Em bovinos, o desenvolvimento embrionário é caracterizado pelo surgimento de duas camadas de células distintas, o trofectoderma e a massa celular interna. Esta última sofrerá diferenciação para formar o disco embrionário constituído pelo epiblasto e hipoblasto. Os trabalhos de caracterização morfológica do epiblasto e hipoblasto em bovinos são necessários uma vez que podem ajudar a elucidar as causas de perdas gestacionais, principalmente nos casos de embriões derivados de produção in vitro. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar ultraestruturalmente o embrião bovino em diferentes fases do desenvolvimento com ênfase nas células do hipoblasto. Para isso, os embriões bovinos com 7, 14 e 16 dias de gestações derivados de técnicas de produção in vitro foram fixados para processamento e realização de microscopia eletrônica de transmissão. De acordo com os resultados obtidos observou-se que os embriões derivados de transferência nuclear de células somáticas e de partenogênese apresentaram grandes modificações na estrutura macro e microscópica. Nestes embriões, o tamanho estava reduzido, a massa celular interna não se apresentou de forma definida. Além disso, as organelas destes embriões, responsáveis por processos de absorção, comunicação, crescimento e metabolismo celular estavam em menor quantidade e tinham modificações quanto à forma, quando comparados aos resultados vistos nos embriões derivados de fertilização in vitro. Assim, verificamos que os blastocistos D7 derivados de transferência nuclear e partenogênese apresentaram graves modificações morfológicas, assim como verificou-se também nas células do hipoblasto dos embriões D14 e D16. / In cattle, the embryo development is characterized by the apperance of two distinct cell layers, the trophectoderm and the inner cell mass. This latter one will siffer a differentiation to form the embryonic disc constituted by the epiblasto and hypoblast. The works on the morphological characterization of the epiblasto and hypoblast in cattle are needed because they may help to elucidate the causes of pregnancy loss, especially in cases of embryos derived from in vitro production. Considering this, the objective of this study was to characterize ultrastrcturally the bovine embryo at different stages of development with emphasis on the hypoblast cells. To do so, bovine embryos at 7, 14 and 16 days of pregnancies derived from in vitro production techniques were fixed for processing and performing transmission electron microscopy. According to the results observed that embryos derived from the nuclear transfer of somatic cells and from parthenogenesis showed significant changes in the macroscopic and microscopic structure. In these embryos, the size was reduced, the inner cell mass has not show a defined shape. Furthermore, the organelles from such embryos, responsible for the absorption processes, communication, growth and cellular metabolism were fewer in number and have changes in shape, when compared to the results seen in embryos derived from in vitro fertilization. Thus, we observed that the blastocyst D7 derived from nuclear transfer and from the parthenogenesis, showed severe morphological changes, as well as for the hypoblastic cells in the D14 and D16 embryos.

It was hypothesized that technical factors associated with in vitro production (IVP) of embryos may influence rate of blastocyst development of oocytes matured at 38.5 or 41.0 C. To test this hypothesis, a retrospective meta-analysis was performed. Simple linear regression was performed to analyze continuous variables and ANOVA for categorical variables. Interactions among factors and maturation temperature on blastocyst development were analyzed using dummy regression for continuous variables, and using a factorial treatment design and ANOVA for categorical variables. Month of collection was the only variable that impacted responsiveness of ova to heat stress. Independent of maturation temperature, variables that explained most variation in blastocyst development included technician, total number of sliced ovaries per collection, ova number placed per well of oocyte maturation media, oocyte collection time, bull ID, sperm concentration added to ova, and ova age at IVF. The proportion of 8 to 16-cell embryos at time of cleavage assessment was the best predictor of blastocyst development. Results of model selection showed that development of ova matured at 38.5 C was associated with size of the collection, while development of ova matured at 41.0 C was mainly associated with ova age at fertilization. When data for ova matured at 38.5 and 41.0 C were combined, the effect of number of PZ per well on blastocyst development became evident. Use of these findings for optimizing efficiency of IVP procedures would effectively reduce experimental costs related to embryo production and increase laboratory productivity.

