Zoonotische, durch Vektoren übertragene Arboviren (engl.: arthropod-borne-viruses) aus der Familie der Flaviviridae, wie das West-Nil-Virus (WNV), das Usutu-Virus (USUV) und das Frühsommer- Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV) stellen eine erhebliche Bedrohung für die Gesundheit von Menschen und Tieren dar. Das WNV wurde im Jahr 2018 erstmalig in Deutschland nachgewiesen. Seitdem wird von Infektionen bei Menschen, Pferden und Vögeln regelmäßig v. a. aus der ostdeutschen Tiefebene berichtet. Der natürliche Infektionszyklus des WNV und des USUV spielt sich vorwiegend zwischen Vögeln und Stechmücken ab, aber auch Menschen und Pferde sind immer wieder von milden bis hin zu fatalen Krankheitsverläufen nach einer WNV-Infektion betroffen. Eine noch größere Bedeutung für die öffentliche Gesundheit wird dem Virus der Frühsommer- Meningoenzephalitis (FSME) mit bis zu 10 000 Erkrankungen in Eurasien jährlich zugeschrieben. Im Gegensatz zum WNV und USUV wird es vor allem von Zecken übertragen und hat in Kleinsäugern sein Hauptreservoir. Da Pferde ebenfalls nach Infektionen mit dem WNV und FSMEV erkranken können und spezifische Antikörper nach einer Infektion mit allen drei untersuchten Flaviviren ausbilden, sind sie geeignet, um Aufschluss über deren Verbreitung in Deutschland zu geben.Ziel dieser Studie war der Vergleich der Flavivirus-Seropositivitätsrate in der mitteldeutschen Pferdepopulation mit den Zahlen der 2020 durchgeführten Arbeit von Ganzenberg et al. 2022, sowie die Ausweitung des Untersuchungsgebiets auf noch nicht beprobte Landkreise. Durch die erneute Beprobung von bereits 2020 getesteten Pferden sollten Serokonversionen festgestellt und die bereits von Ganzenberg et al. 2022 erhobenen Risikofaktoren für eine Infektion mit dem WNV anhand des neu gesammelten Materials überprüft werden. Abschließend wurden zusätzlich anhand des Studienmaterials Risikofaktoren für die Infektion von Pferden mit dem FSME-Virus untersucht.Das bereits von Ganzenberg et al. 2022 definierte Studiengebiet, welches neun Landkreise in den Bundesländern Sachsen, Sachsen-Anhalt und Brandenburg umfasste, wurde für die erneute Erfassung der Flavivirus-Seropositivitätsrate 2022 an der Nordgrenze um sechs Landkreise erweitert. Erneut wurden Pferdehalter mit fünf oder mehr gemeldeten Equiden zur Teilnahme an der Studie 74 eingeladen. Zur Teilnahme waren wie bereits bei Ganzenberg et al. 2022 gesunde Pferde geeignet, die mindestens zwölf Monate alt und nicht gegen das WNV geimpft waren, und die dauerhaft in der Region gehalten wurden. Nach der Probennahme erfolgte bei allen Serumproben ein Screening mittels kommerziellem kompetitivem ELISA (cELISA) auf flavivirusspezifische Antikörper. Alle positiven und grenzwertigen Proben aus den ELISA-Untersuchungen wurden beim Referenzlabor im Virusneutralisationstest (VNT) differenziert und bestätigt. Die per Fragebogen erhobenen individuellen sowie haltungsspezifischen Daten wurden mittels logistischer Regression auf Risikofaktoren für eine Infektion mit dem WNV und dem FSMEV untersucht.Im Frühjahr 2022 (Januar-März) wurde von 1232 Pferden aus 114 Betrieben Blut entnommen und das Serum anschließend im cELISA auf flavivirusspezifische Antikörper untersucht. Von allen untersuchten Seren zeigten 125 ein positives Ergebnis. Von diesen konnten im anschließend durchgeführten VNT 40/125 (3,3 %) als neutralisierend gegen das WNV, 5/125 (0,4 %) als neutralisierend gegen das USUV und 69/125 (5,6 %) als neutralisierend gegen das FSMEV bestätigt werden. Bei drei Seren konnte keine eindeutige Zuordnung zu einem der drei Viren erfolgen. Diese Seren stellen somit potenzielle Doppelinfektionen dar. Abschließend konnten die Antikörper aus acht Seren keinem der drei untersuchten Viren im Neutralisationstest zugeordnet werden. Weiterhin wurden eine WNV-Serokonversion und vier FSMEV-Serokonversionen bei in der Testung von 2020 noch seronegativen Pferden festgestellt. Bei 17 Tieren, welche 2020 positiv auf Antikörper gegen das FSMEV getestet wurden, waren erneut Antikörper nachweisbar. Weiterhin konnten bei vier Tieren erneut Antikörper gegen das USUV festgestellt werden. Bei USUV-positiven Pferden waren bis zu 15 Monate und bei FSMEV-positiven Pferden bis zu 19 Monate seit der vorherigen Testung vergangen. Während im Regressionsmodell keine Risikofaktoren für eine WNV-Infektion festgestellt werden konnten, wurden für eine Infektion mit dem FSMEV das Alter der Tiere und die Anzahl der Pferde im Bestand als Risikofaktoren ermittelt. Das Risiko einer Infektion mit dem FSMEV war bei älteren Tieren größer und bei Tieren in großen Beständen kleiner.Diese Studie lieferte weitere Beweise für das Vorkommen von Infektionen mit den drei untersuchten Flaviviren in der mitteldeutschen Pferdepopulation. Die Serokonversion bei Pferden für WNV und FSMEV zeigt, dass diese Viren im Untersuchungsgebiet zirkulieren und auch im Jahr 2021 auf Pferde übertragen wurden. Schließlich hat diese Arbeit gezeigt, dass neutralisierende Antikörper gegen das USUV und das FSMEV in Pferdeseren für mindestens 15 bzw. 19 Monate nach einer vorherigen Infektion persistieren. Prinzipiell kommen Pferde als Sentinels für alle drei untersuchten Flaviviren in Betracht. Im Fall des WNV konnten serologische Nachweise beim Pferd in allen Landkreisen, bei denen bisher Fälle beim Menschen aufgetreten waren, gefunden werden. Weiterhin wurde auch in Landkreisen, in denen noch keine WNV-Infektion beim Menschen gemeldet wurde, serologisch positive Pferde ermittelt. Für die FSME konnte die Studie Antikörper bei Pferden auch in noch nicht als Risikogebiete ausgewiesenen Landkreisen feststellen. Pferde könnten somit ein weiteres ergänzendes Werkzeug zur Abschätzung des Risikos einer humanen FSMEV-Infektion darstellen.:1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 West-Nil-Virus 3 2.1.1 Taxonomie, Morphologie und Verbreitung 3 2.1.2 Infektionszyklus und alternative Übertragungswege 4 2.1.3 Vektorspezies 6 2.1.4 Einflussfaktoren auf den Übertragungszyklus des West-Nil-Virus 7 2.1.5 Pathogenese und Erkrankungsformen nach West-Nil-Virus-Infektion 8 2.1.6 West-Nil-Virus-Erkrankung bei Menschen und Pferden 9 2.1.7 Diagnostik und tierseuchenrechtliche Einordnung 10 2.1.8 West-Nil-Virus-Seroprävalenzstudien 11 2.1.9 Tabelle 1 Equine West-Nil-Virus-Seroprävalenzstudien aus Europa von 1999 bis 2022. 13 2.1.10 Risikofaktoren für eine West-Nil-Virus-Infektion beim Pferd 16 2.2 Das Usutu-Virus 17 2.2.1 Taxonomie und Struktur 17 2.2.2 Übertragung und Epidemiologie 17 2.2.3 Klinik und Pathogenese 17 2.2.4 Diagnostik 18 2.3 Das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus 18 2.3.1 Taxonomie und Struktur 18 2.3.2 Übertragung und Epidemiologie 18 2.3.3 Klinik und Pathogenese 20 2.3.4 Diagnostik 20 3 PUBLIKATION 21 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil 21 3.2 Ergänzende Daten der Publikation 39 4 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNG 67 4.1 West-Nil-Virus 67 4.2 Usutu-Virus 70 4.3 Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus 71 4.4 Schlussfolgerungen 73 5 ZUSAMMENFASSUNG 74 6 SUMMARY 76 7 LITERATURVERZEICHNIS 78 8 DANKSAGUNG 95

Einleitung: Virale Infektionen gefährden global die Gesundheit von Mensch und Tier und stehen unter Beobachtung internationaler Organisationen. Die Eintrittspforte der meisten viralen Erreger sind Schleimhautoberflächen. Das Schleimhaut-assoziierte Immunsystem schützt Lebewesen lokal vor Infektionen. Daher ist das Ziel vieler Impfstoffe eine vor Infektion bzw. Erkrankung schützende Immunantwort zu stimulieren um Schleimhaut-assoziierter Erreger an der Eintrittspforte abzuwehren zu können. Um den Schutz eines Individuums oder einer Population vor solchen viralen Erkrankungen einschätzen zu können, braucht es ein belastbares einfach zu gewinnendes Korrelat. Bei streng Schleimhaut-assoziierten Erregern können Erreger-spezifische Antikörper zwar auch im Serum gefunden werden, doch korreliert die Konzentration in vielen Fällen nicht mit dem Schutz vor Infektion bzw. Erkrankung. Im Menschen wurde ein Zusammenhang zwischen der Konzentration an Antikörpern im Speichel zu denen in der Lungen- bzw. Darmschleimhaut beschrieben. Ziele der Untersuchungen: Die Untersuchungen in der Arbeit dienten zur Überprüfung der Hypothese, dass die Bestimmung neutralisierender Antikörper im Speichel von Schweinen sich zur Beurteilung des Immunstatus gegenüber streng enteral assoziierten Erregern eignet. Es wurde weiterhin die Hypothese aufgestellt, dass mit Speichelproben der enterale Immunstatus von dem des systemischen differenziert betrachtet werden kann. Tiere, Material und Methoden: Als Modellpathogen diente das Rotavirus (RV), ein be-deutender Erreger von gastrointestinalen Erkrankungen bei Säuglingen, Kleinkindern und Jungtieren. Zu Beginn der Arbeit wurde ein RV-spezifischer Virusneutralisationstest (VNT) modifiziert und für den Einsatz von Speichel, Serum und Darmschleim validiert. Von 17 individuellen Schweinen wurden die Pathogen-spezifischen neutralisierenden Titer in Serum, Speichel und Darmschleim bestimmt und die erhobenen Titer auf Korrelation zwischen den Probenmaterialien der individuellen Tiere geprüft (Vergleichsstudie). Um die stark variablen Konzentrationen an IgA (Immunglobulin A) und damit auch an neutralisierenden Antikörpern im Speichel auszugleichen, wurde die Normierung anhand von Elektrolyt- und Amylase-konzentrationen