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Sucrose breakdown in the potato tuber / Sucrose breakdown in the potato tuberJunker, Björn H. January 2004 (has links)
In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um das Verständnis des Saccharose-zu-Stärke Stoffwechselweges in sich entwickelnden Kartoffelknollen zu untersuchen. Zunächst wurde ein induzierbares Genexpressions-System aus dem Schimmelpilz Aspergillus nidulans für die Untersuchung des Metabolismus von Kartoffelknollen optimiert. Es wurde herausgefunden, dass dieses sogenannte alc system schneller auf Acetaldehyd reagiert als auf Ethanol, und dass Acetaldehyd weniger Seiteneffekte auf den Metabolismus hat. Die optimalen Induktionsbedingungen wurden dann benutzt um die Effekte einer zeitlich kontrollierten zytosolischen Expression einer Hefe-Invertase auf den Metabolismus der Kartoffelknolle zu untersuchen. Die beobachteten Unterschiede zwischen induzierter und konstitutiver Expression der Invertase führten zu der Feststellung, dass die Glycolyse erst induziert wird nachdem ein ATP-Mangel durch erhöhtes Saccharose-Cycling kreiert wurde. Weiterhin lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass Maltose in der Kartoffelknolle eher ein Produkt der Kondensation zweier Glucose-Einheiten ist statt ein Produkt des Stärke-Abbaus zu sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Expression einer Hefe-Invertase in der Vakuole von Kartoffelknollen ähnliche Effekte auf deren Metabolismus hat wie die Expression des gleichen Enzymes im Apoplasten. Diese Beobachtung ist ein weiterer Beleg für die Präsenz eines Mechanismus, bei dem Saccharose mittels Endozytose in die Vakuole aufgenommen wird anstatt über Transporter direkt ins Zytosol aufgenommen zu werden. Zum Schluß wird ein kinetisches Modell des Saccharose-Abbaus vorgestellt, das in der Lage ist diesen Teil des Stoffwechsels der Kartoffelknolle quantitativ zu simulieren. Weiterhin kann dieses Modell die metabolischen Effekte der Einführung einer Hefe-Invertase in das Zytosol von Kartoffelknollen mit erstaunlicher Präzision vorhersagen. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass induzierbare Genexpression sowie Computermodelle von Stoffwechselwegen nützliche Hilfsmittel für eine Verbesserung des Verständnisses des Pflanzenmetabolismus sind. / In this work different approaches are undertaken to improve the understanding of the sucrose-to-starch pathway in developing potato tubers. At first an inducible gene expression system from fungal origin is optimised for the use of studying metabolism in the potato tuber. It is found that the alc system from Aspergillus nidulans responds more rapidly to acetaldehyde than ethanol, and that acetaldehyde has less side-effects on metabolism. The optimal induction conditions then are used to study the effects of temporally controlled cytosolic expression of a yeast invertase on metabolism of potato tubers. The observed differences between induced and constitutive expression of the invertase lead to the conclusion that glycolysis is induced after an ATP demand has been created by an increase in sucrose cycling. Furthermore, the data suggest that in the potato tuber maltose is a product of glucose condensation rather than starch degradation. In the second part of the work it is shown that the expression of a yeast invertase in the vacuole of potato tubers has similar effects on metabolism than the expression of the same enzyme in the apoplast. These observations give further evidence to the presence of a mechanism by which sucrose is taken up via endocytosis to the vacuole rather than via transporters directly to the cytosol. Finally, a kinetic in silico model of sucrose breakdown is presented that is able to simulate this part of potato tuber metabolism on a quantitative level. Furthermore, it can predict the metabolic effects of the introduction of a yeast invertase in the cytosol of potato tubers with an astonishing precision. In summary, these data prove that inducible gene expression and kinetic computer models of metabolic pathways are useful tools to greatly improve the understanding of plant metabolism.
