Einleitung: Coxiella burnetii ist ein gramnegatives und obligat intrazelluläres Bakterium und Erreger der meldepflichtigen Zoonose Q-Fieber. Den Hauptübertragungsweg stellt die Inhalation infizierter Stäube dar, aber auch Zecken werden seit der Isolation des Pathogens aus der Spezies Dermacentor andersonii als Vektoren diskutiert. Es liegen jedoch keine gesicherten Berichte über Infektionen des Menschen durch Zecken oder eine Beteiligung von Vektoren bei Q-Fieber-Ausbrüchen vor. Zudem steht durch die genetische Nähe zu überwiegend apathogenen Endosymbionten die Spezifität molekularer Untersuchungsmethoden in Frage, wodurch die Relevanz von Zecken in der Übertragung von Q-Fieber in der Literatur kontrovers diskutiert wird. Ziele der Untersuchung: Es sollten mithilfe einer systematischen Literaturanalyse die Daten zur Prävalenz von C. burnetii in Zecken in Europa dargelegt werden. Zudem sollte mittels eines in-vitro-Fütterungssystems untersucht werden, inwieweit die heimischen Spezies Ixodes ricinus und Dermacentor marginatus den Erreger aus dem Blut aufnehmen und ausscheiden, sowie ob das Bakterium transstadial in I. ricinus übertragen wird, wodurch Aussagen über die Vektorkompetenz dieser Arten möglich sind. Tiere, Material und Methoden: Im experimentellen Ansatz wurde die Infektion der Zecken in einem Silikonmembran-basierten Fütterungssystem mit heparinisiertem Rinderblut vorgenommen. Die Gruppengrößen betrugen 7-9 Weibchen mit fünf Männchen oder 50-60 Nymphen. Es wurden verschiedene Konzentrationen C. burnetii Nine Mile RSA439 Phase II eingesetzt: 10^4 (zwei Gruppen adulte I. ricinus), 10^5 (zwei Gruppen adulte I. ricinus) und 10^6 (fünf Gruppen adulte I. ricinus, vier Gruppen adulte D. marginatus, drei Gruppen I. ricinus Nymphen) Genomäquivalente (GE)/ml Blut sowie insgesamt sieben Negativkontrollgruppen. Zudem wurden vier Gruppen adulte I. ricinus für 36 Stunden zu Beginn der Fütterung mit 10^6 GE C. burnetii/ml infiziert und anschließend mit sterilem Blut gefüttert. Täglich wurde Zeckenkot entfernt, zudem wurden adulte I. ricinus zu unterschiedlichen Zeitpunkten während oder nach der Fütterung entnommen. Die Proben wurden nach DNA-Extraktion mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) auf das C. burnetii-Gen icd untersucht. Ein Teil (n = 46) der infizierten Nymphen wurde vor bzw. nach der Häutung mittels qPCR untersucht. Ein anderer Teil (acht Weibchen in zwei Gruppen) wurde nach der Häutung erneut auf sterilem Blut gefüttert. Dabei wurden Kot sowie Blut getestet. Weiterhin fand in L929-Zellen und axenischem Medium eine Anzucht von C. burnetii aus einem Filtrat des Zeckenkots sowie aus dem Filtrat eines qPCR-positiven Weibchens statt, welches sich von einer zuvor infizierten Nymphe gehäutet hatte. Die statistische Auswertung erfolgte mittels SPSS V 22.0, wobei je nach Voraussetzung der t-Test, der Mann-Whitney-U-Test sowie der Chi²-Test nach Pearson verwendet wurden. Das Signifikanzniveau wurde jeweils auf p < 0,05 festgelegt. Ergebnisse: Im Fütterungssystem haben 49 % der adulten I. ricinus und 29 % der D. marginatus vollständig gesaugt. Die Häutungsrate der I. ricinus Nymphen betrug 92 %. I. ricinus-Weibchen nahmen den Erreger auf, welcher innerhalb von sieben Wochen in einer Konzentration von ca. 10^3 GE/mg in den Zecken nachweisbar war. Eine Ausscheidung von infektiösen C. burnetii mit dem Kot wurde bei adulten Zecken ab einer Konzentration von 10^5 GE/ml im verfütterten Blut festgestellt. Dabei erfolgte in allen Versuchen mit beiden Zeckenspezies eine signifikant höhere Ausscheidung von C. burnetii an den Tagen 10-13, welche bis zu 10^5 GE/mg erreichte. Es wurde eine transstadiale Übertragung bei I. ricinus mit einer Rate von 25 % nach-gewiesen. Infizierte Nymphen, die nach der Häutung steriles Blut bekamen, schieden ebenfalls C. burnetii im Kot aus; im Blut wurde hingegen keine DNA von C. burnetii nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Das genutzte Fütterungssystem eignet sich für die Untersuchung der Vektorkompetenz von Zecken. Beide Zeckenspezies sind in der Lage, infektiösen Zeckenkot auszuscheiden, wodurch eine Gefahr einer möglichen aerogenen Übertragung entsteht. Dabei muss jedoch eine hohe Erregerkonzentration im Blut des Wirts erreicht werden. Es wurde eine transstadiale Übertragung von C. burnetii in I. ricinus von Nymphen zu Adulten und damit die Möglichkeit der Bildung eines Reservoirs nachgewiesen. Die Ergebnisse legen eine Vermehrung von C. burnetii im Mitteldarm der Zecken nahe. Dadurch konnten historische Aussagen aus der Literatur über andere Zeckenspezies zur Ausscheidung von C. burnetii mittels Zeckenkot bestätigt werden. In der Studie konnte weiterhin gezeigt werden, dass heimische Zecken unter Laborbedingungen zur Verbreitung von Q-Fieber beitragen können. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig, um die tatsächliche Bedeutung der Vektorkompetenz von Zecken unter natürlichen Bedingungen abschätzen zu können.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Coxiella burnetii 2.1.1 Historischer Ursprung und taxonomische Einordnung 2.1.2 Morphologie und Replikation 2.1.3 Coxiella burnetii als Krankheitserreger 2.1.3.1 Epidemiologie 2.1.3.2 Coxiellosen der Tiere 2.1.3.3 Q-Fieber des Menschen 2.1.3.4 Nachweis und Therapie 2.2 Zecken 2.2.1 Taxonomie 2.2.2 Verbreitung und Habitat 2.2.3 Morphologie 2.2.4 Lebenszyklus 2.2.5 Wirtssuche und sensorische Fähigkeiten 2.2.6 Blutmahlzeit und Verdauung 2.2.7 Zeckenmikrobiom und Coxiella-like Endosymbionten 2.2.8 Zecken als Vektoren 2.2.8.1 Infektionserreger 2.2.8.2 Coxiella burnetii in Zecken 2.3 Fütterung von Zecken 2.3.1 Fütterungssysteme 2.3.1.1 Membranbasierte Fütterungssysteme 2.3.1.2 Fixierungsstimuli im Zeckenfütterungssystem 2.3.1.3 Experimentelle Infektionen im membranbasierten in-vitro-System 3 Veröffentlichungen 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 3.1.1 Publikation 1 3.2 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 3.2.2 Publikation 2 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang 8.1 Bilder der Zeckenfütterung 9 Danksagung

Es geht um die Verbesserung verschiedener Infektions- und Transfektionsprotokolle zur in vitro Arbeit mit Cryptosporidium parvum in der Zellkultur. Des weiteren wurden Mausdarmorganoide ohne Hilfe eines Mikroinjektors mit C. parvum Sporozoiten infiziert. Außerdem wurde ein Protein (Trap-C1) von C. parvum welches ein putativer Virulenzfaktor ist, molekularbiologisch untersucht.