im Speichel angestrebt (Normierungsstudie). Der analysierte Datensatz basiert auf den Werten von 34 Speichelproben, die von fünf Schweinen gewonnen wurden. Abschließend wurde überprüft, ob sich die Antikörperbestimmung im Speichel dazu eignet, den Immunstatus post Vakzinierung im Schwein zu beurteilen (Immunisierungsstudie). Erstmalig wurden dafür 18 Sauen eines Bestands über einen Zeitraum von sechs Monaten während der Einführung eines bestandsspezifischen 96 RVA-Impfstoffs unter Feldbedingungen begleitet. Für die immunologische Aufarbeitung wurden mittels VNT und IFT (Immunfluoreszenztest) in Speichel- und Blutproben RV-spezifische (neutralisierende) Antikörpertiter bestimmt. Ergebnisse: Im Rahmen der Arbeit gelang es einen belastbaren RV-spezifischen VNT zu entwickeln. Die Spezifität wurde durch die Anpassung der Viruslast sowie der Proben-Virus- Inokulationszeit im Protokoll gegenüber dem Ursprungsprotokoll verbessert. Die Sensitivität wurde indirekt über den IFT bestimmt und lag in dem Bereich der IFT-Titer von 8.000 bis 40.000. Die Wiederholbarkeit für mittlere bis hohe VNT-Titer entsprach den WAOH-Empfehlungen. Vergleichsstudie: Eine signifikante Korrelation (0,69) konnte zwischen den neutralisierenden Titern im Speichel und den neutralisierenden Titern im Duodenum festgestellt werden. Die Korrelationen zwischen den neutralisierenden Titern im Speichel und denen im Darmschleim waren höher als die Korrelation zwischen den neutralisierenden Titern im Serum und denen im Darmschleim. Normierungsstudie: Bei der statistischen Auswertung des gesamten Datensatzes ergaben sich keine Hinweise auf Korrelationen zwischen den Amylase- und Elektrolytkonzentrationen und der IgA-Konzentration oder dem VNT-Titer im Speichel. Bei Ausschluss der Datensätze, in denen die IgA-Konzentration im Speichel unter 350 ng/ml lag, zeigte sich jedoch eine signifikant positive Korrelation (Korrelationskoeffizient: 0,7607) der IgA-Konzentration zu den RVC G1P[1]1- spezifischen VNT-Titern (p = 0,0014). Immunisierungsstudie: Die VNT-Titer im Serum als Korrelat zur systemischen Immunantwort und die Speichel-VNT-Titer als Korrelat zur mukosalen Immunantwort verdeutlichten in der Immunisierungsstudie die differenzierte Immunantwort auf den parenteral verabreichten Totimpfstoff. Die Grundimmunisierung erzeugte sowohl im Serum als auch im Speichel einen signifikanten VNT-Titer-Anstieg. Bei der darauffolgenden Auffrischungsimpfung war lediglich in den Serumproben ein erneuter signifikanter VNT-Titer-Anstieg zu messen. Nach Erreichen des Titer-Höhepunkts fielen die Titer im Speichel innerhalb von zwei Wochen und die im Serum in- nerhalb von drei Monaten auf Werte nahe der Ausgangstiter ab. Mittels der IFT-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Speichel-VNT-Titer eine stark positive Korrelation zu den IgA- Titern im Blut sowie die Serum-VNT-Titer zu den IgG-Titern im Blut aufweisen. Schlussfolgerungen: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen einen für alle Probenmaterialien geeigneten VNT zu etablieren. Bei Betrachtung aller drei Teilstudien ergeben sich Indizien, die die aufgestellte Hypothese unterstützen. Die Herausforderungen bei der Nutzung von Speichelproben als Diagnostikum konnten auch in dieser Arbeit aufgezeigt werden. Eine Normierung der neutralisierenden Titer im Speichel sollte weiterverfolgt werden. Möglicherweise ist die Gewinnung von Speichel aus den Unterkiefer- bzw. Unterzungendrüsen geeigneter als Diagnostikum. Zusammenfassend betrachtet, zeigen die Untersuchungen dieser Arbeit auf, dass der differenzierten Erhebung der systemischen und der mukosalen Immunantwort eine besondere Bedeutung zukommt und grundlegende Erkenntnisse zum Verständnis immunologischer Reaktionen mittels Speichel-basierter Diagnostik erlangt werden können. / Introduction: Viral infections are a global burden to human and animal health and are in the focus of international organisations. The entry sites of most viral pathogens are mucosal surfaces. The mucosa-associated immune system protects organisms locally against infections. Therefore, the goal of many vaccines is to stimulate a protective immune response against infection or disease in order to combat mucosal-associated pathogens at the site of entry. In order to assess the protection of an individual or a population against such viral diseases, a robust correlate that can be easily obtained is needed. Although pathogen-specific antibodies can be found in serum, the concentration does often not correlate with protection against infection or disease with strictly mucosa-associated pathogens. In humans, a correlation between the concentration of antibodies in saliva and those in the lung or intestinal mucosa has been described. Objectives: The investigations in this thesis aimed to prove the hypothesis that the determination of neutralising antibodies in the saliva of pigs is suitable for the assessment of the immune status against enteral associated pathogens. It was further hypothesised that saliva samples can be used to differentiate the mucosal immune status from the systemic immune status. Animals, material and methods: Rotavirus (RV), a significant pathogen of gastrointestinal diseases in infants, children and young animals, served as a model. At the beginning of the work, an RV-specific virus neutralisation Assay (VNA) was modified and validated for use with saliva, serum and intestinal mucus. Pathogen-specific neutralising titres were determined in serum, saliva and intestinal mucus from 17 individual pigs and the titres obtained were tested for correlation between the sample materials of the individual animals (comparative study). In order to compensate for the highly variable concentrations of IgA (immunoglobulin A) and thus also of neutralising antibodies in saliva, normalisation was aimed at using electrolyte and amylase concentrations in saliva (normalisation study). The analysed data set is based on the values of 34 saliva samples obtained from five pigs. Finally, it was examined whether the determination of antibodies in saliva is suitable for assessing the post-vaccination immune status in pigs (immunisation study). For the first time, 18 sows of a herd were followed over a period of six months during the introduction of a herd-specific RVA vaccine under field conditions. For immunological work-up, RV specific (neutralising) antibody titres were determined by VNA and IFA (immune fluorescence assay) in saliva and blood samples. 98 Results: In the work developing of a robust RV-specific VNA was successful. The specificity was improved by adjusting the viral load as well as the sample-virus inoculation time in the protocol compared to the original protocol. Sensitivity was determined indirectly by IFA and was in the range of IFA titres from 8,000 to 40,000. Repeatability for intermediate to high VNA titres was in line with WAOH recommendations. Comparative study: A significant correlation (0.69) was found between the neutralising titres in saliva and the neutralising titres in the duodenum. The correlations between the neutralising titres in saliva and those in intestinal mucus were higher than the correlation between the neutralising titres in serum and those in intestinal mucus. Normalisation study: Statistical analysis of the entire data set revealed no evidence of correlations between the amylase and electrolyte concentrations and the IgA concentration or the VNA titre in saliva. However, when excluding the datasets in which the salivary IgA concentration was below 350 ng/ml, there was a significant positive correlation (correlation coefficient: 0.7607) of IgA concentration to RVC G1P[1]1-specific VNA titres (p = 0.0014). Immunisation study: The serum VNA titres as a correlate of the systemic immune response and the saliva VNA titres as a correlate of the mucosal immune response illustrated the differential immune response to the parenterally administered inactivated vaccine in the immunisation study. The primary immunisation produced a significant VNA titer increase in both serum and saliva. During the subsequent booster vaccination, a renewed significant VNA titer increase was only measured in the serum samples. After reaching the titer peak, the titres in saliva dropped to values close to the initial titres within two weeks and those in serum within three months. By means of the IFA examinations, it could be shown that the salivary VNA titres showed a strong positive correlation to the IgA titres in the blood and the serum VNA titres to the IgG titres in the blood. Conclusion: Within the framework of the present work, it was possible to establish a VNA suitable for all sample materials. Considering all three sub-studies, there are indications that support the hypothesis that was established. The challenges in the use of saliva samples as a diagnostic tool could also be demonstrated in this work. A standardisation of the neutralising titres in saliva should be further pursued. It may be that the collection of saliva from the submandibular or sublingual glands is more appropriate as a diagnostic tool. In summary, the investigations of this study show that the differentiated assessment of the systemic and mucosal immune response is of particular importance and that fundamental insights into the understanding of immunological reactions can be gained by means of saliva-based diagnostics.

