Les statines sont des inhibiteurs sélectifs de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase, utilisées pour diminuer la biosynthèse du cholestérol. Ces molécules possèdent en plus de leur capacité à réduire le cholestérol des effets pléiotropiques comme les propriétés anti-inflammatoires et anti-oxydantes. Les cucurbitacines sont des triterpènes dérivés des plantes, ayant des propriétés biologiques diverses comme les effets anti-inflammatoires et anticancéreux, associées toutefois à une toxicité élevée. Les dérivés de thiazole sont des molécules contenant un noyau hétérocyclique formé de trois atomes de carbones, un atome de sulfure et un atome d'azote, disposant des effets anti-inflammatoires importantes. Les cyclooxygénases et les hème-oxygénases jouent un rôle dans l'inflammation et le stress oxydatif et sont les cibles des statines et des cucurbitacines in vitro. Les dérivés de thiazole peuvent inhiber plutôt l'activité enzymatique des cyclooxygénases. Le but de ma thèse est d'étudier les effets de ces 3 molécules in vivo et d'analyser si possible les mécanismes impliqués, comme par exemple pour les statines. Pour cela, nous avons eu recours chez les souris C57BL/6 au modèle d'inflammation de la poche à air-stérile injecté par le zymosan.Nous avons d'abord montré que le traitement des souris avec l'atorvastatine pendant 10 jours a réduit la migration des cellules dans l'exsudat de la poche à air ainsi que l'expression de gènes des marqueurs pro-inflammatoires tels que les cytokines, les chimiokines, la cyclooxygénase-2 et la nitric oxide synthase -II. Le taux de la prostaglandine E2 et de l'interleukine-6 a été également réduit. L'inhibition de l'hème-oxygénase-1 par son inhibiteur sélectif, tin protoporphyrine, a partiellement réduit l'effet inhibiteur de l'atorvastatine sur la migration des cellules et sur certaines cytokines suggérant un rôle important de la l'hème-oxygénase-1 dans les propriétés anti-inflammatoires in vivo.En parallèle, nous avons utilisé ce modèle animal tester l'effet de la cucurbitacine E sur l'inflammation et évaluer le rôle d'encapsulation in vivo dans des liposomes à base de phosphatidylcholine. Nous avons démontré que la cucurbitacine E libre (12.5 μg/poche ou 25 μg/poche) a tendance à diminuer l'interleukine-6, l'hème oxygénase-1 et la cyclooxygénase-2 alors que la cucurbitacine E encapsulée (12.5 μg/poche) a significativement réduit la prostaglandine E2, l'interleukine-6 et le taux de nitrite sans affecter le niveau d'ARNm de la cyclooxygénase-2 et l'hème oxygénase-1. Nos résultats suggèrent que l'incorporation de la cucurbitacine E dans des liposomes améliore son effet anti-inflammatoire et réduit sa cytotoxicité.Finalement, deux dérivés de thiazole qui diffèrent dans leur structure par la présence d'un groupement butyle- ou benzyle- sur leur chaîne latérale, ont été explorés dans ce modèle. Nous avons montré que le dérivé de thiazole contenant le groupe benzyle est sélectif de la cyclooxygénase-2 dans les macrophages et le modèle in vivo chez la souris.En résumé, mon travail de thèse met en évidence in vivo les effets anti-inflammatoires des statines et le rôle de l'hème oxygénase-1, et permet en plus la caractérisation des effets anti-inflammatoires des cucurbitacines et des dérivés de thiazole. L'ensemble de ces résultats renforcent les effets anti-inflammatoires de ces substances et démontre in vivo leur effet et les suggèrent comme molécules anti-inflammatoires. / Statins are selective competitive inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase used to lower cholesterol biosynthesis and have multiple pleiotropic effects beyond lowering cholesterol such as anti-inflammatory and anti-oxidant properties. Cucurbitacins are triterpenoid derived from plants and exhibit potential anti-inflammatory and anticancer properties though they have a high cytotoxicity. Thiazole derivatives are molecules containing heterocyclic ring with three carbons, one sulfur and one nitrogen atom, with important anti-inflammatory activities. Cyclooxygenases and heme-oxygenases play a role in inflammation and oxidative stress and are targets for statins or cucurbitacins in vitro. Thiazole derivatives are potential inhibitors of cyclooxygenases. The aim of my thesis is to investigate the anti-inflammatory effect of these three compounds in vivo and attempt to analyze the mechanisms involved, mainly for statins. Thus we set up an animal model of inflammation in C57BL/6 corresponding to the zymosan -injected dorsal sterile air pouch.First we have shown that treatment of mice with atorvastatin for 10 days reduced cell migration in the exudate of the air pouch as well as the expression of inflammatory markers such as cytokines, chemokines, cyclooxygenase-2 and nitric oxide synthase -II. The synthesis of prostaglandin E2 and interleukin-6 was also reduced. Inhibition of heme-oxygenase-1 by the selective inhibitor tin protoporphyrin partially diminished the inhibitory effect of statins on cell migration and some cytokines suggesting a significant role of HO-1 in the anti-inflammatory properties for atorvastatin in vivo.For cucurbitacins, we used the same animal model to investigate the effect of this substance in vivo and further assess the beneficial effect of encapsulating cucurbitacin in phosphatidylcholine-liposomes. Free cucurbitacin E (12.5 μg/pouch or 25 μg/pouch) tended to increase interleukin-6, decrease heme oxygenase-1 and cyclooxygenase-2 whereas cucurbitacin E loaded liposomes (12.5 μg/pouch) significantly reduced prostaglandin E2, interleukin-6 and nitrite without affecting cyclooxygenase-2 and heme oxygenase-1 mRNA levels. We demonstrated that the incorporation of Cuc E into liposomes enhances its anti-inflammatory effect and reduces its cytotoxicity.Finally, we used the dorsal air pouch model to investigate the anti-inflammatory effect of two thiazole derivatives that differ in their side chain by the presence of butyl or benzyl group. In addition to analyzing their effect on cyclooxygenase activity in human blood platelets, on recombinant COX-1 and in culture macrophage cell lines, we demonstrated their capacity to block cyclooxygenase-dependent prostaglandin synthesis in the lumen of the air pouch.In summary, my thesis presents in vivo evidence for the anti-inflammatory effects of atorvastatin dependent on HO-1 activity. My studies characterized the anti-inflammatory effects of cucurbitacins and thiazole derivatives. All these results support the anti-inflammatory effects of these substances and suggested them as potential anti-inflammatory substances.

