La producción de embriones mediante la recuperación de ovocitos inmaduros por ovum pick up (OPU), y su posterior maduración, fecundación y cultivo en el laboratorio in vitro, presenta numerosos beneficios para optimizar el potencial reproductivo, tanto de hembras como de machos. Además, frente a la superovulación convencional mediante tratamiento hormonal y la recogida de embriones in vivo, la producción in vitro de embriones (PIVE) con ovocitos de OPU ofrece considerables ventajas. Sin embargo, actualmente la PIVE continua siendo ineficiente e incapaz de producir embriones de calidad similar a los in vivo, lo cual ha limitado una aplicación más amplia de esta tecnología. Así pues, el objetivo de esta tesis fue la optimización de la PIVE en ganado vacuno, condicionado por las peculiaridades y deficiencias de la PIVE cuando los ovocitos son recuperados por la técnica de OPU. Con este fin, cinco experimento se llevaron a cabo en esta tesis. En el primero de ellos se estudió el efecto del fluido oviductal bovino (FOb) sobre el desarrollo y la calidad embrionaria (Experimento 1). Las fases del proceso de PIVE en las cuales el cultivo de ovocitos/embriones, bien individualmente o bien en número reducido, pudiera perjudicar el posterior desarrollo hasta el estadio de blastocisto y/o a su calidad, se estudiaron en el Experimento 2. En el Experimento 3 se testó si el desarrollo y la calidad de embriones cultivados in vitro en número reducido podría ser mejorada con la adición conjunta de factor de crecimiento epidérmico, insulina, transferrina y selenio (FCE-ITS) o por el sistema de cultivo de embriones llamado well of well (WOW). Las propiedades protectoras de la melatonina frente a los daños causados por el estrés oxidativo, subsecuentes de las condiciones de PIVE o de un estrés térmico durante la maduración ovocitaria, fueron evaluadas en el Experimento 4. Por último, en el Experimento 5 usamos ovocitos recolectados por OPU para evaluar el efecto del semen sexado sobre / Cebrián Serrano, A. (2013). Factors affecting the in vitro embryo production in cattle associated to ovum pick up sistem [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/27646 / Palancia

Resumo: O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da suplementação energética e com diferentes fontes de gordura na produção de embriões FIV e no perfil metabólico em novilhas nelore. Foram realizados dois experimentos, no primeiro, vinte novilhas Nelore (Bos taurus indicus) com idade média de 30 meses, com peso médio de 417,0 ± 42,4 kg foram distribuidas aleatoriamente em 3 tratamentos: T1 (n= 7), animais receberam 100% das exigências de manutença de energia, calculados conforme NRC (1997), T2 onde os animais receberam 170% das exigências de manutenção de energia (1,7 X M), e T3, onde os animais receberam 170 % das exigências de manutenção de energia com adição de 200 g de gordura protegida-AGCL (Megalac®). No segundo experimento 12 novilhas Nelore (Bos taurus indicus) com idade variando de 14 a 18 meses, com peso médio inicial de 309,6 kg, foram distribuidas em 4 tratamentos, de acordo com peso e população folicular avaliada por ultrasonografia: T1, animais receberam 100% dos requerimentos de mantença de energia, calculados conforme NRC (1997), T2- animais receberam 170% das exigências de mantença de energia, T3- idem ao T2, com adição de 4% de óleo de soja na MS, e T4- idem ao T2, com adição de 200 g de AGCL (Megalac ®). O período de adaptação foi quinze dias, onde os animais receberam feno de capim Brachiaria e ração concentrada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two experiments were carried to evaluate the effect of the energy and fat in the metabolic profile, follicular dynamic, oocyte and in vitro embryo production in Nelore heifers (Bos taurus indicus). In the first, twenty Nelore heifers with 30 months old, and average weight 417,0 ± 42,4 were allocated in 3 treatments, in accordance with weight and follicular population evaluated by ultrasound: T1, animals received 100% of energy maintenance, calculated as NRC (1997), T2- animals received 170% of energy maintenance; T3: animals received 170% of energy maintenance with addition of 200 g Megalac ®. In the second experiment, 12 Nelore heifers with 14-18 months and 309,6 kg average weight, were allocated in 3 treatments, in tree periods: T1, animals received 100% of energy maintenance, calculated as NRC (1997), T2- animals received 170% of energy maintenance; T3: animals received 170% of energy maintenance with addition of 4% soybean oil in Dry Matter and T4: animals received 170% of energy maintenance with addition of 200 g Megalac ®. After adaptation period, the treatment initiated, animals had synchronized ovulation, blood samples were collected, and follicular aspiration was carried to evaluate the oocytes and in vitro embryo production. Follicular development was monitored daily by ultrasonography until day post heat. The consumption of MS and the weight gain were lower in group T1 (P< 0.05), in relation to the others treatments. The FSH, LH, and albumin concentrations were not different (P > 0.05) among treatments. The cholesterol concentrations were higher in the T3 and T4 groups (P< 0.05) only in the second experiment... (Complete abstract, click electronic access below) / Orientadora: Gisele Zoccal Mingoti / Coorientador: Roberto Sartori Filho / Banca: Ciro Moraes Barros / Banca: César Roberto Esper / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Doutor