It was hypothesized that technical factors associated with in vitro production (IVP) of embryos may influence rate of blastocyst development of oocytes matured at 38.5 or 41.0 C. To test this hypothesis, a retrospective meta-analysis was performed. Simple linear regression was performed to analyze continuous variables and ANOVA for categorical variables. Interactions among factors and maturation temperature on blastocyst development were analyzed using dummy regression for continuous variables, and using a factorial treatment design and ANOVA for categorical variables. Month of collection was the only variable that impacted responsiveness of ova to heat stress. Independent of maturation temperature, variables that explained most variation in blastocyst development included technician, total number of sliced ovaries per collection, ova number placed per well of oocyte maturation media, oocyte collection time, bull ID, sperm concentration added to ova, and ova age at IVF. The proportion of 8 to 16-cell embryos at time of cleavage assessment was the best predictor of blastocyst development. Results of model selection showed that development of ova matured at 38.5 C was associated with size of the collection, while development of ova matured at 41.0 C was mainly associated with ova age at fertilization. When data for ova matured at 38.5 and 41.0 C were combined, the effect of number of PZ per well on blastocyst development became evident. Use of these findings for optimizing efficiency of IVP procedures would effectively reduce experimental costs related to embryo production and increase laboratory productivity.

Em bovinos, o desenvolvimento embrionário é caracterizado pelo surgimento de duas camadas de células distintas, o trofectoderma e a massa celular interna. Esta última sofrerá diferenciação para formar o disco embrionário constituído pelo epiblasto e hipoblasto. Os trabalhos de caracterização morfológica do epiblasto e hipoblasto em bovinos são necessários uma vez que podem ajudar a elucidar as causas de perdas gestacionais, principalmente nos casos de embriões derivados de produção in vitro. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar ultraestruturalmente o embrião bovino em diferentes fases do desenvolvimento com ênfase nas células do hipoblasto. Para isso, os embriões bovinos com 7, 14 e 16 dias de gestações derivados de técnicas de produção in vitro foram fixados para processamento e realização de microscopia eletrônica de transmissão. De acordo com os resultados obtidos observou-se que os embriões derivados de transferência nuclear de células somáticas e de partenogênese apresentaram grandes modificações na estrutura macro e microscópica. Nestes embriões, o tamanho estava reduzido, a massa celular interna não se apresentou de forma definida. Além disso, as organelas destes embriões, responsáveis por processos de absorção, comunicação, crescimento e metabolismo celular estavam em menor quantidade e tinham modificações quanto à forma, quando comparados aos resultados vistos nos embriões derivados de fertilização in vitro. Assim, verificamos que os blastocistos D7 derivados de transferência nuclear e partenogênese apresentaram graves modificações morfológicas, assim como verificou-se também nas células do hipoblasto dos embriões D14 e D16. / In cattle, the embryo development is characterized by the apperance of two distinct cell layers, the trophectoderm and the inner cell mass. This latter one will siffer a differentiation to form the embryonic disc constituted by the epiblasto and hypoblast. The works on the morphological characterization of the epiblasto and hypoblast in cattle are needed because they may help to elucidate the causes of pregnancy loss, especially in cases of embryos derived from in vitro production. Considering this, the objective of this study was to characterize ultrastrcturally the bovine embryo at different stages of development with emphasis on the hypoblast cells. To do so, bovine embryos at 7, 14 and 16 days of pregnancies derived from in vitro production techniques were fixed for processing and performing transmission electron microscopy. According to the results observed that embryos derived from the nuclear transfer of somatic cells and from parthenogenesis showed significant changes in the macroscopic and microscopic structure. In these embryos, the size was reduced, the inner cell mass has not show a defined shape. Furthermore, the organelles from such embryos, responsible for the absorption processes, communication, growth and cellular metabolism were fewer in number and have changes in shape, when compared to the results seen in embryos derived from in vitro fertilization. Thus, we observed that the blastocyst D7 derived from nuclear transfer and from the parthenogenesis, showed severe morphological changes, as well as for the hypoblastic cells in the D14 and D16 embryos.

