Das Feline Coronavirus (FCoV) ist in den Katzenpopulationen der ganzen Welt weit verbreitet. Das Problem dieses Virus ist seine große Wahrscheinlichkeit zu mutieren. Einige dieser Mutationen können zu einer veränderten Pathogenität und zu einem schweren Verlauf der Infektion führen. So bleibt es möglicherweise nicht wie bei den meisten der infizierten Tiere bei einem inapparenten Verlauf oder milden Durchfall, sondern es kommt zur Entwicklung einer häufig tödlich endenden systemischen Erkrankung, der Felinen Infektiösen Peritonitis (FIP). Um dies zu verhindern ist es essentiell, Virusausscheider schnell zu identifizieren und zu eliminieren, um den Virusdruck in Katzenpopulationen so gering wie möglich zu halten. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für den Nachweis von FCoV in Kot ist der Goldstandard, aber ist zeitaufwendig und erfordert ein gut ausgestattetes Labor. Als isothermale Methode liefert die Reverse Transkription Rekombinase Polymerase Amplifikation (RT-RPA) eine schnelle und kostengünstige Alternative für den molekularen Nachweis von FCoV. Ziel dieser Studie war es, einen Schnelltest zum Nachweis von FCoV zu entwickeln, der auf der RT-RPA basiert. Drei Vorwärts- und drei Rückwärtsprimer sowie eine Sonde wurden erstellt. Als Zielsequenz wurde die hochkonservierte, nicht-translatierte Region des 7b Gens gewählt. Alle möglichen Kombinationen dieser Primer wurden getestet und das Paar mit der höchsten Sensitivität für die weitere Validierung ausgewählt. Bei einer konstanten Temperatur von 42 °C wurde die reverse Transkription mit anschließender DNA-Amplifikation und Detektion innerhalb von 15 Minuten durchgeführt. Die analytische Sensitivität wurde anhand von neun Wiederholungen mit der Verdünnungsreihe des molekularen Standards (10^3-10^0RNA Kopien/µL) ermittelt und die Nachweisgrenze mittels Probit-Analyse berechnet. Für die Untersuchung auf Kreuzreaktionen wurde DNA oder RNA von 19 Viren getestet. Die Leistung der RT-RPA unter Verwendung klinischer Proben wurde mit extrahierter RNA von 39 felinen Kotproben analysiert. Alle Ergebnisse wurden denen der real-time RT-PCR gegenübergestellt. Die UTR des 7b Gens ausgewählter Proben, einschließlich einer falsch negativ getesteten Probe, wurde sequenziert und mittels Geneious Prime analysiert. Die Probit-Analyse ergab eine Nachweisgrenze von 58,5 RNA-Kopien/Reaktion. Die RT-RPA amplifizierte keine Nukleinsäuren der 17 getesteten anderen Pathogenen, zeigte jedoch eine Kreuzreaktion mit dem Caninen Coronavirus und dem Transmissiblen Gastroenterits-Virus. Der Vergleich der Resultate der real-time RT-PCR mit den 39 extrahierten Kotproben und den Ergebnissen der RT-RPA ergab eine Sensitivität von 90,9% und eine Spezifität von 100%. Bei der Sequenzierung wurde keine Sequenzänderung in der Region von Primern und Sonde festgestellt. Die RT-RPA hat sich als schnelle und effektive Maßnahme für den Nachweis von FCoV in extrahierten Kotproben herausgestellt. Die einfache Handhabung der RPA macht wiederholtes Testen möglich, um auch die intermittierenden Ausscheider zu erkennen. Die Anwendung des Schnelltests könnte so zu einer Reduktion von FCoV innerhalb der Katzenpopulationen beitragen.:Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 2. Literaturübersicht 3 2.1 Felines Coronavirus 3 2.1.1 Virus Klassifikation 3 2.1.2 Struktur und Genom 4 2.1.3 Virusevolution 6 2.2 Epidemiologie und Krankheitsverlauf 8 2.2.1 Übertragung und Umweltstabilität 8 2.2.2 Krankheitsverlauf 9 2.2.3 Prävalenz 12 2.2.4 Prävention 13 2.2.5 Behandlung 13 2.2.6 Impfung 14 2.3 Diagnostik 15 2.3.1 Indirekter Erregernachweis 15 2.3.2 Direkter Erregernachweis 17 3. Publikation 27 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil der Publikation 27 3.2 Publikation 27 4. Diskussion und Schlussfolgerung 40 5. Zusammenfassung 47 6. Summary 49 7. Literaturverzeichnis 51 8. Abbildungsverzeichnis 64 9. Tabellenverzeichnis 64 10. Anhang 65 11. Danksagung 72