Os programas de melhoramento genético objetivam a seleção de animais geneticamente e fenotipicamente superiores. Dentre as características selecionadas para aumentar o ganho genético do rebanho, o perímetro escrotal destaca-se por sua alta herdabilidade e correlação com precocidade sexual, peso do animal e morfologia espermática. A seleção fenotípica para perímetro escrotal pode ser auxiliada pela junção da DEP PE 365 (diferença esperada na progênie para perímetro escrotal aos 365 dias) com a biotecnologia reprodutiva PIVE (produção in vitro de embriões), e tecnologias moleculares como o uso de marcadores do tipo SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) e marcadores bioquímicos (proteínas). Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo: verificar se os SNPs presentes nos genes atuantes na maturação sexual B4GALT1 (Beta 1,4- galactosyltransferase), FSHR (Follicle-stimulating hormone), LHR (Luteinizing hormone receptor) e IGF2 (Insulin-like growth factor 2) podem estar associados a maiores valores de DEP PE 365 em touros da raça Nelore; fazer o estudo global de proteínas no sêmen de touros da raça Nelore que possam ser indicativas de maior DEP PE 365 e verificar se a DEP PE 365 interfere negativamente ou positivamente nos resultados da PIVE. Para as análises de SNP, 178 touros foram divididos em dois grupos, sendo um com 104 animais de DEP PE 365 negativa e outro com 74 animais com DEP positiva. O DNA foi extraído do sangue destes animais e a região genômica de interesse foi amplificada e analisada por RFLP (restriction fragment lengh polymorphism). No caso da proteômica, dois pools de sêmen foram comparados entre si quanto aos seus perfis protéicos por LCMS (Liquid chromatographymass spectrometry): um proveninete de três touros que produzem em média 17,6% de embriões/oócito in vitro e DEP PE 365 média de -0,3 (inferiores) e outro pool proveniente de três touros que produzem em média 34,25% de embriões/oócito, com DEP PE 365 média de 1,07 (superiores). Para verificar se a DEP PE 365 de touros utilizados na PIVE influencia na quantidade e cinética de embriões produzidos, 48 touros foram divididos em três grupos (superior, neutro e inferior) por meio da amplitude total de suas DEPs PE 365 e então utilizados na PIVE. Então, observou-se a quantidade e os tipos de blastocistos gerados por cada um dos grupos. Os resultados do presente trabalho mostraram: o genótipo CC no SNP analisado no gene LHR, e o genótipo TT no SNP analisado no gene IGF2 podem estar relacionados a animais de maiores DEP PE 365 (p 0.05); proteínas envolvidas em vias metabólicas foram predominantes no grupo dos touros superiores e portanto podem ser prováveis marcadores bioquímicos de reprodutores com maiores DEP PE 365; touros com maiores DEPs PE 365 resultam na maior PIV de embriões favoráveis para serem transferidos para vacas receptoras (Bl e Bx; blastocisto e blastocisto expandido; p 0.05). Tais resultados apresentam informações que podem auxiliar na seleção de animais com melhores dados fenotípicos de DEP PE 365 e, portanto, melhores reprodutores. / The breeding programs aim the selection of phenotypically and genetically superior animals . Among the selected characteristics to increase genetic gain in the herd, scrotal circumference stands out for its high heritability and correlation with sexual precocity, animal weight and morphology . Phenotypic selection for scrotal circumference may be aided by the addition of EPD SC 365 (expected progeny difference for scrotal circumference at 365 days ) to IVPE (in vitro production of embryos) reproductive biotechnology and molecular technologies such as the use of molecular markers like SNPs (Single Nucleotide Polymorphism ) and biochemical markers (proteins). Thus, this study aimed to: determine whether the SNPs present in genes B4GALT1 (Beta 1,4 - galactosyltransferase), FSHR (Follicle - stimulating hormone), LHR (Luteinizing hormone receptor) and IGF2 (Insulin- like growth factor 2) may be associated with higher values of EPD SC 365 in Nelore bulls; make global study of proteins in semen from Nelore bulls that may be indicative of greater EPD SC 365 and check if EPD SC 365 interferes negatively or positively on the results of IVPE. For the analysis of SNP, 178 bulls were divided into two groups, one with 104 animals of 365 negative EPD SC 365 and another with 74 animals with positive EPD SC 365. DNA was extracted from blood of these animals and genomic region of interest was amplified and analyzed by RFLP (restriction fragment polymorphism lengh). In the case of proteomics, two pools of semen were compared in respect to their protein profiles by LCMS (Liquid chromatography - mass spectrometry): One from three bulls that produce on average 17.6 % of in vitro embryo/oocyte and with EPD SC 365 average -0.3 (lower) and another pool from three bulls that produce on average 34.25% of in vitro embryo/oocyte with EPD SC 365 average of 1.07 (upper). To check if EPD SC 365 bulls used in IVPE influences the amount and kinetics of embryos, 48 bulls were divided into three groups (upper, lower and neutral ) through the full range of their EPDs SC 365 and then used in IVPE. Then, it was observed the amount and types of blastocysts generated by each group. The results of this study showed: the CC genotype at SNP analyzed in LHR gene, and the TT genotype at SNP analyzed in the IGF2 gene may be related to larger EPD SC 365 animals (p 0.05); proteins involved in metabolic pathways were predominant in group of senior bulls and can therefore be likely biochemical markers of breeding with larger EPD SC 365; bulls with larger EPD SC 365 used in IVPE result in greater favor of embryos to be transferred to recipient cows (Bl and Bx; blastocyst and expanded blastocyst, p 0:05). These results provide information that can assist in the selection of animals with improved phenotypic data EPS SC 365 and, therefore, the best breeders.