Comparadas com células de mamífero, as células de inseto são mais fáceis de cultivar, não acumulam quantidade significativa de sub-produtos tóxicos e apresentam maiores rendimentos na expressão de proteínas heterólogas, porém apresentam uma menor capacidade de realizar modificações pós-traducionais. Células de inseto podem ser empregadas na produção in vitro de baculovírus, usados como pesticidas biológicos. As células Sf-9 estão entre as células de inseto com uso mais difundido. Entender o metabolismo destas células permitirá melhorias nos processos que as empregam, entretanto, ainda há relativamente pouca informação sobre o assunto. Considerando mais especificamente o uso dessas células para produção de baculovírus, também é necessário mais entendimento sobre o processo infectivo e parâmetros que o afetam. Este trabalho teve como objetivo estudar a influência da suplementação do meio de cultivo com diferentes aminoácidos no desenvolvimento das células Sf-9 e determinar a concentração de oxigênio dissolvido ideal para o cultivo destas células, visando elaborar uma metodologia de cultivo em biorreator otimizada e, paralelamente, estudar o processo de infecção de cultivos dessas células com o baculovírus Spodoptera frugiperda (SfMNPV) em diferentes escalas. Para estudar a influência que a adição de aminoácidos ao meio tem sobre o crescimento celular, células Sf-9 foram cultivadas em frascos schotts de 100 e 500 mL, com 20 mL do meio SF900III SFM (serum free medium) suplementados com cisteína, prolina, serina ou asparagina. Os resultados foram comparados com cultivos feitos sem suplementação (controles). A condição que apresentou o melhor resultado em frasco schott foi replicada em biorreator de 1 L de volume útil. Para estudar a influência do oxigênio dissolvido (O.D.) foram testados diferentes setpoints de O.D. em cultivos em biorreator. Em tais ensaios foram testadas as concentrações de O.D de 10%, 30% e 50% da saturação com o ar. Para o estudo do processo de infecção, foram realizadas infecções em frascos schotts de 500 mL, com 20 mL de cultivo, e em biorreator de 1 L. Também foram realizadas infecções em garrafas T-25 como forma de controle de virulência do inóculo viral e do vírus produzido. As principais variáveis analisadas foram µmáx, Xvmáx YX/Glc. Nos ensaios de influencia de O.D., analisou-se também qO2 e qCO2 e, nos ensaios de infecção, a porcentagem de células contendo poliedros. A suplementação com prolina foi prejudicial ao cultivo. A adição de asparagina não teve qualquer influência no desenvolvimento celular. Os resultados das adições de cisteína e serina não foram muito conclusivos, em alguns ensaios houve aumento de Xvmáx, já em outros não foi notado efeito significativo. Nos ensaios em biorreator, todos os valores de O.D. testados apresentaram resultados semelhantes, já a adição de cisteína ao meio em biorreator foi bastante maléfica ao crescimento celular. Os ensaios de infecção mostraram que células Sf-9 são bastante susceptíveis à infecção pelo baculovírus Spodoptera frugiperda e boas produtoras de poliedros virais, e que a vazão gasosa tem efeito negativo na concentração viral na fase líquida dos cultivos em biorreator (título viral). / Compared to mammalian cells, insect cells are easier to culture, do not accumulate significant amounts of toxic byproducts and are capable of higher heterologous protein yields, but have a lower ability to perform post-translational modifications. Insect cells may be employed in the in vitro production of baculoviruses, used as biological pesticides. Sf-9 cells are among the most used insect cell lines. Understanding the metabolism of these cells would allow improvements in the processes that employ them, however, Howeverreports on the metabolism and physiology of Sf-9 cells and insect cells in general are scarce. When considering the use of these cells for baculovirus production, it is also necessary more understanding about the infective process and parameters that can affect it. This work aimed to study the influence that the supplementation of the culture medium with different amino acids have on the development of Sf-9 cells and to determine the ideal dissolved oxygen concentration for the culture of these cells, aiming to elaborate an optimized bioreactor culture methodology and, in parallel, to study the infection process of these cells with the Spodoptera frugiperda baculovirus (SfMNPV) at different scales. To study the influence that the addition of amino acids to the medium has on cell growth, Sf-9 cells were cultured in 100 and 500mL schott flasks with 20mL SF900III SFM (serum free medium) supplemented with cysteine, proline, serine or asparagine. The results were compared with cultures without supplementation (controls). The condition that presented the best result in schott flasks was replicated in a 1L bioreactor. To study the influence of dissolved oxygen (O.D.), experiments with different values of O.D. were conducted at a 1L bioreactor. The O.D. tested were 10%, 30% and 50% of air saturation. To study the infection process, infections were carried out in 500 mL schotted flasks, with 20 mL of culture, and in a 1L bioreactor. Infections were also carried out in 25 cm² T-flasks as a form of virulence control of the viral inoculum and virus produced. The main variables analyzed were µmax, Xvmax YX/Glc. In the O.D. tests, qO2 and qCO2 were also analyzed and, in the infection assays, the percentage of cells containing polyhedra. Proline supplementation was detrimental to the culture. The addition of asparagine had no influence on cellular growth. The results of cysteine and serine additions were not very conclusive, in some studies there was an increase of Xvmax, while in others no significant effect was observed. In the bioreactor trials, all O.D. tested showed similar results and the addition of cysteine to the medium was quite harmful to cell growth. Infection assays showed that Sf-9 cells are quite susceptible to infection by the Spodoptera frugiperda baculovirus and good producers of viral polyhedra, and that the gas flow has a negative effect on the viral concentration in the liquid phase of the bioreactor cultures (viral titer).