Les monocytes détectent des signaux métaboliques circulants qu’ils traduisent en signaux immunologiques. ils infiltrent les tissus inflamés et sont également les précurseurs des macrophages. Dans l’obésité, la fréquence, le nombre, le phénotype et la fonctionnalité des sous populations de monocytes (CD14++CD16- [CM], CD14++CD16+ [IM] et CD14+CD16++ [NCM]) sont spécifiquement modulés. Le phénotype des monocytes est pro-inflammatoire avec une plus forte réponse à la stimulation de TLR4 et de TLR8. Nos travaux suggèrent une capacité migratoire accrue des CM et des IM. La comparaison du transcriptome des sous populations chez des sujets obèses et des témoins, révèle une signature spécifique de chaque sous population montrant un plus fort impact de l’obésité sur les CM. Ils soutiendraient l’inflammation en modulant des gènes impliqués dans la signalisation cellulaire. Ils migreraient avec les IM vers les tissus inflamés. Les NCM resteraient plus longtemps dans la circulation où leur fonction de « patrouilleurs » serait accrue. Les gènes les plus modulés par les CM et les IM, respectivement Clusterine et CDGSH iron sulfur domain 1 sont des ponts entre la réponse immunitaire, le métabolisme et la réponse au stress. L’étude des « tops » gènes dont l’expression est la plus fortement modulée et des fonctions les plus probablement modulées révèle que le métabolisme des monocytes serait modifié dans l’obésité. Ce travail ouvre des perspectives concernant : 1) une éventuelle composante auto-immune de l’inflammation de bas grade et 2) des relations entre des modifications du métabolisme des monocytes et leur fonctionnalité. / Systemic inflammation is pivotal in establishing and sustaining the obesity low-grade inflammatory status. Studying monocytes is important because they can detect metabolic cues in the circulation that are then translated into immunological factors. Monocytes infiltrating inflamed tissues are also macrophage precursors. In obesity, frequency, number, phenotype and functionality of the three monocyte-subsets (CD14++CD16- [CM], CD14++CD16+ [IM] et CD14+CD16++ [NCM]) are specifically altered. We observed a pro-inflammatory phenotype of monocytes in obesity with an increased response to TLR4 and TLR8 stimulation. Our work suggests an increased migratory capacity of CM and IM. Comparison of the transcriptome of the three subsets in obese and control subjects shows an increased imprint of obesity on CM. CM could sustain inflammation by modulating genes involved in cell signaling. They most probably migrate with the IM toward inflamed tissues. Whereas, NCM should stay longer in the circulation where their patrolling function could be increased. The most modulated genes by CM and IM, respectively Clusterin and CDGSH iron sulfur domain 1 (CISD1) are bridges between immune response, metabolism and stress response. The analysis of the top modulated genes and of the most probably modulated functions indicates that monocyte metabolism is altered by obesity. We open new paths of research: 1) a possible auto-immune trait of the low grade inflammation and 2) a possible link between altered monocyte metabolism and their functionality.

La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin qui peut être expliquée par une dysbiose et une dérégulation de la réponse immunitaire. La mannose-binding lectin (MBL), récepteur lectinique et les Toll-like récepteurs jouent un rôle crucial dans la défense contre les pathogènes et dans le développement de la réponse inflammatoire. Ils peuvent reconnaitre de nombreux micro-organismes dont Candida albicans. Cette levure commensale est un immunogène des anticorps anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA), anticorps utilisés dans le diagnostic de la MC. Une association entre un déficit en MBL et des taux élevés d’ASCA a été montrée chez les patients atteints de MC. Ce déficit en MBL est fréquemment associé à un phénotype sévère de la maladie. Le récepteur TLR2, associé à TLR1 ou à TLR6, est également impliqué dans la reconnaissance de C. albicans et le maintien de la barrière intestinale. L’objectif de ce projet a été d’étudier le rôle de la MBL et des récepteurs TLR2/TLR1/TLR6 dans l’homéostasie intestinale et l’élimination de C. albicans du tube digestif. Pour cela, nous avons exploré, les effets de la MBL et des TLR sur la colonisation intestinale à C. albicans et l’inflammation intestinale. Par ailleurs, nous avons déterminé, chez l’homme, l’influence des polymorphismes du gène MBL2 sur la modulation de l’activité et des taux de MBL au cours de la MC.A l’aide d’un modèle murin, nous avons mis en évidence l’expression de MBL-A et de MBL-C par les cellules épithéliales intestinales et leur implication dans l’homéostasie intestinale. Un déficit en MBL favorise la colonisation par C. albicans et une dissémination de la levure, en présence d’une colite chimio-induite. Les récepteurs TLR1 et TLR2 participent également dans la défense contre la colonisation par C. albicans, sans pour autant que leurs déficits n’entrainent de dissémination de la levure. A l’inverse, le récepteur TLR6 favorise la colonisation par C. albicans. La MBL et les récepteurs TLR1/TLR2/TLR6 régulent aussi l’expression des cytokines pro-inflammatoires impliquées dans les réponses Th1 et Th17. Ces résultats expérimentaux ont incité à envisager la poursuite