Einleitung: Die Gesellschaft für Ernährungsphysiologie (GFE 2014) schlägt ein neues Proteinbewertungssystem für Pferdefutter vor, welches eine ausschließlich praecaecale Absorption von Aminosäuren beim Pferd unterstellt. Es nutzt eine futtermittelkundlich-chemische Fraktionierung des Rohproteins (XP). Die Fraktion des fasergebundenen Proteins (NDIXP = Neutral-Detergenzien-unlösliches Rohprotein) repräsentiert den postileal abbaubaren Proteinanteil. Das praecaecal verdauliche Protein (pcvXP) wird aus dem nicht faserassoziierten Protein (NDLXP = Neutral-Detergenzien-lösliches Rohprotein) geschätzt. Das System ermöglicht auf gleiche Weise die Schätzung der praecaecal verdaulichen Aminosäuren. Das neue System basiert auf der Auswertung von Literaturdaten, weshalb eine In-vivo-Validierung bislang ausstehend ist. Ziele der Untersuchungen: Die Arbeit gibt im ersten Teil einen Überblick über die Gehalte von pcvXP in Futtermitteln der täglichen Fütterungspraxis aus den Gruppen Raufutter, Getreide, Leguminosen und fettreiche Samen, sowie Ergänzungsfuttermitteln für Pferde. Die futtermittelkundliche Betrachtung soll die Frage beantworten, ob der Anteil an pcvXP in Abhängigkeit von Protein- und/oder Fasergehalt der Futtermittel zu erwarten ist. Für die In-vivo-Fütterungsstudie im zweiten Teil der Arbeit wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Unterschiede in der Proteinbewertung von Futtermitteln nach GFE (2014) im Plasma anhand von Unterschieden im postprandialen (ppr) Verlauf der Aminosäure Lysin nachvollzogen werden können, um die futtermittelkundlich-chemische Bewertung in vivo validieren zu können. Tiere, Material und Methoden: Im ersten Teil der Arbeit wurden 71 Futtermittel mittels Weender-Analyse und Faserfraktionierung nach van Soest analysiert und nach dem neuen Proteinbewertungssystem bewertet. Im zweiten Teil der Arbeit wurden 4 der analysierten Futtermittel (LUC = Luzerne, KF = Ergänzungsfutter für Sportpferde, SES = Sojaextraktions-schrot, sAS = kommerzieller Aminosäurenergänzer mit synthetischen Aminosäuren) in einer Fütterungsstudie (Tierversuch TVV 18/15) auf die ppr Veränderungen von Lysin im Plasma von Pferden hin untersucht. Dazu wurde 8 genüchterten, adulten Wallachen randomisiert eine von drei auf Lysin standardisierten Rationen (LUC, KF + SES, KF + sAS) und eine Kontrollration (KF) gefüttert. Bei gleichem Lysin-Gehalt unterschieden sich die Rationen in der Menge an NDIXP. Lysin wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie im Plasma der Pferde zu den Zeitpunkten 0 und 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360, 420 und 480 min ppr, sowie in den Fraktionen NDIXP und NDLXP untersucht. Zur statistischen Auswertung kamen nur Werte von Pferden, welche die komplette Ration gefressen hatten. Alle Daten wurden auf Normalverteilung überprüft (Shapiro-Wilks-Test). Futtermittelkundliche Daten wurden auf lineare Regressionen getestet. Das mittlere pcvXP der Gruppen wurde mittels einfacher ANOVA und Bonferroni Korrektur ausgewertet. Die Plasma Lysin-Werte wurden auf die Einflussfaktoren Zeit und Behandlung (ANOVA und Least Significant Difference Test) getestet und die Flächen unter der Kurve verglichen. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Ergebnisse: Die pcvXP-Gehalte der 71 Futtermitteln korrelierten mit den Gehalten an XP (r = 0,967; p < 0,01), NDLXP-Gehalten (r = 0,701; p < 0,01) und der Faserfraktion der aschefreien Neutral-Detergenzien-Fasern (aNDFom, r = – 0,573; p < 0,01). Im Fütterungsversuch kam es teilweise zur Verweigerung von Testrationen. In vivo konnte ein alimentärer Effekt auf Lysin im Plasma für KF + sAS und KF + SES im Vergleich zur Kontrolle KF gezeigt werden. Der mittlere Anstieg (± SD) vom Nüchternwert (LysX0) zum Maximalwert für Lysin im Plasma (LysMax) fiel für die Fütterung der Kontrollration KF geringer aus (14,4 ± 13,5 %) als für die 3 anderen Testrationen. Der höchste mittlere Anstieg (± SD) von LysX0 zu LysMax war nach der Fütterung von KF + sAS (110 ± 37,6 %) und KF + SES (92,3 ± 47,7 %) zu verzeichnen. LUC führte mit 75,1 ± 33,6 % ebenfalls zu einem deutlichen Anstieg, der jedoch geringer ausfiel als für KF + sAS und KF + SES. Der LysMax dieser beiden Rationen wurde 60 min ppr detektiert. Für LUC wurde das LysMax jeweils 120 min ppr ermittelt werden. Die mittlere Fläche unter der Kurve (AUC) (± SD) war am geringsten für KF (n = 7; 22.944 ± 9940 µmol × min/l). Die höchste AUC wurde für KF + sAS gemessen (n = 4; 46.262 ± 18.858 µmol × min/l), welche signifikant höher war als für KF (p = 0,042). KF + SES (n = 8; 40.768 ± 15.399 µmol × min/l) ergab eine signifikant höhere mittlere AUC als KF (p < 0,01). Die AUC für LUC (n = 2, 41.809 ± 11.871 µmol × min/l) war der von KF + SES vergleichbar. Schlussfolgerungen: Bekannte „Proteinträger“ wie z.B. Sojaprodukte, werden auch nach dem neuen System als hochwertige Proteinlieferanten bewertet. Die In-vivo-Ergebnisse zweier Pferde nach Fütterung von Luzerne zeigen hohe ppr Lysin-Anstiege im Blut an. Dies lässt auf eine gute Verfügbarkeit des Lysins aus der Luzerne schließen. Das Proteinbewertungssystem stuft jedoch die Luzerne deutlich schlechter ein, als die In-vivo-Ergebnisse vermuten lassen. In vivo gilt ein Einfluss von Kauprozess und Mikrobiota auf die Lysin-Verfügbarkeit aus der Luzerne als wahrscheinlich. Die Erarbeitung von Korrekturfaktoren für Raufutter wie Luzerne im neuen Proteinbewertungssystem (GFE 2014) erscheint sinnvoll.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Grundlagen der Proteinverdauung beim Pferd 2 2.1.1 Magen 2 2.1.2 Dünndarm 3 2.1.3 Dickdarm 4 2.2 Proteinbewertung von Futtermitteln für Pferde 6 2.2.1 Stickstoffquellen in Pflanzen 6 2.2.2 Analytische Verfahren zur Proteinbewertung 7 2.2.2.1 Rohprotein 7 2.2.2.2 Bewertung des verdaulichen Rohproteins 7 2.2.2.3 Das Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) des Wiederkäuers 7 2.2.2.4 Bewertung des praecaecal verdaulichen Rohproteins 8 2.2.3 In-vivo-Verfahren zur Proteinbewertung 11 2.2.3.1 Verdauungsversuche 11 2.2.3.2 Postprandiale Messung von Aminosäuren im venösen Blut 15 3 Material und Methoden 20 3.1 Versuchsziel 20 3.2 Analytische Proteinbewertung 20 3.2.1 Probenumfang und Probenahme 20 3.2.2 Trockensubstanz und Rohnährstoffe 21 3.2.3 Faserfraktionen nach van Soest 22 3.2.4 Neutral-Detergenzien-unlösliches Protein (NDIXP) und Proteinbewertung nach GFE (2014) 23 3.2.5 Aminosäuren in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP 25 3.3 In-vivo-Proteinbewertung durch Messung postprandial freien Lysins im Plasma 28 3.3.1 Versuchstiere und allgemeine Haltungsbedingungen 28 3.3.2 Versuchsdesign 28 3.3.3 Adaptation und Grundration 29 3.3.4 Testfuttermittel 30 3.3.5 Versuchsrationen 31 3.3.6 Blutentnahmetage 32 3.3.7 Analyse von Totalprotein und freiem Lysin im Plasma 33 3.4 Statistische Methoden 35 4 Ergebnisse 36 4.1 Futtermittelkundliche Untersuchungsergebnisse 36 4.1.1 Rohnährstoffe der Futtermittelgruppen 36 4.1.2 Proteinbewertung der Futtermittelgruppen 39 4.1.3 Korrelationen ausgewählter Parameter 42 4.1.4 Protein- und Lysin-Bewertung der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 44 4.1.5 Lysin-Gehalte in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 45 4.1.6 Protein- und Lysin-Bewertung der Versuchsrationen 46 4.2 In-vivo-Untersuchungsergebnisse 48 4.2.1 Allgemeine Beobachtungen 48 4.2.1.1 Gesundheitszustand der Pferde 48 4.2.1.2 Gewichtsentwicklung 48 4.2.2 Futteraufnahme der Testrationen 48 4.2.2.1 Futteraufnahmezeit 49 4.2.2.2 Lysin-Aufnahme 49 4.2.3 Lysin-Konzentrationen im Plasma 52 4.2.3.1 Nüchternwerte X0 von Lysin im Plasma 52 4.2.3.2 Postprandiale Lysin-Gehalte im Plasma der Pferde nach vollständiger Aufnahme der Testmahlzeiten 53 4.2.3.3 Gehalte im Plasma in Abhängigkeit der Lysin-Aufnahme 56 4.2.3.4 Lysin-Konzentration im Plasma von Pferd 8 58 5 Diskussion 60 5.1 Kritik der Methoden 60 5.1.1 Auswahl der Futtermittel 60 5.1.2 Versuchsaufbau und Untersuchungsmethoden 61 5.1.3 Futteraufnahme 64 5.2 Diskussion der Ergebnisse 64 5.2.1 Analytische Proteinbewertung 64 5.2.2 In-vivo-Untersuchungen 68 5.3 Schlussfolgerungen 73 6 Zusammenfassung 75 7 Summary 77 8 Literaturverzeichnis 79 9 Anhang 91 9.1 TABELLENVERZEICHNIS 91 9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 92 9.3 TABELLENANHANG 94 10 Danksagung 108 / Introduction: The Society of Nutrition Physiology (GFE 2014) proposed a new protein evaluation system for horsefeeds, assuming solely a preceacal absorption of amino acids in horses. Therefore, the crude protein (CP) is divided into two different chemical fractions. The fraction of the fibre-bound protein (NDICP = Neutral detergent insoluble crude protein) represents the postileal degradable protein fraction. The precaecal digestible protein (pcdCP) is estimated from the non-fibre-bound protein (NDSCP = Neutral detergent soluble crude protein). Similarly, the system allows the estimation of the precaecal digestible amino acids from chemical analysis. Since in vivo validation is still lacking, the new system is still based on the evaluation of literature data. Aim of the study: In the present study, typical feedstuffs such as roughage, grains, legumes and high-fat seeds, as well as complementary feeds for horses were analyzed for the pcdCP content. The aim of the chemical analysis was to answer the question whether the content of pcdCP depended on the protein and/or fibre content of the feeds. In the second part, an in vivo trial should verify the hypothesis, that the differences in the protein evaluation of feeds according to GFE (2014) are reflected in differences in the postprandial (ppr) kinetics of plasma lysine, in order to validate the prediction of pcdCP based on chemical analysis. Animals, material and methods: The 71 feeds were analysed by Weende analysis and fibre analysis according to van Soest. The feeds were evaluated according to the new protein evaluation system. In the second part of the study 4 selected feeds (LUC = lucerne, CF = complementary feed for sport horses, SES = soybean meal solvent extracted, sAS = supplement with synthetic amino acids) were examined in a feeding trial (animal experiment TVV 18/15) for ppr changes of plasma lysine in horses. After an overnight fasting period, 8 adult geldings were randomly fed one of three rations that were standardized according to the lysine content (LUC, SES, sAS) or a control ration (CF). The meals differed in the amounts of NDICP. Before feeding the test meals and 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360, 420 and 480 min ppr plasma was analysed for lysine by high performance liquid chromatography, as well the NDICP and NDSCP fractions of the components of the test meals were analyzed for lysine. All data were statistically assessed by a commercial software package (Statistica®). Data were assessed for normal distribution (Shapiro-Wilks test). The nutrient values of the feedstuffs were tested for linear regression to NDICP, NDSCP and pcdCP. Feedstuffs groups were evaluated by one-way ANOVA with Bonferroni correction. Plasma lysine values were analyzed for variance factoring in the effects of diet and postprandial time (ANOVA). Only data from horses who finished the complete test meals were included in the statistical assessment. The Least Significant Difference test was used for post hoc comparison. The areas under the curve (AUC) were calculated and compared (Mann-Whitney-U test). Level of significance was set at p < 0.05. Results: The pcdCP content correlated with the content