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: César Roberto Esper / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Resumo: O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos da substituição do SFB e do BSA pela OVA na PIV, por estudos nas etapas de maturação, fecundação e cultivo in vitro. Observamos que durante a etapa de maturação, a concentração 4mg/mL de OVA não afetou a maturação nuclear (82,66%) e a migração de grânulos corticais (GC) para a periferia dos oócitos (54,21%), sendo, portanto, utilizada nos experimentos subseqüentes. Foi observado que as fontes protéicas SFB, BSA, OVA, e BSA com OVA (BO) não afetaram (p>0,05) as taxas de maturação nuclear e migração de GC. Para a sigla dos tratamentos, as fontes protéicas foram identificadas pelas iniciais (SFB=S, BSA=B e OVA=O). Cada tratamento foi abreviado com a primeira letra referente à etapa de maturação, a segunda à fecundação, e a terceira ao cultivo. Quanto às taxas de formação de pronúcleo (PN) observamos que o grupo SO (76,67% de 2 PN) foi semelhante (p>0,05) ao grupo controle (82,95% de 2 PN). A etapa de CIV permitiu avaliar que os diferentes tratamentos foram semelhantes (p>0,05) quanto à taxa de clivagem. Entretanto, quanto à taxa de produção de blastocistos, o grupo OOO (26,0%) foi semelhante (p>0.05) aos grupos SOS (33,8%), BBB (35,8%), BOB (32%), e OBO (33%), mas foi inferior (p<0,05) aos grupos CONT (45%) e SBS (42,8%). Quanto à taxa de eclosão, o grupo OOO (20,4%), foi inferior (p<0,05) aos grupos CONT (46,2%), SBS (43,4%), SOS (38,4%), BBB (41,6%), e semelhante aos grupos BOB (28,2%) e OBO (25,4%). Concluímos que é possível produzir embriões bovinos na ausência de SFB e/ou BSA, com a fonte protéica OVA, embora tanto a quantidade como a qualidade dos blastocistos tenham se apresentado inferiores em relação àqueles produzidos na presença de SFB e/ou BSA. / Abstract: The present work aimed to evaluate the effects of FCS and BSA substitution for OVA on in vitro production of bovine embryos, studying in vitro maturation, fertilization, and development. For maturation, we observed that the concentration 4mg/mL of OVA didn't affect nuclear maturation (82.66%), and cortical granule (CG) migration (54.21%), which indicated its use in the subsequent experiments. It was observed that the protein sources FBS, BSA, OVA and BO didn't significantly affect (p>0.05) the rates of nuclear maturation and CG migration. For evaluation of pronucleus (PN) formation rates, we observed that the SO group (the first letter means the protein source for the maturation stage, the second for the fertilization, and the third for the development), (76.67% of 2 PN) was similar (p>0.05) to the control group (82.95% of 2 PN). However, two pronucleus formation rates in BB (56.98%), BO (39.02%), OB (37.36%) and OO (39.24%) were different (p<0.05) from the control group (82.95% of 2 PN). Different treatments (CONT, SBS, SOS, BBB, BOB, OOO, OBO) were similar (p>0.05) in cleavage rates. However, regarding to blastocyst production rates, the OOO group (26.0%) was similar (p>0.05) to the SOS group (33.8%), BBB (35.8%), BOB (32%), and OBO (33%) groups, but it was inferior (p <0.05) compared to the CONT (45%) and SBS (42.8%) groups. In relation to blastocyst hatching rate, the OOO group (20.4%) was inferior (p<0.05) when compared to the CONT (46.2%), SBS (43.4%), SOS (38.4%), BBB (41.6%) groups, and it was to BOB (28.2%) and OBO (25.4%) groups. We concluded that it’s possible to produce bovine embryos in the absence of FBS and/or BSA using ovalbumin (OVA) as the protein source, even though decreased quantity and quality rates of bovine blastocysts were observed. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-18Bitstream added on 2014-06-13T19:45:09Z : No. of bitstreams: 1 tetzner_tad_dr_jabo.pdf: 1320248 bytes, checksum: 1bcf0f410a95d0c6af2b76012cc2d1bc (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Not available