Einleitung: Das kontrollierte Zusammenspiel zwischen glatter Muskulatur und enterischen Nervenzellen ist eine essentielle Voraussetzung für einen auf die Erfordernisse der Verdauungsprozesse angepassten Transport des Chymus im Magen-Darm-Kanal. Obwohl es zahlreiche Untersuchungen zu den einzelnen Komponenten dieses Zusammenspiels gibt, liegen nur wenige Erkenntnisse zur simultanen Steuerung der Zirkulär- (ZM) und Longitudinalmuskulatur (LM) durch nervale Komponenten vor. Aus meiner Diplomarbeit war für diesen Zweck ein neues Messsystem hervorgegangen, das simultane Motilitätsableitungen an den verschiedenen Muskelschichten im Darm ermöglicht. Ziele der Untersuchungen: In der vorliegenden Arbeit sollte das neue Messystem zur funktionellen Charakterisierung intrinsischer nervaler Schaltkreise insbesondere im Hinblick auf die Beteiligung cholinerger und nitrerger enterischer Nervenzellen am porcinen Colon angewendet und evaluiert und mit der bisher verfügbaren, eindimensionalen Messmethode verglichen werden. Tiere, Material und Methoden: Die Untersuchungen erfolgten an Präparationen aus dem distalen Colon 21 adulter Schlachtschweine. Die Präparate bestanden aus ZM und LM und dem dazwischen liegenden myenterischen Plexus. Als Referenzmethode wurde die bisher standardmäßig eingesetzte eindimensionale Messmethode (Apparatur 1) angewendet. Diese beurteilte die Colonmotilität für ZM und LM getrennt voneinander, in je 2 Organbädern je Muskulaturrichtung, an Präparationen mit einer Größe von 1x3 cm. Mit dem neuen Messsystem (Apparatur 2) erfolgten simultane, zweidimensionale Motilitätsmessungen an je drei Messpunkten der ZM bzw. LM im Abstand von 2 cm innerhalb eines größeren Darmpräparates (5x5 cm). In beiden Messapparaturen wurden mittels elektrischer Feldstimulation (EFS) evozierte Nerv-Muskel-Antworten hervorgerufen. Diese EFS-Antworten setzten sich aus einer ON-Kontraktion (während der Stimulation) und einer OFF-Kontraktion (im unmittelbaren Anschluss an die Stimulation) zusammen. In Apparatur 2 erfolgte die EFS lokal an drei verschiedenen Positionen im Präparat. Es wurden in N=15 Versuchsansätzen vergleichende Untersuchungen zwischen Apparatur 1 und 2 zur Spontanmotilität sowie zu den nach EFS erzeugten Nerv-Muskel-Antworten gemacht. Um die Beteiligung intrinsischer cholinerger und nitrerger Komponenten in der Kontrolle der Darmmotilität zu untersuchen, wurden sowohl der Einfluss der cholinergen Antagonisten Atropin und Hexamethonium als auch eine Hemmung der NO- Synthese durch L-NAME (NG Nitro L arginine methylester Hydrochlorid) in je 3 Konzentrationsstufen und N=5 Versuchsansätzen je Hemmstoff erfasst. Für die statistische Analyse wurden nichtparametrischen Verfahren verwendet. Für Einstichprobentests wurde der Wilcoxon-Vorzeichenrangtest genutzt und zur Testung nach Unterschieden innerhalb von Gruppen der Test nach Friedman und der Post-hoc Test nach Wilcoxon mit angepasstem Signifikanzniveau für Mehrfachvergleiche nach Bonferroni. Paarweise Vergleiche erfolgten durch den Wilcoxon-Test. Ergebnisse wurden als statistisch signifikant bezeichnet, wenn das Signifikanzniveau (p) < 0,05 war. Ergebnisse: Apparatur 1 und 2 lieferten unter Kontrollbedingungen qualitativ gleichwertige Messergebnisse sowohl für die Spontanmotilität als auch für die EFS-Antworten an ZM und LM. Die Spontanmotilität wurde in beiden Messapparaturen durch die Hemmstoffe kaum beeinflusst. Zwischen den Messmethoden bestanden insbesondere an der LM teils signifikante Unterschiede in der Hemmstoffwirkung. Alle drei Hemmstoffe hatten an der LM in Apparatur 1 einen erregenden Einfluss auf die Spontanmotilität sowie die OFF-Antworten, während mit Apparatur 2 ein hemmender Einfluss festgestellt wurde. Mit Apparatur 2 gelang es, lokal begrenzt im Abstand von 2 cm enterische Neurone durch EFS zu erregen und deren Muskel-Antworten am Ort der Stimulation wie auch an weiter entfernten Messorten oral und anal der Stimulationsstelle zu detektieren. Unter Kontrollbedingungen waren die OFF-Antworten der ZM signifikant vom Ort der Stimulation abhängig. Die OFF-Kontraktionen waren an anal zur Stimulationsstelle gelegenen Messpunkten signifikant niedriger ausgeprägt, während sie oral zum Stimulationsort signifikant stärker waren als am Stimulationsort selbst. Atropin und Hexamethonium führten an der ZM zu einer signifikanten Hemmung der OFF-Antworten, blockierten diese allerdings nicht komplett und waren unabhängig vom Ort der Stimulation. L-NAME demaskierte insbesondere direkt am Stimulationsort signifikant lokal erregende Anteile der EFS-Antworten. Schlussfolgerungen: Die Spontanmotilität unterliegt im porcinen Colon, unabhängig von der Messmethode, kaum cholinergen und nitrergen Einflüssen. Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Messmethoden an der LM unter Hemmstoffeinfluss könnten Folge des Größenunterschiedes zwischen den Darmpräparaten sein und auf unterschiedliche Projektionslängen cholinerger wie auch nitrerger Neurone hinweisen. Acetylcholin ist zwar ein wichtiger, aber nicht der einzige Transmitter aus myenterischen Nervenzellen, der Muskelkontraktionen am porcinen Colon induziert. Nitrerge hemmende Motoneurone haben kurze Projektionslängen (< 2 cm) und die entfernt vom Stimulationsort registrierten EFS-Antworten wurden eher durch nicht-nitrerge Interneurone oder nicht-nitrerge lang projizierende hemmende Motoneurone vermittelt. Cholinerge Interneurone sind an den EFS-Antworten beteiligt und spielen sowohl bei den lokalen als auch bei den weiter vom Stimulationsort entfernt registrierten EFS-Antworten eine Rolle. Es ist mit dieser Arbeit gelungen, neue Erkenntnisse zu cholinergen und nitrergen enterischen Schaltkreisen am porcinen Colon zu gewinnen und eine neue Messmethode für zukünftige Untersuchungen zum Zusammenspiel von ZM und LM zu evaluieren und etablieren. Aufgrund der qualitativen Vergleichbarkeit der Messergebisse zwischen beiden Messapparaturen kann in Folgeuntersuchungen mit Apparatur 2 auf bestehende Befunde aus eindimensionalen Untersuchungen zurückgegriffen werden. Vertiefend können durch die simultanen Motilitätsmessungen an ZM und LM sowohl Ausbreitungsrichtung als auch Zeitunterschiede zwischen den spontanen sowie evozierten Motilitätsmustern beider Muskelschichten bewertet werden.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Funktionen des porcinen Colons 2.2 Aufbau des Colons 2.2.1 Makroskopischer Aufbau 2.2.2 Mikroskopischer Aufbau 2.3 Darmmotilität 2.3.1 Myogene Mechanismen 2.3.2 Gastrointestinale Hormone 2.3.3 Enterisches Nervensystem (ENS) 2.3.4 Extrinsische Steuerung 2.3.5 Motilitätsmuster im Colon verschiedener Tierarten 2.3.6 Spezielle Motilitätsmuster im porcinen Colon 2.4 Untersuchungen der Darmmotilität 2.4.1 Untersuchungen in vivo 2.4.2 Untersuchungen in vitro 2.5 Bedeutung der Befunde für die vorliegende Arbeit 3 Material und Methoden 3.1 Versuchsvorbereitung 3.1.1 Gewinnung des Organmaterials 3.1.2 Gewebeaufbereitung 3.2 Versuchsanordnung 3.2.1 Apparatur: 1: eindimensionale Motilitätsmessung 3.2.2 Apparatur 2: zweidimensionale Motilitätsmessung 3.2.3 Elektrische Feldstimulation (EFS) 3.2.4 Hemmstoffe 3.3 Versuchsdurchführung 3.3.1 Voruntersuchungen 3.3.2 Funktionelle Charakterisierung enterischer Schaltkreise 3.3.3 Datenauswertung und Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Voruntersuchungen 4.1.1 TTX-Sensitivität der EFS-induzierten Muskelantworten 4.1.2 Funktioneller Ausschluss einer direkten EFS-Wirkung außerhalb des Stimulationsortes 4.2 Funktionelle Charakterisierung enterischer Schaltkreise 4.2.1 Spontanmotilität 4.2.2 Nerv-Muskel-Antworten nach elektrischer Feldstimulation 5 Diskussion 5.1 Methodendiskussion 5.2 Diskussion der Messergebnisse von Apparatur 1 und 2 5.2.1 Spontanmotilität 5.2.2 Nerv-Muskel-Antworten nach Elektrischer Feldstimulation 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis Danksagung