Dentre as tecnologias de reprodução assistida (TRAs), a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é a mais amplamente estudada, além de possuir um grande interesse econômico. Entretanto, existem fatores que influenciam negativamente a taxa de produção embrionária e o sucesso da gestação. Sabe-se que embriões provenientes das TRAs apresentam frequentemente alterações epigenéticas, relacionadas principalmente ao microambiente no qual os gametas e embriões se desenvolvem. A suplementação com ácido fólico parece prevenir tais erros epigenéticos, visto que além de ser um importante composto vitamínico, ele pode atuar como doador de grupamentos metil e possui ação antioxidante. A adição de ácido fólico durante a maturação oocitária parece influenciar positivamente a PIVE, além de existir evidências de que ele possa alterar os níveis de metilação do DNA e a expressão de genes importantes ao desenvolvimento embrionário. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo, avaliar a influência de diferentes concentrações de ácido fólico durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos de diferentes qualidades (graus I e III) na produção embrionária e na expressão dos genes IGF2 e LIT1 em blastocistos bovinos. Para tanto, três diferentes concentrações de ácido fólico (10, 30 e 100µM) foram avaliadas durante a MIV, em que 2159 oócitos (1087 oócitos grau I e 1072 oócitos grau III) foram maturados, fertilizados e cultivados por sete dias. Os blastocistos foram avaliados quanto à (1) taxa de produção nos diferentes tratamentos e origem dos oócitos e (2) a expressão dos genes IGF2 e LIT1 foi investigada utilizando a transcrição reversa associada a PCR quantitativa. A análise estatística foi realizada através do teste t de Student. A avaliação da produção embrionária mostrou que a adição de 10µM de ácido fólico influencia positivamente a produção de embriões provenientes de oócitos grau III (p=0,017), enquanto em embriões provenientes de oócitos grau III não foi observada influência. O segundo tratamento mostrou que a adição de 30µM de ácido fólico parece não influenciar tanto embriões provenientes de oócitos grau I quanto grau III. Por outro lado, a adição de 100µM de ácido fólico prejudica o desenvolvimento de embriões provenientes de oócitos grau I (p=0,043), mas parece não influenciar os embriões provenientes de oócitos grau III. Quando avaliada a expressão gênica, o gene IGF2 foi expresso em 25% das amostras, sendo que, com exceção de uma amostra, todas eram provenientes de oócitos grau I. Apesar do gene LIT1 ser expresso em todas as amostras analisadas, não foram observadas diferenças entre os embriões cujos oócitos foram maturados na ausência ou na presença de ácido fólico, independente da concentração adicionada ou origem oocitária (graus I ou III). A adição de ácido fólico durante a maturação de oócitos bovinos parece ser interessante para a PIVE. No entanto, a concentração e a qualidade oocitária parecem ser fatores importantes para a produção embrionária, visto que menores concentrações favorecem oócitos de baixa qualidade enquanto que maiores concentrações prejudicam oócitos de maior qualidade. Por fim, as alterações na produção embrionária devido à adição de ácido fólico parecem não estar relacionada com os níveis de expressão dos genes IGF2 e LIT1. / Among assisted reproductive Technologies (ARTs), in vitro production (IVP) of bovine embryos is the most studied, besides exist a great economic interest. However, there are many factors that negatively influences production rates and pregnancy success. It\'s know that embryos produced by ARTs frequently present epigenetics alterations, related, specially, to the microenvironment where occurs the development of gametes and embryos. Supplementation with folic acid seems to prevent these epigenetics damages, since it is an important component and may act like a methyl donor and has antioxidant action. Folic acid addition during oocitary maturation seems to positively influences embryos IVP, in addition there are evidences that it may alter DNA methylation levels and expression of important genes during embryo development. Thus, this paper had as objective; evaluate different concentrations of folic acid during in vitro maturation (IVM) of different bovine oocytes (Grade I and III) on the embryo production and expression of IGF2 and LIT1 gene in the bovine blastocyst. For this purpose, three different folic acid concentrations (10, 30, and 100µM) were evaluated during IVM, when 2159 oocytes (1087 grade I and 1072 grade III) were matured, fertilized and cultured during seven days. Blastocysts were evaluated for (1) production rates in different treatments and oocyte type and (2) expression of IGF2 and LIT1 was investigated using quantitative reverse transcription PCR. Statistical analysis was realized using student t test. Embryo production analysis revealed that addition of 10µM of folic acid positively influences production of embryos from oocytes grade III (p=0,017), whereas in embryos from oocytes grade I this influence wasn\'t observed. The second treatment showed that 30µM of folic acid didn\'t influence both embryos from oocytes grade I and embryos from oocytes grade III. On the other hand, addition of 100µM of folic acid damages the development of embryos provide from oocytes grade I (p=0,043), but this wasn\'t observed in embryos provide from oocytes grade III. When evaluated gene expression, IGF2 gene were expressed in 25% of all samples, being that, with exception of one sample, all of them were embryos from oocytes grade I. Despite LIT1 expression were detected in all samples, wasn\'t observed statistical difference between embryos whose oocytes were matured in the absence or presence of folic acid, independent of concentration added or oocytes types (grades I ou III). Folic acid addition during bovine oocytes maturation seems to be interesting to embryo IVP. However, folic acid concentration and oocyte quality seems to be important factors to embryo production, since lower concentration its beneficial for lower quality oocytes, while higher folic acid concentration damage better oocytes. Finally, embryos production rates alterations due folic acid addition appears to be unrelated with expression levels of IGF2 and LIT1.