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:38:29Z : No. of bitstreams: 1 tetzner_tad_me_jabo.pdf: 994984 bytes, checksum: dc3b9f9b3b09f1b6ee7040b88cd31ad8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos da substituição do SFB e do BSA pela OVA na PIV, por estudos nas etapas de maturação, fecundação e cultivo in vitro. Observamos que durante a etapa de maturação, a concentração 4mg/mL de OVA não afetou a maturação nuclear (82,66%) e a migração de grânulos corticais (GC) para a periferia dos oócitos (54,21%), sendo, portanto, utilizada nos experimentos subseqüentes. Foi observado que as fontes protéicas SFB, BSA, OVA, e BSA com OVA (BO) não afetaram (p>0,05) as taxas de maturação nuclear e migração de GC. Para a sigla dos tratamentos, as fontes protéicas foram identificadas pelas iniciais (SFB=S, BSA=B e OVA=O). Cada tratamento foi abreviado com a primeira letra referente à etapa de maturação, a segunda à fecundação, e a terceira ao cultivo. Quanto às taxas de formação de pronúcleo (PN) observamos que o grupo SO (76,67% de 2 PN) foi semelhante (p>0,05) ao grupo controle (82,95% de 2 PN). A etapa de CIV permitiu avaliar que os diferentes tratamentos foram semelhantes (p>0,05) quanto à taxa de clivagem. Entretanto, quanto à taxa de produção de blastocistos, o grupo OOO (26,0%) foi semelhante (p>0.05) aos grupos SOS (33,8%), BBB (35,8%), BOB (32%), e OBO (33%), mas foi inferior (p<0,05) aos grupos CONT (45%) e SBS (42,8%). Quanto à taxa de eclosão, o grupo OOO (20,4%), foi inferior (p<0,05) aos grupos CONT (46,2%), SBS (43,4%), SOS (38,4%), BBB (41,6%), e semelhante aos grupos BOB (28,2%) e OBO (25,4%). Concluímos que é possível produzir embriões bovinos na ausência de SFB e/ou BSA, com a fonte protéica OVA, embora tanto a quantidade como a qualidade dos blastocistos tenham se apresentado inferiores em relação àqueles produzidos na presença de SFB e/ou BSA. / The present work aimed to evaluate the effects of FCS and BSA substitution for OVA on in vitro production of bovine embryos, studying in vitro maturation, fertilization, and development. For maturation, we observed that the concentration 4mg/mL of OVA didn't affect nuclear maturation (82.66%), and cortical granule (CG) migration (54.21%), which indicated its use in the subsequent experiments. It was observed that the protein sources FBS, BSA, OVA and BO didn't significantly affect (p>0.05) the rates of nuclear maturation and CG migration. For evaluation of pronucleus (PN) formation rates, we observed that the SO group (the first letter means the protein source for the maturation stage, the second for the fertilization, and the third for the development), (76.67% of 2 PN) was similar (p>0.05) to the control group (82.95% of 2 PN). However, two pronucleus formation rates in BB (56.98%), BO (39.02%), OB (37.36%) and OO (39.24%) were different (p<0.05) from the control group (82.95% of 2 PN). Different treatments (CONT, SBS, SOS, BBB, BOB, OOO, OBO) were similar (p>0.05) in cleavage rates. However, regarding to blastocyst production rates, the OOO group (26.0%) was similar (p>0.05) to the SOS group (33.8%), BBB (35.8%), BOB (32%), and OBO (33%) groups, but it was inferior (p <0.05) compared to the CONT (45%) and SBS (42.8%) groups. In relation to blastocyst hatching rate, the OOO group (20.4%) was inferior (p<0.05) when compared to the CONT (46.2%), SBS (43.4%), SOS (38.4%), BBB (41.6%) groups, and it was to BOB (28.2%) and OBO (25.4%) groups. We concluded that it s possible to produce bovine embryos in the absence of FBS and/or BSA using ovalbumin (OVA) as the protein source, even though decreased quantity and quality rates of bovine blastocysts were observed.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreaFA.pdf: 1749500 bytes, checksum: 3468acf35904221d81b3482eef39fc68 (MD5) Previous issue date: 2005-04-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / In vivo production of viral biopesticides is the major source of viral insecticides currently in the marketplace. However, this system presents limitations during production scale-up. For the Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), the insect used for replication has cannibalistic characteristics, thus production is even more difficult. Insect cells are commonly used for in vitro baculovirus production. Most of these cell lines are derived from Lepidoptera species. The Sf21 cell line is derived from Spodoptera frugiperda caterpillar ovarian tissue, and its clonal isolate Sf9 has been used for biopesticide production due to its ease of growth