Einleitung: Reinigung und Desinfektion sind wichtige Instrumente zur Verhinderung der Ausbreitung von Krankheitserregern, insbesondere wenn es sich um multiresistente Bakterien handelt. MRSA und ESBL-produzierende Enterobacteriaceae kommen sowohl in der Human- wie auch in der Veterinärmedizin vor und sind teilweise zoonotisch. Um eine wirksame Desinfektion mit entsprechenden Handelspräparaten zu gewährleisten, gibt es standardisierte mehrschrittige Prüfverfahren, die vor einer Listung des Desinfektionsmittels erfolgreich durchlaufen werden müssen (z.B. Prüfverfahren der Deutschen Veterinär-medizinischen Gesellschaft e.V. (DVG) oder dem Verbund für angewandte Hygiene e.V. (VAH)). Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Studie war es zu ermitteln, inwieweit die zugrundeliegende Testmethode einen Einfluss auf die Aussage einer möglichen Desinfektionsmittel-Resistenz bei Bakterien hat. Außerdem sollten stammspezifische Unterschiede zwischen Antibiotika-sensiblen Prüfkeimen und (multi-)resistenten Stämmen untersucht werden. Ebenfalls wurde nach Unterschieden zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien in Bezug auf die Wirksamkeit des jeweiligen Desinfektionsmittels geschaut. Material und Methoden: Die Desinfektionsmittelprüfung wurde in einem dreistufigen Testverfahren bestehend aus: Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK), qualitativem Suspensionstest mit und ohne geringer organischer Belastung und Keimträgertest mit geringer organischer Belastung in Anlehnung an die Richtlinie der DVG von 2013 bzw. 2015 durchgeführt. Dabei wurden zwölf grampositive S. aureus-Stämme (zwei MSSA, neun MRSA und ein MRSA-QC Stamm) und 13 gramnegative Enerobacteriaceae (z.T. ESBL-positiv, drei 3MRGN) der Gattung E. coli, K. pneumoniae und S. Typhimurium getestet. Geprüft wurden fünf chemischen Grundsubstanzen, welche in gängigen Desinfektionsmitteln eingesetzt werden. Diese sind Benzalkoniumchlorid (BAC), Natriumhypochlorit (SHO), Peressigsäure (PA), Glutaraldehyd (GA) und Ethanol (ETH). Die Ergebnisse wurden anschließend verglichen und statistisch ausgewertet. Ergebnisse: Es besteht eine große Varianz der Ergebnisse in Bezug auf den Vergleich der drei Prüfmethoden. So gab es beispielsweise deutliche Unterschiede im Vergleich der MHK-Werte und der Ergebnisse im Keimträgertest. Hier konnten im Praxistest höhere Konzentrationen wie am deutlichsten bei BAC (maximal 1.500-fach bei SA 2) zu sehen aber auch bei ETH, SHO (5 min) und PA (5 min) ermittelt werden. Andersherum reichten geringere Konzentrationen bei GA, SHO (30 min) und PA (30 min) zur Desinfektion im Keimträgertest aus. Beim Vergleich der (multi-)resistenten Erreger (MRE) gegenüber den entsprechenden Prüfstämmen gab es ebenfalls keine homogene Richtung. So waren die Antibiotika-sensiblen Prüfstämme häufig mit geringeren Desinfektionsmittel-Konzentrationen abzutöten, dennoch nicht immer (gleiche oder höhere Konzentrationen notwendig). Auch beim Vergleich der Sensibilität zwischen grampositiven und gramnegativen Stämmen ergab sich ein heterogenes Bild. So waren in Bezug auf die MHK-Werte die grampositiven Stämme signifikant sensibler gegenüber BAC und andererseits signifikant toleranter gegen-über ETH und SHO. Der Effekt einer Erhöhung der wirksamen Konzentration bei geringer organischer Belastung konnte bestätigt werden und war am deutlichsten bei BAC und SHO ausgeprägt mit einer Erhöhung der wirksamen Konzentration um das bis zu 50-fache. Zusammenfassend können wir mit unseren Ergebnissen keine per se vorhandene Desinfektionsmittel-Resistenz bei den getesteten MRE gegenüber den Antibiotika-sensiblen Prüfstämmen nachweisen. Schlussfolgerungen: Die Prüfmethode hat maßgebenden Einfluss auf das Ergebnis der Desinfektionsmittelprüfung und der damit verbundenen Einstufung eines Erregers als resistent bzw. tolerant gegenüber Desinfektionsmitteln. Praxisnahe Tests sollten dabei immer mit einbezogen werden. Für eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit anderen Studien wäre eine weitere Vereinheitlichung der Prüfmethoden wünschenswert. Mit unseren Ergebnissen konnten wir zeigen, dass bei einer korrekten Anwendung der Desinfektionsmittel keine zusätzlichen Maßnahmen für MRE getroffen werden müssen. Diese werden ebenfalls zuverlässig bei der Routinedesinfektion mit gelisteten Produkten bei handelsüblichen Gebrauchskonzentrationen abgetötete.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Multiresistente Erreger (MRE) 2.1.1 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) 2.1.2 Enterobacteriaceae 2.1.3 Vorkommen von MRE in der Veterinärmedizin, der Humanmedizin und im Lebensmittel 2.2 Biozidresistenz 2.3 Prüfrichtlinien 2.3.1 Prinzip der Desinfektionsmittelprüfung nach DVG 2.3.2 weitere Prüfrichtlinien/ Desinfektionsmittellisten 2.3.3 verwendete chemische Grundsubstanzen 2.3.4 Wirkungsweise von Desinfektionsmitteln 2.4 Beschreibung der ausgewählten Bakterienstämme 3 Veröffentlichung 3.1 Eigenanteil 3.2 Fremdanteil 3.3 veröffentlichter Zeitschriftenartikel 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary Literaturverzeichnis Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Danksagung

Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSCs) stellen nicht nur beim humanen Patienten, sondern auch in der Veterinärmedizin einen vielversprechenden Therapieansatz in der Behandlung erkrankter muskuloskelettaler Gewebe dar. Ziel der Behandlung ist dabei die Regeneration der betroffenen Strukturen im Vergleich zur Reparation nach konservativer Therapie. Vor allem im Bereich von Sehnenerkrankungen können nach MSC-Applikation vielversprechende Ergebnisse im Hinblick auf niedrigere Rezidivraten beobachtet werden. Dennoch sind noch nicht alle Umstände einer optimalen MSC-Anwendung geklärt. Hierbei sind unter anderem Fragen bezüglich der Herkunft und Gewinnung von MSCs offen, da Unterschiede von MSCs aufgrund ihrer Gewebezugehörigkeit bereits nachgewiesen wurden. Grundlegende umfassende Arbeiten zum Vergleich von equinen MSCs aus verschiedenen Quellen sowie deren mögliche Beeinflussung durch die Isolierung aus dem Gewebe lagen bislang noch nicht vor. Ziel dieser Studie war es daher, equine MSCs aus verschiedenen Quellen zu gewinnen und mögliche Unterschiede in vitro aufzuzeigen. Weiterhin sollten Unterschiede zwischen den Zelleigenschaften nach Anwendung verschiedener Isolationsprotokolle untersucht werden. In der hier vorliegenden Studie wurden MSCs aus Fett- und Sehnengewebe, Knochenmark, Nabelschnurblut und Nabelschnurgewebe von Pferden isoliert und vergleichend charakterisiert. Dabei wurden für die soliden Körpergewebe zwei unterschiedliche Isolationsmethoden, die Digestion und die Explantation, angewendet, um mögliche Einflüsse auf die gewonnen Zellen zu ermitteln. Die untersuchten Kriterien beinhalteten Zellertrag, Proliferation, Differenzierungspotenz und das Migrationsverhalten von MSCs. Hinblickend auf eine Anwendung von MSCs bei Sehnenerkrankungen wurde auch die Expression von Sehnenmarkern verglichen. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass sich die MSCs aus verschiedenen Quellen hinsichtlich der Zellausbeute und ihres Wachstumspotentials unterschieden. Aus soliden Geweben konnten mittels Digestion im Vergleich zu Körperflüssigkeiten signifikant mehr MSCs isoliert werden (p < 0,001). Dabei erbrachte die Isolation von MSCs mittels Digestionsmethode einen deutlich höheren Zellertrag nach der Passage 0 im Vergleich zur Explantationsmethode (p < 0,05). Im weiteren Verlauf der Kultivierung zeigten MSCs aus Sehnengewebe und Fettgewebe ein signifikant besseres Proliferationsverhalten im Vergleich zu Knochenmark-MSCs und Nabelschnurblut-MSCs. Im Hinblick auf das Differenzierungspotential konnten signifikante Unterschiede zwischen den MSCs aus den verschiedenen Quellen beobachtet werden. MSCs aus Knochenmark zeigten eine sehr gute osteogene Differenzierungsfähigkeit im Vergleich zu MSCs aus den geburtsassoziierten Geweben (p < 0,05). Im Gegensatz dazu zeichneten sich diese MSCs durch eine deutlich bessere chondrogene Differenzierung im Vergleich zu Knochenmark-MSCs aus (p < 0,05). Im Hinblick auf die Isolationsmethode konnten keine Unterschiede im Differenzierungspotential beobachtet werden. Weitere Unterschiede aufgrund der Zellquelle lassen sich in der Genexpression der Sehnenmarker erkennen. MSCs aus Fettgewebe und Sehnengewebe exprimierten Kollagen 1A2 auf höchstem Niveau. Sklexaris hingegen wurde von MSCs aus Nabelschnurblut und Sehnengewebe am höchstem exprimiert. Dabei zeigten MSCs, die mittels Digestionsmethode isoliert worden waren, ein signifikant höheres Expressionslevel von Skleraxis im Vergleich zur Explantationsmethode (p < 0,05). Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen einen Einfluss der Zellquelle auf die Zellcharakteristika erkennen. MSCs aus Fettgewebe stellen dabei eine vielversprechende Alternative zu Knochenmark-MSCs dar. Allerdings scheint für eine klinische Anwendung von MSCs eine selektive Auswahl der Zellquelle entsprechend der vorliegenden Erkrankung von Vorteil zu sein. Dabei ist eine Isolierung von MSCs aus soliden Geweben mittels Digestionsverfahren zu empfehlen, da hier deutlich höhere Zellzahlen gewonnen werden können. Eine negative Beeinflussung der Zelleigenschaften durch die enzymatische Digestion lässt sich nach den vorliegenden Ergebnissen nicht vermuten. Inwiefern die beobachteten Unterschiede bei in-vivo-Anwendungen von Bedeutung sind, muss jedoch noch umfassend untersucht werden. / Not only in humans but also in veterinary medicine, multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) are a promising treatment option in the therapy of injured musculoskeletal tissues. This is due to the improved tissue regeneration instead of the insufficient reparation following conventional therapies. With regard to an application of MSCs for treatment of tendinopathies in horses, lower rates of reinjury have been reported. However, further investigations to optimize the MSC treatment are still outstanding. Differences in MSCs from different origins have been already reported, but there are still remaining questions about the influence of origin and isolation procedures of MSCs. Fundamental research on equine MSCs derived from different sources and their potential impact due to the isolation process has not been published so far. The aim of this study was to isolate equine MSCs from different sources and to demonstrate potential differences in vitro. Furthermore, differences in cell features following different isolation methods were investigated. In the present study, MSCs from horses were isolated from adipose tissue, tendon tissue, bone marrow, umbilical cord blood and umbilical cord tissue and subsequently subjected to comparative characterization. In case of the solid tissues, two different isolation methods, digestion and explantation, were performed in order to analyze influences on obtained cells. Investigated cell features included cell yield, proliferation, differentiation and migration potential. Furthermore, expression of tendon markers was evaluated with regard to an application of MSCs in tendinopathies. In the present study it was shown that MSCs derived from different sources differ distinctly in cell yield and proliferation potential. In comparison to body fluids, significantly more MSCs could be isolated from solid tissues when using the digestion method (p < 0.001). Furthermore, the cell yield at first cell harvest was distinctly higher when performing the isolation by digestion in comparison to isolation by explantation (p < 0.05). With regard to further cultivation, MSCs derived from tendon tissue and adipose tissue displayed a significantly better proliferation potential compared to MSCs derived from other sources. Considering the differentiation potential, significant differences were obvious between the MSCs derived from different sources. Bone marrow-MSCs showed an excellent osteogenic differentiation capacity in comparison to MSCs derived from umbilical cord blood and tissue (p < 0.05). In contrast, the birth-associated MSCs displayed a distinctly better chondrogenic differentiation than MSCs derived from bone marrow (p < 0.05). No difference in the differentiation potential was noticeable following the different isolation procedures. Furthermore, differences in the gene expression of tendon markers were evident with regard to the cell source. MSCs derived from adipose tissue and tendon tissue expressed collagen 1A2 on the highest level. On the other hand, scleraxis was expressed highest in MSCs derived from umbilical cord blood and tendon tissue. In these cells, MSCs isolated by the digestion method showed a significantly higher expression level of scleraxis in comparison to MSCs isolated by explantation (p < 0.05). Based on the results obtained so far, a relevant impact of the source of MSCs on cell features was evident. MSCs derived from adipose tissue are a promising alternative to bone marrow-MSCs. However, with regard to a clinical application of MSCs, a selection of the MSC source depending on the respective intended use seems to be advantageous. For routine isolation of MSCs from solid tissues, the digestion method could be recommended due to the higher obtainable cell numbers. Furthermore, a negative influence of the enzymatic digestion on the cell features was not detectable. However, to what extent the observed differences in vitro are relevant for in-vivo-applications needs to be further investigated.