de notre travail en approfondissant l’étude clinique sur des variations quantitatives et qualitatives de la MBL chez les patients atteints de MC et leur lien éventuel avec la persistance de l’inflammation intestinale. L’étude sur la cohorte de patients MC a montré que le gène MBL2 était associé à un déficit quantitatif en MBL et un déficit qualitatif du complexe MBL-MASP chez les sujets sains et les patients. Ce polymorphisme est également associé à des taux élevés d’ASCA chez les patients MC (p<0.05) de la maladie et il est fréquemment associé aux formes sévères de la maladie. De plus, le variant rs2066844 du gène NOD2, variant associé à la MC, est significativement corrélé à une diminution de l’activité fonctionnelle du complexe MBL-MASP, sans diminution quantitative des taux de MBL.Ces données montrent, pour la première fois, la production intestinale de MBL, qui est modulée par la colonisation par C. albicans. Elles confirment le rôle de la MBL et des récepteurs TLR dans l’homéostasie intestinale et dans la défense contre C. albicans. De plus, l’étude clinique sur la cohorte de patients MC révèle un défaut d’activité fonctionnelle du complexe MBL-MASP chez les patients MC ayant des polymorphismes des gènes MBL2 et NOD2, pouvant mener à un phénotype sévère de la maladie. Ces études expérimentales et cliniques apportent des nouvelles données sur le lien entre les récepteurs de l’immunité innée et la maladie de Crohn ainsi que la colonisation/infection fongique et ouvrent des nouvelles perspectives sur le lien entre la persistance de la colonisation fongique et le déficit quantitatif/qualitatif de la MBL chez les patients MC. / Crohn’s disease (CD) is an inflammatory bowel disease characterized by a dysregulation of the inflammatory response caused by dysbiosis and immune system disorders. Mannose Binding Lectin (MBL) and Toll like receptors (TLR) are involved in recognition of microorganisms and inflammatory response. They can recognize different patterns on the surface of the pathogens including Candida albicans. This pathogenic yeast is an immunogen for anti-Saccharomyces cerevisiae antibody (ASCA), diagnostic marker of CD. An association between MBL-deficiency and ASCA is observed in CD, and this MBL deficiency is frequently associated with a severe clinical phenotype of CD. In addition to MBL, TLR2, which forms heterodimers with either TLR1 or TLR6, have a major role in the innate immune defense against C. albicans and promotes intestinal homeostasis. In this project, we studied the role of MBL, TLR1, TLR2, and TLR6 in intestinal homeostasis and elimination of C. albicans in the intestinal tract. In the first part this study; we assessed the effect of either MBL or TLR deficiencies on C. albicans colonization and intestinal inflammation in a murine model. In the second part of this study, we assessed the role of MBL polymorphisms in the modulation of MBL level and activity in CD patients.In murin model, we showed that MBL is locally produced by the epithelial cells in response to C. albicans sensing and to intestinal inflammation and this lectin is required for the intestinal homeostasis. MBL-deficient mice had a higher level of colonization than wild-type mice. DSS-induced colitis promoted a high C. albicans colonization and dissemination to the kidneys and lungs of MBL-deficient mice. MBL-deficient mice exhibited reduced expression of Il-1β and IL-6 and elevated expression of IL-17, IL-23, dectin-1 and TLR-4. In terms of mice deficient in TLRs, DSS treatment and C. albicans oral challenge induced greater weight loss, worse clinical signs of inflammation, higher histopathologic scores, and increased mortality rates in TLR1-/- and TLR2-/- mice when compared to TLR6-/- and wild-type mice. Cytokine expression (TNF, IL-1β, IL-10, and IL-17A) was significantly increased in TLR1-/- and TLR2-/- mice, while they were decreased in TLR6-/- mice. In addition to the experimental studies, we observed in the clinical cohort of CD patients that MBL2 variant rs5030737 (codon 52) was associated with a low level of MBL that leads to impaired MBL-MASP functional activities in both CD patients and healthy subjects. Furthermore, this variant was also associated with a higher level of ASCA in CD patients (p<0.05). Increased ASCA levels were found in CD patients with stricture formation and penetrating disease complications, 42% and 21% respectively. Besides, we observed that NOD2 variant rs2066844, associated with susceptibility to CD, is significantly correlated with the impairment of the functional activity of MBL-MASP complex.Overall, this study emphasizes the role of MBL and TLR in intestinal homeostasis and host defense against C. albicans and shows for the first time that MBL could be produced locally in the intestinal epithelial cells in response to C. albicans sensing. In terms of the clinical study, we observed that CD patients with a severe clinical phenotype have an impairment in MBL-MASP functional activity, and that this defect is associated with MBL2 and NOD2 polymorphisms These experimental studies contribute to understand the link between innate immunity receptors, Crohn’s disease and fungal colonization/infection. Finally, this study leads to new objectives which are to study the link between intestinal microbiota and MBL variation in Crohn’s disease patients.

