Das Equine Metabolische Syndrom (EMS) beschreibt einen Cluster von metabolischen Störungen, die durch Adipositas, Insulinresistenz und Hufrehe im Zusammenhang stehen. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss einer achtwöchigen oralen Supplementierung von Chrom, Metformin beziehungsweise von einer Kombination aus Chrom und Metformin auf die Insulinsensitivität und die Glukosetoleranz bei adipösen Pferden und Ponys zu untersuchen. Für diese Studie standen 24 Pferde und Ponys (14,4 ± 3,87 Jahre, 14 Stuten und 10 Wallache) mit Adipositas, Insulinresistenz und Hufrehe zur Verfügung. Während der achtwöchigen Versuchsphase bekamen die Tiere eine Heuration (1,5 kg Heu/100 kg Körpermasse (KM)) und zweimal täglich das ihnen zugewiesene Supplement (Chrom: 25 µg/kg KM, Metformin: 15 mg/kg KM, Chrom+Metformin: 25 µg/kg KM Chrom + 15 mg/kg KM Metformin in jeweils 25 g Grünmehl/100 kg KM) verabreicht. Eine vierte Gruppe erhielt als Placebo 25 g Grünmehl/100 kg KM ohne Supplement. Vor Versuchsbeginn und nach Versuchsende durchliefen die Pferde und Ponys, an zwei aufeinanderfolgenden Tagen, nach jeweils einer zwölfstündigen Fastenperiode einen kombinierten Glukose-Insulin-Toleranztest (KGIT) zur Bestimmung der Insulinsensitivität und einen oralen Glukose-Toleranz-Test (OGTT) zur Bestimmung der Glukoseabsorption und -toleranz. Im Verlauf des Versuchszeitraums konnte bei den Pferden ein durchschnittlicher Gewichtsverlust von 2,77 ± 2,99 % verzeichnet werden (Behandlung p > 0,05). Beim OGTT zeigte sich keine signifikante Veränderung der Glukose- und Insulinreaktionen zwischen Versuchsbeginn und Versuchsende. Die Seruminsulinmaximalwerte der mit Metformin und der mit Chrom+Metformin supplementierten Gruppen waren nach der Versuchszeit numerisch gesunken (Metformin Versuchsbeginn: 452 ± 642 µU/ml, Versuchsende: 202 ± 121 µU/ml; Chrom+Metformin Versuchsbeginn: 388 ± 347 µU/ml, Versuchsende: 342 ± 164 µU/ml, Behandlung p > 0,05). Im KGIT zeigten sich bei den Glukosewerten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen und zwischen den Werten vor Versuchsbeginn und nach Versuchsende. Die Seruminsulinkonzentrationen lagen im KGIT vor Versuchsbeginn bei allen Probanden zum Zeitpunkt Minute 45 über 100 µU/ml. Somit gelten alle Versuchsteilnehmer per definitionem als insulinresistent. Nach den acht Wochen Supplementierung befanden sich beim KGIT zum Zeitpunkt Minute 45, mit Ausnahme eines Probanden aus der Chrom+Metformin-Gruppe, alle Seruminsulinwerte weiterhin >100 µU/ml. Somit sind die übrigen 23 Pferde und Ponys weiterhin als insulinresistent einzustufen. Weder Chrom, noch Metformin oder die Kombination von Chrom+Metformin konnte in den hier im Versuch angewandten Dosierungen die Insulinsensitivität und Glukosetoleranz der erkrankten Pferde und Ponys verbessern.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Das Equine Metabolische Syndrom (EMS) 2 2.1.1 Definition 2 2.1.1.1 Adipositas 3 2.1.2 Diagnostische Methoden 6 2.1.3 Beeinflussung der Insulinresistenz und der Adipositas 12 3 Material und Methode 23 3.1 Versuchsziel 23 3.2 Versuchsaufbau 23 3.3 Vorversuch 23 3.4 Versuchstiere 24 3.5 Versuchsdurchführung 24 3.5.2 Fütterung 25 3.5.3 Gruppeneinteilung 26 3.5.4 Oraler Glukosetoleranztest vor und nach der Supplementierungsphase 26 3.5.5 Kombinierter Glukosetoleranztest vor und nach der Supplementierungsphase 27 3.5.6 Scoring 28 3.5.7 Wägung 29 3.6 Analysen 29 3.6.1 Vorversuch 29 3.6.2 Hauptversuch 30 3.7 Statistik 31 4 Ergebnisse 33 4.1 Einschlusskriterien 33 4.2 Hauptversuch 34 4.2.1 Gesundheitszustand der Pferde und Ponys 34 4.2.2 Gewichtsentwicklung der Pferde und Ponys 35 4.2.4 Blutparameter 36 5 Diskussion 54 5.1 Kritik der Methoden 54 5.2 Diskussion der Ergebnisse 58 5.2.1 Effekte der vier verschiedenen Supplementierungen auf die Insulinsensitivität 58 5.3 Abschließende Betrachtung 61 6 Zusammenfassung 63 7 Summary 65 8 Literaturverzeichnis 67 9 Anhang 79

Einleitung: Alpakas gehören zu einer Tiergruppe, die in den vergangenen Jahren im Patientengut der Tierärzte immer häufiger anzutreffen ist. Daher ist es von großer Bedeutung, sich mit der Physiologie und Pathologie dieser Tierart zu beschäftigen. Die Versorgung der Neonaten spielt dabei eine große Rolle. Da Alpakacrias, wenn überhaupt, dann erst sehr spät, klinische Anzeichen einer Erkrankung zeigen, ist es für den Untersucher von großem Nutzen, einen Einblick in den Blutgas- und Säure-Basen-Haushalt, sowie Kenntnis von den hämatologischen und blutchemischen Parametern des Neonaten zu erhalten. Des Weiteren bietet die Blutuntersuchung ein wichtiges Hilfsmittel zur Überprüfung der Versorgung mit kolostralen Antikörpern. Ziele der Untersuchungen: Ein Ziel der Untersuchungen war die Erstellung von bisher nicht vorhandenen Referenzwerten für die venöse Blutgasanalyse, die Hämatologie und für einige blutchemische Parameter bei gesunden, lebensfrischen Alpakacrias innerhalb der ersten drei Lebenstage. Des Weiteren sollte in diesem Zusammenhang die Eignung eines mobil einsetzbaren Blutgasanalysegerätes (epoc®, Fa. Alere GmbH, Köln) für die Tierart Alpaka eruiert werden. Hierfür wurden Doppelbestimmungen der Proben mit einem etablierten stationären Blutgasanalysegerät (ABL90 FLEX®, Fa. Radiometer, Kopenhagen) durchgeführt. Tiere, Material und Methoden: In die Studie wurden 20 gesunde neugeborene Alpakacrias integriert. Die Fohlen stammten vornehmlich aus Stuten, die zur Geburtsüberwachung in die Klinik eingestallt wurden, bei anderen handelte es sich um solche, die innerhalb der ersten Lebensstunden wegen vermeintlich verzögerter Tränkeaufnahme vorgestellt worden waren, was sich aber nicht bestätigte. Alle Alpakafohlen wurden nach dem Gießener Vorsorgeschema II für neonatale Equiden klinisch untersucht. Anschließend erfolgte 3-8 Stunden p. n., 24 Stunden p. n. und 72 Stunden p. n. je eine Blutprobenentnahme. Der erste Analysezeitpunkt wurde bewusst nicht unmittelbar post natum gewählt, da die Etablierung einer stabilen Prägungsphase zwischen Muttertier und Cria nach der ersten Tränkeaufnahme abgewartet werden sollte. Die Blutentnahme erfolgte nach Reinigung und Desinfektion aus der ungestauten V. jugularis externa im Bereich des sechsten Halswirbels. Die Blutgasanalyse wurde innerhalb von 15 Minuten mit den zuvor genannten Blutgasautomaten durchgeführt. Die hämatologischen Parameter wurden mit dem pocH-100 iV (Fa. Sysmex Deutschland GmbH, Norderstedt) bestimmt, die blutchemischen Untersuchungen erfolgten mit dem FUJI DRI CHEM 3500 (Fa. Sysmex Deutschland GmbH, Norderstedt). Insgesamt wurden 55 Blutproben entnommen und analysiert. Pro Analysegerät (epoc®, ABL90 FLEX®, pocH-100 iV, FUJI DRI-CHEM 3500) wurden je 55 Messungen durchgeführt. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm IBM SPSS Statistics 22.0. Die Normalverteilung wurde mittels Shapiro-Wilk-Test überprüft. Für den Gerätevergleich (epoc®/ABL90 FLEX®) fand der Wilcoxon-Test Anwendung. Der Vergleich der Zeitpunkte erfolgte über den Friedman-Test für verbundene Stichproben. Des Weiteren wurden für die einzelnen Parameter der Median und die Perzentile, bzw. der Mittelwert und die Standardabweichung bestimmt. Die grafische Darstellung erfolgte mit Boxplots und Bland-Altman-Plots. Ergebnisse: Im Gerätevergleich konnte insgesamt auf eine gute Übereinstimmung der Messwerte geschlossen werden. Signifikante und gleichzeitig klinisch relevante Unterschiede gab es lediglich bei der Bestimmung der Sauerstoffsättigung und des Hämatokrits, was auf unterschiedliche Mess- und Berechnungsmethoden bei den Geräten zurückzuführen ist. So liegen die Hämatokritwerte beim epoc® deutlich unter denen vom ABL90 FLEX®. In diesem Zusammenhang wichtig für die Interpretation der Ergebnisse ist, dass für jedes Messgerät die individuellen Referenzbereiche berücksichtigt werden müssen. Die venöse Blutgasanalyse ergab für gesunde Crias zu Beginn des ersten Lebenstages einen pH-Wert von 7,34 – 7,40, einen Sauerstoffpartialdruck (pO2) von 21,6 – 29,2 mmHg, einen Kohlendioxidpartialdruck (pCO2) von 37,3 – 46,0 mmHg, eine Sauerstoffsättigung (sO2) von 30,5 – 48,0 %, ein aktuelles Bikarbonat (HCO3-) von 21,3 – 25,1 mmol/l, eine Standardbasenabweichung (SBE) von -3,3 – 0,2 mmol/l und einen Laktatgehalt von 1,6 – 3,4 mmol/l. Der pH Wert ähnelte im Verlauf dabei dem von Kälbern und Lämmern gleichen Alters, der pO2 war insgesamt etwas niedrig, aber konstant und ähnelte über den Messzeitraum dem von Kälbern. Es wurden bei den Crias im Vergleich zu Fohlen, Kälbern und Lämmern niedrigere pCO2-Werte festgestellt. Die Sauerstoffsättigung ähnelte der von Equidenfohlen, über den Messzeitraum fällt die Konzentration im Mittel geringfügig ab, bei den anderen Vergleichstierarten steigt sie an. Die Glukosekonzentrationen waren postnatal höher als bei anderen Haustierneonaten (3-8 h p.n.: 4,4 – 8,2; 24 h p.n.: 7,3 – 12,8; 72 h p.n.: 7,3 – 16,2 mmol/l). Laktat kann nicht, wie es beim Equidenfohlen postuliert wird, als Indikator für den Gesundheitszustand eines Alpaka-Crias genutzt werden. Hämatologisch sind die spezielle Form und die hohe Anzahl der Alpakaerythrozyten, die hohe Zahl an Leukozyten und Thrombozyten (speziell bei den Crias), sowie die hohe MCHC zu nennen. Schlussfolgerungen: Es konnten teilweise bisher fehlende Daten zur venösen Blutgasanalyse für die Beurteilung der Stoffwechsellage neugeborener Alpakacrias etabliert werden. Das mobile Blutgasgerät epoc® stellt eine für die Anwendung geeignete Alternative dar.

Einleitung: / Introduction:

Angiogenese ist an physiologischen Vorgängen wie der Embryogenese und der Wundheilung, aber auch bei pathologischen Abläufen wie bei Neoplasien und der Makula Degeneration beteiligt. Im Bereich des Tissue Engineering ist sie ebenfalls unersetzlich und ausschlaggebend für den Erfolg einer Gewebetransplantation. In dieser Studie wurde an 40 männliche Charles Lewis-Ratten das arteriovenöse (AV-) Loop-Modell angewandt, um spontane Angiogenese unter Einfluss wachstumshemmender Faktoren in vivo zu untersuchen. Der AV-Loop wurde in einer mit Fibrin gefüllten Teflonkammer gebettet. Für die statistische Auswertung wurde der Student t-Test mit ungepaarten Stichproben angewandt und das Signifkanzniveau betrug α=0,05. Multiple Testungen wurden nach der Bonferroni-Holm-Methode angepasst. In der Anfangsphase der Studie wurde der zeitliche Verlauf der AV-Loop assoziierten Angiogenese an 16 Tieren untersucht. Es wurde ein signifikanter Anstieg der Gefäßfläche über einen Zeitraum von 5 (n=2), 10 (n=3) und 15 Tagen (n=3) beobachtet und ebenfalls eine signifikant höhere Gefäßanzahl an Tag 15 im Vergleich zu Tag 5. Acht Tiere konnten nicht in die Studie miteingeschlossen werden infolge von Thrombosierungen des Loops. Diese erwartete Verlustrate trat aufgrund Lernkurve dieses komplexen mikrochirurgischen Modells, insbesondere zu Beginn des Projektes, auf. In der zweiten Phase der Studie wurde die Neoangiogenese auf drei unterschiedliche Verfahren gehemmt. Die Implantationszeit betrug bei allen Gruppen 15 Tage. In der ersten Gruppe (n = 6) wurde ein Inhibitor des Wachstumfaktors VEGF (vascular endothelial growth factor) intravenös appliziert, nämlich der monoklonale Antikörper Bevacizumab. Hier konnte ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (n = 6) bei der Gefäßfläche (94 432 ± 17 903 μm2 gegenüber 268 682 ± 63 575 μm2) und ebenfalls bei der Gefäßdichte (18 ± 5 Gefäße pro mm2 versus 40 ± 9 Gefäße pro mm2 in der Kontrollgruppe) gemessen werden. Dieser Befund ließ darauf schließen, dass die Neovaskularisation durch VEGF vermittelt wurde. Die direkte Bestrahlung von 2 Gy auf den venösen Graft in der zweiten Versuchsgruppe (n = 7) löste eine signifikante Verringerung von Gefäßanzahl (311 ± 73), -fläche (43 137 ± 10 225 μm2) und –dichte (15 ± 7 Gefäße pro mm2) im Vergleich zur Kontrollgruppe (776 ± 123, 268 682 ± 63 575 μm2 und 40 ± 9 Gefäße pro mm2) aus. Dieses Verfahren hatte somit starken Einfluss auf den Reifeprozess der Neoangiogenese. Bei der Kombinationsgruppe (Bevacizumab und Bestrahlung, n = 5) konnte nur bei der Gefäßfläche ein signifikant geringerer Unterschied in der Angiogenese erhoben werden. Dies ließ vermuten, dass das hier zu findende physiologische und somit geordnete Gefäßwachstum nicht auf diese hemmende Methode anspricht, wie es bei chaotischen Tumorgefäßsystemen der Fall ist und der vermutete Synergismus ausbleibt. Zusätzlich wurde im Zuge dieser Studie ein standardisiertes Auswertungsprogramm etabliert. Dabei handelt es sich um ein selbstentwickeltes Computerprogramm, das nicht nur die hier gesammelten aber auch 2-D-Aufnahmen anderer Angiogenese-Modelle benutzerunabhängig und standardisiert evaluieren kann. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das AV-Loop-Modell sich ausgezeichnet für die Untersuchung der Angiogenese im gesunden Gewebe eignet. Es bietet die Möglichkeit verschiedene angiogene und anti-angiogene Faktoren zu applizieren sowie deren Einfluss auf eine physiologische Neovaskularisation zu beobachten.:1 EINLEITUNG 1 1.1 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 3 2 LITERATURÜBERSICHT 5 2.1. ANGIOGENESE 5 2.1.1 PHYSIOLOGIE 5 2.1.1.1 Bildung von Blutgefäßen 5 2.1.1.2 Embryogenese 8 2.1.1.3 Angiogenese und Wundheilung 9 2.1.2 TUMOR-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 11 2.2 TISSUE ENGINEERING 22 2.3 DAS ARTERIOVENÖSE (AV) LOOP-MODELL 22 2.4 AUSWERTUNG VON ANGIOGENESEPROZESSEN 23 3 MATERIAL UND METHODEN 24 3.1 TIERE UND HALTUNG 24 3.2 OPERATIVE EINGRIFFE 24 3.2.1 KAMMER UND MATRIX 24 3.2.2 HERSTELLUNG DES AV-LOOPS 25 3.2.3 BESTRAHLUNG 29 3.3 EXPLANTATION 29 3.3.1 PERFUSION MIT INDIA INK 29 3.3.2 PERFUSION MIT MICROFIL® 31 3.4. HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE METHODEN 32 3.4.1 VORBEREITUNG DER SCHNITTE 32 3.4.2 HÄMATOXYLIN-EOSIN-FÄRBUNG 33 3.4.3 LEKTINFÄRBUNG 34 3.5 DATENVERARBEITUNG 36 3.5.1 MIKROSKOPISCHE AUFZEICHNUNGEN 36 3.5.2 AUSWERTUNG DER HISTOLOGISCHEN SCHNITTE 36 3.5.3 AUFNAHMEN DER MIKRO-CT-BILDER 41 3.5.4 AUSWERTUNG DER MIKRO-CT-BILDER 42 3.5.5 POWER ANALYSE 43 3.5.6 STATISTISCHE AUSWERTUNGEN 43 3.6 VERWENDETES MATERIAL 44 4 ERGEBNISSE 47 4.1 AV-LOOP-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 48 4.2 ZEITLICHER VERLAUF DER AV-LOOP-ASSOZIIERTEN ANGIOGENESE 50 4.3 HISTOMORPHOMETRISCHE ANGIOGENESE-CHARAKTERISIERUNG MITTELS HE- UND LEKTINFÄRBUNG 52 4.4 AUTOMATISCHE, COMPUTERGESTÜTZTE UND UNTERSUCHERUNABHÄNGIGE ANGIOGENESE- QUANTIFIZIERUNG 53 4.5 EINFLUSS VON VEGF AUF AV-LOOP-ANGIOGENESE 58 4.6 EINFLUSS VON BESTRAHLUNG AUF DIE NEOVASKULARISATION IM AV-LOOP-MODELL 62 4.7 WECHSELWIRKUNG VON VEGF UND IONISIERENDER BESTRAHLUNG AUF DIE ANGIOGENESE IM AV-LOOP-MODELL 65 5 DISKUSSION 71 6 ZUSAMMENFASSUNG 81 7 SUMMARY 83 8 LITERATURVERZEICHNIS 85 9 ANHANG 95 9.1 PROTOKOLL ZUR HERSTELLUNG DER PUFFER 95 9.1.1 CITRATPUFFER 95 9.1.2 TRISPUFFER 95 9.2 TABELLEN 95 9.3 ABBILDUNGEN 95 10 DANKSAGUNG 98 / Angiogenesis is evident in both physiological and pathological processes in the body. It is involved in events of embryogenesis and in wound healing as well as in neoplastic growth and macula degeneration. In the field of Tissue Engineering neovascularisation plays an irreplaceable role and determines the result of the transplantation. Here, an arterio-venous loop (AV-loop) model embedded in fibrin- filled teflon chambers in 40 Charles Lewis rats was applied to conduct in vivo investigations of the physiological processes of vessel growth in healthy tissue and to understand neovascularisation under the impact of anti-angiogenic factors such as monoclonal anti-bodies and ionizing radiation (IR). For statistical analysis the unpaired t-test was applied with a significance level of α = 0,05. Multiple testing was adapted according to the Bonferroni-Holm method. At the beginning of the study the AV-loop induced angiogenesis was examined on 16 animals and consecutively characterized. A significant increase in vessel area was observed over a time frame of 5 (n=2), 10 (n=3) and 15 days (n=3). Additionally the vessel count has increased significantly at day 15 in comparison to day 5. Eight of the animals had to be excluded due to thrombosis of the loop, which was expected due to the complex microsurgical model, especially at the onset of the project. In the second phase of the study three different anti-angiogenic procedures were investigated. Time of implantation was 15 days. In group one (n = 6) the monoclonal antibody of VEGF (vascular endothelial growth factor) named Bevacizumab was applied intravenously. As a result a significant lower vessel area (94 432 ± 17 903 μm2) and density (18 ± 5 vessels per mm2) could be measured in comparison to the control group (n = 6; 268 682 ± 63 575 μm2 respectively 40 ± 9 vessels per mm2). We concluded from these results that angiogenesis was mediated by VEGF. In comparison to the controlgroup direct IR of 2 Gy led in group two (n = 7) to a significant decrease in vessel number (311 ± 73 versus 776 ± 123), area (43137±10225μm2 versus 268682±63575μm2) and density (15±7 versus 40±9 vessels per mm2). Therefore this procedure has an obvious impact on the vessel maturation. In the combined group (n = 5) of both anti-angiogenic procedures (anti- VEGF and IR) a significant decrease was only evident in the vessel area. We assumed that this physiological and accordingly organized angiogenesis does not respond to the applied inhibiting methods, as it is observed in tumor vessel growth. Additionally, an evaluation program was established with the goal of designing a user-independent and standardized computer program to measure 2-D-images of both this and other angiogenesis models. In summary the AV-loop presents a proficient model to investigate angiogenesis in healthy tissue. It offers a variety of possibilities to apply pro- and anti-angiogenic factors and to examine their impact in vivo.:1 EINLEITUNG 1 1.1 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 3 2 LITERATURÜBERSICHT 5 2.1. ANGIOGENESE 5 2.1.1 PHYSIOLOGIE 5 2.1.1.1 Bildung von Blutgefäßen 5 2.1.1.2 Embryogenese 8 2.1.1.3 Angiogenese und Wundheilung 9 2.1.2 TUMOR-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 11 2.2 TISSUE ENGINEERING 22 2.3 DAS ARTERIOVENÖSE (AV) LOOP-MODELL 22 2.4 AUSWERTUNG VON ANGIOGENESEPROZESSEN 23 3 MATERIAL UND METHODEN 24 3.1 TIERE UND HALTUNG 24 3.2 OPERATIVE EINGRIFFE 24 3.2.1 KAMMER UND MATRIX 24 3.2.2 HERSTELLUNG DES AV-LOOPS 25 3.2.3 BESTRAHLUNG 29 3.3 EXPLANTATION 29 3.3.1 PERFUSION MIT INDIA INK 29 3.3.2 PERFUSION MIT MICROFIL® 31 3.4. HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE METHODEN 32 3.4.1 VORBEREITUNG DER SCHNITTE 