A ineficiência dos protocolos de criopreservação limita o uso em larga escala da produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação e pelo cultivo embrionário de embriões bovinos produzidos in vitro após a descongelação, avaliando a morfologia, a expressão gênica e o desenvolvimento in vitro antes e após a criopreservação. Complexos cummulusoócitos foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=600) obtidos entre os dias 7 e 9 de cultivo (fecundação D0) foram submetidos a congelação controlada (grupo controlado: 10% de etileno glicol (EG) por 10 minutos, 1,2oC por minuto), congelação rápida (grupo rápido: 10% de EG por 10 minutos , 20% de EG + 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos) ou vitrificação (grupo vitrificação: 10% de EG por 10 minutos, 25% EG + 25% Gli por 30 segundos). Os embriões do grupo controle não foram expostos a crioprotetores e nem a protocolos de criopreservação, sendo avaliado o índice de eclosão 12 dias após a fecundação (46,09%). As palhetas para os protocolos de congelação rápida e vitrificação foram mantidas em vapor de nitrogênio líquido (0,8cm sobre o líquido) por 2 minutos e imersas no nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos em ar e 20 segundos em banhomaria a 25oC. Os embriões foram reidratados em solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de sacarose e em solução de PBS + 0,2% de BSA ambos por 3 minutos. Para avaliar o desenvolvimento, os embriões, após a descongelação, foram co-cultivados com células da granulosa em meio TCM199 ou SOFaa por 4 dias. Os dados foram analisados com o aplicativo PROC MIXED do programa SAS Sistems for Windows®. O grupo controlado apresentou índices de eclosão de 44,65% ± 5,94 e 11,65 ± 3,37 para o meio TCM199 e para o meio SOFaa, respectivamente. Embriões do grupo rápido não apresentaram eclosão, independente do meio de cultivo. O grupo vitrificação apresentou índices de eclosão de 9,43% ± 6,77 e 8,67% ± 4,47, respectivamente, em meio TCM199 e SOFaa. Os valores foram significativos quando p<0,05. O grupo controlado apresentou diferença em relação aos outros grupos em ambos os meios de cultivo. No meio TCM199 os índices de re-expansão e eclosão foram mais altos. Para a análise da expressão gênica, 2 pools de 10 blastocistos expandidos de embriões frescos e criopreservados (congelação controlada) foram utilizados para a extração de RNA. Foi feita reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) e de PCR em Tempo Real. Os resultados da reação de PCR em Tempo Real demonstraram que a quantidade de material não foi suficiente para a amplificação de produtos em todas as reações. Concluindo, o meio de cultivo TCM199 exerce influência sobre o desenvolvimento embrionário após a criopreservação, sendo mais apropriado do que o meio SOFaa. E, para proceder a análise da expressão gênica pela reação de PCR em Tempo Real é necessário número maior de blastocistos expandidos. / The inefficiency of embryo cryopreservation protocols limits the broad use of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The aim of this work was to identify the damage caused by cryopreservation and embryo culture of in vitro produced bovine embryos after thawing by morphological analysis, gene expression and in vitro development before and after cryopreservation. Cummulus-oocyte complexes were in vitro matured, fertilized and cultured. Expanded blastocysts (n= 600) harvested on days 7-9 were submitted controlled freezing [controlled group: 10% ethylene glycol (EG) for 10 minutes and 1.2oC per minute cryopreservation], quick-freezing [quick group: 10% EG for 10 minutes, 20% EG + 20% Glycerol (Gly) for 30 seconds] or vitrification [vitrification group: 10% EG for 10 minutes, 25% EG + 25% Gly for 30 seconds] protocols. The embryos of the control group were not exposed to cryoprotectant or crypreservation method and the hatching rate was evaluated on day12 post-insemination. The straws (quick and vitrification groups) were first placed on nitrogen vapor (0.8 cm over the liquid nitrogen) for 2 minutes and than immersed in liquid nitrogen. Embryos were thawed in air for 10 seconds followed by 25oC water bath for 20 seconds. Embryos were rehydrated in PBS + 0.2% BSA + 0.3M sucrose for 3 minutes and PBS + 0.2% BSA for the same time. In order to evaluate development of frozen-thawed embryos they were cocultured on granulosa cells in TCM 199 or SOFaa for 4 days. Hatching rate of control group was 46.09%. Data was analyzed by PROC MIXED model of SAS Sistems for Windows®. Controlled group hatching rate was 44.65% ± 5.94 and 11.65% ± 3.37 for TCM 199 and in SOFaa, respectively. Embryos submitted to quick group did not hatch regardless of culture condition. Vitrification group showed hatching rates of 9.43% ± 6.77 and 8.67% ± 4.47, respectively, in TCM 199 and SOFaa., and values were significant at p<0.05. The controlled group showed difference between the other groups of cryopreservation in both medium (TCM 199 and SOFaa). However, TCM 199 showed high rates of re-expansion and hatching. To gene expression analysis, 2 pools of 10 expanded blastocysts of fresh and cryopreserved embryos (controlled freezing) was used to RNA extraction, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) was done and submitted to a Real Time PCR. The results of the Real Time PCR showed that the amount of material was not enough to the amplification of products in all reactions. In conclusion, the culture medium influences the embryo development after the cryopreservation being TCM199 more appropriate than SOFaa. And more number of expanded blastocysts is necessary to analysis the gene expression in a Real Time PCR reaction.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA14MA159.pdf: 569478 bytes, checksum: ef21b44746ded4d4693eb2dc59f3084b (MD5) Previous issue date: 2014-12-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study evaluated the relationship of nelore breed donor infected with bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea with in vitro and in vivo embryos and effects on conception rate of embryo recipients. The experiment was conducted in the municipality of Boca do Acre - AM (2013 to 2014). 