Viren haben als Ursache lebensmittelassoziierter Infektionen eine große Bedeutung. Sie können vor allem über rohe oder unzureichend erhitzte Lebensmittel übertragen werden. In diesem Zusammenhang werden grüner Salat, Erdbeeren, Himbeeren, Frühlingszwiebeln, Muscheln, halbgetrocknete Tomaten, fäkal verunreinigtes Trinkwasser, Backwaren und Rohwürste als häufige Infektionsquellen genannt. Vor allem kurzgereifte Rohwürste gehören aus mikrobiologischer Sicht zu Risikoprodukten. Um eine gleichbleibende Qualität der Produkte zu gewährleisten, ist die Verwendung von Starterkulturen unerlässlich. Als sogenannte Schutzkulturen sollen sie gleichzeitig die Vermehrung unerwünschter bakterieller Pathogene unterbinden. Bisher ist allerdings nicht bekannt, inwieweit diese zur Virusinaktivierung in kurzgereiften Rohwürsten führen bzw. beitragen. Aus diesem Grund war es das Ziel dieser Arbeit, den Einfluss von rohwurstrelevanten Starter- und Schutzkulturen sowie deren Metabolite (Bacteriocine, Milchsäure) auf die Tenazität und Inaktivierungskinetik von Viren zu prüfen. Die Untersuchungen erfolgten mit dem murinen Norovirus (MNV) S 99 sowie dem humanen Influenzavirus H1N1 (A/WSN/33). Antivirale Effekte wurden zum einen anhand von in-vitro-Studien, zum anderen anhand von experimentell mit Viren kontaminierten kurzgereiften Rohwürsten (Mettwurst/Teewurst) geprüft. Die Bacteriocine Sakacin A und Nisin zeigten in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) keine viruzide Wirkung gegenüber MNV S 99 und H1N1 (pH 6,2; 24 °C; Exposition: 3 Tage). Weiterhin wurden anhand von in-vitro-Untersuchungen 29 verschiedene zellfreie Kulturüberstände [Milchsäurebakterien, Staphylococcus spp. (S.), Kocuria (K.) varians] hinsichtlich ihrer antiviralen Wirkung geprüft. Dabei konnte eine signifikante Titerreduktion von MNV S 99 bei Exposition mit dem Kulturüberstand eines Lactobacillus (Lb.) curvatus-Isolates festgestellt werden (p < 0,05). In mit dieser Kultur fermentiertem Tee- und Mettwurstbrät zeigte sich jedoch kein Effekt. Die Virustenazität von H1N1 und MNV S 99 konnte mit D,L-Milchsäure unter rohwurstrelevanten Bedingungen (pH 5,0 bis 6,2) sowohl in-vitro als auch im frischen Mettwurstbrät beeinflusst werden. In-vitro erzielte Titerreduktionen lagen bei 2,5 (H1N1) bzw. 3,25 log-Stufen (MNV S 99) nach drei Tagen (24 °C) Lagerung. Im Gegensatz dazu war MNV S 99 im Vergleich zu H1N1 im Mettwurstbrät stabiler. H1N1 konnte unterhalb von pH 5,5 bereits direkt nach dem Einmischen der Influenzaviren in das Wurstbrät nicht mehr nachgewiesen werden. MNV S 99 wurde hingegen erst nach einem Tag Lagerung (22 °C) maximal um 0,7 log-Stufen reduziert (pH 5,2). Die verwendeten Starter- und Schutzkulturen (Lb. sakei, Lb. curvatus, Lb. paracasei, Lb. plantarum, S. carnosus, S. xylosus, K. varians) zeigten im Mett- und Teewurstbrät im Vergleich zur Kontrolle (ohne Starterkultur) keinen zusätzlichen viruziden Effekt auf MNV S 99. Zunehmende Virustiterreduktionen konnten mit pH-Wert-Erniedrigung beobachtet werden. Nach der Reifung (1 Tag, 22 °C, pH 4,9) von Mettwurst mit Starterkulturen wurde das Virus um maximal 1,65 log-Stufen reduziert. In mit Einzel- beziehungsweise Mehrstamm-Mischkulturen fermentierter Teewurst (7 Tage, 22 °C, pH 4,9) betrug die Titerreduktion maximal 1,10 log-Stufen. Das Influenzavirus H1N1 konnte im Rohwurstbrät mit Starterkulturen auch nach Verwendung hoher Ausgangstiter bereits zu Beginn der Untersuchungen nicht mehr nachgewiesen werden. Aus den erzielten Daten kann geschlussfolgert werden, dass die Bacteriocine Sakacin A und Nisin nicht als antivirale Zusatzstoffe in Lebensmitteln (z. B. Rohwürste) geeignet sind. Das antivirale Potential von zellfreien Kulturüberständen war Bakterienstamm-spezifisch und nur in-vitro ersichtlich. Daher muss die Nutzung des Lb. curvatus 1-Stammes nicht anderen rohwurstrelevanten Starterkulturen vorgezogen werden. Die Verwendung von Milchsäure als Zusatzstoff im Rohwurstbrät eignet sich nur zum Ausschluss einer viralen Exposition im Zusammenhang mit H1N1. Frische Mettwurst muss allerdings hierzu adäquat gesäuert (pH < 5,5) werden. Neben dem antiviralen Effekt durch gebildete Säure, konnte keine weitere spezies-spezifische antivirale Wirkung verwendeter Starter- und Schutzkulturen auf MNV S 99 festgestellt werden. Die Säureleistung einzelner Kulturen ist demzufolge für eine Virusinaktivierung entscheidend. Das antivirale Potential verwendeter Starter- und Schutzkulturen in Rohwürsten ist im Zusammenhang mit MNV S 99 als gering einzuschätzen. Unter der Annahme, dass murine und humane Noroviren eine ähnliche Tenazität in kurzgereiften Rohwürsten aufweisen, sollten diese Produkte im Zusammenhang mit Noroviren als Risikoprodukte eingestuft werden.

Circoviren sind kleine, unbehüllte Viren mit einem einzelsträngigen zirkulären DNA Genom mit eine Größe von 1,7 bis 2,4 kb. Das Porcine Circovirus Typ 2 (PCV2), welches zum Genus Circovirus gehört, ist mit einer Anzahl von Krankheitsmanifestationen verbunden worden, die heute als Porcine Circovirus Assoziierte Krankheiten (PCVAD) zusammengefasst sind. Die PCV2-Infektion bei Rindern ist bis zum jetzigen Zeitpunkt marginal erforscht worden. Serologische Untersuchungen auf Circovirus spezifische Antikörperführten zu widersprüchlichen Ergebnissen. Im Jahr 2007 wurde von der Bovinen Neonatalen Panzytopenie (BNP) in Europa mit unklarer Genese berichtet. Das klinisch - pathologische Bild der Hämorrhagien ähnelte dem Krankheitsbild der Infektiösen Anämie, welche durch ein Circovirus bei Hühnern verursacht wird. Deshalb wurde in dieser Studie eine Breitspektrum PCR zum Nachweis von Cirocvirus-Genomen durchgeführt. In 5 von 25 BNP betroffenen Kälbern konnte circovirale DNA nachgewiesen werden. Das komplette Genom wurde nachfolgend amplifiziert, kloniert und sequenziert. Das nachgewiesene Genom (PCV2-Ha08) hat eine Länge von 1768 Nukleotiden und zeigte eine hohe Homologie (bis zu 99%) mit PCV2-Genotyp b (siehe Publikation 1). Als Ursache der BNP ist vor kurzen die Übertragung von Alloantikörpern über das Kolostrum beschrieben wurden, welche die Zerstörungen von Leukozyten und Thrombozyten sowie deren Vorläuferzellen bewirken. Ungeachtet dessen war es wichtig, die Empfänglichkeit und Immunantwort von Kälbern nach experimenteller Infektion mit PCV2 zu studieren. Für diesen Zweck wurden weitere 181 Proben von BNP-Kälbern aus Deutschland mit Hilfe einer Breitspektrum-PCR getestet. In zwei von 181 Proben wurde PCV2 DNA nachgewiesen. Die vollständigen Sequenzen konnten amplifiziert werden. Während das erste Genom aus einer Blutprobe eines Kalbs in Bayern stammte (PCV2-Ha09), stammte das zweite nachgewiesene Genom aus Lunge und Gehirn von einem Kalb in Sachsen (PCV2-Ha10). Das Genom (PCV2-Ha09) besteht aus 1768 nt, währenddessen das Genom (PCV2-Ha10) aus 1767 nt aufgebaut ist (siehe Publikation 2). Weiterhin wurden die PCV2 Empfänglichkeit und die Immunantwort von Kälbern durch experimentellen PCV2 Inokulation sowie die Möglichkeit, eine Serokonversion nach Impfung mit einer kommerziellen PCV2 Vakzin zu entwickeln, untersucht. PCV2-spezifische Antikörper wurden in den PCV2-infizierten Tieren und in den PCV2-immunisierten Tieren im Tag 11 und 7 nach Inokulation (p.i.) nachgewiesen. PCV2-Genome wurden durch quantitative Realtime-PCR zwischen Tag 4 und Tag 46 p.i. nur in den Blutproben sowie in verschiedenen Geweben (z.B. Milz, Lymphknoten, Thymus) der PCV2-infizierten Tiere nachgewiesen. Das Genom, welches von den Lymphknoten der PCV2-infizierten Kälber erneut isoliert wurde, zeigt eine Identität von 99,9% gegenüber dem Inokulum. Dies weist möglicherweise auf adaptierte Mutationen im PCV2 Genom hin. Die Mutationen C1708T und G365C sind während der Infektionen aufgetreten. Die Sequenzanalyse zeigt eine mögliche adaptierte Mutation an der Aminosäure Nr. 105 in Replikationsgen (Met zu Ile) (siehe Publikation 3). Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass der Nachweis der PCV2 Genomen und eine experimentell induzierte Serokonversion möglich war. Es konnte gezeigt werden, dass die Empfänglichkeit von PCV2 nicht allein auf Schweine begrenzt ist und eine Übertragung von PCV2 auf Rinder möglich ist.