32 3.4.2 HÄMATOXYLIN-EOSIN-FÄRBUNG 33 3.4.3 LEKTINFÄRBUNG 34 3.5 DATENVERARBEITUNG 36 3.5.1 MIKROSKOPISCHE AUFZEICHNUNGEN 36 3.5.2 AUSWERTUNG DER HISTOLOGISCHEN SCHNITTE 36 3.5.3 AUFNAHMEN DER MIKRO-CT-BILDER 41 3.5.4 AUSWERTUNG DER MIKRO-CT-BILDER 42 3.5.5 POWER ANALYSE 43 3.5.6 STATISTISCHE AUSWERTUNGEN 43 3.6 VERWENDETES MATERIAL 44 4 ERGEBNISSE 47 4.1 AV-LOOP-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 48 4.2 ZEITLICHER VERLAUF DER AV-LOOP-ASSOZIIERTEN ANGIOGENESE 50 4.3 HISTOMORPHOMETRISCHE ANGIOGENESE-CHARAKTERISIERUNG MITTELS HE- UND LEKTINFÄRBUNG 52 4.4 AUTOMATISCHE, COMPUTERGESTÜTZTE UND UNTERSUCHERUNABHÄNGIGE ANGIOGENESE- QUANTIFIZIERUNG 53 4.5 EINFLUSS VON VEGF AUF AV-LOOP-ANGIOGENESE 58 4.6 EINFLUSS VON BESTRAHLUNG AUF DIE NEOVASKULARISATION IM AV-LOOP-MODELL 62 4.7 WECHSELWIRKUNG VON VEGF UND IONISIERENDER BESTRAHLUNG AUF DIE ANGIOGENESE IM AV-LOOP-MODELL 65 5 DISKUSSION 71 6 ZUSAMMENFASSUNG 81 7 SUMMARY 83 8 LITERATURVERZEICHNIS 85 9 ANHANG 95 9.1 PROTOKOLL ZUR HERSTELLUNG DER PUFFER 95 9.1.1 CITRATPUFFER 95 9.1.2 TRISPUFFER 95 9.2 TABELLEN 95 9.3 ABBILDUNGEN 95 10 DANKSAGUNG 98

Einleitung: Tiermodelle spielen für die Aufklärung pathophysiologischer Mechanismen und die Entwicklung erfolgsversprechender Therapieoptionen zentralnervöser Bewegungsstörungen eine unverzichtbare Rolle. Die Identifizierung von Gendefekten für die Parkinson-Krankheit und Dystonien ermöglichte die Generierung von Tiermodellen mit einer hohen „construct validity“. Weibliche transgene Thy1-aSyn Mäuse sowie DYT1 Knock-in (KI) Mäuse zeigen jedoch keine motorischen Störungen. In der vorliegenden Arbeit sollten zur Aufdeckung sensomotorischer Beeinträchtigungen, die bei Parkinson- und Dystoniepatienten beobachtet werden, detaillierte Untersuchungen des Verhaltens an diesen beiden Mausmodellen durchgeführt werden. Zielstellung: Zunächst sollte ein sensitiver Verhaltenstest konstruiert und entwickelt werden, bei dem sich ändernde sensorische Stimuli während der Ausübung der motorischen Aufgabe impliziert werden. Bei der Etablierung dieses sogenannten „adaptiven rotierenden Balkentests“ (ARB-Test) sollte auch der Einfluss des genetischen Hintergrunds bei Wildtyp-Mäusen evaluiert werden. Daraufhin sollte überprüft werden, ob dieser Test den Endophänotyp der weiblichen Thy1-aSyn Mäuse aufdecken kann. In dem DYT1 KI Mausmodell sollte der Frage nachgegangen werden, ob die Tiere Verhaltensdefizite in spezifischen Tests zeigen, die sensomotorische Verschaltungen untersuchen. Material und Methoden: Die mRNA-Expression von α-Synuclein in der Substantia nigra bei männlichen und weiblichen Thy1-aSyn Mäusen wurde mithilfe der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) ermittelt. Im Anschluss an die Entwicklung des neuen Verhaltensapparates für den ARB-Test wurden Thy1-aSyn Tiere beider Geschlechter in diesem Versuch getestet und ihre Leistung den Ergebnissen auf etablierten motorischen Verhaltenstests („challenging beam test“, „pole test“) gegenübergestellt. Um den Einfluss des Hintergrundstammes auf das Verhalten der Tiere auf dem ARB-Test zu untersuchen, wurden Wildtypen der reinen C57BL/6J-Linie sowie Hybrid-Tiere des Stammes C57Bl/6J × DBA2 (BDF1) allen drei o. g. Versuchen unterzogen. Bei den Mäusen des DYT1 KI Modells wurde der „adhesive removal test“ und der ARB-Test zur Analyse der Sensomotorik durchgeführt. Im Vergleich dazu wurden vielfältige Verhaltensparameter in einer Reihe vorwiegend motorischer (Offenfeld-Test, „challenging beam test“, „pole test“, Zylinder-Test, Block-Test, Nestbau-Test) und kognitiver („y-maze test“) Verhaltenstests ausgewertet. Ergebnisse: Bei den weiblichen Thy1-aSyn Mäusen wurde eine geringere Expression des Transgens im Vergleich zu den männlichen Tieren festgestellt. Der neue ARB-Test wurde erfolgreich etabliert und konnte signifikante Verhaltensdefizite der weiblichen und männlichen Mutanten des Parkinson-Modells im Vergleich zu den Kontrolltieren aufdecken. Der genetische Hintergrund beeinflusste die Leistung der Wildtypen auf diesem Balkentest. Während die DYT1 KI Tiere in den rein motorischen und kognitiven Versuchen keine Beeinträchtigungen des Verhaltens zeigten, konnten der „adhesive removal test“ sowie der neue ARB-Test signifikante sensomotorische Defizite der KI Mäuse im Unterschied zu den Wildtypen zum Vorschein bringen. Schlussfolgerung: Im Thy1-aSyn Mausmodell konnte die Bedeutung der sensomotorischen Integration für die Ausprägung motorischer Defizite sowie für eine mögliche Kompensation solcher motorischen Beeinträchtigungen demonstriert werden. Hierfür hat sich der neu entwickelte, sensitive ARB-Test als geeignet herausgestellt. Die Aufdeckung von Beeinträchtigungen der Sensomotorik spricht auch bei den DYT1 KI Tieren für den Einfluss einer gestörten sensomotorischen Integration bei der Ausprägung der Symptomatik. Damit eignet sich dieses Mausmodell für die Untersuchung weiterer Parameter, die Auswirkungen auf die Aufdeckung des Phänotyps und die Penetranz der Erkrankung haben sowie um die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu erforschen.

Der zu den bedeutendsten Ektoparasiten des Schweines gehörende Erreger der Schweineräude, Sarcoptes scabiei var. suis, ist weltweit verbreitet und von wirtschaftlichen Interesse für Schweinezucht- und Mastbetriebe. Ziel dieser seroepidemiologischen Studie war die Gewinnung neuer Erkenntnisse über die Bestandsdynamik klinischer Räudeerscheinungen und dem Titerverlauf von IgG-Antikörpern gegen Sarcoptes scabiei var. suis im Serum von Sauen in Abhängigkeit vom Reproduktionszyklus (Trächtigkeit, Laktation, Besamung) und von Saugferkeln während der Säugeperiode sowie Aufzucht. Schlussfolgernd aufgrund der Ergebnisse dieser Studie eignen sich für die Kontrolle und Überwachung sowie Diagnostik der Sarcoptes-Räude von Beständen serologische Untersuchungen von Ferkeln bis zur zweiten Lebenswoche von räudeverdächtigen Sauen, „Jungsauen erster und zweiter Wurf“ sowie Sauen während der Trächtigkeit (vor allem letztes Drittel) und Deckeber. Eine Vorselektion auf räudeverdächtige Hautveränderungen sowie gesteigerte Kratzaktivitäten erhöht die Wahrscheinlichkeit serologisch positive Tiere zu identifizieren.

