A esporotricose é uma doença crônica que envolve o tecido subcutâneo afetando seres humanos e animais, causada pelo fungo termodimórfico Sporothrix spp.. A esporotricose é endêmica na América latina, principalmente no Brasil que teve o maior surto zoonótico já registrado, ocorrendo na cidade do Rio de Janeiro. A espécie Sporothrix brasiliensis é a mais diagnosticada no surto e a mais virulenta entre as especies de Sporothrix spp., causando formas mais graves da doença. A esporotricose em gatos é endêmica, fatal e um dos principais fatores pelo alto número de casos no Rio de Janeiro. O tratamento é longo e não vem sendo o suficiente para conter o número de casos da doença. Uma vacina contra a esporotricose poderia mudar esse paradigma no Brasil. O presente trabalho obteve o proteoma da cepa S. brasiliensis 5110 por meio de uma eletroforese 2D, e caracterizou e identificou as possíveis proteínas imunogênicas do fungo por espectrometria de massa. Por meio de programas de predição, foi avaliado e sintetizado 7 sequências de aminoácidos,das proteínas identificadas com maiores chances de se acoplar a molécula MHC de classe II. Apenas 3 foram capazes de induzir proliferação in vitro, os peptídeos ZR3, ZR4 e ZR8, que foram utilizados como vacina na esporotricose subcutânea e avaliados sua eficácia por meio da carga fúngica, diâmetro das lesões, perfil celular e níveis de citocinas. Neste trabalho concluímos que o peptídeo ZR8 foi o melhor candidato à vacina na esporotricose, pois foi capaz de diminuir o diâmetro das lesões, aumentar os níveis de citocinas protetoras (IFN-γ, IL-17A e IL-1β) e aumentar o número de células TCD4+ e CD3-/CD19+, sendo assim induzindo uma resposta imunológica protetora na esporotricose subcutânea. / Sporotrichosis is a chronic disease, which involves the subcutaneous tissue affecting humans and animals caused by the thermodymorphic fungus Sporothrix spp. Sporotrichosis is endemic in Latin America, mainly in Brazil that had the largest zoonotic outbreak ever recorded, occurring in the city of Rio de Janeiro. The Sporothrix brasiliensis is the species more diagnosed in the outbreak and most virulent, causing severe forms of the disease. Sporotrichosis in cats is endemic, fatal and the main factors due to the high number of cases of the disease in Rio de Janeiro. The treatment is long, and has not been enough to contain the number of cases of sporotrichosis. A vaccine against sporotrichosis could change this paradigm in Brazil. The present work obtained the proteome of S. brasiliensis 5110 strain by 2D electrophoresis, and characterized and identified possible immunogenic proteins by mass spectrometry. By prediction programs were evaluated and synthesized 7 peptide sequence from antigenic proteins that have the highest chances of coupling to the MHC class II molecule. From these 7 peptides only 3 were able to induce proliferation in vitro, called ZR3, ZR4 and ZR8 peptides, that were used as a vaccine in subcutaneous sporotrichosis and evaluated their efficacy through fungal load, lesion diameter, cell profile and cytokine levels. We conclude that ZR8 peptide was the best candidate for sporotrichosis vaccine, since it was able to decrease the lesion diameter, increase the levels of protective cytokines (IFN-γ, IL-17A and IL-1β) and increase the number of CD4+ T cells and CD3-/CD19+ inducing a protective immune response in subcutaneous sporotrichosis.

