Orientador: Jose Mario Martinez / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matematica, Estatistica e Computação Científica / Made available in DSpace on 2018-07-16T17:34:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sampaio_RaimundoJoseBorgesde_M.pdf: 953418 bytes, checksum: 14edc30143171b0e3b1ce369b0c3f580 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed / Mestrado / Mestre em Matemática Aplicada

Introdução: O gene MAMLD1 tem sido relacionado à etiologia da hipospádia penoescrotal por ser fundamental para produção adequada de testosterona durante o período crítico do desenvolvimento sexual masculino. Até o momento, 3 mutações nonssense com perda de função foram identificadas em pacientes japoneses com hipospadia. Objetivo: Pesquisar a presença de mutações no gene MAMLD1, em uma grande casuística de pacientes brasileiros portadores de DDS 46,XY de origem indeterminada e realizar estudo funcional de possíveis alterações encontradas. Pacientes e Métodos: Avaliamos 50 pacientes com DDS 46.XY de causa indeterminada nos quais havia se excluído, previamente, os defeitos de síntese da testosterona, deficiência da 5 alfa-redutase 2 e insensibilidade parcial a andrógenos, por critérios laboratoriais e sequenciamento gênico. Toda região codificadora do MAMLD1 e os sítios de splice que flanqueiam essas regiões foram amplificados e sequenciados a partir do DNA genômico. Seis marcadores de microssatélites que flanqueiam o gene foram utilizados para analisar o efeito fundador da nova variante alélica identificada. A função de transativação do MAMLD1 foi analisada através de ensaio de luciferase. Células COS-1 foram distribuídas em placas de 12 poços e transitoriamente transfectadas com o vetor repórter de luciferase (p-Hes1, p-Hes3 e p-Hes5), vetor de expressão para MAMLD1 (selvagem e contendo a variante alélica) e o vetor PRL-CMV como um controle interno. Resultados: Identificamos uma variante alélica, a p.H347Q, no exon 3 em 4 pacientes brasileiros não relacionados (3 casos esporádicos e 1 caso familiar). Dois pacientes foram submetidos à gonadectomia na infância e foram criados no sexo social feminino. A ultrassonografia pélvica demonstrou a presença de útero em uma delas. Os outros dois pacientes do sexo masculino apresentavam micropênis, criptorquidia e hipospádia perineal. Esta variante alélica foi encontrada em apenas 1 de 250 controles brasileiros estudados frequência 0,4%. A atividade de transativação da variante protéica do MAMLD1 foi 2,0 vezes maior do que a proteína selvagem para ativar a transcriação do p-Hes3. Nenhum efeito fundador foi demonstrado nestas famílias. Discussão: A variante alélica está localizada em uma região altamente conservada do MAMDL1 que é essencial para o desenvolvimento da genitália masculina. Os genes Hes constituem uma família genes de repressor transcricional de sinalização intracelular Notch. Os genes Hes exibem um padrão de expressão oscilatório e controlam o momento exato de diversos eventos biológicos. O padrão de expressão dos genes Hes nas gônadas não é bem estabelecido. Hirata e col. demonstraram que tanto a ausência quanto a persistência da expressão dos genes Hes resultam nos mesmos defeitos na somitogênese. Nossa hipótese é que a superexpressão do gene Hes3 poderia prejudicar a diferenciação sexual masculina normal pela continua supressão de genes essenciais envolvidos posteriormente na cascata do desenvolvimento sexual masculino. Conclusão: Essa é a primeira descrição de uma variante alélica do gene MAMLD1 com ganho de função em pacientes com 46, XY DDS de causa indeterminada. O papel desta variante protéica do MAMDL1 na etiologia DDS 46,XY deve ser melhor determinada através de estudos in vivo / Introduction: MAMLD1 has been shown to be implicated in the etiology of penoscrotal hypospadias. To date, 3 loss-of-function nonsense mutations have been identified in Japanese patients with hypospadias. Objective: To screen