Sheep are commonly used as animal model for in vivo testing of new spinal implants as well as surgical procedures. Therefore, extensive knowledge of the precise morphometry and biomechanics features of sheep spine is crucial for experimental design and interpretation of results obtained in these trials. Little is known about the sheep spine. Therefore, the current study, which comprises of two parts, aimed to gain more knowledge concerning the morphometry of sheep thoracolumbar spine. The first part aimed to document the morphometry of the sheep thoracolumbar vertebrae and to assess the feasibility of using sheep lumbar vertebrae as a model for human spine researches based on morphometric comparison. For this reason, computed tomographic (CT) scanning was carried out in five clinically healthy female Merino sheep (2 years, 62 ± 5.3 kg) under general anaesthesia. CT images were reformatted with 1-mm slice thickness from T2 through L6. The CT images were reformatted in transverse and sagittal planes using multiplaner reconstruction algorithm. Subsequently, CT images were transferred to a workstation and reviewed with dedicated software for measuring the dimensions of the vertebral bodies, spinal canal, intervertebral disc, and pedicles. Based on the generated morphometric data of the sheep lumbar vertebrae, four spinal indices and Pavlov’s ratio were calculated as well as the volume of the vertebral bodies. The spinal indices were concavity index, endplate index, spinal canal index and pedicle index. For measuring vertebral body volume, the transverse CT data were reformatted in 5-mm slice thickness and imported in dedicated software. Thereafter, the four spinal indices and the volume were compared to human published data. The parameter was defined comparable if the ratio sheep/human of each individual vertebra showed variation less than 20%. The second part of the current work aimed to provide quantitative morphometric data of the thoracolumbar dural sac and describe the anatomical relationship between the dural sac and its surrounding osseous structures of the spine. To achieve these aims, computed assisted myelography was carried out in five adult female blackhead sheep (2.0 ± 0.4 years, 80.6 ± 28.7 kg) under general anaesthesia. Transverse images were acquired with 2-mm slice thickness from T1 to L6. Sagittal and transverse diameters and cross-sectional area of the dural sac and the spinal canal were measured on CT images. To determine the anatomical relationship between the dural sac and osseous structures of spinal canal, the pedicle-dural sac distance and available space for dural sac were calculated. The morphometric data showed that the sheep thoracolumbar vertebral bodies and the spinal canal were wider than they were deep, most obviously in the lumbar vertebrae. The intervertebral discs were as much as 57.4% thicker in the lumbar than in the thoracic spine. The pedicles were higher and longer than they were wide over the entire thoracolumbar spine. Compared to humans, sheep lumbar vertebral body volumes were 48.6% smaller. The comparison of absolute values between both species revealed that sheep had smaller, longer and narrower vertebral bodies, thinner intervertebral discs, narrower spinal canal and narrower, higher pedicles. The comparison of the spinal indices showed a good comparability to human in terms of the vertebral endplate and spinal canal. The results of the second parts showed that the dural sac area covered 45.9% and 49.0% of the thoracic and lumbar vertebral canal area, respectively, and it is significantly (positive) correlated with the transverse diameter as well as area of the vertebral canal. The pedicledural sac distance in the lumbar vertebrae was up to 15.8% larger than in the thoracic ones. The clinical relevance of the current study, the sheep lumbar spine has good comparability to that of humans in terms of the vertebral endplate regions and spinal canal, suggesting that a sheep spinal model would be appropriate for studying artificial intervertebral discs, implantation of intervertebral fusion, etc. With regard to sheep pedicles, can be used as a model for spinal implant conditioned by adaptation of implant size to sheep pedicel dimensions. The lumbar vertebral canal shows more space for the dural sac, which seems to be safer for testing fixation spinal implants. / Schafe werden häufig als Tiermodell für In-vivo-Versuche verwendet, um neue Wirbelsäulenimplantate sowie chirurgische Prozeduren zu testen. Daher ist die umfassende Kenntnis der präzisen Morphometrie und der biomechanischen Merkmale der Schafwirbelsäule entscheidend für das experimentelle Design und die Interpretation der Ergebnisse in den Studien. Es sind wenige Daten über die Schafwirbelsäule bekannt. Auf Grund dessen zielt die aktuelle Studie darauf ab, mehr Wissen über die Morphometrie der thorakolumbalen Wirbelsäule von Schafen zu gewinnen. Der erste Teil dieser Studie soll die Morphometrie der Brust- und Lendenwirbelsäule dokumentieren. Das Ziel besteht darin, die Verwendung von Schaflendenwirbeln als Modell für die menschliche Wirbelsäule im morphometrischen Vergleich beurteilen zu können. Aus diesem Grund wurden Computertomographische Untersuchungen (CT) von fünf klinisch gesunden weiblichen Merino-Schafen (2 Jahre, 62 kg ± 5,3 kg) unter Allgemeinanästhesie durchgeführt. Die CT-Bilder wurden mit einer Schichtdicken von 1 mm aus T2 bis L6 gewonnen. Anschließend wurden die CT-Bilder in der transversalen und sagittalen Ebene multiplanar reformatiert. Danach wurden Messungen und Bewertungen mit einer geeigneten Software an den Wirbelkörpern, Wirbelkanälen, Bandscheiben und Pedikeln durchgeführt. Basierend auf den erzeugten morphometrischen Daten der Schaflendenwirbel wurden vier Wirbelsäulen-Indizes und Pavlov’s-ratio sowie das Volumen der Wirbelkörper berechnet. Die Wirbelsäulen-Indizes stellten den Konkavitäts-, Endplatten-, Spinalkanal- und Pedikel-Index dar. Für die Messung des Volumens von Wirbelkörpern wurden die transversalen CT-Daten in 5 mm Schichtdicke formatiert und in geeignete Software eingefügt. Danach wurden die vier Indizes-Wirbelsäulen und das Volumen der Lendenwirbelkörper mit den veröffentlichten Daten von menschlichen Wirbeln verglichen. Sie wurden als „vergleichbar“ definiert, wenn das Verhältnis Schaf-Mensch jedes einzelnen Wirbels Variationen von weniger als 20 % aufwies. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit hat zum Ziel, quantitative morphometrische Daten des thorakolumbalen Duralsacks zu ermitteln. Weiterhin sollen die anatomischen Beziehungen zwischen dem Duralsack und seinen umliegenden knöchernen Strukturen der Wirbelsäule beschrieben werden. Dazu wurden CT-Myelographien an fünf erwachsenen weiblichen Schwarzkopfschafen (2 Jahre ± 0,4 Jahre, 80,6 kg ± 28,7 kg) unter Allgemeinanästhesie durchgeführt. Transversale CT-Bilder wurden mit 2 mm Schichtdicke von T1 bis L6 gemessen. Sagittal- und Transversal-Durchmesser sowie die Querschnittsfläche von Duralsack und Wirbelkanal wurden auf CT-Bildern gemessen. Um die anatomische Beziehung zwischen dem Duralsack und den knöchernen Strukturen des Wirbelkanals zu ermitteln, wurden der Pedikel-Duralsack-Abstand und das Platzangebot für den Duralsack berechnet. Die Wirbelkörper und der Wirbelkanal der ovinen thorakolumbalen Wirbelsäule sind breiter als tief, vor allem im Bereich der Lendenwirbel. Die Bandscheiben sind in der Lendenwirbelsäule 57,4 % dicker als in der Brustwirbelsäule. Die Pedikel der Brust- und Lendenwirbelsäule waren höher und länger als breit. Im Vergleich zum Menschen ist das Volumen von Schaflendenwirbelkörpern 48,6 % kleiner. Der Vergleich der absoluten Werte zwischen den beiden Spezies ergab, dass Schafe kleinere, längere und schmalere Wirbelkörper, dünnere Bandscheiben, einen schmaleren Spinalkanal und schmalere, höhere Pedikel besitzen. Der Vergleich der Wirbelsäulen-Indizes zeigte eine gute Vergleichbarkeit mit menschlichen Wirbelendplatten und Wirbelkanälen. Im zweiten Teil der Studie konnte festgestellt werden, dass die Duralsackfläche 45,9 % des Brustwirbelkanals und 49,0 % des Lendenwirbelkanals einnimmt. Die Duralsackfläche korreliert deutlich positiv mit dem Querdurchmesser und der Fläche des Wirbelkanals. Der Pedikel-Duralsack-Abstand in der Lendenwirbelsäule war bis zu 15,8 % größer als in der Brustwirbelsäule.