Einleitung: Der seit über 30 Jahren ausgiebig erforschte Transkriptionsfaktor p53 besitzt offenbar Funktionen, die über seine bekannte und gut untersuchte Aktivität als Tumorsuppressor hinausgehen. So scheint er auch an der Regulation der menschlichen Lebenserwartung - über die Vermittlung einer allgemeinen physischen Robustheit - sowie der weiblichen Fertilität beteiligt zu sein. Insbesondere Primaten zeichnen sich durch eine vergleichsweise lange Lebenserwartung und eine lange reproduktive Phase aus. Ob p53 hier eine Rolle spielen könnte, ist unbekannt. Unsere Arbeitsgruppe entdeckte vor einigen Jahren das humane endogene Retrovirus-K (HERV-K) Protein Np9, dessen Gen sich in mehreren Kopien nur bei Menschen, Schimpansen und Gorillas findet. Weitere Untersuchungen wiesen außerdem darauf hin, dass Np9 an den Tumorsuppressor p53 zu binden vermag. Ziele der Untersuchungen: Es stellte sich also die Frage, ob die Funktion von p53 durch die Bindung an Np9 moduliert werden kann. Eine derartige Modulation des multifunktionellen Transkriptionsfaktors wäre natürlich auf Hominiden beschränkt. In der vorliegenden Arbeit sollten einige Teilaspekte der Interaktion von p53 und Np9 näher untersucht werden. Material und Methoden: Für die Bindungskartierung von p53 und Np9 wurden GST-Pulldown-Analysen durchgeführt. Die GST-Protein-Plasmide wurden in E.coli BL21 transformiert und nach Induktion mit IPTG exprimiert. Sie dienten als „Fängerproteine“ und waren dank ihres Glutathion-S-Transferase-tags in der Lage an GST-Sepharose-Kügelchen zu binden. Der putative Interaktionspartner als „Beuteprotein“ wurde in vitro translatiert und in diesem Zuge auch mit 35S radioaktiv markiert. Dann wurde er mit den an die Beads gebundenen GST-Proteinen inkubiert und anschließend die Proben auf ein SDS-Gel aufgetragen und aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend auf eine Membran übertragen und der Blot auf einen Radioaktivfilm aufgelegt, woraufhin die Protein-Protein-Bindungen anhand des radioaktiven Beuteproteins als Banden erkennbar waren. Abschließend wurde der Blot mit GST-Antikörper inkubiert, dann am Folgetag mit Anti-Mouse-Antikörper. Mittels ECL Substrat konnte nun die Bindung der GST-getaggten Proteine an die Sepharosebeads nachgewiesen werden. Für den Electrophoretic Mobility Shift Assay wurden verschiedene Versuchsansätze pipettiert, welchen nach einer Inkubationszeit das zuvor mit 32P radioaktiv markierte Oligonukleotid zugegeben wurde. Nach erneuter Inkubation wurden die Proben auf das nicht-denaturiende EMSA-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Dabei wurden die Protein-Oligonukleotid-Verbindungen gemäß ihrer Ladung, Größe und Konformation getrennt. Die Gele wurden im Geltrockner getrocknet und direkt mit einer Verstärkerfolie auf den Radioaktivfilm in einer Radioaktivkassette aufgelegt. Ergebnisse: Zunächst war es notwendig, die Bindung der beiden Partner biochemisch zu kartieren. Dies geschah mittels der GST-Pulldown-Analyse, in der Fragmente der Proteine exprimiert, miteinander inkubiert und schließlich kopräzipitiert wurden. Es stellte sich heraus, dass p53 mit seinem C-Terminus an Np9 bindet. Np9 hingegen band mit seinen Aminosäureresten (aa) 1-64 (ohne den C-terminus mit den aa 65-74) an p53. Das Np9-Fragment 36-74 zeigte nur eine schwache Bindung an p53. Interessanterweise band das Np9-Fragment 36-64 stärker an p53 als Volllängen-Np9 (1-74), was auf eine die Interaktion hemmende Domäne im C-Terminus von Np9 hinweisen könnte. Um zu untersuchen, ob die Bindung von Np9 an den C-Terminus von p53 die p53-DNA-Interaktion beeinflusst, wurden Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass Np9-zumindest in vitro-durch Bindung an die regulatorische Domäne von p53 und in Anwesenheit des p53-aktivierenden Antikörpers PAb421 in der Lage war, die spezifische Bindungsfähigkeit von p53 an DNA zu erhöhen und somit seine Funktion als Transkriptionsfaktor zu unterstützen. Schlussfolgerungen: Die Resultate weisen also erstmals darauf hin, dass das nukleäre HERV-K Protein Np9 spezifisch in Hominiden eine p53-abhängige Tumorsuppressoreigenschaft aufweisen könnte. Weitere Untersuchungen-insbesondere in vivo-sind nun notwendig. Dies könnte auch als Forschungsgrundlage zu endogenen Retrovirusproteinen beim Pferd dienen.:1 Einleitung und Zielsetzung der Arbeit 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Der Tumorsuppressor p53 2 2.2 Das Kernprotein Np9 7 2.2.1 Retroviren 7 2.2.2 Endogene Retroviren 8 2.2.3 Humane endogene Retroviren 8 2.2.4 HERV-K 10 2.2.5 Das nukleäre Protein Np9 10 3 Material und Methoden 15 3.1 Material 15 3.1.1 Chemikalien 15 3.1.2 Puffer und Lösungen 17 3.1.3 Antikörper 21 3.1.4 Enzyme 22 3.1.5 Reaktionskits 22 3.1.6 Bakterienstämme 23 3.1.7 Kulturmedien 23 3.1.8 Oligonukleotide für EMSA 23 3.1.9 Größenstandards 24 3.1.10 Plasmide 26 3.2 Methoden 28 3.2.1 Nukleinsäuretechniken 28 3.2.2 Protein-Methoden 31 3.2.3 Prokaryonten 40 4 Ergebnisse 42 4.1 Interaktion zwischen Np9 und dem Tumorsuppressorprotein p53 42 4.2 GST-Pulldown 43 4.2.1 Klonierung für die GST-Pulldown-Analysen 43 4.2.2 Induktion der Proteinexpression 48 4.2.3 GST-Pulldown-Experimente 53 4.3 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) 57 4.3.1 Radioaktive Markierung der Sonden 58 4.3.2 EMSA-Experimente 58 5 Diskussion 63 6 Zusammenfassung 68 7 Summary 70 8 Literaturverzeichnis 72 Danksagung 86 Abbildungsverzeichnis 87 Tabellenverzeichnis 88 / Introduction: The transcription factor p53, extensively investigated for over 30 years, apparently has functions which exceeds his known and well examined activity as a tumor suppressor. It seems to be involved in the regulation of the human life expectancy – by providing a general physical robustness - as well as of the female fecundity. Primates too are characterized by a comparatively long life expectancy and long reproductive phases, yet the possible influence of p53 is unknown. Our research group has discovered some years ago the Np9 protein of human endogenous retrovirus K (HERV K), which is found in several copies only with humans, chimpanzees and gorillas. Other investigations by our group suggested that Np9 might be able to interact with the tumor suppressor p53. Objective of the investigations: To study whether the function of p53 can be modulated by the interaction with Np9. Such a modulation of the multifunctional transcription factor would of course be limited to hominids. In the present work some aspects of the interaction between p53 and Np9 were analysed. Materials and methods: For the mapping of the interaction of p53 and Np9, GST pulldown assays were carried out. The GST protein plasmids were transformed in E. coli BL21 and expressed after IPTG induction. They served as bait proteins and bound to GST sepharose beads because of their Glutathione S-transferase-tags. The putative interaction partner as a prey protein was translated in vitro and radioactively marked with 35S. After being incubated with the GST-proteins bound to the beads, the samples were transferred on a SDS gel and separated. The gel was transferred to a membrane and the blot was exposed to an X-ray film. Thus, the radioactively labelled prey protein forms bands that identify the protein-protein interaction. Finally the blot was incubated with GST antibody, then on the following day with anti-mouse antibody. Using ECL-substrate it was now possible to demonstrate that the GST-tagged proteins bound to the sepharose beads. For the Electrophoretic Mobility Shift Assay different samples were prepared