A esporotricose é uma doença crônica que envolve o tecido subcutâneo afetando seres humanos e animais, causada pelo fungo termodimórfico Sporothrix spp.. A esporotricose é endêmica na América latina, principalmente no Brasil que teve o maior surto zoonótico já registrado, ocorrendo na cidade do Rio de Janeiro. A espécie Sporothrix brasiliensis é a mais diagnosticada no surto e a mais virulenta entre as especies de Sporothrix spp., causando formas mais graves da doença. A esporotricose em gatos é endêmica, fatal e um dos principais fatores pelo alto número de casos no Rio de Janeiro. O tratamento é longo e não vem sendo o suficiente para conter o número de casos da doença. Uma vacina contra a esporotricose poderia mudar esse paradigma no Brasil. O presente trabalho obteve o proteoma da cepa S. brasiliensis 5110 por meio de uma eletroforese 2D, e caracterizou e identificou as possíveis proteínas imunogênicas do fungo por espectrometria de massa. Por meio de programas de predição, foi avaliado e sintetizado 7 sequências de aminoácidos,das proteínas identificadas com maiores chances de se acoplar a molécula MHC de classe II. Apenas 3 foram capazes de induzir proliferação in vitro, os peptídeos ZR3, ZR4 e ZR8, que foram utilizados como vacina na esporotricose subcutânea e avaliados sua eficácia por meio da carga fúngica, diâmetro das lesões, perfil celular e níveis de citocinas. Neste trabalho concluímos que o peptídeo ZR8 foi o melhor candidato à vacina na esporotricose, pois foi capaz de diminuir o diâmetro das lesões, aumentar os níveis de citocinas protetoras (IFN-γ, IL-17A e IL-1β) e aumentar o número de células TCD4+ e CD3-/CD19+, sendo assim induzindo uma resposta imunológica protetora na esporotricose subcutânea. / Sporotrichosis is a chronic disease, which involves the subcutaneous tissue affecting humans and animals caused by the thermodymorphic fungus Sporothrix spp. Sporotrichosis is endemic in Latin America, mainly in Brazil that had the largest zoonotic outbreak ever recorded, occurring in the city of Rio de Janeiro. The Sporothrix brasiliensis is the species more diagnosed in the outbreak and most virulent, causing severe forms of the disease. Sporotrichosis in cats is endemic, fatal and the main factors due to the high number of cases of the disease in Rio de Janeiro. The treatment is long, and has not been enough to contain the number of cases of sporotrichosis. A vaccine against sporotrichosis could change this paradigm in Brazil. The present work obtained the proteome of S. brasiliensis 5110 strain by 2D electrophoresis, and characterized and identified possible immunogenic proteins by mass spectrometry. By prediction programs were evaluated and synthesized 7 peptide sequence from antigenic proteins that have the highest chances of coupling to the MHC class II molecule. From these 7 peptides only 3 were able to induce proliferation in vitro, called ZR3, ZR4 and ZR8 peptides, that were used as a vaccine in subcutaneous sporotrichosis and evaluated their efficacy through fungal load, lesion diameter, cell profile and cytokine levels. We conclude that ZR8 peptide was the best candidate for sporotrichosis vaccine, since it was able to decrease the lesion diameter, increase the levels of protective cytokines (IFN-γ, IL-17A and IL-1β) and increase the number of CD4+ T cells and CD3-/CD19+ inducing a protective immune response in subcutaneous sporotrichosis.

Canine brucellosis is a zoonotic disease, caused by Brucella canis, which is the main cause of abortion and infertility in dogs. This study had the objective to investigate a B. canis outbreak in a breeding kennel, to describe a multistep approach to characterize the B. canis isolates obtained, and to identify B. canis proteins specifically reacting with antibodies from naturally infected dogs. The kennel was located in São Paulo, SP, Brazil. At the time of sampling, in 2014, the kennel comprised 17 adult Pug dogs. Blood samples were used both to isolate the bacteria and to detect Brucella spp. DNA by the polymerase chain reaction. Serum samples were used to detect antibodies against B. canis using an immunocromatographic test, the rapid slide agglutination test with or without 2-mercaptoethanol and two ELISA kits. The Brucella isolates were characterized through the classical bacteriological tests, mass spectrometry and whole genome