Ziel dieser Arbeit war, in einem experimentellen Ansatz der Frage nachzugehen, welche pathophysiologischen Veränderungen in Bezug auf Hypertrophie und Funktionalität der Herzmuskulatur nach einem Myokardinfarkt durch Calsarcin-1 hervorgerufen werden und welchen Einfluss das Z-Scheiben-Protein in-vivo auf den Kalzium-Calmodulin Signalweg besitzt. Für die dafür durchgeführten Untersuchungen konnte auf drei verschiedene Mauslinien zurückgegriffen werden (Calsarcin-1 knockout-Mäuse, Calsarcin-1 transgene Mäuse, Wildtypmäuse). Die vorliegende Arbeit baut auf den in-vitro Ergebnissen von Frey et al. (2004) auf. Insgesamt wurden 278 Mäuse einer Infarkt- oder Scheinoperation unterzogen. Fünf Wochen nach ihrer Operation wurde das Herz jeder Maus mittels Ultraschall vermessen und auf seine Funktionstüchtigkeit untersucht. Anschließend wurden die Tiere getötet. Die entnommenen Herzen wurden gewogen, die entnommenen Unterschenkel vermessen. Insgesamt 60 Herzen wurden nach konventionellen histologischen Verfahren HE-gefärbt. 39 Mäuse wurden 24 Stunden nach ihrer Infarktoperation getötet. Ihre Herzen wurden mit Evans-blue und Tetrazoliumchlorid gefärbt. Insgesamt gingen Gewebeproben von 67 Herzen in die Untersuchungen auf RNA-Ebene (Real-Time PCR, Dot Blot) ein. Die Herzen von 40 Tieren konnten auf Proteinebene (Western Blot) untersucht werden. Die echokardiologische Untersuchung der Mäuse nach fünf Wochen zeigte eine deutliche Dilatation des linken Ventrikels derjenigen Tiere, die einer Infarktoperation unterzogen worden waren. Die größte Dilatation der drei Infarktgruppen wiesen die Mäuse auf, die nicht in der Lage sind, das Z-Scheiben-Protein Calsarcin-1 auszubilden (0,558 cm (ko Mi) vs. 0,494 cm (Wt Mi); p < 0,001). Diese Mäuse zeigten auch gegenüber den anderen beiden Infarktgruppen die ausgeprägteste systolische Dysfunktion (FS von 0,238% (ko Mi) vs. 0,376% (Wt Mi) und 0,353% (tg Mi); jeweils p < 0,001). Keine Unterschiede bestanden zwischen den Gruppen der scheinoperierten Mäuse. Morphometrische Analysen belegten eine deutliche Hypertrophie der Calsarcin-1 defizienten Mäuse, die durch die Infarktoperation einer biomechanischen Stresssituation ausgesetzt wurden. Als Hypertrophiemaß wurde der Quotient aus Herz- und Körpergewicht gewählt, zusätzlich wurde der Quotient aus Herzgewicht und Tibialänge bestimmt. Bei beiden Messungen unterschied sich das Herzgewicht der knockout-Mäuse mit Infarkt signifikant von den anderen beiden Infarktgruppen. Für das Verhältnis von Herz- zu Körpergewicht wurde für die drei Mäusegruppen ermittelt: 7,55 ± 0,6mg/g (ko Mi ), 5,56 ± 0,23mg/g (WtMi) und 5,73 ± 0,4mg/g (tgMi), wobei p < 0,01 bei ko Mi/Wt Mi und p < 0,86 bei tg Mi / Wt Mi. Für das Verhältnis von Herzgewicht zu Tibialänge ergab sich: 12,4mg/mm (ko Mi), 10,11mg/mm (Wt Mi) und 10,02mg/mm (tg Mi) (p < 0,001 koMi / WtMi, p < 0,27 tg Mi / WtMi). Zwischen den Gruppen der scheinoperierten Mäuse wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Auch auf zellulärer Ebene wiesen die Calsarcin-1 knockout-Mäuse mit Myokardinfarkt eine deutliche Hypertrophie auf verglichen mit den Wildtyp-Mäusen mit Infarkt und den Calsarcin-1 transgenen Tieren (Zellgrößenzunahme um 43,12% (koMi), 34,85% (WtMi) und 29,12% (tgMi); jeweils p < 0,001). Von allen drei Infarktgruppen zeigten die knockout-Mäuse nach fünf Wochen die ausgeprägteste Narbenbildung (Fläche der Infarktnarbe in % der Fläche des linken Ventrikels: 73,41±7,85% (ko-Mi), 53,71±3,81% (WtMi) und 48,60±6,04% (tgMi)). Übereinstimmend dazu wiesen die knockout-Mäuse mit Myokardinfarkt eine übermäßige Steigerung der ANP Produktion auf mRNA-Ebene auf. Auf Proteinebene konnte eine Steigerung der Produktion von MCIP nachgewiesen werden (ko Mi 4,3 ± 0,5 vs. Wt Mi 2,3 ± 0,3 ; p < 0,01). Zusammenfassend lassen die Ergebnisse auf eine gesteigerte Aktivität von Calcineurin und auf ein pathologisches Remodeling in der Abwesenheit von Calsarcin-1 schließen. Die Überexpression von Calsarcin-1 scheint dagegen eine pathologische Hypertrophie des Herzmuskels abmildern zu können.

Rokshana Parvin Molecular epidemiology and biological properties of avian influenza viruses of subtype H5N1 and H9N2 Institute of Virology Submitted in November 2014 Pages 106, Figures 7, Table 1, References 339, Publications 4 Keywords: Avian Influenza Virus, H5N1, H9N2, Reassortment, Mutation, Replication and Growth kinetics Introduction Avian influenza viruses (AIVs) are the major cause of significant disease outbreaks with high morbidity and mortality worldwide in domestic birds resulting in great economic losses. Especially the subtypes of highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) H5N1 and low pathogenic avian influenza viruses (LPAIV) H9N2 became the most prevalent AIVs in poultry causing regular disease outbreaks in many countries of Asia, the Middle East and Europe and are still ongoing events. Therefore, continues monitoring, surveillance and characterization of the circulating viruses are of high priority. Objectives The current study was designed for three main objectives; i) Molecular epidemiology of the HPAIV H5N1 in migratory birds in Bangladesh, ii) Molecular characterization of the AIV subtype H9N2 and iii) Biological properties of the AIV subtype H9N2. Materials and methods In first the part of the investigations, two HPAIV H5N1 strains were confirmed from 205 pools of fecal surveillance samples in Bangladesh. The two isolated H5N1 viruses were characterized by genome amplification and sequence analysis of the all eight genome segments. In the second part of the investigations, a confirmed AIV H9N2 from a retrospective analysis derived from a poultry farm in Bangladesh was characterized. Furthermore, three AI-H9N2 viruses were isolated and characterized from a commercial broiler and broiler breeder flock with clinical respiratory manifestations in Egypt. Full length genome amplification, cloning, sequencing and comprehensive phylogenetic analyses were performed for all eight genome segments. In the final part of the study, four selected Eurasian lineage H9N2 viruses - three G1 sub-lineages H9N2 and one European wild bird H9N2 virus - were propagated in embryonated chicken eggs (ECE) and Madin-Darby canine kidney epithelial cell culture systems. The ECE-grown and cell culture-grown viruses were monitored for replication kinetics based on tissue culture infectious dose (TCID50), hemagglutination assay (HA) and quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR). The cellular morphology after infections was analyzed by immunofluorescence assay and cellular ELISA was performed to screen the sensitivity of the viruses to amantadine. Results The two newly isolated HPAIV H5N1 strains from migratory birds belonged to clade 2.3.2.1 and clustered together with other recently isolated viruses in Bangladesh derived from ducks, chickens, quails and crow. The amino acid sequences were also genetically similar although, some unique amino acid substitutions were observed. These substitutions were not related to the known conserved region of the molecular determinants of the virus. The phylogenetic analyses of the isolated AIV H9N2 from Bangladesh and Egypt revealed their close relationship with their respective contemporary isolates and maintained ancestor relation with A/Quail/HK/G1/1997 confirming that all studied H9N2 belonged to G1 sub-lineage. All six internal gene segments of the Bangladeshi AIV H9N2 showed high sequence homology with the HPAIV subtype H7N3 from Pakistan. In addition, also the PB1 internal gene showed high nucleotide homologies with a recently circulating HPAI-H5N1 virus from Bangladesh. Thus, the Bangladeshi AIV H9N2 is genetically a unique strain which shares internal gene segments with different HPAI viruses and takes part in reassortment events. On the other hand, the internal gene segments of the Egyptian H9N2 viruses were similar to the other members of the G1 sub-lineage with no evidence of