Tierärztl. Hochsch., Diss., 2003--Hannover.

Universiẗat, Diss., 2005--Bonn.

Thesis (Ph. D.)--Faculty of Veterinary Science, University of Sydney, 2005. / Title from title screen (viewed 13 January 2009). Degree awarded 2005; thesis submitted 2004. Submitted in fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy to the Faculty of Veterinary Science. Includes bibliographical references. Also available in print form.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-01Bitstream added on 2014-08-13T18:01:04Z : No. of bitstreams: 1 000740552_20150801.pdf: 754242 bytes, checksum: bc5e88cf87d7787c34d18c1a6e215275 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:20:57Z: 000740552_20150801.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:17Z : No. of bitstreams: 1 000740552.pdf: 1359921 bytes, checksum: 8d035cb78ff5afaa9c1f0d1ef3b02d72 (MD5) / O fator de crescimento dos fibroblastos 8 (FGF8) é expresso pelo oócito bovino, ativa os receptores expressos por células do cumulus e oócitos, e está envolvido na regulação da glicólise e meiose no CCO de murinos. O primeiro objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do FGF8 sobre a expansão das células do cumulus, a progressão da meiose e metabolismo energético em CCOs bovinos submetidos à MIV. Uma vez que foram observadas influências sobre a progressão da meiose e no metabolismo energético, os efeitos de FGF8 sobre a abundância de genes que codificam o RNAm que controlam estes processos foram avaliados. O FGF8 não afetou a expansão do cumulus, mas diminuiu a porcentagem de oócitos que alcançaram a metáfase II, consequentemente houve o aumento da porcentagem de oócitos na metáfase I. Tal efeito foi associado com um efeito inibitório do FGF8 sobre os níveis de RNAm que codifica a Ciclina B1 no oócito. Em contraste com os achados anteriores em murinos, o FGF8 leva à diminuição dos níveis de RNAm de NPR2 nas células do cumulus. O FGF8 tende a diminuir a absorção de glicose e produção de lactato, que foi acompanhada por uma redução significativa nos níveis de RNAm para PFKP em células de cumulus. O FGF8 também tende a diminuir a expressão de RNAm para o LDHA, mas não alterou os níveis de RNAm para GLUT1, GLUT4 e PDHA1 nas células do cumulus, enquanto que aumentou a expressão de RNAm para o PDHA1 no oócito. Este estudo apresenta evidências de que o FGF8 pode retardar a progressão da meiose durante a MIV em bovinos por meio de mecanismos que envolvam redução da expressão de Ciclina B1. Além disso, novamente em contraste com estudos em ratos, os dados sugerem um efeito inibidor modesto de FGF8 sobre o metabolismo glicolítico das células do cumulus durante a maturação in vitro de bovinos / Fibroblast growth factor 8 (FGF8) is expressed by the bovine oocyte, activate receptors expressed by cumulus cells and oocytes, and is involved in the regulation of glycolysis and meiosis in the murine COC. The first aim of this study was to assess the effects of FGF8 on cumulus expansion, meiosis progression and energy metabolism in bovine COCs submitted to IVM. Then, once influences on meiosis progression and energy metabolism were observed, effects of FGF8 on abundance of mRNA encoding genes that control these processes were assessed. FGF8 did not affect cumulus expansion but decreased the percentage of oocytes reaching metaphase II, while increasing the percentage of oocytes in metaphase I. This was associated with an inhibitory effect of FGF8 on levels of mRNA encoding Cyclin B1 in the oocyte. In contrast with previous findings in mice, FGF8 decreased mRNA levels of NPR2 in cumulus cells. FGF8 tended to decrease glucose uptake and lactate production, which was accompanied by a significant reduction in PFKP mRNA abundance in cumulus cells. FGF8 also tended to decrease LDHA mRNA expression, but did not change GLUT1, GLUT4 and PDHA1 mRNA levels in cumulus cells, while it increased PDHA1 mRNA abundance in the oocyte. This study presents novel evidence that FGF8 can slow meiosis progression during IVM in cattle through mechanisms involving reduction of Cyclin B1 expression