sequencing. The total protein content of Brucella isolates was extracted and separated using one and two-dimension polyacrylamide gel electrophoresis (1D and 2D, respectively), and then tested against sera collected from bacteremic, non-bacteremic and non-B. canis infected dogs using western immunoblotting. The reacting protein spots were identified using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Vaginal discharge, abortion, stillbirth, conception failure and general lymphadenopathy were the clinical signs found in the infected dogs. Gram-negative, coccoid rod-shaped bacteria were isolated from 24 blood samples. Antibodies against B. canis were detected in all dogs at least once by the performed serological tests. Mass spectrometry analysis assigned all isolates to the genus Brucella. The phenotypic data clearly identified the isolates as B. canis with only slight differences in phage typing patterns. The 2D separated protein spots were identified by MALDI-TOF MS as 93 different proteins, out of them, 19 were identified in infected dogs (during the bacteremic and non-bacteremic phases of the infection) and were not identified in non-infected dogs. These proteins have the potential to be used as antigens in serological tests in an attempt to improve the diagnosis of the infection, since a reliable diagnosis is an essential measure for the control and prevention of canine brucellosis. The multistep approach using classical microbiological methods, mass spectrometry and whole genome sequencing allowed the characterization of the B. canis with high discriminatory power, which may be useful for outbreak investigations. / A brucelose canina é uma doença zoonótica, causada pela Brucella canis, que é uma das principais causas de abortamentos e infertilidade em cães. O objetivo deste estudo foi investigar um surto de B. canis em um canil, caracterizar os isolados de Brucella obtidos e identificar proteínas de B. canis reagentes especificamente a anticorpos de cães naturalmente infectados. O canil é localizado em São Paulo, SP, Brasil e no momento da amostragem, em 2014, o canil era composto por 17 cães adultos da raça Pug. Amostras de sangue foram utilizadas tanto para isolar as bactérias quanto para detectar o DNA de Brucella spp. pela reação em cadeia pela polimerase. Amostras de soro foram utilizadas para detectar anticorpos contra B. canis nos soros dos cães, utilizando um teste imunocromatográfico, o teste de soroaglutinação rápida em placa com ou sem 2-mercaptoetanol e dois kits de ELISA. Os isolados foram caracterizados pelos métodos bacteriológicos clássicos, espectrometria de massa e pelo sequenciamento do genoma completo. O conteúdo proteico total dos isolados de B. canis foi extraído e as proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de uma e duas dimensões (1D e 2D, respeectivamente), sendo então testadas frente aos soros dos cães infectados (com ou sem bacteremia) e não infectados, utilizando Western Immunoblotting. Os spots proteicos reagentes foram identificados usando espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). Secreção vaginal, aborto, natimorto, falha na concepção e linfoadenopatia foram os sinais clínicos observados nos cães infectados. Coco-bacilos gram-negativos foram isolados em 24 amostras de sangue. Anticorpos contra B. canis foram observadas em todos os cães, em pelo menos uma amostragem, pelos testes sorológicos empregados. A MS atribuiu todos os isolados ao gênero Brucella. Os dados fenotípicos identificaram claramente B. canis com apenas pequenas diferenças nos padrões de lise por fagos. Os spots de proteínas, separados por 2D, foram identificados por MALDI-TOF MS como 93 diferentes proteínas, dentre elas, 19 foram identificadas em cães infectados (com ou sem bacteremia) e não foram identificadas nos cães não infectados. Tais proteínas são candidatas a serem utilizadas como antígenos para o aprimoramento do sorodiagnóstico, uma vez que a existência de um diagnóstico confiável constitui uma medida essencial para o controle e a prevenção da brucelose canina. A abordagem múltipla utilizada, envolvendo métodos microbiológicos clássicos, espectrometria de massa e sequenciamento completo do genoma bacteriano possibilitou a caracterização dos isolados de B. canis com elevado poder discriminatório, o que pode auxiliar em investigações de surtos.