of CP (N = 71, r = 0.96712; p < 0.001), NDSCP (r = 0.701; p < 0.001) and the fraction of neutral detergent fibres (aNDFom, r = – 0.5733; p < 0.001). In the feeding trial, some test meals were refused by the horses due to a low palatability. In vivo, a feeding effect on plasma lysine could be shown for sAS and SES compared to the control group. The mean increase (± SD) from the basal value LysX0 to the maximum level for plasma lysine LysMax was lower (14.4 ± 13.5 %) after feeding the control diet CF compared to the other 3 diets. The highest increase (mean ± SD) from LysX0 to LysMax was observed after feeding sAS (110 ± 37.6 %) and SES (92.3 ± 47.7 %). LUC also led to a notable increase (75.1 ± 33.6 %) from LysX0 to LysMax, although, less than for sAS and SES. The LysMax of these two diets were detected 60 min ppr. For LUC the LysMax was determined 120 min ppr. The AUC (mean ± SD) was lowest for CF (n = 7; 22,944 ± 9,940 µmol × min/L). The highest AUC was determined for aAS (n = 4; 46,262 ± 18,858 µmol × min/L), which was significantly higher than for CF (p = 0.042). Also, SES (n = 8; 40,768 ± 15,399 µmol × min/L) led to a significantly higher AUC than CF (p < 0.01). The AUC for LUC (n = 2; 41,809 ± 11,871 µmol × min/L) was comparable to SES. Conclusion: Feeds for horses, well-known as 'protein-rich feeds' such as soybean byproducts, have been confirmed as high-quality protein suppliers under the new evaluation system. Since the in vivo results of two horses fed LUC showed a marked increase in ppr plasma lysine in blood, a high availability of lysine from LUC can be assumed. However, the new protein evaluation system estimates the availability of lysine from LUC considerably lower than suggested by the in vivo results. Most likely, the influence of the chewing process and microbiota on lysine availability from LUC needs to be considered in horses. In conclusion, correction factors for roughages such as LUC with respect to the new protein evaluation system for horsefeeds (GFE 2014) seem to be necessary.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Grundlagen der Proteinverdauung beim Pferd 2 2.1.1 Magen 2 2.1.2 Dünndarm 3 2.1.3 Dickdarm 4 2.2 Proteinbewertung von Futtermitteln für Pferde 6 2.2.1 Stickstoffquellen in Pflanzen 6 2.2.2 Analytische Verfahren zur Proteinbewertung 7 2.2.2.1 Rohprotein 7 2.2.2.2 Bewertung des verdaulichen Rohproteins 7 2.2.2.3 Das Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) des Wiederkäuers 7 2.2.2.4 Bewertung des praecaecal verdaulichen Rohproteins 8 2.2.3 In-vivo-Verfahren zur Proteinbewertung 11 2.2.3.1 Verdauungsversuche 11 2.2.3.2 Postprandiale Messung von Aminosäuren im venösen Blut 15 3 Material und Methoden 20 3.1 Versuchsziel 20 3.2 Analytische Proteinbewertung 20 3.2.1 Probenumfang und Probenahme 20 3.2.2 Trockensubstanz und Rohnährstoffe 21 3.2.3 Faserfraktionen nach van Soest 22 3.2.4 Neutral-Detergenzien-unlösliches Protein (NDIXP) und Proteinbewertung nach GFE (2014) 23 3.2.5 Aminosäuren in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP 25 3.3 In-vivo-Proteinbewertung durch Messung postprandial freien Lysins im Plasma 28 3.3.1 Versuchstiere und allgemeine Haltungsbedingungen 28 3.3.2 Versuchsdesign 28 3.3.3 Adaptation und Grundration 29 3.3.4 Testfuttermittel 30 3.3.5 Versuchsrationen 31 3.3.6 Blutentnahmetage 32 3.3.7 Analyse von Totalprotein und freiem Lysin im Plasma 33 3.4 Statistische Methoden 35 4 Ergebnisse 36 4.1 Futtermittelkundliche Untersuchungsergebnisse 36 4.1.1 Rohnährstoffe der Futtermittelgruppen 36 4.1.2 Proteinbewertung der Futtermittelgruppen 39 4.1.3 Korrelationen ausgewählter Parameter 42 4.1.4 Protein- und Lysin-Bewertung der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 44 4.1.5 Lysin-Gehalte in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 45 4.1.6 Protein- und Lysin-Bewertung der Versuchsrationen 46 4.2 In-vivo-Untersuchungsergebnisse 48 4.2.1 Allgemeine Beobachtungen 48 4.2.1.1 Gesundheitszustand der Pferde 48 4.2.1.2 Gewichtsentwicklung 48 4.2.2 Futteraufnahme der Testrationen 48 4.2.2.1 Futteraufnahmezeit 49 4.2.2.2 Lysin-Aufnahme 49 4.2.3 Lysin-Konzentrationen im Plasma 52 4.2.3.1 Nüchternwerte X0 von Lysin im Plasma 52 4.2.3.2 Postprandiale Lysin-Gehalte im Plasma der Pferde nach vollständiger Aufnahme der Testmahlzeiten 53 4.2.3.3 Gehalte im Plasma in Abhängigkeit der Lysin-Aufnahme 56 4.2.3.4 Lysin-Konzentration im Plasma von Pferd 8 58 5 Diskussion 60 5.1 Kritik der Methoden 60 5.1.1 Auswahl der Futtermittel 60 5.1.2 Versuchsaufbau und Untersuchungsmethoden 61 5.1.3 Futteraufnahme 64 5.2 Diskussion der Ergebnisse 64 5.2.1 Analytische Proteinbewertung 64 5.2.2 In-vivo-Untersuchungen 68 5.3 Schlussfolgerungen 73 6 Zusammenfassung 75 7 Summary 77 8 Literaturverzeichnis 79 9 Anhang 91 9.1 TABELLENVERZEICHNIS 91 9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 92 9.3 TABELLENANHANG 94 10 Danksagung 108

Das Chemokine SDF-1α und sein Rezeptor CXCR4 sind in eine Vielzahl biologischer Prozesse, wie der Organogenese, der Hämatopoese und der Immunantwort involviert. Die Entdeckung des alternativen SDF-1α-Rezeptors CXCR7 bewirkte eine erneute Untersuchung der Funktion des SDF-1-Systems in diesen Vorgängen. CXCR7 ist in der Lage, je nach Gewebe- oder Zelltyp, als \'Scavenger\'-Rezeptor, Modulator des CXCR4 oder selbstständig aktiver Rezeptor zu agieren. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern beide Rezeptoren im Verlauf der Entwicklung der Muskulatur exprimiert werden, welche Aufgabe sie dabei übernehmen und ob sich Rückschlüsse auf die Muskelregeneration daraus ableiten lassen. Hierfür erfolgten in vitro-Untersuchungen an C2C12-Zellen und die anschließende Analyse der Expression von CXCR4, CXCR7 und SDF-1α in der sich entwickelnden Gliedmaßenmuskulatur von Wildtyp- und mdx-Mäusen. Die Untersuchung von C2C12-Zellen zeigte in allen Differenzierungsstadien eine detektierbare Menge von CXCR4 und eine zunehmende Expression des CXCR7. Die Behandlung der Zellen mit SDF-1α führte zu einer Phosphorylierung von Erk1/2 und PKCζ/λ und hemmte gleichzeitig deren Differenzierung. Nach einer Blockierung des CXCR4 mit seinem pharmakologischen Antagonist AMD3100 oder nach Hemmung der Expression durch spezifische siRNA blieb die Aktivierung des Signalweges aus und der hemmende Einfluss des SDF-1α auf die Differenzierung verschwand vollständig. Im Gegensatz dazu blieben nach der pharmakologischen Blockierung oder durch siRNA vermittelten Expressionshemmung des CXCR7 alle SDF-1α induzierten Effekte vollständig erhalten. Eine Untersuchung des Signalweges am dritten Tag der Differenzierung zeigte keine Aktivierung von Erk1/2. Ebenso blieb Erk1/2 nach einer Hemmung der Expression des CXCR4 unphosphoryliert. Im Gegensatz dazu fand nach einer Hemmung der Expression des CXCR7 mit spezifischer siRNA erneut eine Aktivierung des Signalweges statt. Weiterhin konnte in vivo festgestellt werden, dass die Expression des CXCR4 in der Muskulatur während der embryonalen Entwicklung am höchsten ist und bereits kurz nach der Geburt stark abnimmt, wenn die sekundäre Muskelentwicklung abgeschlossen ist. Die Expression des CXCR7 hingegen steigt perinatal an und bleibt bis zum Erwachsenenalter bestehen. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass CXCR4 aktiv das Signalgeschehen von SDF-1α in der Myogenese vermittelt und somit zur Differenzierungshemmung von Myoblasten beiträgt. CXCR7 hingegen wirkt als passiver SDF-1α-Scavenger und induziert somit durch eine Modulierung der extrazellulären SDF-1α-Konzentration die Differenzierung. In Übereinstimmung mit der Rolle des SDF-1α-Systems bei der Muskelentwicklung, konnte eine kontinuierliche SDF-1α- Expression im Bindegewebe um pränatale und im Endomysium von postnatalen und adulten Muskelfasern festgestellt werden. Diese SDF-1α-Expression stieg ebenso wie die CXCR4-Expression bei der Analyse der Muskulatur von dystrophin-defizienten Mäusen an und zeigte somit, dass dieses System auch für die Proliferation von Muskelvorläuferzellen in der regenerativen Muskulatur eine wichtige Rolle spielt. Bemerkenswerter Weise hatte diese Muskeldystrophie keinen Einfluss auf die Expression des CXCR7 und beeinflusst vermutlich dessen Funktion über einen anderen Mechanismus. Durch die offensichtlich enge Kontrolle von Muskelentwicklung und Regeneration durch CXCR4, CXCR7 und deren Liganden SDF-1α, bilden diese ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für bestimmte Muskelerkrankungen. / The chemokine, SDF-1α, and its receptor, CXCR4, are assumed to control a multitude of biological processes such as organogenesis, haematopoesis, and immune responses. The previous demonstration that SDF-1α additionally binds to the chemokine receptor, CXCR7, currently urges a re-evaluation of the function of the SDF-1 system in these processes. In fact, depending on the tissue and cell type, CXCR7 either acts as a scavenger receptor, a modulator of CXCR4 or an independent active receptor. This thesis is dedicated to answer the following questions: Are both SDF-1α receptors expressed during muscle development? What is the actual function of these receptors during myogenesis? Is there a role of the SDF-1 system in muscle regeneration? To adress these issues both in vitro studies with the myoblast cell line, C2C12, as well as in vivo analyses on the expression of CXCR4, CXCR7 and SDF-1α in developing and regenerating limb muscles have been performed. At all stages of differentiation, C2C12 cells exhibited measurable amounts of CXCR4. In addition, in the course of differentiation C2C12 cells showed increasing expression levels of CXCR7. Treatment of the cells with SDF-1α resulted in the phosphorylation of Erk1/2 and PKCζ/λ and subsequently blocked their myogenic differentiation. Following inactivation of CXCR4 either by its antagonist, AMD3100, or by specific siRNA, SDF-1α failed to activate both pathways and in addition no longer inhibited the myogenic differentiation of C2C12 cells. By contrast, inactivation of CXCR7 remained without effects on SDF-1α-induced cell signalling and resulting inhibitory effects on myogenic differentiation. Interestingly, SDF-1α also failed to activate Erk1/2 signalling in differentiated C2C12 cells. Cell signalling in differentiated C2C12 cells was, however, restored following inhibition of CXCR7 expression, but not following inhibition of CXCR4 expression. The in vivo analysis further revealed that in limb muscles expression of the CXCR4 is highest during embryonic development with a decrease in expression levels shortly after birth when secondary muscle development is completed. Vice versa, expression levels of CXCR7 increased perinatally and remained high into adulthood. In summary, these findings unravel that CXCR4 actively mediates SDF-1α-signalling during myogenesis. The findings further provide evidence that CXCR7 acts as a scavenger receptor during myogenesis which controls myogenic differentiation by modulating extracellular SDF-1α concentration. In further agreement with a major role of SDF-1α in muscle development, SDF-1α is continously expressed by the endomysium of postnatal and adult muscle fibers. Moreover, expression of SDF-1α as well as CXCR4 is massively increased in muscles of dystrophin-deficient mice further implying that the SDF-1 system plays an equally important role during muscle development and regeneration. The pivotal role of SDF-1α in muscle development and regeneration points to the SDF-1 system as a promising therapeutical target for certain muscle diseases.