Orientador: Eunice Oba / Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Otavio Mitio Ohashi / Banca: Marcelo Marcondes Seneda / Banca: Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpção / Resumo: Pesquisadores do mundo inteiro têm investigado a função de fatores e eventos biológicos envolvidos na foliculogênese e no processo de maturação ovocitária in vitro em várias espécies, com o intuito de aprimorar tecnologias de produção e manipulação de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar: a morfometria ovariana; os aspectos morfométricos e ultra-estruturais dos folículos ovarianos; os fatores que influenciam a recuperação, qualidade ovocitária e taxas de maturação nuclear in vitro; as concentrações de progesterona e insulina plasmáticas e os níveis de hormônios esteróides (estradiol e progesterona) e IGF-I no líquido folicular, em búfalas e vacas. Amostras de sangue e os ovários de 86 búfalas (33 gestantes e 53 não gestantes) e de 95 vacas (36 gestantes e 59 não gestantes) foram colhidos em abatedouros. Os ovários foram transportados ao laboratório em solução salina acrescida de penicilina e estreptomicina a 36ºC. As dimensões ovarianas foram mensuradas com o auxílio de paquímetro e balança digitais. Para a maturação ovocitária in vitro, os complexos cumulus oophorus (CCOs) foram recuperados por aspiração folicular, selecionados e cultivados em meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino, piruvato de sódio, FSH, LH, estradiol, cisteamina e gentamicina, por 22 a 24 horas, a uma temperatura de 38,5ºC, em atmosfera úmida com 5% de CO2 em ar. Para as técnicas de histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão foram processados 10 e 5 ovários de cada espécie, respectivamente. As concentrações de progesterona, insulina, estradiol e IGF-I nas amostras de sangue e fluido folicular foram determinadas por procedimento de radioimunoensaio, utilizando-se kits comerciais. Na análise histológica, verificou-se ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Researchers around the world have investigated the function of biological factors and events during folliculogenisis and in the process of in vitro maturation of oocytes in several species in order to improve technologies of embryo production and manipulation. The aim of the present study was to evaluate: ovarian morphometry; morphological and ultrastructural aspects of ovarian follicles; factors affecting the recovery and competence of oocytes and in vitro nuclear maturation; plasma progesterone and insulin concentrations; progesterone, estradiol and IGF-I in follicular fluid, in bubaline and bovine species. Blood samples and ovaries of 86 buffaloes (33 pregnant and 53 non pregnant) and 95 cows (36 pregnant and 59 non pregnant) were collected at slaughterhouses. The ovaries were transported to the laboratory in saline solution enriched with penicillin and streptomycin at 36ºC. The ovarian dimensions were measured using digital paquimeter and balance. For in vitro maturation process, cumulus-oocyte complexes (COCs) were recovered by follicular aspiration, selected and matured in TCM 199 supplemented with 10% fetal calf serum, sodium pyruvate, LH, FSH, estradiol, gentamicin and cysteamin. In vitro maturation was carried out at 38.5ºC under a controlled gas atmosphere of 5% CO2 in humidified air for 22-24 hours. For classical histology and transmission electron microscopy, 10 and 5 ovaries of each species respectively were processed. Progesterone, insulin, estradiol and IGF-I concentrations of blood and follicular fluid were determined by use of radioimmunoassay and commercial kits. In histological evaluation, the diameters of follicles and oocytes increased according to follicular development. Ultrastructural characterization of bubaline and bovine ovarian follicles showed a differentiated cell apparatus for substrate metabolization, ...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Mestre em Ciências Veterinárias / Os efeitos benéficos da adubação com silício (Si) têm sido observados em várias espécies vegetais, especialmente quando estas são submetidas a estresse, seja ele biótico ou abiótico. Aumentos de produtividade e resistência a pragas e doenças estão entre os principais benefícios do Si para as plantas que o absorvem e o acumulam na parte aérea, uma das possíveis razões para maior adaptabilidade e resistência do capim braquiária nas áreas de acidez e baixa fertilidade do solo das regiões do cerrado brasileiro. Objetivou-se avaliar o efeito da adubação superficial com silicato e calcário sobre algumas características químicas do solo; concentração de Si na folha, produção de matéria seca, composição