in suspension cultures. In this work, the in vitro production capabilities of a Brazilian SfMNPV isolate obtained from cornfields was evaluated. Comparison of polyhedra production was carried out using both Sf21 and Sf9 cells, based on volumetric and specific yields. Both cell lines were cultivated in Hyclone medium supplemented with different fetal bovine serum concentrations (2,5 and 5%). The best results were obtained using Sf9 cells supplemented with 5% serum. These results were further confirmed quantitively through kinetic parameter estimation for both cells lines and different serum concentrations. After seven successive passages, this system still presented high specific polyhedra production / A produ??o in vivo de biopesticidas virais ? a maior fonte destes inseticidas presentes no mercado atualmente. Entretanto, o sistema in vivo apresenta limita??o em rela??o ao escalonamento de produ??o. No caso do v?rus Spodoptera frugiperda nucleopoliedrovirus (SfMNPV), o inseto usado para sua multiplica??o tem caracter?sticas canibais, o que dificulta ainda mais a sua produ??o in vivo. As c?lulas de inseto s?o comumente utilizadas para produ??o in vitro de baculov?rus. V?rias linhagens destas c?lulas s?o derivadas principalmente da esp?cie Lepidoptera. A linhagem Sf21 ? derivada do tecido ovariano da lagarta Spodoptera frugiperda e um clone isolado da linhagem original, denominado Sf9, tem sido utilizado para produ??o de biopesticidas, por apresentar f?cil crescimento em cultivo em suspens?o. Neste trabalho, foi testada a viabilidade de produ??o in vitro de um isolado viral brasileiro de SfMNPV obtido em lavouras de milho. A produ??o de poliedros, em c?lulas Sf21 e Sf9, foi determinada com base na avalia??o comparativa da produtividade volum?trica e espec?fica destes poliedros. Ambas as linhagens celulares foram cultivadas, em suspens?o, em meio HyClone suplementado com diferentes concentra??es de soro fetal bovino (2,5 e 5%). A c?lula Sf9 suplementada com 5% de soro apresentou os melhores resultados de produ??o. Os resultados foram confirmados quantitativamente atrav?s dos par?metros cin?ticos estimados para as duas linhagens e diferentes concentra??es de soro. O sistema demonstrou, ap?s sete passagens sucessivas, uma alta produ??o espec?fica de poliedros

Comparadas com células de mamífero, as células de inseto são mais fáceis de cultivar, não acumulam quantidade significativa de sub-produtos tóxicos e apresentam maiores rendimentos na expressão de proteínas heterólogas, porém apresentam uma menor capacidade de realizar modificações pós-traducionais. Células de inseto podem ser empregadas na produção in vitro de baculovírus, usados como pesticidas biológicos. As células Sf-9 estão entre as células de inseto com uso mais difundido. Entender o metabolismo destas células permitirá melhorias nos processos que as empregam, entretanto, ainda há relativamente pouca informação sobre o assunto. Considerando mais especificamente o uso dessas células para produção de baculovírus, também é necessário mais entendimento sobre o processo infectivo e parâmetros que o afetam. Este trabalho teve como objetivo estudar a influência da suplementação do meio de cultivo com diferentes aminoácidos no desenvolvimento das células Sf-9 e determinar a concentração de oxigênio dissolvido ideal para o cultivo destas células, visando elaborar uma metodologia de cultivo em biorreator otimizada e, paralelamente, estudar o processo de infecção de cultivos dessas células com o baculovírus Spodoptera frugiperda (SfMNPV) em diferentes escalas. Para estudar a influência que a adição de aminoácidos ao meio tem sobre o crescimento celular, células Sf-9 foram cultivadas em frascos schotts de 100 e 500 mL, com 20 mL do meio SF900III SFM (serum free medium) suplementados com cisteína, prolina, serina ou asparagina. Os resultados foram comparados com cultivos feitos sem suplementação (controles). A condição que apresentou o melhor resultado em frasco schott foi replicada em biorreator de 1 L de volume útil. Para estudar a influência do oxigênio dissolvido (O.D.) foram testados diferentes setpoints de O.D. em cultivos em biorreator. Em tais ensaios foram testadas as concentrações de O.D de 10%, 30% e 50% da saturação com