MAMLD1 for mutations in a large cohort of Brazilian patients with undetermined 46,XY DSD. Patients and Methods: We evaluated 50 patients in which defects of testosterone synthesis, 5 alfa-reductase 2 deficiency and partial androgen insensitivity were previously excluded. The entire coding region and the flanking splicing sites of MAMLD1 were amplified and sequenced from genomic DNA. Six microsatellite markers flanking the gene were used to analyze founder effect of new allelic variant. Transactivation function of MAMLD1 was analyzed by a luciferase assays. COS-1 cells seeded in 12-well dishes were transiently transfected with luciferase reporter vector (p-Hes1, p-Hes3 and p-Hes5), expression vector for MAMLD1 (WT and allelic variant) and pRL-CMV vector as an internal control. All experiments were performed in triplicates and repeated 3 times. Results: We identified an allelic variant, the p.H347Q on exon 3 in 4 unrelated patients (3 sporadic and 1 familial cases). Two patients underwent gonadectomy in infancy and were raised as girls. Pelvic ultrasound showed a uterus in one of them. The other two male patients had micropenis, cryptorchidism and perineal hypospadias. This allelic variant was found in 1 out of 250 Brazilian controls frequency 0,4%. The transactivation activities of the variant protein were 2.0 folds higher than the WT with p-Hes3. No founder effect was demonstrated in these families. Discussion: The allelic variant is located in a highly conserved region of MAMDL1 which is essential for male genitalia development. HES is a family of transcriptional repressors of Notch signaling. Hes gene expression pattern is tissue and cell specific and control the timing of biological events. In gonads, their expression pattern remained to be elucidated. In somitogenesis, Hirata showed that both loss of expression or persistent expression of Hes genes result in the same defects. Therefore, overexpression of Hes genes should impair the normal male differentiation by continuous suppression of downstream genes involved in male sex development. Conclusion: This is the first report of an allelic variant of MAMLD1 determining a gain of function in its protein in patients with 46,XY DSD. The role of this variant protein of MAMDL1 in the etiology of 46, XY DDS should be better determined by in vivo studies

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-12-18T13:43:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Rogério Gomes Furtado - 2013.pdf: 8231426 bytes, checksum: 27a3b18b8a08192dc1223e0b4a48c1b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-12-18T14:07:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Rogério Gomes Furtado - 2013.pdf: 8231426 bytes, checksum: 27a3b18b8a08192dc1223e0b4a48c1b8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-18T14:07:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Rogério Gomes Furtado - 2013.pdf: 8231426 bytes, checksum: 27a3b18b8a08192dc1223e0b4a48c1b8 (MD5) Previous issue date: 2013-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Objective: To evaluate the prevalence of systolic and diastolic right ventricular (RV) in patients with indeterminate form of Chagas Disease (FDIC) and compare with asymptomatic patients without this condition. Methods: An observational, case-control, descriptive and prevalent study in which 91 patients were divided into 2 groups: group I (normal n = 31) and group II (FIDC normal cardiac n = 61). Were performed 2D Doppler echocardiography in adult patients, applying the criteria assessment of systolic and diastolic RV. Results: The general characteristics of both groups: age (39.73 ± 12.94 vs 45.32 ± 12.36, p = 0.071), weight in kg (71.29 ± 14.91 vs 67.66 ± 12, 37 with p = 0.270), Height in cm (159.24 ± 32.63 vs 156.88 ± 30.56, p = 0.749), ISC (1.77 ± 0.24 vs 1.69 ± 0.19 with p = 0.174) , female sex (24/77, 4% vs 45/73, 8%, p = 0.190) ,heart rate (FC) in bpm ( 71,90 ± 10,43 vs 