bromatológica, produção de gases e degradabilidade ruminal in vitro da gramínea Brachiaria decumbens. Para tal foi utilizado o delineamento em blocos casualizado, com cinco doses de silicato: 0, 880, 1320, 1760 e 2640 kg.ha-1 e uma dose de 1760 kg.ha-1 de calcário, aplicados superficialmente com leve incorporação em pastagem de Brachiaria decumbens na região do Triângulo Mineiro. Foram realizados cinco cortes na parte aérea da braquiária aos 45, 75, 103, 166 e 382 dias após a instalação do experimento, sendo analisadas as variáveis: matéria seca, concentração de Si foliar e Si acumulado na parte aérea. O material proveniente do terceiro corte foi usado nas avaliações bromatológicas, de produção de gases e degradabilidade ruminal in vitro. Procederam-se também duas amostragens de solo nas profundidades de 0-10, 10-20 e 20-40 cm aos 5 e 12 meses após a implantação do experimento, para avaliar o pH (CaCl2), Ca, Mg e Si no solo. Os resultados demonstraram que o silicato não afetou a produção de matéria seca, porém aumentou as concentrações de Si na parte aérea da planta, comprovando ser a Brachiaria decumbens uma espécie acumuladora de Si. O silicato também elevou os teores de Si e Ca no solo, entretanto o mesmo não se mostrou significativo para os valores de pH e Mg no solo. Com relação à comparação entre o silicato e o calcário este não apresentou diferenças entre as médias estudadas, tanto na análise das variáveis relacionadas ao solo como à parte aérea da braquiária. Não houve efeito da concentração de Si na folha sobre a composição bromatológica, a não ser na fração mineral do material estudado. A presença do Si em altas concentrações na folha da gramínea Brachiaria decumbens (12,7 g.kg-1 na dose testemunha e 16,0 g.kg-1 na dose de 2640 kg.ha-1 de silicato) não afetou a cinética de fermentação na produção de gases ou sua degradabilidade ruminal in vitro.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002-03Bitstream added on 2014-06-13T19:16:47Z : No. of bitstreams: 1 tofoli_jg_me_botfca.pdf: 325404 bytes, checksum: 21b23979c734273014381947d0594a68 (MD5) / O presente trabalho visou verificar a ação “in vitro” e “in vivo” de alguns fungicidas e do indutor de resistência acibenzolar-S-methyl (BTH) no controle da pinta preta do tomateiro e seus reflexos na produção. A ação “in vitro” de fungicidas, nas concentrações de 0, 1, 10 e 100 μgmL-1 do ingrediente ativo, foi verificada com base no crescimento micelial, germinação de conídios e efeito anti-esporulante sobre A. solani. Em condições de casa de vegetação foram estudadas as ações: preventiva, residual e curativa de fungicidas em cultivares com diferentes níveis de resistência a pinta preta. Em experimentos de campo, realizados nos municípios paulistas de Sumaré (1999), Socorro (2000) e Bragança Paulista (2000 e 2001), foi avaliada a ação de diferentes grupos fungicidas e acibenzolar-S-methyl (isolado, em mistura com fungicidas e em programas de aplicação) sobre: a severidade da doença (folíolos e hastes); redução de área foliar; incidência de frutos sadios; doentes e danificados pelo sol; massa fresca de frutos sadios, produção em kilos por 10 plantas e porcentagem de frutos grandes, médios e pequenos (Bragança Paulista, 2001). Todos os fungicidas apresentaram ação positiva e diferenciada para todos os parâmetros avaliados, em função das características inerentes de cada princípio ativo. Os maiores potenciais de controle foram verificados para os fungicidas com maior especificidade e ação sistêmica... . / The aim of this study was to verify the “in-vitro” and in-vivo effectiveness of various fungicides and plant activator acibenzolar-S-methyl (BTH) in the control of tomato early blight and its effects on yield. The in-vitro effect of the fungicides, in the concentrations 0, 1, 10 and 100 μgmL-1 of the active ingredient, was assessed based on mycelial growth, conidial germination, and the antisporulating effect on A. solani. The various groups of fungicides were studied to compare their preventative, residual and curative efficacy, in greenhouse environment. Field tests were conducted in the state of São Paulo, Brazil, in the countries of Sumaré (1999), Socorro (2000) and Bragança Paulista (2000 and 2001), to compare the effect of various fungicide groups and acibenzolar-S-methyl (alone, mixed with the fungicides, or applied in conjunction with