and, after an incubation time, the oligonucleotide radioactively marked with 32P was added. After additional incubation it was transferred on non-denaturating EMSA gel and separated by electrophoresis. Thus the protein oligonucleotide conjugates were separated according to charge, size and conformation. The gels were dried in the gel dryer, transferred to a membrane and placed against an X-ray film in a cassette. Results: Initially a biochemical mapping of the binding of the two partners had to be carried out. This was done by means of the GST pulldown assay, in which fragments of the proteins were extruded, incubated together and finally co-precipitated. It turned out that the C-terminus of p53 bound to Np9. However, Np9 bound to p53 with his amino acid residues (aa) 1-64 (lacking the C-terminal aa 65-74). The Np9 fragment 36-74 showed only a weak binding to p53. Interestingly the Np9 fragment 36-64 was binding stronger to p53 than a full length Np9 (1-74), which could point to a C-terminal domain in Np 9 inhibiting the interaction. In order to examine whether the binding of Np9 to the C-terminal of p53 affects the interaction of p53 with DNA, Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) were carried out. It could be shown that Np9 was able to raise the specific binding ability of p53 with DNA and to support therefore its function as a transcription factor, by binding to the regulatory domain of p53 in presence of the activating p53 antibody PAB421. Conclusions: The results show for the first time that, specifically in hominids, the nuclear HERV-K protein Np9 could have a tumor suppressing quality that is dependent on p53. Further investigations, in particular in vivo, are necessary. This could be the starting point for research on equine endogenous retrovirusproteins in horses.:1 Einleitung und Zielsetzung der Arbeit 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Der Tumorsuppressor p53 2 2.2 Das Kernprotein Np9 7 2.2.1 Retroviren 7 2.2.2 Endogene Retroviren 8 2.2.3 Humane endogene Retroviren 8 2.2.4 HERV-K 10 2.2.5 Das nukleäre Protein Np9 10 3 Material und Methoden 15 3.1 Material 15 3.1.1 Chemikalien 15 3.1.2 Puffer und Lösungen 17 3.1.3 Antikörper 21 3.1.4 Enzyme 22 3.1.5 Reaktionskits 22 3.1.6 Bakterienstämme 23 3.1.7 Kulturmedien 23 3.1.8 Oligonukleotide für EMSA 23 3.1.9 Größenstandards 24 3.1.10 Plasmide 26 3.2 Methoden 28 3.2.1 Nukleinsäuretechniken 28 3.2.2 Protein-Methoden 31 3.2.3 Prokaryonten 40 4 Ergebnisse 42 4.1 Interaktion zwischen Np9 und dem Tumorsuppressorprotein p53 42 4.2 GST-Pulldown 43 4.2.1 Klonierung für die GST-Pulldown-Analysen 43 4.2.2 Induktion der Proteinexpression 48 4.2.3 GST-Pulldown-Experimente 53 4.3 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) 57 4.3.1 Radioaktive Markierung der Sonden 58 4.3.2 EMSA-Experimente 58 5 Diskussion 63 6 Zusammenfassung 68 7 Summary 70 8 Literaturverzeichnis 72 Danksagung 86 Abbildungsverzeichnis 87 Tabellenverzeichnis 88

Einleitung: Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) sind im Laufe der letzten Jahre vermehrt in den Fokus der Verhaltens-, Alters- und Stoffwechselforschung gerückt. Blutdruckmessungen könnten für die Gesundheitsüberwachung dieser Tiere einen wertvollen Beitrag leisten. Bisher erhobene Daten zeigen jedoch unterschiedliche oder unvollständige Messmethoden und vernachlässigen wichtige physiologische Faktoren wie Alter, Gewicht und Geschlecht der Tiere. Dies erschwert die Reproduzierbarkeit der Werte sowie deren Vergleich untereinander. Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war es daher, ein praxistaugliches Protokoll für Blutdruckmessungen beim Weißbüschelaffen zu erstellen. Darauf aufbauend sollten die Tiere der Primatenkolonie des Veterinär-Physiologisch-Chemischen Institutes Leipzig über mehrere Monate untersucht werden, um physiologische Blutdruckwerte unter standardisierten Bedingungen zu erhalten. Tiere, Material und Methoden: Für ein Messprotokoll wurde in einem Vorversuch bei 10 Tieren der Einfluss der Messlokalisation (Gliedmaße oder Schwanz) und bei 6 Tieren der Einfluss der Tageszeit per High-Definition Oszillometrie (HDO)- Blutdruckmessungen (über drei Tage) untersucht. Mit diesen Erkenntnissen wurden dann alle Tiere der Kolonie (n= 56, 25 männlich, 31 weiblich; Altersspanne: 14 - 209 Monate, Gewichte 313 – 499 g) überprüft (Gesamtdauer 30 Monate). Alters- und gewichtsabhängige Blutdruckveränderungen sowie der Unterschied zwischen den Geschlechtern wurde zusätzlich untersucht (Korrelations- und Regressionsanalysen, t-Tests). Bei vier Tieren wurden Blutdruckabweichungen festgestellt, deren weiterführende Analyse in Form von Blut-, Urin- oder Ultraschalluntersuchungen erfolgte. Ergebnisse: Das etablierte Messprotokoll unterschied sich zu denen bei anderen Tierarten, v.a. im Hinblick auf die Messlokalisation (Messungen an den Hintergliedmaßen lieferten präzisere Ergebnisse als am Schwanz). Während 3 - 7 Messungen bei Weißbüschelaffen möglich sind, hatte die Tageszeit keinen Einfluss auf die Werte. Darauf aufbauend konnten Grenzen für physiologische und pathologische Blutdruckwerte beim Weißbüschelaffen festgelegt werden. Sowohl Alter als auch Gewicht beeinflussten die Blutdruckwerte. Das Blutdruckmuster zeigte dabei einen Anstieg der Werte sowohl mit steigendem Alter als auch mit höherem Gewicht an. Das Geschlecht hatte keinen Einfluss auf die Blutdruckwerte, beeinflusste aber ebenso wie das Alter die Messdauer. Messungen an weiblichen und/ oder älteren Tieren konnten schneller durchgeführt werden als bei männlichen und/ oder jungen Individuen. Durch die Früherkennung von Blutdruckabweichungen konnten bei den beschriebenen Patienten die zugrundeliegenden Krankheiten näher untersucht und behandelt werden. Dabei zeigten zwei der vier Tiere progressiv verlaufende Nierenerkrankungen bei gleichzeitigem Vorliegen von Begleiterscheinungen wie Anämie oder Demineralisierung der Knochen. Eine Patientin wies Stoffwechselentgleisungen in Form von erhöhten Triglycerid- und Insulinwerten sowie Übergewicht auf. Bei der vierten Patientin wurden Herzveränderungen in Form einer Endokardiose und Hypertrophie festgestellt. Schlussfolgerungen: Im Rahmen dieser Arbeit wurden sowohl ein Messprotokoll für die nicht-invasive Blutdruckmessung beim Weißbüschelaffen als auch physiologische Blutdruckwerte unter Berücksichtigung von Alter, Gewicht und Geschlecht etabliert. Die Tatsache, dass weibliche und alte Tiere besser zu messen waren, könnte zukünftige Studien in puncto Blutdruckauswertung und -beurteilung erleichtern. Der Nachweis der den veränderten Blutdruckwerten zugrundeliegenden Krankheiten bestätigt die klinische Relevanz von Blutdruckmessungen. Die regelmäßige Akquirierung dieser Daten dient so nicht nur der generellen Gesundheitsüberwachung, sondern bietet sich besonders auch über lange Zeiträume zur Verlaufskontrolle an. / Introduction: The common marmoset (Callithrix jacchus) recently moved into focus for behavioral, age and metabolic studies. Blood pressure measurements could be a positive contribution to the health maintenance of these animals. However, the data that has been gathered so far show differing measurement techniques and give little or no information about the protocols applied. In addition, important factors such as age, weight and sex, have not yet been taken into account. This complicates reproducibility and comparison of values. Aim: Aim of this study was therefore to establish a standard protocol for blood pressure measurements in the common marmoset. Based on this, animals from