La maladie d’Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative la plus commune et reste à ce jour incurable. Elle se caractérise par l’accumulation dans le cerveau du peptide neurotoxique bêta-amyloïde (Aβ), par une neuroinflammation et des atteintes neurovasculaires, qui ensemble induisent la mort des neurones et des déficits cognitifs. En raison de leurs activités multiples, les métalloprotéases matricielles (MMPs) émergent comme des acteurs importants dans la MA. Mes travaux ont permis de mieux comprendre l’implication de 3 de ces MMPs dans la MA et soulignent le caractère spécifique et complémentaire de MT1- et MT5-MMP, directement impliquées dans la production d’Aβ, et le rôle de MMP-12 dans la neuroinflammation et dans la perte d’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, un système vasculaire particulier qui protège efficacement le cerveau. Mes travaux ouvrent des perspectives dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur la modulation de ces MMPs. / Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease and remains to this day incurable. It is characterized by the accumulation in the brain of the beta-amyloid (Aß) neurotoxic peptide, by neuroinflammation and neurovascular damage, which together induce neuronal death and cognitive deficits. Because of their multiple activities, matrix metalloproteinases (MMPs) are emerging as important players in AD. My work has provided insight into the involvement of 3 of these MMPs in AD and highlight the specific and complementary nature of MT1- and MT5-MMP, directly involved in the production of Aß, and the role of MMP-12 in neuroinflammation and in the loss of integrity of the blood-brain barrier, a particular vascular system, which effectively protects the brain. My work opens perspectives in the development of new therapeutic strategies based on the modulation of these MMPs.

The human GI tract has evolved to simultaneously absorb nutrients and be the frontline in host defence. These seemingly mutually exclusive goals are achieved by a single cell thick epithelial barrier, and a complex resident immune system which lives in symbiosis with the intestinal microflora and is also able to rapidly respond to invading pathogens. An immunological balance is therefore required to permit tolerance to the normal intestinal microflora, but also prevent the dissemination of pathogenic micro-organisms to the rest of the host. Inappropriate immune responses in genetically susceptible individuals are the hallmark of human inflammatory bowel disease (IBD) and are thus targeting effector immune cells and their cytokines remains the mainstay of treatment. However despite vigorous efforts to delineate the genetic contribution to IBD disease susceptibility using large multinational cohorts, the majority of disease heritability remains unknown. Epigenetics describes heritable changes in chromatin that are not conferred by DNA sequence. These incorporate changes to histones, chromatin structure and DNA methylation, which confer changes to gene transcription and thus gene expression and cellular function. Methylbinding proteins (MBD) have the ability to bind to methylated DNA and recruit large chromatin remodeling complexes that underpin a variety of epigenetic modifications. Methyl- CpG-binding domain protein 2 (MBD2) is one such MBD that is required for appropriate innate (dendritic cell) and adaptive (T cell) immune function, though its role has not been investigated in the GI tract. We hypothesized that alterations in chromatin are central to the reprogramming of normal gene expression that occurs in disease states. By defining the phenotype of immune cells in the absence of MBDs we hope to understand the mechanisms of chromatin-dysregulation that lead to immune-mediated diseases such as IBD. We therefore aimed to assess the role of MBD2 in colon immune cells in the steady state and in murine models of GI tract inflammation, thereafter identifying the culprit cell types and genes responsible for any observed changes. We envisaged that investigating heritable, epigenetic changes in gene expression that are inherently more amenable to environmental manipulation than our DNA code, may provide novel insight to a poorly understood mechanism of disease predisposition. In addition identifying the cellular and gene targets of Mbd2 mediated changes to immune homeostasis that may provide exciting and novel approaches to therapeutic modulation of pathological inflammatory responses. In chapter 3 we assessed the expression of Mbd2/MBD2 in the murine/human GI tract. Consistent with existing mouse data, levels of Mbd2 mRNA increased between anatomical divisions of small (duodenum, ileum, terminal ileum) and large intestine (caecum, colon, rectum). In addition MBD2 mRNA was greater in the rectum versus ileum, with active IBD associated with lower rectal MBD2 mRNA compared to quiescent IBD controls. Thus we sought to understand the role of Mbd2 in the colon, where mRNA levels were the highest in the GI tract and where appropriate immune function is central to prevent damaging inflammation. To address these aims required the development of existing methods of cell surface marker expression analysis using flow cytometry techniques to simultaneously identify multiple innate and adaptive immune populations. Using naïve Mbd2 deficient mice (Mbd2-/-) we observed CD11b+ CD103+ DCs were significantly reduced in number in Mbd2 deficiency. To understand the role of Mbd2 in colonic inflammation we employed a mouse model of chemical (DSS) and infectious (T. gondii) colitis comparing Mbd2-/- and littermate controls (WT). Mbd2-/- were extremely sensitive to DSS and T. gondii mediated colonic inflammation, characterized by increased symptom score, weight loss and histological score of tissue inflammation (DSS) and increased antibody specific cytokine responses (T. gondii) in Mbd2 deficient animals. Flow cytometry analysis of colon LP cells in both infectious and chemical colitis revealed significant accumulation of monocytes and neutrophils in Mbd2-/-. Indeed monocytes and neutrophils were the principal myeloid sources of IL-1b and TNF in DSS colitis and the number of IL-1b/TNF+ monocytes/neutrophils was significantly greater in Mbd2-/-. Lastly we employed our colon LP isolation techniques to analyse immune populations in active and quiescent IBD and healthy controls, using endoscopically acquired biopsy samples. Analysis revealed that as in murine colitis, active human IBD is characterized by the accumulation of CD14High monocyte-like cells, with an associated increased ratio of macrophage:monocyte-like cells. In Chapter 4 