fungicidal treatments) on various parameters: the severity of the disease (leaflets and stems); percentage of leaf drop; relative numbers of healthy fruit as compared to diseased or sun-damaged fruit; yield in kg per 10 plants; and the relative percentages of large, medium and small-sized fruits (Bragança Paulista, 2001). All the fungicides presented a positive effect on all of the parameters evaluated, consistent with the active ingredients of each. The greatest efficacies of control were shown by systemic, more-specific fungicides. In regard to mycelial growth and conidial germination, the greatest inhibition percentages were obtained with metconazole, tebuconazole, difenoconazole, iprodione, cyprodinil, procymidone, prochloraz, fluazinam and pyrimethanil. The fungicides kresoxim methyl, azoxystrobin, pyraclostrobin+methiram, fenamidone+chlorothalonil and famoxadone+mancozeb presented an intermediate degree of inhibition on the mycelial growth and complete inhibition of conidial germination at concentrations of 1 μgmL-1 and above... (Complete abstract, click electronic address below).

Marek’s disease (MD) is a highly infectious economically important oncogenic viral disease of chickens. It is found throughout the world and is caused by an alphaherpesvirus, Marek’s disease virus (MDV). Though this disease can currently be successfully controlled by vaccination, the virus has continuously evolved to greater virulence over the last several decades. Hence, there is a need for alternative approaches to control MD. Selection and breeding of MD-resistant chickens presents an attractive option for prevention of this disease. MHC-congenic chicken inbred lines, 61 and 72, which are highly resistant and susceptible to MD, respectively, have been identified, but the cellular and genetic basis for these phenotypes is unknown. The overall aim of this study was to investigate the cellular basis of resistance to MD using an in vitro MDV infection model with the hypothesis that resistance is exerted by the innate immune cells. MDV is a highly cell-associated virus which makes in vitro studies difficult. In vivo, MDV infects APCs (antigen-presenting cells: macrophages and/or dendritic cells [DCs]), B cells and activated T cells. Though both B and T cells can be infected in vitro, co-culture infection models have not been described for APCs. Thus, the primary goal was to develop a model for infecting these cells with MDV in vitro and to characterise infected and uninfected cells. Developmental studies used APCs derived from outbred chickens. Chicken bone marrow cells were cultured with chCSF-1 (for macrophages) or chIL-4 and chCSF-2 (for DCs) for 4 days and then infected by the addition of chicken embryo fibroblasts (CEFs) infected with recombinant MDV expressing GFP. CEF preparations naturally contain a mixture of CEFs (92-98%) and macrophages (2-8%) and both appear to be infectable with MDV. Infected CEFs were therefore separated from infected macrophages by FACS before adding to the bone marrow-derived APCs. Infected and uninfected APCs were sorted by FACS using GFP expression and APC-specific mAb staining (KUL01 and anti-CD45). Characteristic virus-infected and uninfected APCs were revealed via examination with live cell confocal microscopy. The presence of herpesvirus specific immediate early (ICP4), early (pp38), late (gB) transcripts and MDV specific transcript, L-Meq, in infected APCs was confirmed by RT-PCR providing evidence for MDV replication. Hence, a new in vitro MDV infection model of APCs has been established. Using the infected macrophages to infect CEFs showed that the infection was productive. This model was then extended to infect APCs of lines 61 and 72. Flow cytometric analysis revealed that a higher percentage of macrophages were infected in the susceptible line (72) than in the resistant line (61). To analyse this in detail, RNA-Seq was carried out to identify differentially expressed (DE) genes between the two lines pre- and post-MDV infection. From these DE genes, potential candidate genes involved in MD resistance and susceptibility were identified. Functional analysis of DE genes support the hypothesis that resistance to MD is determined at the macrophage level of the resistant line (61) and the JAK-STAT signalling pathway is at least one anti-viral mechanism by which this signature is expressed.