70,36 ± 9,83), diastolic dimension of LV ( LVDD) em mm ( 46,71± 5,21 vs 46,05 ± 5,22) e ejection fracion of LV ( % por Teicholz) (73,55 ± 6,66 vs 73,56 ± 7,35). The prevalence of RV systolic dysfunction in normal patients and FIDC, using criteria such as FAC <35%, TAM <16mm and systolic S wave velocity <10 cm / s tissue Doppler was: FAC (- / 0.0% vs 1 / 0.6%, p = 0.663), TAM (- / 0.0% vs. - / 0.0%, p = 1.00) and S wave (2/6,4% vs 16/26% with p = 0.016) and a weak correlation (r = 0.31) between age and S wave (p = 0.019). The prevalence of RV global dysfunction in normal patients and FIDC : RIPM of TD(5/16,1% vs 17/27,8% , p=0,099) and RIPM of DP(19/61,3% vs 42/68,8%,p 0,141).The prevalence of RV diastolic dysfunction in groups I and II respectively, according to the criteria established by guideline43: abnormal relaxation AR (- / 0.0% vs 4/ 6.0%, p = 0.187), pseudonormal pattern PP (-/0,0 vs. -/0,0% p = 1,00) and restrictive pattern PR (-/0,0% vs -/0,0%, p = 1,000), with no significant difference in diastolic dysfunction in both groups. Conclusion: The prevalence of RV systolic dysfunction was estimated at 26% (S-wave velocity compared to other variables with p significant, with a weak correlation between the S wave velocity and age) and was not observed statistically significant criteria for diastolic dysfunction between groups. / Objetivo: Avaliar a prevalência de disfunção sistólica e diastólica do Ventrículo Direito (VD) em pacientes com forma indeterminada da doença de Chagas (FIDC) e comparar com pacientes assintomáticos sem esta patologia. Métodos: Estudo observacional, caso-controle, descritivo e de prevalência, na qual 91 pacientes foram divididos em dois grupos: grupo I (normal com n = 31) e grupo II (FIDC/normalidade cardíaca n = 61). Foram realizados nos pacientes adultos Dopplerecocardiograma 2D, aplicando os critérios de avaliação da função sistólica e diastólica do VD. Resultados: As características gerais de ambos grupos foram : idade (39,73 ± 12,94 vs 45,32 ± 12,36 com p = 0,071), peso em Kg (71,29 ± 14,91 vs 67,66 ± 12,37 com p = 0,270), altura em cm (159,24 ± 32,63 vs 156,88 ± 30,56 com p = 0,749), índice de superfície corpórea (ISC) (1,77 ± 0,24 vs 1,69 ± 0,19 com p = 0,174), sexo feminino (24/77,4% vs 45/73,8% com p = 0,190), frequência cardíaca (FC) em bpm ( 71,90 ± 10,43 vs 70,36 ± 9,83), dimensão diastólica do VE ( DDVE) em mm ( 46,71± 5,21 vs 46,05 ± 5,22) e fração de ejeção do VE ( % por Teicholz) (73,55 ± 6,66 vs 73,56 ± 7,35). A prevalência da disfunção sistólica do VD em pacientes normais e FIDC, utilizando critérios como Mudança de Área Fracional (MAF) < 35%, Mobilidade do Anel Tricuspídeo (MAT) < 16mm e velocidade da onda sistólica ao Doppler tecidual (ondaS) < 10 cm/s foi: MAF (- /0,0% vs 1/0.6% com p = 0,663), MAT (- / 0,0% vs - / 0,0% com p = 1,00) e onda S (2/6,4% vs 16/26,0% com p = 0.016). Houve fraca correlação (r = 0,31) entre a idade e a onda S (p = 0,019). A prevalência da disfunção global do VD no grupo I e II respectivamente foi: Índice de Performance Miocárdica Direita do Doppler Tecidual IPMD do DT (5/16,1% vs 17/27,8% com p =0,099) e IPMD do Doppler Pulsado DP:(19/61,3% vs 42/68% com p= 0,141), sem diferença estatística significativa entre os grupos. A prevalência de disfunção diastólica do VD nos grupos I e II respectivamente, conforme os critérios estabelecidos pelas diretrizes 43: alteração do relaxamento AR (- / 0,0% vs 4 / 6,0%, p = 0,187), padrão pseudonormal PP (-/ 0,0% vs -/ 0,0%, p =1,00) e padrão restritivo PR (-/0,0% vs -/0,0%, p = 1,00), sem diferenças significativas de disfunção diastólica em ambos grupos. Conclusão: A prevalência de disfunção sistólica do VD foi estimada em 26% (velocidade da onda S em comparação a outras variáveis com p significante e fraca correlação entre a velocidade da onda S e idade) e não foram observados critérios estatisticamente significantes para disfunção diastólica e global entre os grupos.