reassortment events. In this virus rather point mutations within their respective gene segments are observed. With regard to the biological characterization, the three G1-H9N2 viruses produced comparatively higher titer than the Eurasian wild type-AIV H9N2. Overall, the ECE-grown viruses yielded higher titers than cell culture-grown viruses. Following a single passage in cell culture, individual nucleotide substitutions were noticed in HA, NA and NS gene sequences but none of them are related to the conserved region that can alter virus pathogenesis or virulence. All of the studied H9N2 viruses were sensitive to amantadine. Conclusion The present study demonstrated for the first time the presence of HPAI H5N1 in the wild migratory bird population in Bangladesh and determine as one of the major cause to introduce the new clade of HPAIV H5N1 into the Bangladeshi poultry flocks. The Bangladeshi AIV H9N2 strain has exhibited two independent reassortment events with HPAIV of subtype H7N3 and H5N1.The Egyptian AIV H9N2 strains were limited to regular point mutations which is very common for AIVs. The G1-H9N2 viruses showed a higher replication profile when compared to European wild bird-AIV H9N2. Both the ECE and MDCK cell system allowed efficient replication but the ECE system is considered as the better cultivation system for H9N2 viruses in order to get maximum amounts of virus within a short time period. In this study new strains of AIV H9N2 and H5N1 with significant genetic constitutions were described. Thus, continuous monitoring of the field samples, rapid reporting soon after outbreaks, molecular characterization to confirm the emergence of new reassortant strains and the biological properties to know its impact on the virulence are recommended. / Rokshana Parvin Molekulare Epidemiologie und biologische Charakterisierung von aviären Influenzaviren der Subtypen H5N1 und H9N2 Institut für Virologie Eingereicht im November 2014 Seiten 106, Abbildungen 7, Tabelle 1, Literaturangaben 339 , Publikationen 4 Schlüsselwörter: Aviäres Influenza Virus, H5N1, H9N2, Reassortment, Mutation, Replikation und Wachstumskinetik Einleitung Weltweit kommt es in der Geflügelproduktion durch Infektionen mit aviären Influenzaviren (AIV) zu hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten und damit verbunden zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Zu den bedeutenden AIV in der Geflügelwirtschaft werden die hoch pathogenen aviären Influenzaviren (HPAIV) des Subtyps H5N1 sowie AIV des Subtyps H9N2 gezählt. Letztere besitzen die Charakteristika von niedrigpathogenen aviären Influenzaviren. Durch diese Subtypen kommt es regelmäßig in vielen Ländern in Asien, im Nahen Osten und Europa zu wiederholten Krankheitsgeschehen. Dies bedingt die dringende Notwendigkeit von andauerndem Monitoring, Überwachung und Charakterisierung der zirkulierenden Viren. Ziele der Untersuchungen Die vorliegende Studie soll folgende drei Hauptfragestellungen beantworten: i) Molekulare Epidemiologie des HPAIV H5N1 bei Zugvögeln in Bangladesch, ii) Molekulare Charakterisierung von AIV des Subtyps H9N2 und iii) Biologische Eigenschaften von AIV des Subtyps H9N2. Materialien und Methoden Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit zwei HPAIV Stämmen des Subtyps H5N1, welche im Monitoring Programm in Bangladesch von insgesamt 205 gepolten Kotproben, isoliert wurden. Die Charakterisierung der beiden Isolate erfolgte durch Vervielfältigung der acht Genomsegmente und nachfolgende phylogenetische Analysen. Der zweite Teil der Arbeit beschreibt die retrospektive Analyse eines AIV des Subtyps H9N2, welches von einer Geflügelproduktionsanlage in Bangladesch eingesandt wurde. Weiterhin wurden aus einer Geflügelmast- und Legehennenhaltung mit respiratorischer Symptomatik drei AIV des Subtyps H9N2 isoliert und charakterisiert. Auch hier wurde das gesamte Genom amplifiziert, kloniert und nachfolgend phylogenetisch analysiert. Im letzten Teil der Studie wurden vier europäische AIV H9N2 Isolate, von welchen 3 Isolate zur H9N2 Sublinie G1 gehören und ein Isolat von einem Wildvogel selektiert und in embryonierten Hühnereiern (EHE) und auf Madin-Darby canine kidney (MDCK) Zellen passagiert. Mittels 50% tissue culture infectious dose (TCID50), Hämagglutinationstest (HA) und RT-real-time-PCR (qRT-PCR) wurden von diesen so passagierten Viren die Vermehrungskinetik bestimmt. Die Morphologie der infizierten Zellen nach Infektion wurde mittels Immunfluoreszenztest analysiert. Eine Bestimmung der Amantadin Empfindlichkeit dieser Viren erfolgte mit einem ELISA. Ergebnisse Die beiden neuen HPAIV des Subtyps H5N1 von Zugvögeln können in die Clade 2.3.2.1 eingeordnet werden und clustern mit kürzlich aus Enten, Hühnern, Wachteln und Krähen isolierten AIV aus Bangladesch. Eine Verwandtschaft der Viren konnte auch auf Ebene der Aminosäure Sequenz gezeigt werden, obwohl einige einzigartige Aminosäure Austausche nachgewiesen wurden. Diese Austausche zeigen keine Verbindung mit bekannten konservierten Regionen der molekularen Determinanten der Viren. Die phylogenetische Analyse der AIV aus Bangladesch und Ägypten zeigt eine deutliche Verbindung mit den derzeit zirkulierenden AIV auf diesem geographischen Gebiet sowie die Verwandtschaft zu dem Isolat A/Quail/HK/G1/1997. Dies bestätigt, dass die in dieser Studie analysierten AIV zu der Subline G1 gehören. Alle sechs internen Gensegmente des AIV H9N2 aus Bangladesch zeigen eine hohe Sequenz Homologie mit einem HPAIV des Subtyps H7N3 aus Pakistan. Zusätzlich zeigt das interne Gene PB1 eine hohe Homologie auf Nukleinsäureebene zu einem derzeit in Bangladesch zirkulierenden HPAIV des Subtyps H5N1. Somit ist das AIV H9N2 aus Bangladesch als ein einzigartiges Isolat anzusehen, welches durch Reassortierung interne Gensegmente mit hochpathogenen AIV teilt. Im Gegensatz dazu, sind die internen Gene des AIV H9N2 aus Ägypten sehr ähnlich zu anderen Mitgliedern der Sublinie G1, welche keine Hinweise auf Reassorierung zeigen. Nur einzelne Punktmutationen konnten in den entsprechenden Gensegmenten nachgewiesen werden. In Hinblick auf die biologische Charakterisierung, konnte in den drei AIV H9N2 der Sublinie G1 vergleichsweise höhere Titer nachgewiesen werden als in einem europäischen AIV H9N2 Wildtypisolat. Insgesamt zeigten die in EHE passagierten Viren höhere Titer als die MDCK-Zell passagierten Viren. Schon nach einer Passage auf Zellkultur konnten einzelne Nukleotidaustausche in den HA, NA und NS kodierenden Gensegmenten nachgewiesen werden, wobei keine dieser Veränderungen einen Einfluss auf konservierte Regionen haben, die die Pathogenese oder Virulenz der Viren beeinflussen. Alle untersuchten H9N2 Viren sind sensitiv gegenüber Amantadin. Schlussfolgerungen Die vorliegende Studie zeigt erstmalig das Vorkommen von HPAIV H5N1 bei Zugvögeln in Bangladesch, welches als Haupteintragsquelle der neuen HPAIV H5N1 in der dortigen Geflügelhaltung angesehen wird. Das AIV H9N2 aus Bangladesch zeigt zwei unabhängige Reassortierungen mit HPAIV des Subtyps H7N3 und H5N1. Hingegen zeigt das ägyptische AIV H9N2 Punktmutationen, welche sehr typisch für diese Viren sind. Die hier untersuchten AIV H9N2 der Sublinie G1 zeigen im Vergleich zu einem europäischen AIV H9N2 eine höhere Replikationsrate. Eine Replikation der Viren konnte in EHE und MDCK-Zellen gezeigt werden, jedoch wird das EHE als das geeignetere System für die Kultivierung von H9N2 Viren betrachtet, da hier in einer kürzeren Zeitspanne mehr Virus produziert werden kann. Des Weiteren konnten in dieser Studie neue Isolate von AIV des Subtyps H9N2 und H5N1mit einem bedeutenden genetischen Aufbau beschrieben werden. Daher wird ein kontinuierliches Monitoring von Feldproben, unverzügliche Meldung von Ausbruchsgeschehen, die molekulare Charakterisierung zur Dokumentation eventuell auftretender neuer Reassortanten sowie Untersuchungen der biologischer Eigenschaften zur Virulenzbestimmung empfohlen.