Este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar a eficácia de duas temperaturas (370 C e 390 C) e três intervalos de tempo (48, 72 e 96h) comumente usados na maturação in vitro (MIV) de ovócitos caninos, 2) verificar o efeito de hormônios heterólogos: hormônio folículo estimulante (FSH) 0,5µg/ml, estradiol 20µg/ml e somatotropina humana (hST) 1µg/ml; e o efeito de proteínas: 0,4 % albumina sérica bovina (BSA), 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), e 10 % soro de cadela em estro inativado (SCE) na maturação nuclear de ovócitos caninos, 3) observar a influência da condição reprodutiva das doadoras de ovários (folicular, diestro, anestro, piometra, e prenhez) sobre os índices de maturação in vitro ovocitária, 4) verificar a habilidade para fecundação in vitro de ovócitos coletados de fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral, previamente maturados in vitro e adicionalmente, examinar sua capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM-199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v) com 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 1 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH e 0,03 UI/ml de hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento não mostraram diferença estatística no índice de meiose de ovócitos maturados à 37oC ou à 39oC em quaisquer dos intervalos testados (48, 72, 96 horas), embora a proporção de ovócitos que alcançaram metáfase II a 37oC após 72 horas da maturação in vitro, mostrasse uma tendência estatística à significância (p = 0,064), quando comparada àquela dos ovócitos maturados à 39oC. Foi concluído que temperaturas de 37oC e 39oC são similares para maturação in vitro de ovócitos de cadelas. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,05) de retomada da meiose após 72 horas de maturação in vitro foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 0,4 % de BSA. Uma influência positiva sobre a aquisição de metáfase II (MII) foi observada com a suplementação de 1µg/ml de hST no meio de maturação. Ao contrário, ovócitos maturados em TCM 199 com 10 % de soro de cadela em estro não se desenvolveram até o estádio de MII. Os resultados deste experimento mostraram que a suplementação de proteínas e de hormônios ao TCM-199 não facilitam as etapas finais da maturação in vitro de ovócitos de cadelas.No terceiro experimento, os resultados de maturação dos ovócitos não mostraram diferença estatística na progressão do material nuclear até o estádio de MII entre os ovócitos provenientes de cadelas em várias condições reprodutivas (fase folicular: 5,4 %; diestro: 4,2 %; anestro: 4,4 %; piometra: 8,1 % e prenhez: 4,7 %). A retomada da meiose mostrou índices de 24,6 % na fase folicular, 19,6 % no diestro, 16,4 % no anestro, 37,1 % na piometra e 29,2 % na prenhez. Índices positivos e mais elevados de resíduo acima do valor esperado foram observados para as condições de piometra e de prenhez nos estádios de metáfase/anáfase I (MI/AI). Nossos resultados indicam que a maturação nuclear in vitro de ovócitos caninos não é influenciada pela condição reprodutiva in vivo da fêmea no momento da coleta ovariana. No experimento de fecundação in vitro (FIV), 888 ovócitos selecionados através de sua qualidade morfológica superior foram distribuídos em 3 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral da doadora em: a) folicular, b) anestro, c) luteal . Após período de 48 horas de maturação a 37oC em TCM 199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v), com 10 % soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 20 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH, 