Bei der Infrarot-Thermographie handelt es sich um eine nicht invasive, schnelle, berührungslose, bildgebende Methode zur Messung der Wärmestrahlung von Oberflächen, die bereits bei einigen veterinärmedizinischen Fragestellungen zum Einsatz gekommen ist. Ziel der Studie war es, die Oberflächentemperaturen im Kopfbereich von weiblichen Deutsch-Holstein Kälbern um den Enthornungszeitraum mittels Thermographie darzustellen und zu prüfen, welchen Einflussfaktoren die thermographischen Messungen unterlegen sind. Hierfür wurden acht Lokalisationen im Kopfbereich (linkes Auge (liAu), rechtes Auge (reAu), linke Hornanlage (liHa), rechte Hornanlage (reHa), Flotzmaul (FM), Schleimhaut des Flotzmauls (SHFM)) von gesunden, weiblichen Deutsch-Holstein Kälbern mit einer High-End Wärmebildkamera (ThermoPro TP8, Firma DIAS Infrared GmbH) im Rahmen eines standardisierten Studienprotokolls thermographisch untersucht. Die statistische Auswertung pro Merkmal erfolgte mit SAS, Vers.9.4. Die Umgebungstemperatur hatte den größten Einfluss auf die Oberflächentemperaturen (Regressionskoeffizienten von 0,10 bis 0,32; p < 0,01). Die Luftfeuchtigkeit wirkte sich nicht auf die Messergebnisse aus (p > 0,33). Die rektal erfasste Körperinnentemperatur korrelierte nur schwach mit den thermographisch ermittelten Oberflächentemperaturen. Hingegen konnte mit zunehmendem Alter der Tiere ein Abfall der Oberflächentemperaturen beobachtet werden (Regressionskoeffizienten von – 0,42 bis – 0,14; p < 0,01). Die Wiederholbarkeit der unmittelbar aufeinanderfolgenden thermographischen Doppelmessungen pro Lokalisation war sehr gut (r > 0,95). An den verschiedenen Lokalisationen wurde Wärme in unterschiedlichem Maße emittiert, wobei die Augen die höchsten und das Flotzmaul die niedrigsten Oberflächentemperaturen aufwiesen. Die paarigen Lokalisationen (liAu:reAu, liHA:reHa) wiesen ein symmetrisches Wärmestrahlungsmuster auf. Unter Beachtung der genannten Einflussfaktoren konnte direkt nach Abnahme des Brenners an den Ha der Kälber nach thermE eine Maximaltemperatur von ca. 67 °C ermittelt werden. Fünf und 30 Minuten nach dem Eingriff kam es zu einem signifikanten Temperaturabfall an den Ha der Tiere nach thermE, während die Oberflächentemperaturen der anderen Lokalisationen bei den Kälbern beider Gruppen im Vergleich zum Ruhewert anstiegen (p < 0,01). Zu den Messungen 60, 90 und 120 Minuten kam es weiterhin zu einem stetigen Temperaturanstieg (UliHa, liAu, FM, SHFM, reAu, UreHa) bzw. einem Temperaturplateau (liHa, reHa). Vier, spätestens acht Stunden nach Enthornung war das Niveau des Ruhewertes an allen Lokalisationen (exkl. FM, SHFM) wieder erreicht. Aufgrund des analogen Verlaufs der Oberflächentemperaturen der vorliegenden Studie mit dem Verlauf der Kortisolkonzentration im Blut von thermisch enthornten Kälbern ähnlich angelegter Studien lässt sich vermuten, dass es sich dabei um eine perioperative Stressantwort handeln könnte. Weitere Untersuchungen sind nötig, um einen möglichen Einsatz der Thermographie zur nicht invasiven Stressevaluierung zu prüfen.:1. Einleitung 1 2. LITERATURÜBERSICHT 3 2.1. Hornwachstum und Unterschiede in der Hornausbildung 3 2.2. Innervation der Hornanlagen 3 2.3. Enthornung 4 2.3.1. Definition und Methoden der Enthornung 4 2.3.2. Gründe für Enthornung 5 2.3.3. Alternativen zur Enthornung 6 2.3.3.1. Haltung behornter Rinder 6 2.3.3.2. Zucht auf Hornlosigkeit 6 2.4. Schmerz und Stress 7 2.4.1. Schmerz und Stress bei Rindern 7 2.4.2. Stress ausgelöst durch den Umgang mit Menschen 8 2.4.3. Durch den Stressor Enthornung ausgelöste Schmerz- und Stressantwort 9 2.4.4. Schmerz- und Stressevaluierung während der thermischen Enthornung 9 2.5. Thermographie 11 2.5.1. Prinzip der Thermographie 11 2.5.2. Einflussfaktoren auf die Thermographie unter Stallbedingungen 12 2.5.2.1. Vom Tier ausgehende Einflussfaktoren 13 2.5.2.2. Von außen einwirkende Einflussfaktoren 13 2.5.2.3. Einfluss der Aufnahmetechnik 13 2.5.3. Thermographie in der Veterinärmedizin 14 2.5.4. Thermographie bei Rindern 14 2.5.5. Thermographie zur Überwachung der thermischen Enthornung 16 2.5.6. Schlussfolgerung aus der Literaturrecherche und Zielstellung 16 3. Material und Methoden 18 3.1. Auswahl der für die Durchführung der Studie zu verwendenden Wärmebildkamera 18 3.1.1. Kriterien für den Einsatz einer Wärmebildkamera am Tier unter Stallbedingungen 18 3.1.2. Pro- und Contra-Kriterien 19 3.1.3. Technische Daten der Wärmebildkameras testo882 und ThermoPro TP8 21 3.1.4. Vorversuch mit den Wärmebildkameras testo882 und ThermoPro TP8 22 3.1.5. Schlussfolgerung und Entscheidung 23 3.2. Protokoll für die standardisierte Erstellung qualitativ hochwertiger Thermogramme 23 3.2.1. Position von Wärmebildkamera und Kalb 23 3.2.1.1. Standardisierte Erstellung von Thermogrammen an den Augen 24 3.2.1.2. Standardisierte Erstellung von Thermogrammen am Flotzmaul und der Maulschleimhaut 25 3.2.1.3. Standardisierte Erstellung von Thermogrammen an den Enthornungsstellen und deren Umgebung 25 3.2.2. Optimale Fokussierung 26 3.2.2.1. Thermogramme der Augen 26 3.2.2.2. Flotzmaul und Maulschleimhaut 26 3.2.2.3. Enthornungsstellen und deren Umgebung 26 3.2.3. Schlussfolgerung zur Erstellung qualitativ hochwertiger Thermogramme 26 4. Publikation 1 27 5. Publikation 2 38 6. Diskussion 50 6.1. Diskussion des Studienprotokolls 50 6.1.1. Auswahl der Lokalisationen 50 6.1.1.1. Thermographische Erfassung der Oberflächentemperaturen an den Augen 50 6.1.1.2. Thermographische Erfassung der Oberflächentemperaturen am Flotzmaul und der Maulschleimhaut 51 6.1.1.3. Thermographische Erfassung der Oberflächentemperaturen an den Hornanlagen und deren Umgebung 51 6.1.1.4. Abschließende Beurteilung der Messbarkeit der Oberflächentemperaturen an den Lokalisationen 52 6.1.2. Auswahl der Messzeitpunkte 52 6.1.2.1. Ruhewerte vor der thermischen Enthornung 53 6.1.2.2. Kurzfristige Auswirkungen der thermischen Enthornung 53 6.1.2.3. Langfristige Auswirkungen der thermischen Enthornung 54 6.1.2.4. Schlussfolgerung 54 6.1.3. Einflussfaktoren 55 6.1.3.1. Einfluss der Aufnahmetechnik 55 6.1.3.1.1. Abstand zwischen Kamera und Lokalisation am Kopf des Kalbes 55 6.1.3.1.2. Winkel zwischen Kamera und Lokalisation am Kopf des Kalbes 55 6.1.3.2. Von außen einwirkende Faktoren 55 6.1.3.2.1. Umgebungstemperatur 55 6.1.3.2.2. Luftfeuchtigkeit 56 6.1.3.2.3. Sonneneinstrahlung 56 6.1.3.3. Vom Tier ausgehende Einflussfaktoren 57 6.1.3.3.1. Stress 57 6.1.3.3.2. Zirkadiane Rhythmik 57 6.1.3.3.3. Alter der Tiere 57 6.1.3.3.4. Innere Körpertemperatur (IKT) 58 6.1.3.4. Schlussfolgerung 58 6.2. Hitzeentwicklung im Kopfbereich 59 6.2.1. Hitzeeinwirkung durch die thermische Enthornung 59 6.2.2. Evaluierung hitzebedingter Schmerzen 59 6.2.3. Thermische Enthornung und Schmerzmanagement 60 6.2.3.1. Hintergrund zur Entscheidung der thermischen Enthornung ohne multimodales Schmerzmanagement 60 6.2.3.2. Ergebnisse, die durch die Einbeziehung einer Kontrollgruppe generiert werden konnten 60 6.3. Negative Auswirkungen durch fehlerhafte thermische Enthornung 61 6.4. Potentielle Möglichkeiten des Einsatzes der Wärmebildkamera in der Kälberhaltung 62 6.4.1. Stressmonitoring 62 6.4.2. Gesundheitsmonitoring 63 7. Zusammenfassung 66 7.1. Einleitung 66 7.2. Ziele der Untersuchungen 66 7.3. Tiere, Material und Methoden 66 7.4. Ergebnisse 67 7.5. Schlussfolgerung 67 8. Summary 68 8.1. Introduction 68 8.2. Objectives 68 8.3. Animals, Materials and Methods 68 8.4. Results 69 8.5. Conclusions 69 9. Literaturverzeichnis 70 10. Danksagung 82

Einleitung
 Defekte des hyalinen artikulären Knorpels führen häufig zur Ausbildung einer Arthrose, weshalb deren Therapie überaus wichtig ist. Ein vielversprechender Ansatz dafür ist das Tissue Engineering (T.E.) eines zonal aufgebauten Knorpelkonstrukts. Für die Verbindung eines solchen Konstrukts mit dem subchondralen Knochen des nativen Gewebes ist eine untere mineralisierte Knorpelzone von besonderer Bedeutung. Bisher ist es nicht gelungen die Mineralisation in vivo ohne Bildung von Knochengewebe und ohne längere In-vitro-Vorkultivierung auf die untere Zone zu beschränken. Um eine ausreichende Produktion von Extrazellularmatrix (EZM) bis zur Defektfüllung gewährleisten zu können ist die Formstabilität eines solchen Konstrukts ebenfalls wichtig. Ziele der Untersuchung
 Ziel dieser Studie war es, ein formstabiles bizonales Knorpelersatzgewebe mit einer oberen hyalinartigen Zone und einer unteren hypertrophen Knorpelzone zu generieren, bei dem sich die Mineralisation in vitro und in vivo auf die untere Zone beschränkt und die Bildung von Knochengewebe verhindert wird. Außerdem sollte die zonale Entwicklung so weit wie möglich in vivo ohne längere vorherige In-vitro-Kultivierung von statten gehen. Tiere, Material und Methoden