we sought to understand the cellular sources of Mbd2 that may explain the predisposition of Mbd2-/- to colitis. Firstly we restricted Mbd2 deficiency to haematopoietic cells using grafting Mbd2-/- bone marrow (BM) into lethally irradiated WT mice. These animals treated with DSS displayed increased weight loss, symptom score, neutrophil accumulation and histopathology score compared to mice irradiated and grafted with WT BM. Given the accumulation of monocytes in Mbd2-/- DSS treated mice, and existing literature supporting a pathogenic role in this model, we then investigated the role of Mbd2 in monocyte function. Colon monocytes sorted from Mbd2-/- and WT DSS treated mice displayed similar expression for many pro-inflammatory genes (Il6, Il1a, Il1b, Tnf), but demonstrated significantly dysregulated expression for some others (Regb, Lyz1, Ido1, C4a). To investigate this in a more refined model, we lethally irradiated WT mice and repopulated them with a WT:Mbd2-/- BM mix. This enabled the analysis of WT and Mbd2-/- haematopoietic cells in the same animal. Colon WT and Mbd2-/- monocyte recruitment and cytokine production in DSS treated mixed BM chimeras was equivalent between genotypes suggesting that Mbd2 deficiency in monocytes alone did not explain the increased susceptibility of Mbd2-/- to DSS colitis. We then restricted Mbd2 deficiency to CD11c expressing cells, given the known role for Mbd2 in their function, and for CD11c+ cells in DSS, using a CD11cCreMbd2Fl/Fl system. DSS treated mice with Mbd2 deficient CD11c+ cells demonstrated increased weight loss, symptoms score, histolopathology score, monocyte and neutrophil colon accumulation compared to controls. To further explore the role of Mbd2 in colon CD11c+ cells, macrophage and DCs from DSS treated WT and Mbd2-/- mice were purified and their gene expression analysed. Mbd2-/- versus WT macrophages demonstrated significantly altered expression of both pro- (Il1a, C6, Ido1, Trem2) and antiinflammatory (Tgfbi, Retnla) pathways that we hypothesized was a method for attempted host control of excessive colon damage in Mbd2-/- mice. DC gene expression analysis was hampered by small sample size, but demonstrated a large number of small expression changes, including IL-12/IL-23 (Jak2) and autophagy (Lrrk2) pathways. Lastly levels of costimualtory molecules (CD40/CD80) were increased in Mbd2-/- but not CD11cΔMbd2 colon LP DCs/macrophages suggesting that non-CD11c+ cellular sources of Mbd2 were required to produce increased activation phenotype in these cells. Finally in Chapter 5 we explored the role for Mbd2 in non-haematopoietic cells, namely the colonic epithelium. Here we first developed a novel method for identifying and purifying these cells using flow cytometry. Mbd2 deficient colonic epithelium demonstrated increased expression of activation markers MHC II and LY6A/E in the steady state and in DSS / T. muris mediated colonic inflammation. Indeed FACS purified colon epithelial cells from naive and DSS treated, Mbd2-/- and WT mice revealed conserved dysregulated gene expression independent of inflammation: Both naïve and inflamed Mbd2 deficient epithelium displayed significantly increased expression of genes responsible for antigen processing/presentation (MHC I, MHC II, immunoproteasome) and decreased expression of genes involved in cell-cell adhesion (Cldn1, Cldn4). Lastly we investigated whether the observed differences in Mbd2-/- cell types conferred alterations in the makeup of the intestinal microflora. Interestingly independent of co-housing of Mbd2-/- and WT animals, Mbd2 deficiency consistently predicted the microbial composition, with increased levels of Clostridales and decreased levels of Parabacteroides bacteria. Collectively we have identified CD11c+ cells, monocytes and colon epithelial cells as key cell types for Mbd2 mediated changes in gene expression that affect mucosal immune responses. These data thus identify Mbd2 gene targets within these cell types as exciting new areas for investigation and therapeutic modulation to limit damaging GI tract inflammation.

En réponse à l'activation et/ou une apoptose, les cellules endothéliales (CE) libèrent dans le milieu environnant des microparticules endothéliales (MPE). Les microparticules sont des vésicules de petite taille résultant d'évènements membranaires liés à une perte de l'asymétrie des phospholipides. Peu de travaux concernent l'étude des mécanismes de génération des MPE et l'influence du territoire vasculaire sur la capacité de vésiculation des CE n'est pas connue. Nous avons montré que la thrombine induit la génération de MPE par un mécanisme complexe impliquant un lien entre coagulation et inflammation sur les CE macro et microvasculaires. A partir de l'étude du transcriptome, nous avons mis en évidence l'implication de TRAIL dans la génération des MPE procoagulantes par la thrombine. A l'état basal, les CE issues de différents territoires vasculaires présentent des capacités différentes de vésiculation, les CE microvasculaires présentant une plus grande capacité à libérer des MPE. L'étude du transcriptome a permis de déterminer des signatures moléculaires représentatives des territoires macro et microvasculaires. Nos travaux mettent en évidence une génération différentielle de MPE en fonction du calibre des vaisseaux et les signatures spécifiques pourraient permettre une meilleure caractérisation du territoire endothélial lésé. / In response to activation and/or apoptosis, endothelial cells (EC) release endothelial microparticles (EMP) in the extracellular space. Microparticles are small-sized vesicles resulting from membrane events leading to a loss of phospholipid asymmetry. Few works have documented the mechanisms underlying EMP generation and the influence of vascular bed on EMP release remains largely unknown. Our works showed that thrombin induced EMP generation through a complex mechanism involving a cross-talk between coagulation and inflammation in macro and microvascular EC. Using a global gene expression study, we have evidenced the involvement of TRAIL in the procoagulant EMP generation induced by thrombin. In a basal state, EC from various vascular beds showed different capacities of EMP release, with microvascular EC displaying the highest capacity. Gene expression study identified molecular signatures representative of EC from macro and microvascular beds. Our works highlight the role of the vascular beds in the capacity of EC to generate EMP according to the vessel caliber. The specific gene signatures could improve our knowledge the endothelial dysfunction and a better characterization of the damaged vascular beds.