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Nutzung phytobakterieller Gene zur Beeinflussung der pflanzlichen Apikaldominanz - Untersuchungen in transienten und induzierbaren transgenen Expressionssystemen / Use of phytobacterial genes for modulation of apical dominance in plants - Experimental approaches in transient and inducible transgenic expression systemsNitschke, Elke 01 February 2007 (has links)
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Klonierung und pharmakologische Charakterisierung des equinen β2-Adrenozeptors im Zusammenhang mit Equinem Asthma in einem stabil transfizierten In-vitro-SäugerzellmodellKamutzki, Christin Jana 18 September 2023 (has links)
Einleitung: Equines Asthma ist eine herausfordernde Erkrankung der Pferde. Gekennzeichnet ist sie durch verengte Atemwege mit massiver Schleimansammlung mit einhergehender Leistungsinsuffizienz des Pferdes. Eines der Therapieziele ist der β2-Adrenozeptor (β2AR) in den Atemwegen, der nach Aktivierung durch β-selektive Pharmaka zur Bronchienerweiterung und verbesserten Ventilation der Lunge führt. Eine Langzeitapplikation dieser Therapeutika führt jedoch zur Downregulation der Rezeptoranzahl mit korrespondierender Abschwächung des Therapieerfolges, wobei es Unterschiede im Ausmaß dieses Effektes zwischen den Pharmaka zu geben scheint. Der genaue Mechanismus dahinter ist nicht geklärt.
Ziel der Untersuchung: Die vorliegende Arbeit entwickelt zwei neue In-vitro-Zellsysteme, in denen der equine β2AR stabil transfiziert wird und dessen Genexpression (ADRB2) durch Doxycyclin steuerbar ist. Nach Etablierung der reproduzierbaren Anwendbarkeit wird eines der Systeme unter Zugabe von β-selektiven Agonisten genutzt, um den Einfluss der Pharmaka auf die Rezeptor-Signalkaskade und Downregulation zeit- und dosisabhängig zu bestimmen.
Material und Methoden: ADRB2 wurde in den Vektor pSBtet_GP kloniert und HEK293T- und COS-7-Zellen mit dem Konstrukt stabil transfiziert. Zur Bestimmung der Parameter für eine adäquate Genexpression wurden die Zellen mit verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen und Inkubationszeiten induziert und die Rezeptor-mRNA-Bildung, -anzahl und -funktion mittels qPCR, Iodocyanopindolol (ICYP)-Bindungsstudien und AlphaScreen cAMP-Assay bestimmt. Anschließend wurden dem HEK-Zellsystem Agonisten (Isoproterenol, Epinephrin, Norepinephrin, Clenbuterol, Salbutamol, Salmeterol), ebenfalls in zeit- und konzentrationsabhängigen Versuchen, zugegeben. Die Entwicklung der Rezeptor-mRNA und -anzahl wurde mittels qPCR und ICYP-Bindungsstudien verfolgt. Zusätzliche Verdrängungsexperimente wurden zur Affinitätsbestimmung einiger Agonisten zum equinen β2AR genutzt. Der Einfluss von Zeit und Dosis von Doxycyclin wurde mittels Two-way-ANOVA mit Bonferroni-Korrektion ermittelt, wobei das Signifikanzniveau bei p < 0,05 festgelegt wurde.
Ergebnisse: Die Bildung von Rezeptor-mRNA konnte über alle Doxycyclin-Konzentrationen hinweg mit einer 48-stündigen Inkubation am besten generiert werden, weshalb weitere Experimente mit dieser Induktionsdauer durchgeführt wurden. qPCR und ICYP-Bindungsstudien zeigten eine maximale mRNA- und Rezeptorproteinbildung bei 8,0 µg/ml Doxycyclin, wohingegen die Rezeptorfunktion in Form von Bildung des second messengers cAMP bei niedrigeren Doxycyclin-Konzentrationen (COS: 2,0 µg/ml; HEK: 0,5 µg/ml) gegeben war. Daher entschieden wir uns für eine Induktion mit 1,0 µg/ml Doxycyclin für 48 Stunden, welche dann als Startpunkt für die anschließende 72-stündige Agonistenzugabe genutzt wurde. Alle Agonisten induzierten nach 8-stündiger Inkubation eine gesteigerte Rezeptor-Genexpression, die jedoch meist nach 24 Stunden unter das Startniveau sank und dort auf einem niedrigen Level bis zum Betrachtungsende verblieb. Korrespondierend dazu stieg zeitversetzt die durch ICYP-Bindungsstudien bestimmte Rezeptoranzahl bis 48 Stunden an, zeigte danach unter Salmeterol und Salbutamol, jedoch nicht unter Clenbuterol, eine leichte Abnahme, ohne unter das Ausgangsniveau zu sinken. Die Affinität der Agonisten zum equinen β2AR zeigte folgende Reihenfolge: Salmeterol > Clenbuterol > Isoproterenol > Salbutamol.