the primate colony of the Institute of Veterinary Physiological Chemistry Leipzig were to be monitored over several months and their data analyzed to gather physiological measurement values under standardized conditions. Animals, materials and methods: For a measurement protocol the influence of measurement localization (thigh or tail) was reviewed in ten animals using blood pressure measurements via High-Definition Oszillometry (HDO). Following this, the influence of daytime was evaluated in six animals over the course of three days. With this knowledge, all animals of the colony (n= 56, 25 males, 31 females; age range: 14 - 209 months, body weight 313 – 499 g) were assessed. Age- and weight-dependent blood pressure changes as well as differences between the sexes were examined (correlation and regression analyses, t-tests). In four animals with conspicuous blood pressure values analyses of blood and urine as well as ultrasonographic examinations were further performed. Results: The established measurement protocol differed from those used in other animal species in terms of measurement localization (thigh measurements resulted in more precise values than measurements at the tail). While 3-7 single measurements were possible in the common marmoset, day time did not influence values. Based on this, threshold values for physiological and pathological blood pressure data could be determined. Age and weight both influenced blood pressure in common marmosets. The blood pressure pattern showed rising values with both increasing age and weight. Sex had no influence on blood pressure values, but affected together with age measurement time. Measurements in old and/ or female individuals could be performed faster than in male and/ or young individuals. Due to the early detection of blood pressure abnormalities, the causative diseases could be analyzed and treated in the described patients. Two of the four patients showed progressing renal diseases simultaneously with co-morbidities like anemia or bone demineralization. One patient displayed metabolic disease in terms of increased triglyceride and insulin values as well as excess weight. The fourth patient was identified as having heart changes in the form of endocardiosis and cardiac hypertrophy. Conclusion: This work outlines the establishment of a measurement protocol for non-invasive blood pressure measurement in the common marmoset as well as physiological values considering age, weight and sex. The fact that female and old animals were easier to measure could facilitate blood pressure evaluation and interpretation in future studies. The identification of the diseases, responsible for the altered blood pressure values confirmed the clinical relevance of blood pressure assessment. The regular acquisition of such data is therefore not only useful in the health monitoring of all individuals, but especially supports follow-up examinations over longer periods of time.

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Subklinische entzündliche Veränderungen des Endometriums können nur durch die histopathologische Untersuchung eines Bioptates diagnostiziert werden und sind von besonderer Bedeutung bei Fertilitätsstörungen. Die nicht-eitrige (NE) Endometritis ist gekennzeichnet durch eine Infiltration des Endometriums mit Lymphozyten, Plasmazellen und/oder Makrophagen. Die genaue Pathogenese ist unklar. Die immunhistologische Phänotypisierung dieser Zell-(sub-)populationen kann möglicherweise pathogenetische Hinweise geben. Der immunhistologische Nachweis equiner Immunzellen ist jedoch fast ausschließlich an Gefrierschnitten etabliert. Dies ist für die Routinediagnostik ungeeignet. Demzufolge ergaben sich die folgenden Ziele: 1. Eine alternative Methode zur Gewebsfixierung zu etablieren, die in der Routinediagnostik praktikabel einsetzbar ist, die einen guten Strukturerhalt, eine geeignete Anfärbbarkeit und ideale Auswertbarkeit gewährleistet sowie umfangreiche immunhistochemische Untersuchungen ermöglicht; 2. Die immunhistochemische Phänotypisierung von Lymphozyten- und Makrophagen-(sub-)populationen an fixierten equinen Gewebeproben zu entwickeln; 3. Eine semiquantitative Bestimmung der endometrialen Entzündungszellen ohne und mit einer NE Endometritis durchzuführen. Tiere, Material & Methoden: Gewebeproben (Lymphknoten als Referenzgewebe und endometriales Gewebe) wurden von 5 Stuten im Rahmen der Sektion entnommen, in Formalin (F), HOPE® (H) oder IHC Zinc Fixative (Z) fixiert und zusätzlich als natives Gefriermaterial aufgearbeitet. Es erfolgte eine vergleichende Beurteilung der Gewebemorphologie, des Färbeverhaltens und der Artefakte am equinen Endometrium in HE gefärbten Gefrierschnitten bzw. im fixierten, Paraffin-eingebetteten Material (F, H und Z). Equine Lymphknoten dienten als Referenzgewebe für die immunhistochemische Etablierung der Lymphozytenmarker (anti-CD3, -CD4, -CD8) an Gefrierschnitten und am fixierten, Paraffin-eingebetteten Material (F, H und Z). F- und Z-fixiertes Referenzgewebe (Leber, Dünndarm, Darmlymphknoten) von 4 Stuten wurde für die Etablierung der Makrophagenmarker (anti-CD172a, -CD14, -CD206) verwendet. Die Immunreaktionen der Primärantikörper wurden verglichen. Als Resultat aus den vergleichenden Analysen wurde die Z-Fixierung als effektivste alternative Fixierungsmethode ausgewählt. Im abschließenden Teil der Untersuchungen wurden 28 Z-fixierte Endometriumbioptate hinsichtlich der Entzündungszellen semiquantitativ ausgewertet. 4 Stuten zeigten keine Entzündungsreaktion und dienten als Kontrolle. 24 Stuten wiesen eine oberflächliche NE Endometritis auf. Die Anzahl CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD14+ und CD206+ Zellen sowie die Anzahl von Plasmazellen mittels Methylgrün-Pyronin-Färbung wurde an Serienschnitten in 5 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern (400x) jeweils für das Stratum compactum, Stratum spongiosum und das luminale sowie glanduläre Epithel erhoben. Ergebnisse: 1. Die Z-Fixierung zeigt mit der F-Fixierung vergleichbare, exzellente Eigenschaften hinsichtlich des Strukturerhalts, der Anfärbbarkeit und Auswertbarkeit. Sie übersteigt insgesamt die Eigenschaften der H-Fixierung: die Z-Fixierung erweist sich einfacher in der Anwendung und zeigt eine geringere Artefaktbildung. 2. Die immunhistochemische Charakterisierung von T- und B-Lymphozyten, Helfer-T-Lymphozyten sowie zytotoxischen T-Lymphozyten und Makrophagenpopulationen sowie der Nachweis von Plasmazellen mittels Methylgrün-Pyronin-Färbung an Z-fixierten equinen Gewebeproben ist möglich. 3. Im entzündlich veränderten Endometrium sind mehr CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD206+ Zellen sowie Plasmazellen nachweisbar als in unveränderten Gewebeproben bezogen auf das Stratum compactum und Stratum spongiosum. Die durchschnittliche Anzahl CD3+ Zellen ist im Stratum compactum NE Endometritiden knapp 3x höher als im unveränderten Endometrium. Wenige CD20+ B-Zellen und CD172a+ Makrophagen sowie eine unterschiedliche Anzahl an Plasmazellen sind innerhalb des Stratum compactum entzündlich veränderter Endometrien nachweisbar. Es existieren große individuelle Unterschiede in der Anzahl CD4+ und CD8+ T-Zellen in Endometrien ohne sowie mit einer Entzündung. Schlussfolgerungen: Eine Integration der Z-Fixierung in die Routinediagnostik mit zusätzlichen Anwendungsmöglichkeiten ist problemlos möglich. Die immunhistochemische Entzündungszelldifferenzierung im Endometrium der Stute kann an fixierten equinen Endometriumbioptaten durchgeführt werden und bietet darüber hinaus die Möglichkeit, diese Methode an anderen equinen Organen anzuwenden. Die Ergebnisse der semiquantitiven Auswertung deuten auf das mögliche Vorliegen unterschiedlicher Formen der nicht-eitrigen Entzündung hin. Das etablierte Verfahren gibt möglicherweise nähere Hinweise auf immunologische Konstellationen, die das Auftreten einer nicht-eitrigen Endometritis begünstigen.