o ar. Para o estudo do processo de infecção, foram realizadas infecções em frascos schotts de 500 mL, com 20 mL de cultivo, e em biorreator de 1 L. Também foram realizadas infecções em garrafas T-25 como forma de controle de virulência do inóculo viral e do vírus produzido. As principais variáveis analisadas foram µmáx, Xvmáx YX/Glc. Nos ensaios de influencia de O.D., analisou-se também qO2 e qCO2 e, nos ensaios de infecção, a porcentagem de células contendo poliedros. A suplementação com prolina foi prejudicial ao cultivo. A adição de asparagina não teve qualquer influência no desenvolvimento celular. Os resultados das adições de cisteína e serina não foram muito conclusivos, em alguns ensaios houve aumento de Xvmáx, já em outros não foi notado efeito significativo. Nos ensaios em biorreator, todos os valores de O.D. testados apresentaram resultados semelhantes, já a adição de cisteína ao meio em biorreator foi bastante maléfica ao crescimento celular. Os ensaios de infecção mostraram que células Sf-9 são bastante susceptíveis à infecção pelo baculovírus Spodoptera frugiperda e boas produtoras de poliedros virais, e que a vazão gasosa tem efeito negativo na concentração viral na fase líquida dos cultivos em biorreator (título viral). / Compared to mammalian cells, insect cells are easier to culture, do not accumulate significant amounts of toxic byproducts and are capable of higher heterologous protein yields, but have a lower ability to perform post-translational modifications. Insect cells may be employed in the in vitro production of baculoviruses, used as biological pesticides. Sf-9 cells are among the most used insect cell lines. Understanding the metabolism of these cells would allow improvements in the processes that employ them, however, Howeverreports on the metabolism and physiology of Sf-9 cells and insect cells in general are scarce. When considering the use of these cells for baculovirus production, it is also necessary more understanding about the infective process and parameters that can affect it. This work aimed to study the influence that the supplementation of the culture medium with different amino acids have on the development of Sf-9 cells and to determine the ideal dissolved oxygen concentration for the culture of these cells, aiming to elaborate an optimized bioreactor culture methodology and, in parallel, to study the infection process of these cells with the Spodoptera frugiperda baculovirus (SfMNPV) at different scales. To study the influence that the addition of amino acids to the medium has on cell growth, Sf-9 cells were cultured in 100 and 500mL schott flasks with 20mL SF900III SFM (serum free medium) supplemented with cysteine, proline, serine or asparagine. The results were compared with cultures without supplementation (controls). The condition that presented the best result in schott flasks was replicated in a 1L bioreactor. To study the influence of dissolved oxygen (O.D.), experiments with different values of O.D. were conducted at a 1L bioreactor. The O.D. tested were 10%, 30% and 50% of air saturation. To study the infection process, infections were carried out in 500 mL schotted flasks, with 20 mL of culture, and in a 1L bioreactor. Infections were also carried out in 25 cm² T-flasks as a form of virulence control of the viral inoculum and virus produced. The main variables analyzed were µmax, Xvmax YX/Glc. In the O.D. tests, qO2 and qCO2 were also analyzed and, in the infection assays, the percentage of cells containing polyhedra. Proline supplementation was detrimental to the culture. The addition of asparagine had no influence on cellular growth. The results of cysteine and serine additions were not very conclusive, in some studies there was an increase of Xvmax, while in others no significant effect was observed. In the bioreactor trials, all O.D. tested showed similar results and the addition of cysteine to the medium was quite harmful to cell growth. Infection assays showed that Sf-9 cells are quite susceptible to infection by the Spodoptera frugiperda baculovirus and good producers of viral polyhedra, and that the gas flow has a negative effect on the viral concentration in the liquid phase of the bioreactor cultures (viral titer).