Canine brucellosis is a zoonotic disease, caused by Brucella canis, which is the main cause of abortion and infertility in dogs. This study had the objective to investigate a B. canis outbreak in a breeding kennel, to describe a multistep approach to characterize the B. canis isolates obtained, and to identify B. canis proteins specifically reacting with antibodies from naturally infected dogs. The kennel was located in São Paulo, SP, Brazil. At the time of sampling, in 2014, the kennel comprised 17 adult Pug dogs. Blood samples were used both to isolate the bacteria and to detect Brucella spp. DNA by the polymerase chain reaction. Serum samples were used to detect antibodies against B. canis using an immunocromatographic test, the rapid slide agglutination test with or without 2-mercaptoethanol and two ELISA kits. The Brucella isolates were characterized through the classical bacteriological tests, mass spectrometry and whole genome sequencing. The total protein content of Brucella isolates was extracted and separated using one and two-dimension polyacrylamide gel electrophoresis (1D and 2D, respectively), and then tested against sera collected from bacteremic, non-bacteremic and non-B. canis infected dogs using western immunoblotting. The reacting protein spots were identified using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Vaginal discharge, abortion, stillbirth, conception failure and general lymphadenopathy were the clinical signs found in the infected dogs. Gram-negative, coccoid rod-shaped bacteria were isolated from 24 blood samples. Antibodies against B. canis were detected in all dogs at least once by the performed serological tests. Mass spectrometry analysis assigned all isolates to the genus Brucella. The phenotypic data clearly identified the isolates as B. canis with only slight differences in phage typing patterns. The 2D separated protein spots were identified by MALDI-TOF MS as 93 different proteins, out of them, 19 were identified in infected dogs (during the bacteremic and non-bacteremic phases of the infection) and were not identified in non-infected dogs. These proteins have the potential to be used as antigens in serological tests in an attempt to improve the diagnosis of the infection, since a reliable diagnosis is an essential measure for the control and prevention of canine brucellosis. The multistep approach using classical microbiological methods, mass spectrometry and whole genome sequencing allowed the characterization of the B. canis with high discriminatory power, which may be useful for outbreak investigations. / A brucelose canina é uma doença zoonótica, causada pela Brucella canis, que é uma das principais causas de abortamentos e infertilidade em cães. O objetivo deste estudo foi investigar um surto de B. canis em um canil, caracterizar os isolados de Brucella obtidos e identificar proteínas de B. canis reagentes especificamente a anticorpos de cães naturalmente infectados. O canil é localizado em São Paulo, SP, Brasil e no momento da amostragem, em 2014, o canil era composto por 17 cães adultos da raça Pug. Amostras de sangue foram utilizadas tanto para isolar as bactérias quanto para detectar o DNA de Brucella spp. pela reação em cadeia pela polimerase. Amostras de soro foram utilizadas para detectar anticorpos contra B. canis nos soros dos cães, utilizando um teste imunocromatográfico, o teste de soroaglutinação rápida em placa com ou sem 2-mercaptoetanol e dois kits de ELISA. Os isolados foram caracterizados pelos métodos bacteriológicos clássicos, espectrometria de massa e pelo sequenciamento do genoma completo. O conteúdo proteico total dos isolados de B. canis foi extraído e as proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de uma e duas dimensões (1D e 2D, respeectivamente), sendo então testadas frente aos soros dos cães infectados (com ou sem bacteremia) e não infectados, utilizando Western Immunoblotting. Os spots proteicos reagentes foram identificados usando espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). Secreção vaginal, aborto, natimorto, falha na concepção e linfoadenopatia foram os sinais clínicos observados nos cães infectados. Coco-bacilos gram-negativos foram isolados em 24 amostras de sangue. Anticorpos contra B. canis foram observadas em todos os cães, em pelo menos uma amostragem, pelos testes sorológicos empregados. A MS atribuiu todos os isolados ao gênero Brucella. Os dados fenotípicos identificaram claramente B. canis com apenas pequenas diferenças nos padrões de lise por fagos. Os spots de proteínas, separados por 2D, foram identificados por MALDI-TOF MS como 93 diferentes proteínas, dentre elas, 19 foram identificadas em cães infectados (com ou sem bacteremia) e não foram identificadas nos cães não infectados. Tais proteínas são candidatas a serem utilizadas como antígenos para o aprimoramento do sorodiagnóstico, uma vez que a existência de um diagnóstico confiável constitui uma medida essencial para o controle e a prevenção da brucelose canina. A abordagem múltipla utilizada, envolvendo métodos microbiológicos clássicos, espectrometria de massa e sequenciamento completo do genoma bacteriano possibilitou a caracterização dos isolados de B. canis com elevado poder discriminatório, o que pode auxiliar em investigações de surtos.