 Für die Herstellung von Knorpel-T.E.-Konstrukten wurde das Bioprinting von porzinen artikulären Chondrozyten (pACs) und porzinen Mesenchymalen Stromazellen (pMSC) etabliert (pAC: n=3, pMSC: n=4). Anschließend wurden nicht-zonale und zonale gedruckte Konstrukte mit gegossenen Konstrukten verglichen. Als Trägermaterial wurde starPEG/Heparin- (7,5x106 Zellen/ml, 50 % abbaubar, gedruckt: 19 μl, gegossen: 30μl) bzw. Fibrin-Hydrogel (7,5x106 Zellen/ml, gegossen: 30 μl) verwendet (nicht-zonal: n=2, zonal: n=3 bzw. 6). Als Alternative zum Einsatz eines Hydrogels für die untere Zone wurde die Herstellung Hydrogel-freier selbstkondensierter pMSC-Knorpelscheiben in der Transwellkultur (TWK) etabliert und ihr Potential zur hypertrophen Differenzierung untersucht. Anschließend wurde die In-vitro-Mineralisationskapazität der Knorpelscheiben (0,5x106 pMSC) mittels 5 verschiedenen Mineralisationsmedien über 4, 6 und 8 Wochen hinsichtlich der Mineralablagerung und des Erhalts der knorpeligen EZM getestet (n=6). Das Medium mit den besten Ergebnissen wurde für die In-vitro-Kultivierung der unteren Zone der zonalen Konstrukte verwendet. Zur Etablierung der In-vitro-Herstellung der oberen Zone wurden pAC-haltigen starPEG-Heparin- und Fibrin-Hydrogele in konventioneller und TW-Kultur über 6 Wochen chondrogen kultiviert (n=8/9). Zusammenfassung Zonale Konstrukte, bestehend aus einer unteren Knorpelscheibe (0,5x106 pMSC) und einem oberen pAC-haltigen Hydrogel (45μl, 20x106 pACs) aus gegossenem starPEG/Heparin (100 % abbaubar) bzw. Fibrin reiften anschließend über 6 Wochen sowohl unter In-vitro-Bedingungen in der TWK als auch nach subkutaner Implantation in 9 Mäusen (CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl) aus (n=9). Dabei wurde die Formstabilität, die Ablagerung von Kollagen Typ II, die Hypertrophie, der Mineralisationsgrad sowie die Beschränkung der Mineralisation auf die untere Zone mittels Vermessungen der Form, histologischen Färbungen und μCT-Scans untersucht. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U Test mit anschließender Bonferroni-Korrektur (SPSS 22.0.0.0). Als statistisch signifikant wurden dabei Signifikanzniveaus von p ≤ 0,05 angesehen. Ergebnisse
 Mittels Bioprinting von pMSC und pACs in starPEG/Heparin konnten stabile Hydrogele hergestellt werden. Das Bioprinting von starPEG/Heparin-Hydrogel zeigte allerdings keinen Vorteil gegenüber dem Gießen. Sowohl die gedruckten als auch gegossenen zonalen und nicht-zonalen Konstrukte zeigten eine mangelhafte Kollagen Typ II-Ablagerung der pMSC in starPEG/Heparin-Hydrogel. Fibrin-Hydrogel förderte die Kollagen Typ II-Ablagerung der pMSC, zeigte allerdings eine Kontraktion während der Kultivierung. Für die Herstellung von selbstkondensierten Knorpelscheiben aus pMSC als Alternative für die untere Zone hat sich das Waschen der Zellen in Phosphat- gepufferter Salzlösung (PBS) nach Monolayerkultur, die Verwendung von 0,5x106Zellen pro Transwell-Insert gelöst in PBS, die Kultivierung in 0,5 ml chondrogenem Medium (CHO) ohne TGF- β1 über die ersten 3 Tage im unteren Kompartiment und anschließender Kultivierung in 2 ml CHO mit 10 ng/ml TGF-β1 für weitere 18 Tage als optimal erwiesen. Mittels Kultivierung der Knorpelscheibe in Hypertrophen Medium konnte ein hoher Proteoglykangehalt und eine homogene Kollagen Typ X-Verteilung innerhalb der Knorpelscheiben erreicht werden. Für die in-vitro- Kultivierung der pAC-haltigen starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogele wurde in der TWK eine bessere Formstabilität erreicht als in der konventionellen Kultur. Innerhalb der zonalen Konstrukte erreicht das Fibrin-Hydrogel eine bessere Formstabilität sowie eine höhere Mineralisationsstärke der unteren Zone unter In-vitro-Bedingungen als das starPEG/Heparin. Unter In-vivo-Bedingungen blieb die Mineralisation nur bei den starPEG/Heparin-Konstrukten auf die untere Zone beschränk. Die obere Zone der Fibrin-Hydrogele wurde unter In-vivo-Bedingungen vor der Explantation zu einem Großteil abgebaut. Die Mineralisation der unteren Zone sowie die Matrixablagerung in der oberen Zone eines bizonalen Knorpelersatzgewebes ist ohne vorherige In-vitro-Vorkultur unter der Verwendung des starPEG/Heparin-Hydrogels in dieser Arbeit gelungen. Schlussfolgerung
 Die Herstellung eines relativ formstabilen bizonalen Knorpelersatzgewebes mit einer oberen hyalinartigen nicht-mineralisierten und einer unteren mineralisierten Zone ohne Ausbildung von Knochengewebe konnte in dieser Studie erreicht werden. Dabei eignet sich die aus pMSC generierte Knorpelscheibe als untere Zone. Für die obere Zone ist ein pAC-haltiges starPEG/Heparin-Hydrogel aufgrund seiner Eigenschaft, die eine Mineralisation unterbindet, besonders vielversprechend. Fibrin-Hydrogel erwies sich, aufgrund des zu schellen Abbaus in vivo, als ungeeignet für die obere Zone zonaler Konstrukte. Da die Mineralisation der unteren Zone und die Matrixablagerung der oberen Zone nachweislich komplett in vivo stattfinden kann, ist eine vorherige In-vitro-Kultur der zonalen Konstrukte nicht notwendig.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Knorpelgewebe 2.1.1 Histogenese von Knorpelgewebe 2.1.2 Aufbau des Knorpelgewebes 2.1.3 Arten von Knorpelgewebe 2.2 Knorpeldefekte im Gelenk 2.2.1 Ursache, Einteilung und Auswirkung von Knorpeldefekten 2.2.2 Therapie von Knorpeldefekten 2.3 Knorpel-Tissue Engineering 2.3.1 Zellen im Knorpel-Tissue-Engineering 2.3.2 Trägermaterialien 2.3.3 Wachstumsfaktoren 2.3.4 Bioprinting 2.3.5 Zonales Knorpel-Tissue-Engineering 2.4 Tiermodell Maus 2.5 Problemstellung und Zielsetzung 2.5.1 Problemstellung 2.5.2 Zielsetzung 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Tiere 3.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung 3.1.2 Ektope Konstruktimplantation 3.2 Material 3.3 Methoden 3.3.1 Zellbiologische Methoden 3.3.2 Bestimmung des Mineralisierungsgrades der Konstrukte (Micro-CT) 3.3.3 Bestimmung von Durchmesser und Dicke der Konstrukte 3.3.4 Histologische Untersuchungen 3.3.5 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Differenzierungspotential porziner mesenchymaler Vorläuferzellen (pMSC) 4.2 Etablierung des Bioprinting von starPEG/Heparin-Hydrogelen mit porzinen Zellen 4.3 Matrixablagerung von pACs in gedruckten und gegossenen starPEG/Heparin- und gegossenen Fibrin-Hydrogelen 4.4 Chondrogenes Differenzierungspotential von pMSC in gedruckten und gegossenen starPEG/Heparin- und gegossenen Fibrin-Hydrogelen unter verschiedenen Medien- Supplementierungen 4.5 Vergleich gedruckter und gegossener zonaler starPEG/Heparin-Hydrogele mit gegossenen zonalen starPEG/Heparin-Fibrin-Hydrogelen 4.6 Etablierung der Herstellung der unteren Knorpelzone aus pMSC durch Selbstkondensation in Transwellkultur 4.7 In-vitro-Mineralisation von pMSC-haltigen Knorpelscheiben in verschiedenen Mineralisationsmedien 4.8 Etablierung der Herstellung der oberen Knorpelzone: EZM-Ablagerung und Formstabilität 4.9 Charakterisierung von in vitro generierten zonalen Knorpelkonstrukten 4.10 Charakterisierung zonaler starPEG/Heparin- und Fibrin-Konstrukte nach In-vivo-Reifung 5 Diskussion 5.1 Bioprinting nicht-zonaler und zonaler starPEG/Heparin-Hydrogelen mit porzinen Zellen 5.2 Etablierung der Herstellung selbstkondensierender formstabiler Knorpelscheiben aus pMSC 5.3 Effekte verschiedener Mineralisationsmedien auf die Matrixablagerung von pMSC in Knorpelscheiben 5.4 Etablierung der Herstellung und In-vitro-Kultivierung der oberen Knorpelzone: EZM- Ablagerung und Formstabilität 5.5 In-vitro-Vergleich von starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogel zur Herstellung bizonaler Knorpelkonstrukte 5.6 In-vivo-Vergleich von starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogel zur Herstellung bizonaler Knorpelkonstrukte 5.7 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Methoden Bioprinting (zusätzliche Informationen) 9.2 Übersicht der Teilversuche zur Etablierung von Knorpelscheiben aus pMSC 9.3 Materialien 10 Danksagung

Einleitung: Aliarcobacter (A.) cryaerophilus und Aliarcobacter butzleri gelten weltweit als lebensmittelbedingte und zoonotische Krankheitserreger, die vorrangig über kontaminierte Lebensmittel oder Trinkwasser übertragen werden. Beim Menschen stellt sich die Infektion meist als selbstlimitierende Enteritis dar, wohingegen sie bei Tieren neben gastrointestinalen Erkrankungen mit Mastitiden, Aborten und Reproduktionsstörungen assoziiert wird. Aufgrund der engen Verwandtschaft mit den thermophilen Campylobacter spp., deren antimikrobielle Resistenz in den letzten Jahren einen starken Anstieg verzeichnet, ist es wichtig, das Resistenz- und Virulenzprofil dieser beiden Spezies zu untersuchen. Ziel der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der phänotypischen und genotypischen Antibiotikaresistenz sowie die Ermittlung der Virulenzprofile von Aliarcobacter cryaerophilus- und Aliarcobacter butzleri-Stämmen, die aus Kotproben von Wassergeflügel aus Thüringen isoliert worden waren. Tiere, Material und Methoden: In die Untersuchung gingen insgesamt 250 Kotproben von 135 Gänsen, 45 Flugenten, 40 Mularden und 30 Pekingenten ein, die in den Jahren 2016 und 2017 von zehn verschiedenen Wassergeflügel-Betrieben in Thüringen, Deutschland, gesammelt und auf Aliarcobacter spp. untersucht wurden. Die mit MALDI-TOF MS und multiplex-PCR identifizierten Aliarcobacter-Isolate wurden anschließend mithilfe des Epsilometertest (E-Test) auf ihre antimikrobielle Empfindlichkeit gegenüber acht verschiedenen Antibiotika getestet. Nach der DNA-Isolierung und Gesamtgenom-Sequenzierung wurde die phylogenetische Verwandtschaft sowie die Anwesenheit von potentiellen Resistenz- und Virulenzgenen mit Hilfe bioinformatischer Programme untersucht. Ergebnisse: Aus 55 Aliarcobacter-positiven Kotproben wurden mittels MALDI-TOF MS und multiplex-PCR 27 A. cryaerophilus- und 47 A. butzleri-Isolate identifiziert. Die hier untersuchten A. cryaerophilus-Stämme gehören dem Cluster I und somit dem Genomovar A. cryaerophilus gv. pseudocryaerophilus an. Zusätzlich wurde durch die phylogenetischen Untersuchungen deutlich, dass beide Aliarcobacter-Spezies eine hohe genetische