Schlussfolgerungen: Beide Zellmodelle eignen sich zur weiteren Erforschung der Rezeptorregulation des equinen β2AR mit den ermittelten Parametern für eine stabile Genexpression. Im HEK-System konnte erstmalig nach Agonisten-Zugabe gezeigt werden, dass es einen pharmakainduzierten Zusammenhang zwischen Rezeptor-mRNA-Bildung und dichte gibt, bevor die downregulierenden Prozesse unter Dauertherapie die Überhand bekommen. Salmeterol zeigte dabei schon in geringen Konzentrationen Effekte. Clenbuterol regulierte in unserem Modell jedoch die Rezeptoranzahl nach 72-stündiger Agonisten-Zugabe nicht herunter, was im Kontrast zu bisherigen Ergebnissen steht und zelltypabhängig zu sein scheint.
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Effekte von Hyperoxie und Stickstoffmonoxid beim NeugeborenenHöhn, Thomas 01 October 2002 (has links)
In der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen vorgestellt, die sich mit Wirkungen und Interaktionen von zwei ubiquitär im menschlichen Körper vorkommenden Gasen befassen, i.e. Sauerstoff und Stickstoffmonoxid. Im Falle beider Substanzen ermöglicht die geringe Größe der Moleküle eine freie Diffusion über Membranen hinweg, eine Eigenschaft, die für die Funktion der Signaltransduktion geradezu prädestiniert. Aus den vorgelegten Untersuchungen lassen sich die folgenden Folgerungen ableiten: * Stickstoffmonoxid wirkt in-vitro selektiv bakteriostatisch auf Bakterien, die üblicherweise Früh- und Neugeborene besiedeln. Dabei hängt die Selektivität von den jeweiligen bakteriellen Verteidigungsmechanismen ab, die bakteriostatische Wirkung liegt in einem Konzentrationsbereich, der außerhalb desjenigen liegt, der derzeit klinisch angewendet wird. * Hyperoxie führt im Ganztiermodell der unreifen Ratte zu einer zerebralen Hochregulation von iNOS und damit zur Synthese von NO. Soweit dies anhand der Synthese von Peroxynitrit als definitivem Schädigungsmechanismus beurteilbar ist, wird trotz entsprechender iNOS-Expression wenig bis gar kein Peroxynitrit gebildet. Da das Zusammentreffen von NO und Sauerstoff sonst regelhaft zur Entstehung von Peroxynitrit führt, müssen im Gehirn der unreifen Ratte ausreichende antioxidative Schutzmechanismen präsent sein, die diese Reaktion verhindern. * Im in-vitro-Modell der Gasäquilibrierung von Nabelschnur-PMN zeigte sich unter Hyperoxie das ausgeprägteste Aktivierungsmuster aller verglichenen Sauerstoffkonzentrationen. Dies stand im Gegensatz zur Exposition adulter Zellen, hier fand sich eine größere Hyperoxietoleranz bei gleichzeitig stärkster Aktivierung unter Hypoxiebedingungen. Welche Bedeutung diesen Ergebnissen im klinischen Umgang mit Neugeborenen zukommt muß derzeit noch offen bleiben. Allerdings häufen sich Hinweise aus experimentellen Studien, die darauf hindeuten, daß ein restriktiver Umgang mit hohen Sauerstoffkonzentrationen auch im klinischen Umfeld gerechtfertigt sein könnte. / The present investigations deal with the effects and interactions of gases, which are ubiquitous in the human body i.e. oxygen and nitric oxide. Both substances are small enough to freely diffuse across biological membranes. This ability predestines both molecules for the function of signal transduction. The results of our investigations lead to conclusions as follows: * Nitric oxide has selective bacteriostatic effects in-vitro on some bacterial strains typically isolated from preterm and term newborn infants. Selectivity depends on the presence of bacterial defense mechanisms. The bacteriostatic effect takes place at concentrations above those currently used in clinical practice. * Hyperoxia leads to upregulation of iNOS and subsequent NO production in an animal model of the immature rat. Despite this upregulation of iNOS synthesis there is no increased production of peroxynitrite which is known to cause cellular and DNA damage. Since the combination of NO and high concentrations of oxygen lead to peroxynitrite formation on a regular basis, effective antioxidant mechanisms appear to prevent peroxynitrite formation in the brain of the immature rat. * The most pronounced activation of cord blood polymorphonuclear cells (PMN) during conditions of hyperoxia, normoxia, and hypoxia was found for exposure towards high oxygen concentrations in an in-vitro model of gas equilibration. As opposed to that, hypoxia was the most potent trigger for adult PMN. It remains to be determined which clinical implications must be derived from these results. However, increasing experimental evidence indicates that exposure towards high oxygen concentrations should be restricted also in clinical practice and not only in preterm infants, but also in term newborns.