Orientador: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Resumo: A pitiose, cujo agente etiológico é o oomiceto Pythium insidiosum, é uma doença emergente que ocorre principalmente em países tropicais e subtropicais, afetando diversas espécies animais, sendo mais frequente em cavalos no Brasil e humanos na Tailândia. A doença é difícil de diagnosticar, porque as hifas do patógeno são frequentemente confundidas com mucormicoses ou entomoftoromicoses em cortes histológicos. Além disso, não há antígeno eficiente e específico que possa ser utilizado para o diagnóstico rápido e o tratamento eficiente da pitiose em diferentes espécies. Os antígenos são moléculas que o sistema imunológico reconhece, tornando essas moléculas importantes alvos para o diagnóstico de micro-organismos. Para a identificação de antígenos, a imunoproteômica é considerada uma ferramenta poderosa. Nesse sentido, investigamos quais antígenos de P. insidiosum são reconhecidos pelo soro de equinos no Brasil e por soro de pacientes tailandeses com pitiose, a fim de encontrar proteínas semelhantes que possam ser utilizadas para futuros testes de diagnóstico ou terapia para pitiose. Para identificar as proteínas imunorreativas de P. insidiosum, foram utilizadas abordagens imunoproteômicas, técnica de Western blot, seguida pela identificação de antígenos por espectrometria de massas. Consequentemente, foi possível identificar 23 antígenos reconhecidos entre os soros de equinos e humanos. Sete antígenos foram correspondentes aos soros em ambas espécies: heat shock cognate 70 KDa p... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Pythiosis, whose etiological agent is the oomycete Pythium insidiosum, is an lifethreatening disease that occurs mainly in tropical and subtropical countries, affecting several animal species, being more frequent in horses in Brazil and humans in Thailand. The disease is difficult to diagnose, because the pathogen's hyphae are often confused with Mucorales or Entomophthorales fungi in histological sections. In addition, there is no efficient and specific antigen that can be used for the rapid diagnosis and efficient treatment of pythiosis in different species. Antigens are molecules that the immune system recognizes, making these molecules important targets for the diagnosis of microorganisms. For the identification of antigens, immunoproteomics is considered a powerful tool. In this sense, we investigated which P. insidiosum antigens are recognized by horses in Brazil and Thai humans’ serum with pythiosis, in order to find similar proteins that could be used for future diagnostic tests or therapy approaches for pythiosis. To identify the immunoreactive proteins of P. insidiosum, immunoproteomic approaches were used, using the Western blot technique followed by the identification of antigens by mass spectrometry. Consequently, it was possible to identify 23 antigens recognized between the serum of horses and humans. Seven antigens were similar to the two types of serum, being heat shock cognate 70 KDa protein, heat shock 70 KDa protein, glucan 1,3-beta-glucosidase, fructosebi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica de homem e animais, causada pela implantação traumática do patógeno e que normalmente envolve a derme e o tecido subcutâneo. Desde 1898, quando o agente etiológico esporotricose foi descoberto por Schenck, esta doença tem sido atribuída a um único patógeno, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 º C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, os isolados identificados como S. schenckii demonstraram uma grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies crípticas. Com base nesta informação o nosso grupo está interessado no estudo da taxonomia polifásica deste complexo de espécies e suas implicações sobre a eco-epidemiologia da doença no Brasil. Foram estudadas 161 cepas de Sporothrix spp. provenientes de amostras clínicas e ambientais de diversas regiões do Brasil e outros países. Os parâmetros fenotípicos analisados levaram em consideração o crescimento vegetativo em meio PDA sob diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 º C), a coloração da colônia em meio CMA, o padrão de assimilação de fontes de carbono (glicose, ribitol, rafinose e sacarose) e as características micro morfológicas in vitro. Os dados fenotípicos foram confirmados por biologia molecular utilizando as informações de sequenciamento de DNA de um fragmento do lócus calmodulina. Nossos dados mostram que S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii tem uma ampla distribuição geográfica no Brasil. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição na literatura da espécie S. mexicana fora do México, e provocando doença em hospedeiro humano. S. brasiliensis foi isolado com alta frequência de gatos nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, sugerindo que este animal tem sido um importante vetor na epidemiologia desta espécie. Uma abordagem proteômica foi proposta neste trabalho para comparar o perfil protéico de isolados de Sporothrix spp. com o intuito de entendermos as diferenças em termos de expressão de proteína entre as espécies crípticas. Os perfis 2-D foram fortemente diferentes entre os isolados. Para elucidar o principal antígeno da esporotricose humana, o fungo foi cultivado em meio BHI caldo, 37 °C e as proteínas intracelulares foram fracionadas por eletroforese bidimensional. As proteínas foram transferidas para uma membrana e, em seguida, incubadas com soro de pacientes com as duas principais formas clínicas da doença (cutânea fixa e linfocutânea). Nossos resultados demonstram que anticorpos IgG presentes no soro de pacientes reagem com diferentes antígenos dos isolados do complexo Sporothrix schenckii. O imunoblot mostrou que existem imunoglobulinas que reagem com um antígeno de 70 kDa em três isolados (S. brasiliensis, S. globosa e S. schenckii). Diferenças no perfil de antigenicidade foram observadas entre S. mexicana e as demais espécies aqui avaliadas. / Sporotrichosis is a chronic mycotic infectious disease of man and animals caused by the traumatic implantation of a pathogenic fungus that typically involves the skin and subcutaneous tissue. Since 1898, when the sporotrichosis etiological agent was discovered by Schenck, this disease has been attributed to a single pathogen, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, a thermo dimorphic fungus that grow as a yeast at 37 ºC and as a mycelium at room temperature. However, isolates identified as S. schenckii showed a great deal of genetic variability, suggesting that this taxon consist in a cryptic species complex. Based on this information our group is interested in the study of the polyphasic taxonomy of this species complex and its implication on its ecoepidemiology in Brazil. We studied 161 strains of Sporothrix spp. provided from environmental and clinical samples obtained from diverse regions of Brazil and other countries. The phenotypic parameters assayed include vegetative growth on PDA media at different temperatures (30, 35, 37 and 40 ºC), the colony colors on CMA media, the assimilation pattern of carbon sources (raffinose, ribitol and sucrose) and morphological microscopic features of in vitro cultivation. The phenotypic data were confirmed by molecular biology using the sequencing information of a fragment of calmodulin locus. Our data show that the S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana and S. schenckii have a widespread geographical distribution in Brazil. To our knowledgement this is the first description of the specie S. mexicana outside of Mexico and causing disease in human host. S. brasiliensis was isolated with high frequency from cats in Rio Grande do Sul and Rio de Janeiro states, suggesting that cats has been an important vector in epidemiology of this specie. A proteomic approach was proposed in this work to compare protein profile of Sporothrix spp. isolates and get a better understanding about the differences in terms of protein expression among the cryptic species. The 2-D profiles were strongly different among the isolates. To elucidate the major antigen of human sporotrichosis, the fungus was cultured in BHI broth, 37 °C, and intracellular proteins were resolved by 2-DE. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane and then incubated with serum from patients with the two major clinical form of disease (cutaneous fixed and linfocutaneous). Our results show that IgG present in serum from patients react with different antigens from Sporothrix schenckii complex. Immunoblotting showed that the sera of patients had antibodies reacting with a 70 kDa antigen in three isolates (S. brasiliensis, S. globosa and S. schenckii). Profile differences in antigenicity were observed between S. mexicana and the other species studied here. / FAPESP: 2008/55975-8 / TEDE