0,03 UI/ml hCG e 1 µg/ml de hST, os ovócitos eram fecundados in vitro (2x106 espermatozóides/ml) por um período de 24 horas. A percentagem de ovócitos nucleados desenvolvendo-se em embriões foi de 10,1 % (27/ 267). O índice de clivagem (2-8 células) após cinco dias da FIV foi similar nas fases reprodutivas (folicular, anestro, e luteal). Contudo, o índice geral de fecundação foi superior nos ovócitos oriundos de cadelas nos estágios folicular (42,4 %) e anestro do ciclo (34,3 %) comparativamente àqueles provenientes da fase luteal (18,6 %) (p < 0,001). Além disso, foi verificada influência da fase folicular sobre o desenvolvimento de pronúcleos, com os índices nesta fase (24,2 %) sendo estatisticamente diferentes daqueles observados no anestro e na fase luteal (9,6 % e 3,7 %, respectivamente) (p < 0,004). Não foi estabelecida correlação entre a proporção de espermatozóides capacitados ou com reação acrossômica e formação pronuclear e/ou percentagem de clivagem. Em resumo, conclui-se que: a) ovócitos caninos podem ser maturados in vitro de forma similar às temperaturas de 39oC e 37o. b) a adição de hormônios (FSH, estradiol, hST) e proteínas (BSA, SVE, SCE) ao meio TCM 199 não eleva os índices de maturação nuclear até o estádio de MII de ovócitos caninos maturados in vitro. c) em cães, a seleção de ovócitos com base na coleta dentro de um estágio específico do ciclo estral não deve ser usada para prever índices de meiose ou habilidade para desenvolvimento embrionário in vitro. d) ovócitos caninos maturados, fecundados e cultivados in vitro podem se desenvolver a zigotos com até 8 células.

Las células dendríticas (DCs) cumplen un rol fundamental en la ejecución y regulación de la respuesta inmune. En los últimos años su producción in vitro se ha convertido en una herramienta de gran utilidad en inmunología. En tanto, los retinoides son moléculas que han mostrado participar en procesos de diferenciación celular en diversos tejidos, siendo producidos por una variedad de células, incluidas las DCs. Se ha descrito que miembros de la familia de las aldehído deshidrogenasas (ALDH), son responsables de catalizar la oxidación irreversible de retinoides tales como el retinal a ácido retinoico. Los objetivos de esta memoria fueron: Estudiar las diferencias de expresión de marcadores de diferenciación en cultivos normales y cultivos mantenidos con el inhibidor dietilaminobenzaldehido (DEAB), específico de ALDHs; evaluar la acción de DEAB en cultivos diferenciados por una vía independiente de la enzima; definir si la adición del inhibidor tiene repercusiones en la viabilidad y funcionalidad normal de las DCs, y evaluar la expresión de mRNA y la actividad enzimática de ALDHs en cultivos normales de diferenciación. Nuestros resultados indican que DCs generadas en presencia de DEAB muestran una expresión significativamente menor del marcador de superficie CD11c, mientras el marcador CD14 se expresa en niveles más elevados que en las DCs generadas en condiciones normales. La adición de DEAB a cultivos independientes de la enzima no tuvo efecto alguno en la diferenciación celular. La cantidad de células muertas para todas las condiciones de experimentación es invariable y funcionalmente las células mantenidas con DEAB presentan características propias de deprivación de retinoides. x También se pudo demostrar diferencias en la expresión de isoenzimas de ALDHs a distintos días de diferenciación, al igual que en los niveles de actividad enzimática. Concluimos que las enzimas retinal deshidrogenasas cumplen un rol muy importante en la generación de células dendríticas humanas in vitro.