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Die Charakterisierung der induzierbaren Stickstoffmonoxidsynthase im murinen RENCA-Nierenzellkarzinommodell unter spezieller Berücksichtigung tumorassoziierter Makrophagen, der Gefäßdichte und Tumorhypoxie / Characterization of inducible nitric oxide synthase in murine renal cell carcinoma considering of tumor associated macrophages, vessel distance and tumor hypoxiaKrösel, Juliane Franziska 11 March 2013 (has links)
Einleitung: Ziel dieser Arbeit war es, das RENCA-Nierenzell-Karzinommodell anhand der Hypoxie-induzierten Nekrosen, der Makrophageninfitration sowie der iNOS-Expression und –aktivität zu charakterisieren.
Methoden: Für die Erzeugung lokaler Tumoren, wurden Balb/c-Mäusen in vitro kultivierte RENCA-Zellen subkutan appliziert. Die Quantifizierung des Makrophageninfiltrates sowie die Charakterisierung der Hypoxie im Tumorgewebe erfolgten mittels immunhistochemischer Färbungen. Für die Darstellung der Stickstoffmonoxid-Aktivität kamen neben der Immunhistochemie die Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Anwendung. Der Nitrit-Gehalt der Tumorproben wurde mittels Griess-Reaktion bestimmt.
Ergebnisse: Spontan hypoxische Tumornekrosen sind assoziiert mit einer signifikant geringeren Gefäßdichte. Das Ausmaß der Nekrosen korreliert mit dem Alter der Tumoren. Alte Tumoren (28 Tage) zeigen eine höhere Makrophageninfiltration als junge Tumoren (12 bis 19 Tage). Obwohl die iNOS-Expression auf Proteinebene keinen signifikanten Unterschied zwischen alten und jungen Tumoren ergab, findet sich auf mRNA-Ebene eine signifikant erhöhte iNOS-Expression in alten Tumoren. Hinsichtlich der αActinin-4-Expression konnte kein signifikanter Unterschied gesehen werden.
Schlussfolgerung: Bei annähernd gleicher iNOS- und αActinin-4-Expression beziehungsweise erhöhter iNOS-mRNA-Expression ist die Konzentration an Nitrit in Tumoren mit hypoxischer Nekrose reduziert. Daraus kann man schließen, dass die Aktivität der NO-Synthase unter hypoxischen Bedingungen reduziert ist. Dies stützt wiederum die Vermutung, einer die iNOS-Aktivität steuernden normoxie-abhängigen Assoziation von αActinin-4 und iNOS. Die Aktivitätsinhibierung der iNOS könnte somit ein Mechanismus sein, durch den Hypoxie die Zytotoxizität von TAM inhibiert. Die abnehmende Gefäßdichte mit zunehmendem Tumoralter könnte möglicherweise auf eine Regression der Tumorgefäße zurückzuführen sein. Denkbar wäre, dass die Gefäßregression durch makrophagenabhängige Zytokine begünstigt wird.
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