150 cows were used as donors of embryos, which were mated with one of the same breed bull, Nelore, after aspiration of donors and subsequent in vitro production of embryos were transferred in to receptors, free of all pathogens in question. Follicular fluid samples from all donors were individually collected and evaluated for the presence of bovine herpesvirus type 1 and bovine viral diarrhea by PCR (polymerase chain reaction). Analyzing the data, there was a prevalence of 14% (&#61539;2 = 77.76; p<0,001) of donor infected with BoHV-1 virus compared to the evaluated cows (21/150). There was not found to be significant difference in the average production of oocytes (positive = 20,48 (430/21); negative = 19,38 (2500/129) (evaluation by the Kruskal-Wallis Test, k=0,0214, p=0,8837) and embryos (positive =7,67 (161/21), negative = 9,05 (1168/129) (k = 1,5238, p=0,217), between donor. Assessing the rate of conception between the receiver (N = 1329) in which embryos were transferred (n=161) derived from donors positive or not (n=1168), to bovine herpesvirus type 1. The receptors that received embryos from positive cows had a rate of pregnancy of 39,13% (63/161), while those who received negative embryo donors, had a rate of 44,95% (525/1168) did not differ significantly from each other, (&#61539;2=1,417, p=0,1635). These results do not support the hypothesis that oocytes from donors infected with BoHV-1 present a minor in vitro embryo development and a lower pregnancy rate when transferred to the recipient embryo / Este estudo avaliou a relação de doadoras da raça nelore infectadas pelo herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e vírus da diarreia viral bovina com a produção in vitro e in vivo de embriões e efeitos sobre a taxa de concepção de receptoras de embriões. O experimento foi realizado no município de Boca do Acre - AM (2013 - 2014). Foram utilizadas 150 vacas doadoras de embriões, as quais foram acasaladas com um único touro da mesma raça, Nelore, após a aspiração folicular das doadoras e posterior produção in vitro dos embriões, estes foram transferidos em receptoras, sabidamente livre do patógeno em questão. Foram coletadas amostras de líquido folicular de todas as doadoras individualmente e avaliadas quanto a presença de BoHV-1 via PCR (reação da polimerase em cadeia). Analisando os dados, observou-se uma prevalência de 14% (&#61539;2=77,76; p<0,001) de doadoras portadoras do vírus do BoHV-1 em ralação as vacas avaliadas (21/150). Não foi encontrado diferença significativa na produção média de oócitos, (positivas=20,48 (430/21); negativas=19,38 (2500/129), (avaliação realizada pelo teste de Kruskal-Wallis Test, k=0,0214; p=0,8837) e de embriões (positivas=7,67 (161/21); negativas=9,05 (1168/129), (k=1,5238; p=0,217), entre as doadoras. Avaliando a taxa de concepção entre as receptoras (N=1329) nas quais foram transferidos embriões (n=161) oriundos de doadoras positivas ou não (n=1168), para BoHV-1. As receptoras que receberam embriões das vacas positivas tiveram uma taxa de prenhes de 39,13% (63/161), já as que receberam embriões de doadoras negativas, apresentaram uma taxa de 44,95% (525/1168), não diferindo significativamente entre si, (&#61539;2=1,9417, p=0,1635). Estes resultados não corroboram com a hipótese de que oócitos provenientes de doadoras infectadas pelo BoHV-1 apresentariam um menor desenvolvimento embrionário in vitro e uma menor taxa de prenhez quando da sua transferência para as receptoras de embriões

A ineficiência dos protocolos de criopreservação limita o uso em larga escala da produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação e pelo cultivo embrionário de embriões bovinos produzidos in vitro após a descongelação, avaliando a morfologia, a expressão gênica e o desenvolvimento in vitro antes e após a criopreservação. Complexos cummulusoócitos foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=600) obtidos entre os dias 7 e 9 de cultivo (fecundação D0) foram submetidos a congelação controlada (grupo controlado: 10% de etileno glicol (EG) por 10 minutos, 1,2oC por minuto), congelação rápida (grupo rápido: 10% de EG por 10 minutos , 20% de EG + 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos) ou vitrificação (grupo vitrificação: 10% de EG por 10 minutos, 25% EG + 25% Gli por 30 segundos). Os embriões do grupo controle não foram expostos a crioprotetores e nem a protocolos de criopreservação, sendo avaliado o índice de eclosão 12 dias após a fecundação (46,09%). As palhetas para os protocolos de congelação rápida e vitrificação foram mantidas em vapor de nitrogênio líquido (0,8cm sobre o líquido) por 2 minutos e imersas no nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos em ar e 20 segundos em banhomaria a 25oC. Os embriões foram reidratados em solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de sacarose e em solução de PBS + 0,2% de BSA ambos por 3 minutos. Para avaliar o desenvolvimento, os embriões, após a descongelação, foram co-cultivados com células da granulosa em meio TCM199 ou SOFaa por 4 dias. Os dados foram analisados com o aplicativo PROC MIXED do programa SAS Sistems for Windows®. O grupo controlado apresentou índices de eclosão de 44,65% ± 5,94 e 11,65 ± 3,37 para o meio TCM199 e para o meio SOFaa, respectivamente. Embriões do grupo rápido não apresentaram eclosão, independente do meio de cultivo. O grupo vitrificação apresentou índices de eclosão de 9,43% ± 6,77 e 8,67% ± 4,47, respectivamente, em meio TCM199 e SOFaa. Os valores foram significativos quando p<0,05. O grupo controlado apresentou diferença em relação aos outros grupos em ambos os meios de cultivo. No meio TCM199 os índices de re-expansão e eclosão foram mais altos. Para a análise da expressão gênica, 2 pools de 10 blastocistos expandidos de embriões frescos e criopreservados (congelação controlada) foram utilizados para a extração de RNA. Foi feita reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) e de PCR em Tempo Real. Os resultados da reação de PCR em Tempo Real demonstraram que a quantidade de material não foi suficiente para a amplificação de produtos em todas as reações. Concluindo, o meio de cultivo TCM199 exerce influência sobre o desenvolvimento embrionário após a criopreservação, sendo mais apropriado do que o meio SOFaa. E, para proceder a análise da expressão gênica pela reação de PCR em Tempo Real é necessário número maior de blastocistos expandidos. / The inefficiency of embryo cryopreservation protocols limits the broad use of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The aim of this work was to identify the damage caused by