L’acyl-CoA oxydase 1 (ACOX1) est l’enzyme qui catalyse la première étape de la voie classique de la β-oxydation peroxysomale. Cette voie catabolise exclusivement les acides gras à très longue chaîne (AGTLC). Chez l’homme, la déficience en ACOX1 est à l’origine de la pseudo adrénoleucodystrophie néonatale (P-NALD), une maladie neurodégénérative rare caractérisée par une accumulation des AGTLC dans le plasma et les tissus, une hépatomégalie, un retard du développement moteur et une démyélinisation de la matière blanche cérébrale. Chez la souris, l’extinction du gène Acox1 provoque une accumulation des AGTLC dans le plasma, un retard de croissance, une stéatose hépatique et le développement d’une hépatocarcinogenèse avec l’âge. Cependant, ces souris ne développent pas de symptômes cérébraux contrairement aux patients P NALD. Au cours de ce travail, on a pu montrer sur des fibroblastes issus de patients atteints de P NALD qu’en absence d’activité ACOX1, les peroxysomes sont diminués en nombre et augmentés en taille avec un niveau de β-oxydation peroxysomale fortement réduit. L’accumulation des AGTLC suite à la déficience en ACOX1 dans ces cellules provoque, au niveau transcriptionnel, la perturbation de la voie de synthèse du cholestérol et déclenche une réaction inflammatoire caractérisée par l’activation de la voie de l’IL-1 et la sécrétion d’IL-6 et d’IL-8. Le rôle métabolique important que joue l’ACOX1 dans l’homéostasie énergétique cellulaire a pu être souligné chez l’homme et chez la souris. En effet, la déficience en ACOX1 dans les fibroblastes de patients P-NALD perturbe la morphologie de la mitochondrie qui apparaît anormale ainsi que le métabolisme énergétique mitochondrial caractérisé par une inhibition de PGC-1α par acétylation, une surexpression de l’activité du complexe V et une diminution du taux d’ATP mitochondrial. L’absence dans le foie de l’activité ACOX1, chez la souris Acox1-/-, se traduit par des perturbations, au niveau mitochondrial, dela biogenèse et du métabolisme énergétique. Ces perturbations mitochondriales se caractérisent par une diminution de l’activité du complexe IV de la chaîne respiratoire accompagnée d’une diminution de la respiration. Cependant, ces perturbations n’affectent pas le taux d’ATP total. Les altérations mitochondriales observées chez les souris Acox1-/- sont en grande partie corrigées par l’expression de l’ACOX1 humaine. Ceci montre le rôle indispensable de l’ACOX1 dans l’homéostasie de la fonction mitochondriale.L’ensemble des résultats obtenus au cours de ce travail confirme l’importance de l’activité acyl-CoA oxydase 1 pour la dégradation des AGTLC au niveau du système de β-oxydation peroxysomale et pour la biogenèse du peroxysome. L’accumulation des substrats non métabolisés en absence d’ACOX1 pourrait être à l’origine de la perturbation de la fonction mitochondriale montrant à quel point l’activité de l’ACOX1 est indispensable au métabolisme cellulaire / Acyl-CoA oxidase 1 (ACOX1) is the rate-limiting enzyme of the peroxisomal fatty acid β-oxidation pathway of very-long-chain fatty acid (VLCFAs). In humans, ACOX1 deficiency, also called pseudo-neonatal adrenoleukodystrophy, is an autosomal recessive and a severe form of the peroxisomal β-oxidation deficiency. Patients suffer from severe delayed motor development followed by a progressive neurological regression including progressive hypodensity of cerebral white matter, hepatomegaly and deafness and die during late-infantile period. Elevated plasma and tissues VLCFAs levels are detected in these patients. Mice lacking ACOX1 develop severe microvesicular steatohepatitis with increased intrahepatic H2O2 levels and hepatocellular regeneration. Liver cell proliferation in Acox1-/- mice leads to complete replacement of steatotic hepatocytes with hepatocytes that exhibit massive spontaneous peroxisome proliferation. Older mice develop hepatocellular carcinomas due to the sustained activation of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha (PPARα). Contrary to humans, mice lacking ACOX1 have no apparent neurological disorder. Based on fibroblasts cell model from P-NALD patients, we show that ACOX1 deficiency lead to abolition of peroxysomal β-oxidation of cerotic acid (C26:0) and modification of peroxysomal morphology which appear reduced in number and enlarged in size. Moreover, accumulation of VLCFAs in ACOX1 deficiency in human fibroblasts interferes at the transcription level with cholesterol synthesis pathway. Furthermore, these cells show activation of interleukin-1b pathway with elevated production of interleukin-6 and interleukin-8 as an inflammatory response to metabolic disturbance due to VLCFAs accumulation. Furthermore, we show in this study that the ACOX1 deficiency in human fibroblasts and in mice liver leads to alteration of the mitochondrial ultra structure, changes in the expression and activity of mitochondrial chain complexes. These alterations of mitochondrial functions are accompanied by reduction in mitochondrial ATP levels in human fibroblasts and decreased mitochondrial respiration in ACOX1 deficient mice. Interestingly, the mitochondrial changes observed in Acox1-/- mice are restored by expression of human ACOX1 in liver suggesting an essential role of human and murine Acyl-CoA oxidase 1 activity in preventing mitochondrial and lipid disturbance.Together, the results presented in this work underscore the important role of ACOX1 in humans and mice to ensure peroxisomal β-oxidation, VLCFAs catabolism and to preserve peroxisomal morphology. Given mitochondrial perturbation in ACOX1 deficiency, it is clear that this enzyme plays a pivotal role in preventing VLCFAs accumulation and their cellular toxicity and guarantees mitochondrial normal morphology and function in response to energy demand

M. Tech. / Plantar fasciitis is the most common cause of heel pain for which professional care is sought (Singh, 2008). Plantar fasciitis is a common injury, and one which is known to be stubborn to many forms of treatment. The aim of the study was to determine the most effective treatment for individuals suffering with plantar fasciitis comparing three protocols, i.e. mobilisation and manipulation of the foot and ankle with cross friction massage of the plantar fascia versus stretching of the gastroc-soleus complex with cross friction massage of the plantar fascia or a combination of the aforementioned treatments. Participants in the study were recruited from information pamphlets, the University of Johannesburg Chiropractic and Podiatry Day Clinics and running clubs. Only those participants that conformed to the selection criteria were allowed to participate in the study. A total of forty five participants were included. These participants were randomly placed into one of three groups of fifteen participants in each group. Group one received manipulation and mobilisation therapy to the foot and ankle with cross friction massage of the plantar fascia. Group two received cross friction massage of the plantar fascia and stretching of the gastroc-soleus muscle. Group three received a combination of the aforementioned therapies. Subjective data was collected using the Short Form McGill Pain Questionnaire (SF-MPQ) and the Foot Function Index (FFI). Objective data was collected using the algometer to test differences in pain at the plantar fascia as well as ankle range of motion in dorsiflexion and plantarflexion which was measured using a goniometer. The results of this study indicate that cross friction massage of the plantar fascia and stretching of the gastroc-soleus complex would appear to have shown the greatest overall improvement in terms of reducing the pain and disability and ankle dorsiflexion range of motion. Manipulation of the foot and ankle, cross friction massage of the plantar fascia and stretching of the gastroc-soleus complex proved to have shown the greatest overall improvement in plantarflexion only. Based on the results of the study, cross friction massage and gastroc-soleus stretching is the most effective treatment protocol for plantar fasciitis.