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-12-10T14:10:12Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Silva de Oliveira - 2014.pdf: 3199133 bytes, checksum: cb42a7815c2701477249ff4d0cb2a05b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-12-11T07:57:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Silva de Oliveira - 2014.pdf: 3199133 bytes, checksum: cb42a7815c2701477249ff4d0cb2a05b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-11T07:57:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Silva de Oliveira - 2014.pdf: 3199133 bytes, checksum: cb42a7815c2701477249ff4d0cb2a05b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-04-23 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Staphylococcus saprophyticus is characterized as uropathogenic bacteria that causes urinary tract infections especially in young women. Some virulence factors were elucidated, however, little is known about how this bacteria install itself at host human. The urease was the first virulence factor described in S. saprophyticus, being responsible by increasing of the bladder pH in infected patients. This is the first study about S. saprophyticus in proteomics and immunoproteomics perspective of the secreted proteins (exoproteome) of this bacterium. A total of 44 new secreted proteins were detected by mass spectrometry. Among the proteins found, five of them have a crucial role in the glycolytic pathway: Triosephosphate isomerase (TPI), enolase (ENO), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and Glucose-6-phosphate isomerase (GPI), however, its role as moonlighting proteins have been observed in various microorganisms. Through of the immunoproteomics, it was possible to detect 18 protein species that reacted onto Western-blotting, and 5 of them could be identified by mass spectrometry. The most abundant protein specie identified as immunogenic in S. saprophyticus, it was transglycosilase IsaA (Immunodominant staphylococcal antigen A), being it well described in Staphylococcus aureus as virulence factor. Another abundant protein found as immunogenic was Ssa (Staphylococcal secretory antigen), which, it was identified under 3 isoforms. The enolase was the last protein identified at immunoproteome of S. saprophyticus. It was possible to conclude from these results that S. saprophyticus has a wide of extracellular proteins capable to promote bacteria adaption, and some of them are involved in oxidative/nitrosative stress (SOD and AhpC), besides possess proteins that have the capacity to incite the humoral immune response in BalbC mice. All this lead us to hypothesize that S. saprophyticus have defense and virulence mechanisms in order to protect itself against extracellular stresses and appropriate mechanisms to promote urinary tract infections. / Staphylococcus saprophyticus caracteriza-se por ser uma bactéria uropatogênica que causa infecção no trato genito-urinário especialmente de mulheres jovens. Alguns fatores de virulência já foram elucidados, no entanto, pouco se conhece do modo pelo qual esta bactéria acomete o hospedeiro humano. A uréase foi o primeiro fator de virulência descrito em S. saprophyticus, sendo responsável pela alcalinização do pH da bexiga de pacientes contaminados. Este estudo é o pioneiro tratando-se de S. saprophyticus na abordagem da proteômica e imunoproteômica do perfil de proteínas secretadas (exoproteoma) por esta bactéria. Um total de 44 proteínas secretadas inéditas foram detectadas por espectrometria de massas. Dentre as proteínas encontradas, cinco delas possuem papel fundamental na via glicolítica: triose-fosfato isomerase (TPI), enolase (ENO), gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) e glicose-6-fosfato isomerase (GPI), no entanto, seu papel como proteína “moonlighting” já foi observado em diversos microrganismos. Através da imunoproteômica, foi possível detectar 18 espécies proteicas que reagiram no Wester-blotting, e 5 delas puderam ser identificadas por espectrometria de massas. A espécie proteica mais abundante identificada como imunogênica em S. saprophyticus, foi a transglicosilase IsaA (Immunodominant staphylococcal antigen A), sendo bem descrita em S. aureus como um fator de virulência. Outra proteína abundante identificada como imunogênica foi a Ssa (Staphylococcal secretory antigen), no qual, foi identificada em 3 isoformas. A enolase também foi identificada no imunoproteoma de S. saprophyticus. Foi possível concluir através destes resultados que S. saprophyticus possui uma gama de proteínas extracelulares capazes de promover a adaptação desta bactéria, algumas delas envolvidas na proteção contra o estresse oxidativo/nitrosativo (SOD e AhpC), além de possuir proteínas que tem a característica de incitar a resposta imune humoral de camundongos BalbC. Isso tudo nos leva a hipotetizar que S. saprophyticus possui mecanismos de defesa e virulência a fim de se proteger contra estresses exteriores e mecanismos para promover a patogênese no trato genito-urinário.