cryopreservation and embryo culture of in vitro produced bovine embryos after thawing by morphological analysis, gene expression and in vitro development before and after cryopreservation. Cummulus-oocyte complexes were in vitro matured, fertilized and cultured. Expanded blastocysts (n= 600) harvested on days 7-9 were submitted controlled freezing [controlled group: 10% ethylene glycol (EG) for 10 minutes and 1.2oC per minute cryopreservation], quick-freezing [quick group: 10% EG for 10 minutes, 20% EG + 20% Glycerol (Gly) for 30 seconds] or vitrification [vitrification group: 10% EG for 10 minutes, 25% EG + 25% Gly for 30 seconds] protocols. The embryos of the control group were not exposed to cryoprotectant or crypreservation method and the hatching rate was evaluated on day12 post-insemination. The straws (quick and vitrification groups) were first placed on nitrogen vapor (0.8 cm over the liquid nitrogen) for 2 minutes and than immersed in liquid nitrogen. Embryos were thawed in air for 10 seconds followed by 25oC water bath for 20 seconds. Embryos were rehydrated in PBS + 0.2% BSA + 0.3M sucrose for 3 minutes and PBS + 0.2% BSA for the same time. In order to evaluate development of frozen-thawed embryos they were cocultured on granulosa cells in TCM 199 or SOFaa for 4 days. Hatching rate of control group was 46.09%. Data was analyzed by PROC MIXED model of SAS Sistems for Windows®. Controlled group hatching rate was 44.65% ± 5.94 and 11.65% ± 3.37 for TCM 199 and in SOFaa, respectively. Embryos submitted to quick group did not hatch regardless of culture condition. Vitrification group showed hatching rates of 9.43% ± 6.77 and 8.67% ± 4.47, respectively, in TCM 199 and SOFaa., and values were significant at p<0.05. The controlled group showed difference between the other groups of cryopreservation in both medium (TCM 199 and SOFaa). However, TCM 199 showed high rates of re-expansion and hatching. To gene expression analysis, 2 pools of 10 expanded blastocysts of fresh and cryopreserved embryos (controlled freezing) was used to RNA extraction, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) was done and submitted to a Real Time PCR. The results of the Real Time PCR showed that the amount of material was not enough to the amplification of products in all reactions. In conclusion, the culture medium influences the embryo development after the cryopreservation being TCM199 more appropriate than SOFaa. And more number of expanded blastocysts is necessary to analysis the gene expression in a Real Time PCR reaction.

Dentre as tecnologias de reprodução assistida (TRAs), a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é a mais amplamente estudada, além de possuir um grande interesse econômico. Entretanto, existem fatores que influenciam negativamente a taxa de produção embrionária e o sucesso da gestação. Sabe-se que embriões provenientes das TRAs apresentam frequentemente alterações epigenéticas, relacionadas principalmente ao microambiente no qual os gametas e embriões se desenvolvem. A suplementação com ácido fólico parece prevenir tais erros epigenéticos, visto que além de ser um importante composto vitamínico, ele pode atuar como doador de grupamentos metil e possui ação antioxidante. A adição de ácido fólico durante a maturação oocitária parece influenciar positivamente a PIVE, além de existir evidências de que ele possa alterar os níveis de metilação do DNA e a expressão de genes importantes ao desenvolvimento embrionário. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo, avaliar a influência de diferentes concentrações de ácido fólico durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos de diferentes qualidades (graus I e III) na produção embrionária e na expressão dos genes IGF2 e LIT1 em blastocistos bovinos. Para tanto, três diferentes concentrações de ácido fólico (10, 30 e 100µM) foram avaliadas durante a MIV, em que 2159 oócitos (1087 oócitos grau I e 1072 oócitos grau III) foram maturados, fertilizados e cultivados por sete dias. Os blastocistos foram avaliados quanto à (1) taxa de produção nos diferentes tratamentos e origem dos oócitos e (2) a expressão dos genes IGF2 e LIT1 foi investigada utilizando a transcrição reversa associada a PCR quantitativa. A análise estatística foi realizada através do teste t de Student. A avaliação da produção embrionária mostrou que a adição de 10µM de ácido fólico influencia positivamente a produção de embriões provenientes de oócitos grau III (p=0,017), enquanto em embriões provenientes de oócitos grau III não foi observada influência. O segundo tratamento mostrou que a adição de 30µM de ácido fólico parece não influenciar tanto embriões provenientes de oócitos grau I quanto grau III. Por outro lado, a adição de 100µM de ácido fólico prejudica o desenvolvimento de embriões provenientes de oócitos grau I (p=0,043), mas parece não influenciar os embriões provenientes de oócitos grau III. Quando avaliada a expressão gênica, o gene IGF2 foi expresso em 25% das amostras, sendo que, com exceção de uma amostra, todas eram provenientes de oócitos grau I. Apesar do gene LIT1 ser expresso em todas as amostras analisadas, não foram observadas diferenças entre os embriões cujos oócitos foram maturados na ausência ou na presença de ácido fólico, independente da concentração adicionada ou origem oocitária (graus I ou III). A adição de ácido fólico durante a maturação de oócitos bovinos parece ser interessante para a PIVE. No entanto, a concentração e a qualidade oocitária parecem ser fatores importantes para a produção embrionária, visto que menores concentrações favorecem oócitos de baixa qualidade enquanto que maiores concentrações prejudicam oócitos de maior qualidade. Por fim, as alterações na produção embrionária devido à adição de ácido fólico parecem não estar relacionada com os níveis de expressão dos genes IGF2 e LIT1. / Among assisted reproductive Technologies (ARTs), in vitro production (IVP) of bovine embryos is the most studied, besides exist a great economic interest. However, there are many factors that negatively influences production rates and pregnancy success. It\'s know that embryos produced by ARTs frequently present epigenetics alterations, related, specially, to the microenvironment where occurs the development of gametes and embryos. Supplementation with folic acid seems to prevent these epigenetics damages, since it is an important