La mucoviscidose (Cystic Fibrosis, CF) est caractérisée par une symptomatologie variée, dominée par la gravité de l'atteinte pulmonaire et une réponse inflammatoire inadaptée. Elle est due à des mutations du gène CFTR codant un canal chlorure AMPc-dépendant à la surface des cellules épithéliales. L'inflammation des voies aériennes de type neutrophilique est caractérisée au niveau cellulaire par une surproduction de cytokines pro-inflammatoires telles que l'interleukine-8 (IL-8) et une activation anormale des facteurs de transcription impliqués dans les voies de signalisation de l'inflammation comme NF-κB, AP-1 et PPARγ.Notre projet est d'identifier des agents à effet anti-inflammatoire dans le contexte de la mucoviscidose et d'en décrypter les mécanismes d'action. Nous avons pour cela étudié l'effet de molécules anti-inflammatoires avec une autorisation de mise sur le marché mais jamais testées pour la mucoviscidose et l'effet de COMMD1 une protéine pléïotropique impliquée dans l'inhibition de l'inflammation et identifiée au laboratoire pour interagir avec CFTR.Dans un premier temps nous avons montré l'activité anti-inflammatoire de COMMD1 dans le contexte de la mucoviscidose via son action anti-NF-κB. Dans un second temps nous avons montré que le sulindac et l'amlexanox permettent de moduler des facteurs dérégulés dans des cellules CF. Ces molécules inhibent l'activité de NF-κB et activent PPARγ. Le sulindac permet de diminuer la sécrétion d'IL-8 in vitro sur des cellules épithéliales bronchiques et in vivo sur modèles d'inflammation pulmonaire murin. De plus nous avons montré que le sulindac augmente le transport des ions chlorures via CFTR sur des cellules épithéliales nasales humaines non CF suggérant que le sulindac a un double effet anti-inflammatoire et potentiateur.Ce projet de recherche nous a permis de proposer de nouveaux candidats pour les thérapies anti-inflammatoires dans la mucoviscidose et d'initier l'étude de leur mécanisme d'action. / Cystic fibrosis (CF) is characterized by a varied symptomatology dominated by the lung injury severity and inappropriate inflammatory response. It is caused by mutations in the CFTR gene that encodes a cAMP-dependent chloride channel on the surface of epithelial cells. Airway inflammation with neutrphilic profil is characterised by increased Interleukine-8 (IL-8) secretion with dysregulation of transcription factors implicated in the inflammatory pathway such as NF-κB, AP-1 and PPARγ.Our aim is to evaluate agents with anti-inflammatory effect in CF context and to decrypt their mechanisms of action. We have study the effect of anti-inflammatory FDA approved drugs having a yet undefined effect in CF airway epithelial cells and the effect of COMMD1 a pleiotropic protein involved in the inhibition of inflammation and identified in the laboratory to interact with CFTR.In a first time we have shown the anti-inflammatory activity of COMMD1 mediated by its anti-NF-kB activity in the CF context. In a second time we have shown that sulindac and amlexanox can modulate factors dysgulated in CF cells. Both inhibit NF-κB and activate PPARγ. Sulindac reduces IL-8 secretion in vitro on airway epithelial cells and in vivo in mouse model of lung inflammation. Additionally, sulindac increases CFTR-dependent chloride currents in non-CF primary human nasal epithelial cells suggesting that sulindac has a dual anti-inflammatory and potentiator effect.This research has allowed us to propose good anti-inflammatory agents for CF context and to initiate the study of their molecular targets.