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS II 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Das Endometrium der Stute 2 2.1.1 Endometritiden 4 2.1.1.1 Eitrige Endometritis 4 2.1.1.2 Nicht-eitrige Endometritis 5 2.1.1.3 Sonderformen 6 2.1.2 Resistant und susceptible mares 8 2.1.3 Entzündungszelltypisierung im Endometrium der Stute 10 2.1.4 Diagnostische Bedeutung des Endometriumbioptates 13 2.2 Immunologie 14 2.2.1 T-Lymphozyten 14 2.2.2 B-Lymphozyten 17 2.2.3 Makrophagen 18 2.2.4 Immunhistochemische Charakterisierung von equinen Entzündungszellen 21 2.3 Fixierungsmethoden 24 2.4 Fazit aus der Literatur bezüglich der Fragestellung dieser Arbeit 26 3 PUBLIKATIONEN 28 3.1 Publikation 1 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 28 3.2 Publikation 2 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 39 4 DISKUSSION 53 4.1 Etablierung alternativer Methoden zur Gewebefixierung 54 4.2 Immunhistochemische Detektion von Immunzell- (sub-)populationen 59 4.3 Erkenntnisse im Hinblick auf die Pathogenese nicht-eitriger Endometritiden 60 5 ZUSAMMENFASSUNG 63 6 SUMMARY 65 7 LITERATURVERZEICHNIS 67 8 DANKSAGUNG 81 / Clinically unapparent inflammatory alterations of the equine endometrium can only be diagnosed by the histopathological examination of a biopsy and are the main cause of subfertility in mares. The non-suppurative endometritis is characterised by infiltration of the endometrium with lymphocytes, plasma cells and/or macrophages. So far, the cause and pathogenesis of non-suppurative endometritis are unclear. The subclassification of the immune cell populations involved will likely provide important information on the etiology and pathogenesis of this disease. Available antibodies are often established exclusively for immunohistochemistry on cryostat sections of native frozen equine tissue. However, this method is impractical for the routine diagnostic work-up. The aim of the present study was: 1. To reveal the method most suitable for a routine diagnostic work-up in combination with proper tissue preservation, staining results as well as histological and immunohistochemical analysis; 2. To establish an immunohistochemical method for the detection of lymphocytes and macrophages including their subpopulations in fixed equine tissue samples; 3. To characterize the immune cell populations in fixed endometria of mares without and with non-suppurative endometritis. Material & methods: Equine endometrial tissue and intestinal lymph node were obtained from five mares during post mortem examination and were either fixed in formalin, HOPE® or IHC Zinc Fixative. Aditionally snap frozen tissue samples were processed for cryostat sectioning. HE stained cryostat sections and fixed paraffin embedded tissue samples (formalin, HOPE®, IHC Zinc Fixative) of the equine endometrium were analysed regarding tissue preservation, staining results and artefacts. To establish lymphocyte markers (anti-CD3, anti-CD4 and anti-CD8) immunohistochemically on cryostat sections and fixed paraffin embedded tissue samples (formalin, HOPE®, IHC Zinc Fixative) equine lymph node was used as reference. Formalin fixed and zinc fixed tissue samples with macrophage populations (liver, small intestine, intestinal lymph node) from four mares were used for the immunohistochemical establishment of the macrophage markers (anti-CD172a, anti-CD14, anti-CD206). The immunoreactivity of the primary antibodies was compared. The results of the comparative analysis revealed the most suitable alternative fixation method (zinc fixation). Finally, 28 zinc fixed endometrial biopsies were evaluated semiquantitatively with regard to the numbers of CD3+, CD4+, CD8+, CD20+ lymphocytes, CD172+, CD14+, CD206+ macrophages as well as plasma cells. Four mares had no evidence of endometritis and represent the control group. The remaining 24 mares showed a mild superficial non-suppurative endometritis. The comparative analysis was performed in serial sections within five randomly selected high power fields (400x). Positive cells were counted separately within the luminal and glandular epithelium, the stratum compactum and the stratum spongiosum. Results: 1. The zinc fixation provides excellent staining results, tissue preservation and allows histological and immunohistochemical analysis. It has even some advantages compared to the HOPE® fixation regarding the routine diagnostic work-up. The zinc fixation produces less artefacts. 2. The zinc fixation allows the immunohistochemical detection of all applied T- and B-lymphocyte-, helper- and cytotoxic-T-cell- and macrophage-markers and the histochemical detection of plasma cells (methyl green-pyronin stain) within equine fixed tissue. 3. Endometria with non-suppurative endometritis have higher numbers of CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD206+ as well as plasma cells within the stratum compactum and stratum spongiosum than endometria without inflammation. The average cell count of CD3+ lymphocytes within the stratum compactum was approximately 3 x higher within inflamed endometria than this value obtained from endometria without endometritis. Few CD20+ B cells and CD172+ macrophages as well as variable numbers of plasma cells could be detected within the stratum compactum of mares with non-suppurative endometritis. Endometria with and without inflammation showed marked differences in the numbers of CD4+ and CD8+ T cells. Conclusion: The zinc fixation can be easily incoorporated into the routine diagnostic work-up and offers additional application possibilities. Immunohistochemical phenotyping of immune cells in the equine endometrium can be performed on fixed endometrial biopsies of the mare. Furthermore, a widespread applicability is possible, e. g. on other equine organs. These findings suggest the existence of different forms of non-suppurative endometritis. The established method will likely assist to reveal possible etiologies and predisposing conditions for non-suppurative endometritis.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS II 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Das Endometrium der Stute 2 2.1.1 Endometritiden 4 2.1.1.1 Eitrige Endometritis 4 2.1.1.2 Nicht-eitrige Endometritis 5 2.1.1.3 Sonderformen 6 2.1.2 Resistant und susceptible mares 8 2.1.3 Entzündungszelltypisierung im Endometrium der Stute 10 2.1.4 Diagnostische Bedeutung des Endometriumbioptates 13 2.2 Immunologie 14 2.2.1 T-Lymphozyten 14 2.2.2 B-Lymphozyten 17 2.2.3 Makrophagen 18 2.2.4 Immunhistochemische Charakterisierung von equinen Entzündungszellen 21 2.3 Fixierungsmethoden 24 2.4 Fazit aus der Literatur bezüglich der Fragestellung dieser Arbeit 26 3 PUBLIKATIONEN 28 3.1 Publikation 1 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 28 3.2 Publikation 2 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 39 4 DISKUSSION 53 4.1 Etablierung alternativer Methoden zur Gewebefixierung 54 4.2 Immunhistochemische Detektion von Immunzell- (sub-)populationen 59 4.3 Erkenntnisse im Hinblick auf die Pathogenese nicht-eitriger Endometritiden 60 5 ZUSAMMENFASSUNG 63 6 SUMMARY 65 7 LITERATURVERZEICHNIS 67 8 DANKSAGUNG 81