component and may act like a methyl donor and has antioxidant action. Folic acid addition during oocitary maturation seems to positively influences embryos IVP, in addition there are evidences that it may alter DNA methylation levels and expression of important genes during embryo development. Thus, this paper had as objective; evaluate different concentrations of folic acid during in vitro maturation (IVM) of different bovine oocytes (Grade I and III) on the embryo production and expression of IGF2 and LIT1 gene in the bovine blastocyst. For this purpose, three different folic acid concentrations (10, 30, and 100µM) were evaluated during IVM, when 2159 oocytes (1087 grade I and 1072 grade III) were matured, fertilized and cultured during seven days. Blastocysts were evaluated for (1) production rates in different treatments and oocyte type and (2) expression of IGF2 and LIT1 was investigated using quantitative reverse transcription PCR. Statistical analysis was realized using student t test. Embryo production analysis revealed that addition of 10µM of folic acid positively influences production of embryos from oocytes grade III (p=0,017), whereas in embryos from oocytes grade I this influence wasn\'t observed. The second treatment showed that 30µM of folic acid didn\'t influence both embryos from oocytes grade I and embryos from oocytes grade III. On the other hand, addition of 100µM of folic acid damages the development of embryos provide from oocytes grade I (p=0,043), but this wasn\'t observed in embryos provide from oocytes grade III. When evaluated gene expression, IGF2 gene were expressed in 25% of all samples, being that, with exception of one sample, all of them were embryos from oocytes grade I. Despite LIT1 expression were detected in all samples, wasn\'t observed statistical difference between embryos whose oocytes were matured in the absence or presence of folic acid, independent of concentration added or oocytes types (grades I ou III). Folic acid addition during bovine oocytes maturation seems to be interesting to embryo IVP. However, folic acid concentration and oocyte quality seems to be important factors to embryo production, since lower concentration its beneficial for lower quality oocytes, while higher folic acid concentration damage better oocytes. Finally, embryos production rates alterations due folic acid addition appears to be unrelated with expression levels of IGF2 and LIT1.

Os programas de melhoramento genético objetivam a seleção de animais geneticamente e fenotipicamente superiores. Dentre as características selecionadas para aumentar o ganho genético do rebanho, o perímetro escrotal destaca-se por sua alta herdabilidade e correlação com precocidade sexual, peso do animal e morfologia espermática. A seleção fenotípica para perímetro escrotal pode ser auxiliada pela junção da DEP PE 365 (diferença esperada na progênie para perímetro escrotal aos 365 dias) com a biotecnologia reprodutiva PIVE (produção in vitro de embriões), e tecnologias moleculares como o uso de marcadores do tipo SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) e marcadores bioquímicos (proteínas). Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo: verificar se os SNPs presentes nos genes atuantes na maturação sexual B4GALT1 (Beta 1,4- galactosyltransferase), FSHR (Follicle-stimulating hormone), LHR (Luteinizing hormone receptor) e IGF2 (Insulin-like growth factor 2) podem estar associados a maiores valores de DEP PE 365 em touros da raça Nelore; fazer o estudo global de proteínas no sêmen de touros da raça Nelore que possam ser indicativas de maior DEP PE 365 e verificar se a DEP PE 365 interfere negativamente ou positivamente nos resultados da PIVE. Para as análises de SNP, 178 touros foram divididos em dois grupos, sendo um com 104 animais de DEP PE 365 negativa e outro com 74 animais com DEP positiva. O DNA foi extraído do sangue destes animais e a região genômica de interesse foi amplificada e analisada por RFLP (restriction fragment lengh polymorphism). No caso da proteômica, dois pools de sêmen foram comparados entre si quanto aos seus perfis protéicos por LCMS (Liquid chromatographymass spectrometry): um proveninete de três touros que produzem em média 17,6% de embriões/oócito in vitro e DEP PE 365 média de -0,3 (inferiores) e outro pool proveniente de três touros que produzem em média 34,25% de embriões/oócito, com DEP PE 365 média de 1,07 (superiores). Para verificar se a DEP PE 365 de touros utilizados na PIVE influencia na quantidade e cinética de embriões produzidos, 48 touros foram divididos em três grupos (superior, neutro e inferior) por meio da amplitude total de suas DEPs PE 365 e então utilizados na PIVE. Então, observou-se a quantidade e os tipos de blastocistos gerados por cada um dos grupos. Os resultados do presente trabalho mostraram: o genótipo CC no SNP analisado no gene LHR, e o genótipo TT no SNP analisado no gene IGF2 podem estar relacionados a animais de maiores DEP PE 365 (p 0.05); proteínas envolvidas em vias metabólicas foram predominantes no grupo dos touros superiores e portanto podem ser prováveis marcadores bioquímicos de reprodutores com maiores DEP PE 365; touros com maiores DEPs PE 365 resultam na maior PIV de embriões favoráveis para serem transferidos para vacas receptoras (Bl e Bx; blastocisto e blastocisto expandido; p 0.05). Tais resultados apresentam informações que podem auxiliar na seleção de animais com melhores dados fenotípicos de DEP PE 365 e, portanto, melhores reprodutores. / The breeding programs aim the selection of phenotypically and genetically superior animals . Among the selected characteristics to increase genetic gain in the herd, scrotal circumference stands out for its high heritability and correlation with sexual precocity, animal weight and morphology . Phenotypic selection for scrotal circumference may be aided by the addition of EPD SC 365 (expected progeny difference for scrotal circumference at 365 days ) to IVPE (in vitro production of embryos) reproductive biotechnology and molecular technologies such as the use of molecular markers like SNPs (Single Nucleotide Polymorphism ) and biochemical markers (proteins). Thus, this study aimed to: determine whether the SNPs present in genes B4GALT1 (Beta 1,4 - galactosyltransferase), FSHR (Follicle - stimulating hormone), LHR (Luteinizing hormone receptor) and IGF2 (Insulin- like