Introdução: O gene MAMLD1 tem sido relacionado à etiologia da hipospádia penoescrotal por ser fundamental para produção adequada de testosterona durante o período crítico do desenvolvimento sexual masculino. Até o momento, 3 mutações nonssense com perda de função foram identificadas em pacientes japoneses com hipospadia. Objetivo: Pesquisar a presença de mutações no gene MAMLD1, em uma grande casuística de pacientes brasileiros portadores de DDS 46,XY de origem indeterminada e realizar estudo funcional de possíveis alterações encontradas. Pacientes e Métodos: Avaliamos 50 pacientes com DDS 46.XY de causa indeterminada nos quais havia se excluído, previamente, os defeitos de síntese da testosterona, deficiência da 5 alfa-redutase 2 e insensibilidade parcial a andrógenos, por critérios laboratoriais e sequenciamento gênico. Toda região codificadora do MAMLD1 e os sítios de splice que flanqueiam essas regiões foram amplificados e sequenciados a partir do DNA genômico. Seis marcadores de microssatélites que flanqueiam o gene foram utilizados para analisar o efeito fundador da nova variante alélica identificada. A função de transativação do MAMLD1 foi analisada através de ensaio de luciferase. Células COS-1 foram distribuídas em placas de 12 poços e transitoriamente transfectadas com o vetor repórter de luciferase (p-Hes1, p-Hes3 e p-Hes5), vetor de expressão para MAMLD1 (selvagem e contendo a variante alélica) e o vetor PRL-CMV como um controle interno. Resultados: Identificamos uma variante alélica, a p.H347Q, no exon 3 em 4 pacientes brasileiros não relacionados (3 casos esporádicos e 1 caso familiar). Dois pacientes foram submetidos à gonadectomia na infância e foram criados no sexo social feminino. A ultrassonografia pélvica demonstrou a presença de útero em uma delas. Os outros dois pacientes do sexo masculino apresentavam micropênis, criptorquidia e hipospádia perineal. Esta variante alélica foi encontrada em apenas 1 de 250 controles brasileiros estudados frequência 0,4%. A atividade de transativação da variante protéica do MAMLD1 foi 2,0 vezes maior do que a proteína selvagem para ativar a transcriação do p-Hes3. Nenhum efeito fundador foi demonstrado nestas famílias. Discussão: A variante alélica está localizada em uma região altamente conservada do MAMDL1 que é essencial para o desenvolvimento da genitália masculina. Os genes Hes constituem uma família genes de repressor transcricional de sinalização intracelular Notch. Os genes Hes exibem um padrão de expressão oscilatório e controlam o momento exato de diversos eventos biológicos. O padrão de expressão dos genes Hes nas gônadas não é bem estabelecido. Hirata e col. demonstraram que tanto a ausência quanto a persistência da expressão dos genes Hes resultam nos mesmos defeitos na somitogênese. Nossa hipótese é que a superexpressão do gene Hes3 poderia prejudicar a diferenciação sexual masculina normal pela continua supressão de genes essenciais envolvidos posteriormente na cascata do desenvolvimento sexual masculino. Conclusão: Essa é a primeira descrição de uma variante alélica do gene MAMLD1 com ganho de função em pacientes com 46, XY DDS de causa indeterminada. O papel desta variante protéica do MAMDL1 na etiologia DDS 46,XY deve ser melhor determinada através de estudos in vivo / Introduction: MAMLD1 has been shown to be implicated in the etiology of penoscrotal hypospadias. To date, 3 loss-of-function nonsense mutations have been identified in Japanese patients with hypospadias. Objective: To screen MAMLD1 for mutations in a large cohort of Brazilian patients with undetermined 46,XY DSD. Patients and Methods: We evaluated 50 patients in which defects of testosterone synthesis, 5 alfa-reductase 2 deficiency and partial androgen insensitivity were previously excluded. The entire coding region and the flanking splicing sites of MAMLD1 were amplified and sequenced from genomic DNA. Six microsatellite markers flanking the gene were used to analyze founder effect of new allelic variant. Transactivation function of MAMLD1 was analyzed by a luciferase assays. COS-1 cells seeded in 12-well dishes were transiently transfected with luciferase reporter vector (p-Hes1, p-Hes3 and p-Hes5), expression vector for MAMLD1 (WT and allelic variant) and pRL-CMV vector as an internal control. All experiments were performed in triplicates and repeated 3 times. Results: We identified an allelic variant, the p.H347Q on exon 3 in 4 unrelated patients (3 sporadic and 1 familial cases). Two patients underwent gonadectomy in infancy and were raised as girls. Pelvic ultrasound showed a uterus in one of them. The other two male patients had micropenis, cryptorchidism and perineal hypospadias. This allelic variant was found in 1 out of 250 Brazilian controls frequency 0,4%. The transactivation activities of the variant protein were 2.0 folds higher than the WT with p-Hes3. No founder effect was demonstrated in these families. Discussion: The allelic variant is located in a highly conserved region of MAMDL1 which is essential for male genitalia development. HES is a family of transcriptional repressors of Notch signaling. Hes gene expression pattern is tissue and cell specific and control the timing of biological events. In gonads, their expression pattern remained to be elucidated. In somitogenesis, Hirata showed that both loss of expression or persistent expression of Hes genes result in the same defects. Therefore, overexpression of Hes genes should impair the normal male differentiation by continuous suppression of downstream genes involved in male sex development. Conclusion: This is the first report of an allelic variant of MAMLD1 determining a gain of function in its protein in patients with 46,XY DSD. The role of this variant protein of MAMDL1 in the etiology of 46, XY DDS should be better determined by in vivo studies