Diversität aufweisen. Gleichzeitig bildeten einige A. cryaerophilus- und A. butzleri-Isolate Untergruppen. In diesen waren die einzelnen Bakterienstämme, welche zum Teil aus unterschiedlichen Betrieben stammten, nur wenige Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) voneinander entfernt. Die Bestimmung der phänotypischen antimikrobiellen Empfindlichkeit offenbarte, dass allen 74 Aliarcobacter-Isolaten die Cefotaxim-Resistenz gemein war. Ferner waren mehr als drei Viertel der Aliarcobacter-Stämme resistent gegen Streptomycin. Die 27 A. cryaerophilus-Stämme zeichneten sich durch eine Empfindlichkeit gegenüber Erythromycin, Gentamicin sowie Ampicillin und somit durch ein homogenes Resistenzprofil aus. Im Gegensatz dazu zeigten die 47 A. butzleri-Stämme ein heterogenes Resistenzprofil. Während die A. butzleri-Stämme eine deutlich höhere Resistenzrate gegenüber den Tetracyclinen aufwiesen, waren die A. cryaerophilus-Stämme vermehrt gegen Ciprofloxacin resistent. In beiden Aliarcobacter-Spezies wurde ein großes Arsenal an potentiellen Resistenzgenen identifiziert. Neben mehreren Effluxpumpen wurden verschiedene β-Laktamase-Gene sowie die bekannte Ciprofloxacin-Resistenz vermittelnde Punktmutation an Position 254 in der Chinolon-Resistenz-bestimmenden Region im gyrA-Gen detektiert. Des Weiteren wurde eine Vielzahl an potentiellen Virulenzgenen in beiden Aliarcobacter-Spezies ermittelt. Zum Repertoire gehören unter anderem ein komplettes Chemotaxis-System, ein Urease-Cluster, mehrere Flagellum-Gene sowie ein Lipid-A-Cluster. Schlussfolgerungen: Obwohl die untersuchten Isolate auf eine Region (Thüringen), einen bestimmten Wirtstyp (Wassergeflügel) und eine kurze Studienzeit (2 Jahre) begrenzt waren, deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf ein hohes Maß an genetischer Diversität unter den A. cryaerophilus- und A. butzleri-Stämmen hin. Dabei ist die Stammdiversität innerhalb beider Spezies unabhängig von der geographischen Lage, dem Ursprung der Isolate und der Wirtsart. Aliarcobacter-Isolate, die aus dem selben Betrieb stammen, wurden aufgrund ihrer klonalen Verwandtschaft der gleichen Untergruppe zugeordnet. Die Existenz phylogenetisch ähnlicher Stämme aus mehreren Betrieben, weist auf eine mögliche epidemiologische Verbindung zwischen den einzelnen Betrieben hin. Durch die Untersuchungen wurde deutlich, dass auf die Bestimmung der phänotypischen antimikrobiellen Empfindlichkeit zugunsten der genotypischen Resistenzbestimmung nicht verzichtet werden kann, da der Genotyp nur in einem beschränken Umfang mit der phänotypischen Charakterisierung übereinstimmt. Ein direkter Zusammenhang zwischen der Anwesenheit einer bekannten Mutation im gyrA-Gen und der phänotypischen Ciprofloxacin-Resistenz konnte nur bei den A. butzleri-Stämmen festgestellt werden. Die im Rahmen dieser Studie erstellte Resistenz- und Virulenzdatenbank, ermöglicht eine unkomplizierte Bestimmung des genotypischen Resistenz- und Virulenzprofiles von A. butzleri-Stämmen.

Einleitung: Coxiella burnetii ist ein gramnegatives und obligat intrazelluläres Bakterium und Erreger der meldepflichtigen Zoonose Q-Fieber. Den Hauptübertragungsweg stellt die Inhalation infizierter Stäube dar, aber auch Zecken werden seit der Isolation des Pathogens aus der Spezies Dermacentor andersonii als Vektoren diskutiert. Es liegen jedoch keine gesicherten Berichte über Infektionen des Menschen durch Zecken oder eine Beteiligung von Vektoren bei Q-Fieber-Ausbrüchen vor. Zudem steht durch die genetische Nähe zu überwiegend apathogenen Endosymbionten die Spezifität molekularer Untersuchungsmethoden in Frage, wodurch die Relevanz von Zecken in der Übertragung von Q-Fieber in der Literatur kontrovers diskutiert wird. Ziele der Untersuchung: Es sollten mithilfe einer systematischen Literaturanalyse die Daten zur Prävalenz von C. burnetii in Zecken in Europa dargelegt werden. Zudem sollte mittels eines in-vitro-Fütterungssystems untersucht werden, inwieweit die heimischen Spezies Ixodes ricinus und Dermacentor marginatus den Erreger aus dem Blut aufnehmen und ausscheiden, sowie ob das Bakterium transstadial in I. ricinus übertragen wird, wodurch Aussagen über die Vektorkompetenz dieser Arten möglich sind. Tiere, Material und Methoden: Im experimentellen Ansatz wurde die Infektion der Zecken in einem Silikonmembran-basierten Fütterungssystem mit heparinisiertem Rinderblut vorgenommen. Die Gruppengrößen betrugen 7-9 Weibchen mit fünf Männchen oder 50-60 Nymphen. Es wurden verschiedene Konzentrationen C. burnetii Nine Mile RSA439 Phase II eingesetzt: 10^4 (zwei Gruppen adulte I. ricinus), 10^5 (zwei Gruppen adulte I. ricinus) und 10^6 (fünf Gruppen adulte I. ricinus, vier Gruppen adulte D. marginatus, drei Gruppen I. ricinus Nymphen) Genomäquivalente (GE)/ml Blut sowie insgesamt sieben Negativkontrollgruppen. Zudem wurden vier Gruppen adulte I. ricinus für 36 Stunden zu Beginn der Fütterung mit 10^6 GE C. burnetii/ml infiziert und anschließend mit sterilem Blut gefüttert. Täglich wurde Zeckenkot entfernt, zudem wurden adulte I. ricinus zu unterschiedlichen Zeitpunkten während oder nach der Fütterung entnommen. Die Proben wurden nach DNA-Extraktion mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) auf das C. burnetii-Gen icd untersucht. Ein Teil (n = 46) der infizierten Nymphen wurde vor bzw. nach der Häutung mittels qPCR untersucht. Ein anderer Teil (acht Weibchen in zwei Gruppen) wurde nach der Häutung erneut auf sterilem Blut gefüttert. Dabei wurden Kot sowie Blut getestet. Weiterhin fand in L929-Zellen und axenischem Medium eine Anzucht von C. burnetii aus einem Filtrat des Zeckenkots sowie aus dem Filtrat eines qPCR-positiven Weibchens statt, welches sich von einer zuvor infizierten Nymphe gehäutet hatte. Die statistische Auswertung erfolgte mittels SPSS V 22.0, wobei je nach Voraussetzung der t-Test, der Mann-Whitney-U-Test sowie der Chi²-Test nach Pearson verwendet wurden. Das Signifikanzniveau wurde jeweils auf p < 0,05 festgelegt. Ergebnisse: Im Fütterungssystem haben 49 % der adulten I. ricinus und 29 % der D. marginatus vollständig gesaugt. Die Häutungsrate der I. ricinus Nymphen betrug 92 %. I. ricinus-Weibchen nahmen den Erreger auf, welcher innerhalb von sieben Wochen in einer Konzentration von ca. 10^3 GE/mg in den Zecken nachweisbar war. Eine Ausscheidung von infektiösen C. burnetii mit dem Kot wurde bei adulten Zecken ab einer Konzentration von 10^5 GE/ml im verfütterten Blut festgestellt. Dabei erfolgte in allen Versuchen mit beiden Zeckenspezies eine signifikant höhere Ausscheidung von C. burnetii an den Tagen 10-13, welche bis zu 10^5 GE/mg erreichte. Es wurde eine transstadiale Übertragung bei I. ricinus mit einer Rate von 25 % nach-gewiesen. Infizierte Nymphen, die nach der Häutung steriles Blut bekamen, schieden ebenfalls C. burnetii im Kot aus; im Blut wurde hingegen keine DNA von C. burnetii nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Das genutzte Fütterungssystem eignet sich für die Untersuchung der Vektorkompetenz von Zecken. Beide Zeckenspezies sind in der Lage, infektiösen Zeckenkot auszuscheiden, wodurch eine Gefahr einer möglichen aerogenen Übertragung entsteht. Dabei muss jedoch eine hohe Erregerkonzentration im Blut des Wirts erreicht werden. Es wurde eine transstadiale Übertragung von C. burnetii in I. ricinus von Nymphen zu Adulten und damit die Möglichkeit der Bildung eines Reservoirs nachgewiesen. Die Ergebnisse legen eine Vermehrung von C. burnetii im Mitteldarm der Zecken nahe. Dadurch konnten historische Aussagen aus der Literatur über andere Zeckenspezies zur Ausscheidung von C. burnetii mittels Zeckenkot bestätigt werden. In der Studie konnte weiterhin gezeigt werden, dass heimische Zecken unter Laborbedingungen zur Verbreitung von Q-Fieber beitragen können. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig, um die tatsächliche Bedeutung der Vektorkompetenz von Zecken unter natürlichen Bedingungen abschätzen zu können.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Coxiella burnetii 2.1.1 Historischer Ursprung und taxonomische Einordnung 2.1.2 Morphologie und Replikation 2.1.3 Coxiella burnetii als Krankheitserreger 2.1.3.1 Epidemiologie 2.1.3.2 Coxiellosen der Tiere 2.1.3.3 Q-Fieber des Menschen 2.1.3.4 Nachweis und Therapie 2.2 Zecken 2.2.1 Taxonomie 2.2.2 Verbreitung und Habitat 2.2.3 Morphologie 2.2.4 Lebenszyklus 2.2.5 Wirtssuche und sensorische Fähigkeiten 2.2.6 Blutmahlzeit und Verdauung 2.2.7 Zeckenmikrobiom und Coxiella-like Endosymbionten 2.2.8 Zecken als Vektoren 2.2.8.1 Infektionserreger 2.2.8.2 Coxiella burnetii in Zecken 2.3 Fütterung von Zecken 2.3.1 Fütterungssysteme 2.3.1.1 Membranbasierte Fütterungssysteme 2.3.1.2 Fixierungsstimuli im Zeckenfütterungssystem 2.3.1.3 Experimentelle Infektionen im membranbasierten in-vitro-System 3 Veröffentlichungen 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 3.1.1 Publikation 1 3.2 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 3.2.2 Publikation 2 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang 8.1 Bilder der Zeckenfütterung 9 Danksagung

Es geht um die Verbesserung verschiedener Infektions- und Transfektionsprotokolle zur in vitro Arbeit mit Cryptosporidium parvum in der Zellkultur. Des weiteren wurden Mausdarmorganoide ohne Hilfe eines Mikroinjektors mit C. parvum Sporozoiten infiziert. Außerdem wurde ein Protein (Trap-C1) von C. parvum welches ein putativer Virulenzfaktor ist, molekularbiologisch untersucht.

