas polyclonal anti-SmB1LJ antibodies inhibited ADPase (92%), but not ATPase activity, suggesting that the domain B from the S. mansoni ATPDase 2 is involved in enzyme catalytic regulation, being a new target for inhibitor design. Immunolabelled cryostat sections of infected mouse liver by the anti-SmB2LJ polyclonal antibodies revealed positive reactions on the external surface from the miracidium in the S. mansoni egg. Intense fluorescence was detected in the region between the miracidium and the inner side of the egg-shell, located in von Lichtenberg’s envelope, which is a region of production of immunogenic components. Fluorescence was also detected in the outer side of the egg-shell and entrapped by the surface microspines, confirming that this protein, like in the adult worm, is also secreted from the S. mansoni eggs. No reactivity was observed in the surrounding granumomatous tissues, which are rich en inflammatory cells. Serum samples from S. mansoni-infected Swiss mice were tested by ELISA using SmB1LJ or SmB2LJ as coating antigen. Significantly higher IgG, IgG1 or IgG2a antibody reactivity was detected against SmB1LJ, whereas only IgG1 antibody was highly reactive against SmB2LJ. The reactivity of plasma samples (diluted 1:200) from Swiss mice previously inoculated with potato apyrase or r-potDomain B, a 6xHis tag polypeptide belonging to the domain B (r78-117) from the potato apyrase, homologue to the domain B from the ATPDase 2, was also tested by ELISA using the peptides as coating antigens. Polyclonal IgG and IgG1 anti-potato apyrase antibodies significantly reacted with SmB1LJ, whereas only IgG1 reacted with SmB2LJ. Polyclonal anti-r-potDomain B antibodies did not significantly react with SmB2LJ. Compared to controls, plasma samples (diluted 1:200) from these animals pre-immunized with potato apyrase or r-potDomain B and challenged with S. mansoni did not react significantly with peptides. The results confirmed that the domain B from the ATPDase 2 is potentially involved in the host immune response, and peptides SmB1LJ and SmB2LJ can be used in schistosomiasis studies.

A banana é considerada um bom modelo para o estudo da transformação amido-sacarose, já que acumula um alto teor de amido durante o desenvolvimento que é rapidamente degradado durante o amadurecimento. Várias enzimas e provavelmente mais de uma via metabólica estão envolvidas neste processo. Com isso, o objetivo deste trabalho foi estudar as características estruturais dos grânulos, bem como, a atuação das enzimas envolvidas em sua degradação. Os grânulos de amidos foram isolados de bananas controle (não tratadas) e submetidas a diferentes tratamentos: etileno, 1-MCP, frutos mantidos a 13°C e frutos tratados com etileno e mantidos a 13°C. Os resultados obtidos mostraram alta atividade de enzimas α e β-amilases ligadas ao grânulo tanto por ensaios in vitro como por géis de eletroforese contendo amilopectina como substrato. Os resultados obtidos para Western blot utilizando anticorpos produzidos contra essas enzimas, indicaram que a α-amilase atua no início da degradação enquanto a β-amilase foi encontrada no momento em que o amido estava em pleno processo. de degradação. Nos estudos de imunolocalização observou-se que as proteínas associadas aos grânulos de amido e em cortes do fruto demonstraram que estas enzimas estão localizadas na superfície do grânulo. As técnicas utilizadas para observação dos grânulos de amido foram a de Microscopia Óptica, Microscopia Eletrônica de Varredura e Microscopia de Varredura Confocal a Laser. Os grânulos apresentaram um padrão de degradação diferenciado para cada tratamento realizado nos frutos. O teor de amilose encontrado para os amidos foi ao redor de 15%, não variando durante a degradação. O padrão de difração de Raios-X foi do tipo B em amidos de banana recém-colhidas e tipos A e B foram encontrados em amidos degradados. O grau de cristalinidade aumentou de 15% para 17% nos amidos em degradação. / Banana fruit is considered a good example for studying the starch-sucrose transformation, accumulating high starch content during the development being rapidly degraded during the ripening. Several enzymes and, probably more then one metabolic way are involved in this processo Then, the aim of this work was to study the structural characteristics of starch granules and the action of the enzymes involved in its degradation. Starch granules were isolated from bananas control (fruits without treatment), and exposed to different treatments, such as: ethylene, 1-MCP, stored fruits to 13°C and stored fruits to 13°C + ethylene. Results obtained showed high activities of enzymes α and β-amylases associated to starch granules, measured by in vitro assay and native PAGE containing amylopectin like substrate. Results obtained by Western blot using antibodies against these enzymes, indicated that α-amylase is responsible for the initial attack on the starch, and β-amylase was localized at moment that starch was in degradation processo Results of the immunolocalization of proteins associated on starch granule and proteins on banana tissue confirmed that these enzymes are localized on granule surface. When techniques of microscopy were used to starch, such as Optical Microscopy, Scanning Electron Microscopy and Confocal Laser Scanning Microscopy, was observed that granules showed a different degradation pattern, for each treatment made on fruits. Amylose content obtained for starch was around 15%, not changing during degradation. B-type diffraction pattern was found for green banana starch, and A and. B-type patterns for degraded starch. Degree of crystallinity increased from 15% to 17% for starches during degradation.