L'implantation cochléaire reste à ce jour le seul moyen capable de restaurer la perception auditive chez les personnes présentant une surdité sévère ou profonde en échec d'appareillage conventionnel. Son principe repose sur la stimulation électrique directe des neurones auditifs de la cochlée par un faisceau d'électrode inséré dans l'oreille interne. Malgré les progrès réalisés dans le manufacturage des électrodes et dans la technique chirurgicale, le geste d'insertion du faisceau d'électrode demeure traumatique. Ce traumatisme est souvent responsable de la perte de l'audition résiduelle sur les fréquences graves et d'une réaction inflammatoire conduisant à une cicatrisation fibreuse. Cette réaction fibreuse est délétère à la fois pour le fonctionnement de l'implant, car augmentant l'impédance des électrodes, mais aussi pour l'audition résiduelle lorsqu'elle est préservée, limitant ainsi les possibilités de stimulation hybride électro-acoustique. Aussi les recherches actuelles tendent à réduire cette fibrose par des moyens pharmacologiques limités, utilisant un corticoïde (dexaméthasone), sans pour autant que son efficacité n'ait été démontrée de manière formelle in vitro ou in vivo. En outre, les cibles moléculaires visées lors de la réaction inflammatoire et fibrotique dans la cochlée n'étant pas clairement identifiées, il est difficile de savoir si cette approche thérapeutique est la plus adaptée. Dans ce travail nous avons donc mis au point des modèles in vitro de culture de tranche de cochlée et d'explant cochléaire de rat pour tester l'efficacité antifibrotique et la toxicité de plusieurs drogues, dont la dexaméthasone, mais aussi l'aracytine, antimitotique non ototoxique et d'utilisation sûre au contact du système nerveux central. Entre nos mains, il apparaît que la stratégie antimitotique par application d'aracytine était plus efficace contre la fibrose et moins toxique pour les cellules sensorielles que la dexamethasone. Dans une seconde partie de ce travail, nous avons utilisé deux modèles in vivo de fibrose cochléaire, à savoir : l'induction d'une labyrinthite immune à Keyhole Limpet Hemocyanin et l'implantation chronique d'un corps étranger intra-cochléaire. A nouveau, l'aracytine délivrée par pompe osmotique intracochléaire permettait de réduire significativement la fibrose dans le modèle de labyrinthite alors que l'effet de la dexamethasone n'était pas significatif. De même la préservation de l'audition était statistiquement meilleure dans le groupe des animaux traités par antimitotiques. Aussi seule l'aracytine a été testée dans l'autre modèle de corps étranger intracochléaire. Elle permettait également de réduire la fibrose observée dans la cochlée, sans effet toxique sur les neurones auditifs. Si la préservation de l'audition était impossible dans le groupe contrôle, l'audition sur les basses fréquences était conservée chez les animaux traités par aracytine. Enfin, les seuils de stimulation électrique capables de provoquer une réponse électrophysiologique par le potentiel évoqué auditif étaient significativement inférieurs dans le groupe traité par aracytine. Ainsi, nous avons pu montrer qu'une stratégie antimitotique était capable d'inhiber efficacement la fibrose dans la cochlée in vitro et in vivo, et ce avec une efficacité supérieure à la dexaméthasone. Nous recommandons donc d'envisager en pratique clinique l'utilisation de l'aracytine pour prévenir la fibrose cochléaire. De plus, ce travail souligne l'intérêt de mieux décortiquer les voies cellulaires conduisant à l'inflammation et à la fibrose cochléaire, de sorte à déterminer les meilleures cibles et molécules candidates. Ces mêmes molécules pourront être testées sur les modèles que nous avons mis au point afin de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques à la prévention de la fibrose cochléaire. / Cochlear implantation is the only treatment capable of restoring the auditory pathways in patient suffering from severe to profound hearing loss with poor benefit from hearing aids. Its functioning relies on direct electric stimulation of primary auditory neurons through an electrode array inserted into the cochlea.Despite the advances in electrode design and surgical technique, the act of inserting the electrode array is still traumatic. These traumas result in the loss of residual hearing in low frequencies and provoke an inflammatory reaction leading to fibrous scarring. This fibrous reaction is deleterious to not only the implant performance by increasing the impedance of the electrodes, but also the preserved residual hearing which limit the possibilities of hybrid electro-acoustic stimulation.Current researches aim at limiting this fibrosis by drug application, such as corticosteroids. Therefore dexamethasone is frequently used, but its effectiveness has been only demonstrated formally in vitro or in vivo. Furthermore, the molecular targets set in the fibrotic and inflammatory reaction in the cochlea are not clearly identified, and it is unclear whether this therapeutic approach is best suited.In this study we have developed in vitro models of rat cochlear slice and cochlear explants culture to test the antifibrotic efficacy and toxicity of various drugs, including dexamethasone, but also aracytine, an antimitotic drug with very low ototoxicity which is safely used in contact with the central nervous system. In our hands, it appears that antimitotic aracytine is more effective against fibrosis and less toxic to the sensory cells than the anti-inflammatory drug dexamethasone.In the second part of this study, we used two in vivo models of cochlear fibrosis namely the KLH(keyhole limpet hemocyanin)-induced sterile labyrinthitis and the foreign-body-induced chronic labyrinthitis. Again, the intracochlear fibrosis in the model of KLH-induced labyrinthitis was signticantly reduced by the osmotic pump with aracytine, while the effect of dexamethasone was not significant. Also the preservation of the hearing was statistically better in the group of animals treated with this antimitotic drug. Consequently, aracytine was the only drug tested in the other model of foreign-body-induced labyrinthitis. Again, aracytine reduced fibrosis in the cochlea, without any toxic effects on auditory neurons. While the preservation of the hearing was not achieved in the control group, the low frequencies hearing was preserved in animals treated with aracytine. Finally, the thresholds of electrical stimulation eliciting auditory brainstem response recordings were significantly lower in the treated group by aracytine.Thus, we have shown that an antimitotic strategy was able to inhibit fibrosis effectively in the cochlea in vitro and in vivo, and this with a greater efficiency than dexamethasone. We therefore recommend considering in clinical practice the use of aracytine to prevent cochlear fibrosis. In addition, this study stresses the importance of analyzing the cellular pathways of cochlear inflammation and fibrosis, in order to determine the best targets and candidate molecules. These molecules could be tested on the models that we have developed in order to offer new therapeutic options to prevent cochlear fibrosis.