Einleitung: Das kontrollierte Zusammenspiel zwischen glatter Muskulatur und enterischen Nervenzellen ist eine essentielle Voraussetzung für einen auf die Erfordernisse der Verdauungsprozesse angepassten Transport des Chymus im Magen-Darm-Kanal. Obwohl es zahlreiche Untersuchungen zu den einzelnen Komponenten dieses Zusammenspiels gibt, liegen nur wenige Erkenntnisse zur simultanen Steuerung der Zirkulär- (ZM) und Longitudinalmuskulatur (LM) durch nervale Komponenten vor. Aus meiner Diplomarbeit war für diesen Zweck ein neues Messsystem hervorgegangen, das simultane Motilitätsableitungen an den verschiedenen Muskelschichten im Darm ermöglicht. Ziele der Untersuchungen: In der vorliegenden Arbeit sollte das neue Messystem zur funktionellen Charakterisierung intrinsischer nervaler Schaltkreise insbesondere im Hinblick auf die Beteiligung cholinerger und nitrerger enterischer Nervenzellen am porcinen Colon angewendet und evaluiert und mit der bisher verfügbaren, eindimensionalen Messmethode verglichen werden. Tiere, Material und Methoden: Die Untersuchungen erfolgten an Präparationen aus dem distalen Colon 21 adulter Schlachtschweine. Die Präparate bestanden aus ZM und LM und dem dazwischen liegenden myenterischen Plexus. Als Referenzmethode wurde die bisher standardmäßig eingesetzte eindimensionale Messmethode (Apparatur 1) angewendet. Diese beurteilte die Colonmotilität für ZM und LM getrennt voneinander, in je 2 Organbädern je Muskulaturrichtung, an Präparationen mit einer Größe von 1x3 cm. Mit dem neuen Messsystem (Apparatur 2) erfolgten simultane, zweidimensionale Motilitätsmessungen an je drei Messpunkten der ZM bzw. LM im Abstand von 2 cm innerhalb eines größeren Darmpräparates (5x5 cm). In beiden Messapparaturen wurden mittels elektrischer Feldstimulation (EFS) evozierte Nerv-Muskel-Antworten hervorgerufen. Diese EFS-Antworten setzten sich aus einer ON-Kontraktion (während der Stimulation) und einer OFF-Kontraktion (im unmittelbaren Anschluss an die Stimulation) zusammen. In Apparatur 2 erfolgte die EFS lokal an drei verschiedenen Positionen im Präparat. Es wurden in N=15 Versuchsansätzen vergleichende Untersuchungen zwischen Apparatur 1 und 2 zur Spontanmotilität sowie zu den nach EFS erzeugten Nerv-Muskel-Antworten gemacht. Um die Beteiligung intrinsischer cholinerger und nitrerger Komponenten in der Kontrolle der Darmmotilität zu untersuchen, wurden sowohl der Einfluss der cholinergen Antagonisten Atropin und Hexamethonium als auch eine Hemmung der NO- Synthese durch L-NAME (NG Nitro L arginine methylester Hydrochlorid) in je 3 Konzentrationsstufen und N=5 Versuchsansätzen je Hemmstoff erfasst. Für die statistische Analyse wurden nichtparametrischen Verfahren verwendet. Für Einstichprobentests wurde der Wilcoxon-Vorzeichenrangtest genutzt und zur Testung nach Unterschieden innerhalb von Gruppen der Test nach Friedman und der Post-hoc Test nach Wilcoxon mit angepasstem Signifikanzniveau für Mehrfachvergleiche nach Bonferroni. Paarweise Vergleiche erfolgten durch den Wilcoxon-Test. Ergebnisse wurden als statistisch signifikant bezeichnet, wenn das Signifikanzniveau (p) < 0,05 war. Ergebnisse: Apparatur 1 und 2 lieferten unter Kontrollbedingungen qualitativ gleichwertige Messergebnisse sowohl für die Spontanmotilität als auch für die EFS-Antworten an ZM und LM. Die Spontanmotilität wurde in beiden Messapparaturen durch die Hemmstoffe kaum beeinflusst. Zwischen den Messmethoden bestanden insbesondere an der LM teils signifikante Unterschiede in der Hemmstoffwirkung. Alle drei Hemmstoffe hatten an der LM in Apparatur 1 einen erregenden Einfluss auf die Spontanmotilität sowie die OFF-Antworten, während mit Apparatur 2 ein hemmender Einfluss festgestellt wurde. Mit Apparatur 2 gelang es, lokal begrenzt im Abstand von 2 cm enterische Neurone durch EFS zu erregen und deren Muskel-Antworten am Ort der Stimulation wie auch an weiter entfernten Messorten oral und anal der Stimulationsstelle zu detektieren. Unter Kontrollbedingungen waren die OFF-Antworten der ZM signifikant vom Ort der Stimulation abhängig. Die OFF-Kontraktionen waren an anal zur Stimulationsstelle gelegenen Messpunkten signifikant niedriger ausgeprägt, während sie oral zum Stimulationsort signifikant stärker waren als am Stimulationsort selbst. Atropin und Hexamethonium führten an der ZM zu einer signifikanten Hemmung der OFF-Antworten, blockierten diese allerdings nicht komplett und waren unabhängig vom Ort der Stimulation. L-NAME demaskierte insbesondere direkt am Stimulationsort signifikant lokal erregende Anteile der EFS-Antworten. Schlussfolgerungen: Die Spontanmotilität unterliegt im porcinen Colon, unabhängig von der Messmethode, kaum cholinergen und nitrergen Einflüssen. Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Messmethoden an der LM unter Hemmstoffeinfluss könnten Folge des Größenunterschiedes zwischen den Darmpräparaten sein und auf unterschiedliche Projektionslängen cholinerger wie auch nitrerger Neurone hinweisen. Acetylcholin ist zwar ein wichtiger, aber nicht der einzige Transmitter aus myenterischen Nervenzellen, der Muskelkontraktionen am porcinen Colon induziert. Nitrerge hemmende Motoneurone haben kurze Projektionslängen (< 2 cm) und die entfernt vom Stimulationsort registrierten EFS-Antworten wurden eher durch nicht-nitrerge Interneurone oder nicht-nitrerge lang projizierende hemmende Motoneurone vermittelt. Cholinerge Interneurone sind an den EFS-Antworten beteiligt und spielen sowohl bei den lokalen als auch bei den weiter vom Stimulationsort entfernt registrierten EFS-Antworten eine Rolle. Es ist mit dieser Arbeit gelungen, neue Erkenntnisse zu cholinergen und nitrergen enterischen Schaltkreisen am porcinen Colon zu gewinnen und eine neue Messmethode für zukünftige Untersuchungen zum Zusammenspiel von ZM und LM zu evaluieren und etablieren. Aufgrund der qualitativen Vergleichbarkeit der Messergebisse zwischen beiden Messapparaturen kann in Folgeuntersuchungen mit Apparatur 2 auf bestehende Befunde aus eindimensionalen Untersuchungen zurückgegriffen werden. Vertiefend können durch die simultanen Motilitätsmessungen an ZM und LM sowohl Ausbreitungsrichtung als auch Zeitunterschiede zwischen den spontanen sowie evozierten Motilitätsmustern beider Muskelschichten bewertet werden.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Funktionen des porcinen Colons 2.2 Aufbau des Colons 2.2.1 Makroskopischer Aufbau 2.2.2 Mikroskopischer Aufbau 2.3 Darmmotilität 2.3.1 Myogene Mechanismen 2.3.2 Gastrointestinale Hormone 2.3.3 Enterisches Nervensystem (ENS) 2.3.4 Extrinsische Steuerung 2.3.5 Motilitätsmuster im Colon verschiedener Tierarten 2.3.6 Spezielle Motilitätsmuster im porcinen Colon 2.4 Untersuchungen der Darmmotilität 2.4.1 Untersuchungen in vivo 2.4.2 Untersuchungen in vitro 2.5 Bedeutung der Befunde für die vorliegende Arbeit 3 Material und Methoden 3.1 Versuchsvorbereitung 3.1.1 Gewinnung des Organmaterials 3.1.2 Gewebeaufbereitung 3.2 Versuchsanordnung 3.2.1 Apparatur: 1: eindimensionale Motilitätsmessung 3.2.2 Apparatur 2: zweidimensionale Motilitätsmessung 3.2.3 Elektrische Feldstimulation (EFS) 3.2.4 Hemmstoffe 3.3 Versuchsdurchführung 3.3.1 Voruntersuchungen 3.3.2 Funktionelle Charakterisierung enterischer Schaltkreise 3.3.3 Datenauswertung und Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Voruntersuchungen 4.1.1 TTX-Sensitivität der EFS-induzierten Muskelantworten 4.1.2 Funktioneller Ausschluss einer direkten EFS-Wirkung außerhalb des Stimulationsortes 4.2 Funktionelle Charakterisierung enterischer Schaltkreise 4.2.1 Spontanmotilität 4.2.2 Nerv-Muskel-Antworten nach elektrischer Feldstimulation 5 Diskussion 5.1 Methodendiskussion 5.2 Diskussion der Messergebnisse von Apparatur 1 und 2 5.2.1 Spontanmotilität 5.2.2 Nerv-Muskel-Antworten nach Elektrischer Feldstimulation 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis Danksagung