A banana é considerada um bom modelo para o estudo da transformação amido-sacarose, já que acumula um alto teor de amido durante o desenvolvimento que é rapidamente degradado durante o amadurecimento. Várias enzimas e provavelmente mais de uma via metabólica estão envolvidas neste processo. Com isso, o objetivo deste trabalho foi estudar as características estruturais dos grânulos, bem como, a atuação das enzimas envolvidas em sua degradação. Os grânulos de amidos foram isolados de bananas controle (não tratadas) e submetidas a diferentes tratamentos: etileno, 1-MCP, frutos mantidos a 13°C e frutos tratados com etileno e mantidos a 13°C. Os resultados obtidos mostraram alta atividade de enzimas α e β-amilases ligadas ao grânulo tanto por ensaios in vitro como por géis de eletroforese contendo amilopectina como substrato. Os resultados obtidos para Western blot utilizando anticorpos produzidos contra essas enzimas, indicaram que a α-amilase atua no início da degradação enquanto a β-amilase foi encontrada no momento em que o amido estava em pleno processo. de degradação. Nos estudos de imunolocalização observou-se que as proteínas associadas aos grânulos de amido e em cortes do fruto demonstraram que estas enzimas estão localizadas na superfície do grânulo. As técnicas utilizadas para observação dos grânulos de amido foram a de Microscopia Óptica, Microscopia Eletrônica de Varredura e Microscopia de Varredura Confocal a Laser. Os grânulos apresentaram um padrão de degradação diferenciado para cada tratamento realizado nos frutos. O teor de amilose encontrado para os amidos foi ao redor de 15%, não variando durante a degradação. O padrão de difração de Raios-X foi do tipo B em amidos de banana recém-colhidas e tipos A e B foram encontrados em amidos degradados. O grau de cristalinidade aumentou de 15% para 17% nos amidos em degradação. / Banana fruit is considered a good example for studying the starch-sucrose transformation, accumulating high starch content during the development being rapidly degraded during the ripening. Several enzymes and, probably more then one metabolic way are involved in this processo Then, the aim of this work was to study the structural characteristics of starch granules and the action of the enzymes involved in its degradation. Starch granules were isolated from bananas control (fruits without treatment), and exposed to different treatments, such as: ethylene, 1-MCP, stored fruits to 13°C and stored fruits to 13°C + ethylene. Results obtained showed high activities of enzymes α and β-amylases associated to starch granules, measured by in vitro assay and native PAGE containing amylopectin like substrate. Results obtained by Western blot using antibodies against these enzymes, indicated that α-amylase is responsible for the initial attack on the starch, and β-amylase was localized at moment that starch was in degradation processo Results of the immunolocalization of proteins associated on starch granule and proteins on banana tissue confirmed that these enzymes are localized on granule surface. When techniques of microscopy were used to starch, such as Optical Microscopy, Scanning Electron Microscopy and Confocal Laser Scanning Microscopy, was observed that granules showed a different degradation pattern, for each treatment made on fruits. Amylose content obtained for starch was around 15%, not changing during degradation. B-type diffraction pattern was found for green banana starch, and A and. B-type patterns for degraded starch. Degree of crystallinity increased from 15% to 17% for starches during degradation.