growth factor 2) may be associated with higher values of EPD SC 365 in Nelore bulls; make global study of proteins in semen from Nelore bulls that may be indicative of greater EPD SC 365 and check if EPD SC 365 interferes negatively or positively on the results of IVPE. For the analysis of SNP, 178 bulls were divided into two groups, one with 104 animals of 365 negative EPD SC 365 and another with 74 animals with positive EPD SC 365. DNA was extracted from blood of these animals and genomic region of interest was amplified and analyzed by RFLP (restriction fragment polymorphism lengh). In the case of proteomics, two pools of semen were compared in respect to their protein profiles by LCMS (Liquid chromatography - mass spectrometry): One from three bulls that produce on average 17.6 % of in vitro embryo/oocyte and with EPD SC 365 average -0.3 (lower) and another pool from three bulls that produce on average 34.25% of in vitro embryo/oocyte with EPD SC 365 average of 1.07 (upper). To check if EPD SC 365 bulls used in IVPE influences the amount and kinetics of embryos, 48 bulls were divided into three groups (upper, lower and neutral ) through the full range of their EPDs SC 365 and then used in IVPE. Then, it was observed the amount and types of blastocysts generated by each group. The results of this study showed: the CC genotype at SNP analyzed in LHR gene, and the TT genotype at SNP analyzed in the IGF2 gene may be related to larger EPD SC 365 animals (p 0.05); proteins involved in metabolic pathways were predominant in group of senior bulls and can therefore be likely biochemical markers of breeding with larger EPD SC 365; bulls with larger EPD SC 365 used in IVPE result in greater favor of embryos to be transferred to recipient cows (Bl and Bx; blastocyst and expanded blastocyst, p 0:05). These results provide information that can assist in the selection of animals with improved phenotypic data EPS SC 365 and, therefore, the best breeders.

Um dos grandes problemas que afetam a produção in vitro de embriões é a variação entre touros em relação à fertilidade e o maior nascimento de embriões do sexo masculino. Muitos fatores podem alterar a razão de 1:1 entre os gêneros tanto na produção in vitro de embriões, como no método de Inseminação Artificial. No sentido de tentar alterar esta proporção sexual in vitro, estudamos em um primeiro momento, a variação entre touros no desenvolvimento de embriões machos e fêmeas, distribuídos nas fases de blastocisto jovem, blastocisto, blastocisto expandido e blastocisto eclodido, bem como, a proporção macho: fêmea em relação a fase do blastocisto. Para tanto, oócitos foram coletados de ovários oriundos de matadouro e maturados em meio de maturação em incubadora por 24h. Espermatozóides viáveis de 17 touros do Programa de Melhoramento Genético da Raça Nelore, obtidos por centrifugação em gradiente de Percoll, foram utilizados para Fecundação in vitro. Após 12h, os supostos zigotos foram cultivados em meio de cultivo e células do cumulus em incubadora. Ao sétimo dia após a fertilização in vitro foi feita a seleção dos blastocistos viáveis que foram sexados com a utilização de primers Y-específico bovino e autossômico bovino, com visualização dos fragmentos amplificados em gel de agarose. Posteriormente, para obtenção de maior conhecimento a respeito dos animais testados, coletamos dados de progênie a campo destes animais e verificamos a proporção sexual de seus filhos nascidos pelo método da inseminação artificial, monta natural e possíveis correlações com características quantitativas. Diferenças entre touros foram observadas em relação à proporção dos sexos para as fases de blastocisto inicial e blastocisto expandido. Não foi observado desvio da proporção sexual em relação ao touro utilizado na produção in vitro de embriões e progênie a campo. Nosso dados sugerem que é possível alterar a proporção macho:fêmea em sistemas de produção in vitro de embriões pela seleção do estágio do blastocisto para transferência, e ainda, sugerem que touros apresentam variação em relação ao desenvolvimento in vitro de embriões machos e fêmeas de acordo com o estágio do blastocisto. / Some of the main problems that affect the in vitro production of embryos is the variation among bulls in relation to fertility and the greater birth of male embryos. Many factors can change the ratio 1:1 between the genders, both in the in vitro production of embryos and in the method of artificial insemination. To try to change this sex ratio in vitro, we studied at first, the variation among bulls in the development of female and male embryos, the blastocyst-stage distributed in young blastocyst, blastocyst, expanded blastocyst and hatched blastocyst and the proportion male: female in relation to the blastocyst stage. For this, oocytes were collected from slaughterhouse ovaries and matured in maturation medium in an incubator for 24h. Viable sperm from 17 bulls belonging to the Breeding Program of Nellore, obtained by Percoll gradient centrifugation were used for in vitro fertilization. After 12 hours, the presumptive zygotes were cultured in culture medium and cumulus cells in an incubator. After 168 hours of in vitro fertilization the viable embryos in the blastocyst stage were classified. The determination of the sex of the blastocysts was performed by Polymerase Chain Reaction (PCR) using a Y-specific sequence and bovine autosomal sequence visualized in agarose gel. Data analysis was conducted using the Statistical Analysis System software. Later, to obtain more knowledge about the animals tested, data was collected from the field progeny of these animals and established the sex ratio of the offspring produced by the method of artificial insemination, natural mating and possible correlations with quantitative traits. Differences between bulls were observed relating to the proportion of genders at the initial stages of blastocyst and expanded blastocyst. No deviation was observed in the sex ratio in relation to the bull used for in vitro production of embryos and offspring in the field. Our data suggest that it is possible to change the male to female proportion in production systems of in vitro embryos through the selection of the blastocyst stage for transfer, and also suggest that bulls show variation in relation to the in vitro development of male and female embryos, depending on the blastocyst stage.