Einleitung: Wohlbefinden und Tierschutzaspekte spielen in der modernen Zootierhaltung eine entscheidende Rolle und werden von vielen Seiten diskutiert und kritisiert. Die Überwachung des Wohlbefindens ist eine Herausforderung, da nicht alle in menschlicher Obhut gehaltene Tiere leicht untersucht werden können. Probenentnahmen zur Gesundheitsüberwachung stellen zusätzlichen Stress dar. Dass Stress maßgeblich das Wohlbefinden tangiert, ist umfassend bereits beschrieben. Möglichkeiten des Einsatzes nicht invasiver Methoden bieten zoologischen Einrichtungen den Handlungsspielraum, eine Überwachung ihrer Tiere, ohne sie fangen zu müssen, möglich zu machen. Das bedeutet weniger Stress für die Tiere, weniger Gefährdungspotential für das Pflegepersonal und den Tierarzt. Im Rahmen der nicht invasiven Überwachung können bereits erste Hinweise zu weiterführenden Untersuchungen veranlassen und helfen den zoologischen Einrichtungen bei der Überwachung und Verbesserung des Wohlbefindens. Ziel der Untersuchung: Ziel war es, nicht invasive Methoden zur Beurteilung des Wohlbefindens in menschlicher Obhut gehaltener Wildtiere retrospektiv zu betrachten. Hierzu wurden Tierarten, als Wildformen und domestizierte Formen, aus fünf Säugetierordnungen, die in Zoos gehalten werden, untersucht. Evaluierte und erprobte Verfahren wurden zusammengetragen und vergleichend aufgezeigt. Dabei wurden stets der Body Condition Score, Cortisolmetabolite und Verhaltensstudien betrachtet. Wesentlich war es Parallelen und Möglichkeiten zwischen den Tierartengruppen darzustellen und die Praktikabilität der Kombination der Methoden zu betrachten. Weiterhin war es Ziel, Grenzen und Lücken aufzuzeigen und weiterführende Untersuchungen anzuregen. Material und Methoden: In einer Literaturrecherche wurden ca. 1200 Literaturstellen auf die Nutzbarkeit für nicht invasive Überwachung von Wohlbefinden und Tierschutzaspekten sondiert. Im Rahmen der Fokussierung und Eingrenzung wurden fünf Säugetierordnungen mit ausgewählten Familien betrachtet, dafür wurde ein Suchkatalog angelegt. Dieser wurde in den Datenbanken Pub Med, Web of Sciene und dem Leibniz Institut für Zoo und Wildtierforschung recherchiert. Ergebnisse: Rüsseltiere (Proboscidea), Herrentiere (Primates), Raubtiere (Carnivora), Unpaarhufer (Perissodytyla) und Paarhufer (Artiodactyla) mit weit über 60 Vertretern wurden betrachtet. Um eine Vereinheitlichung zur Bewertung des Wohlbefindens bei genannten Wildtieren aufzustellen habe ich das BBC-Schema (Body Condition Score, Behavior und Cortisolmetabolite) entworfen. Somit können bei den Proboscidea alle Bereiche der BBC angewendet werden. Hingegen bei den Primates scheinen besonders Cortisolmetabolite und Verhaltensanalysen zielführend zu sein. Bei den Carnivora bieten BBC-Betrachtungen gute Ansätze, jedoch bedarf es weiterer Body Condition Score Erweiterungen für kleinere Vertreter. Bei den Perissodytyla sind BBC in allen Bereichen anwendbar, jedoch sind bisher für die Tapiridae keine Ethogramme zur Verhaltensevaluierung beschrieben. Für Artiodactyla ist das BBC-Schema eine gute Möglichkeit zur Beurteilung von Wohlbefinden und Stress. Der Unterbereich der Bovidae bedarf bei vielen Vertretern weiterer Evaluierungen von Cortisolmetaboliten und Verhaltensaufnahmen. Mit dem BBC-Schema konnte für jede Gruppe eine geeignete Kombination zur nicht invasiven Beurteilung von Wohlbefinden und Tierschutzaspekten aufgezeigt werden. Darüber hinaus war es möglich tierartübergreifende Parallelen, Unterschiede, Lücken, als auch Vor- und Nachteile herauszuarbeiten. Schlussfolgerung: Die Untersuchungen zeigen, dass eine einzelne Methode nicht immer eine absolute Aussagekraft hat. Desto wichtiger ist eine tierartspezifische, nach Fragestellung und Untersuchungsmöglichkeiten angepasste Auswahl zu nutzen. Anhand meiner betrachteten Methoden lassen sich die ,,5 Domains“ (Ernährung, Umwelt, Gesundheit, Verhalten, und geistige Gesundheit) mit den nachfolgend genannten Methoden als Bestandteil des BBC Schemas überwachen und beurteilen. Body Condition Scores bieten die Möglichkeit zur langfristigen Überwachung des Ernährungszustandes. Verringerungen oder Steigerungen des BCS, können Ausdruck von Faktoren, die das Wohlbefinden beeinflussen, sein. Ausgewählte Verhaltensweisen (Behavior) sind pathognomonisch für mangelndes Wohlbefinden und lassen sich mit Verhaltensaufnahmen beurteilen und quantifizieren. Analysen helfen, Verbesserungen nach Anpassungen der Haltungsbedingungen und/oder Elimination eines Stressors aufzuzeigen. Ebenfalls kann abnormales Verhalten Hinweise auf Erkrankungen geben. Das Stresshormon Cortisol, welches bei Stress vermehrt ausgeschieden wird, kann kurzfristig in Speichel und Harn, mittelfristig im Kot und langfristig in den Haaren nachgewiesen werden. Es kann Rückschlüsse auf die Stressoren, Erkrankungen oder mangelndes Wohlbefinden im Allgemeinen geben.:Inhaltsverzeichnis: 1. Einleitung 1 2. Literaturübersicht 2 2.1 Tierschutzaspekte, Wohlbefinden und die ,,Five Domains“ 2 2.2 Nicht-invasive Methoden zur Beurteilung von Wohlbefinden und Stress 5 a) Body Condition Score: 5 b) Cortisolmetabolitebestimmung aus Kot, Harn, Speichel und Haaren: 5 c) Verhaltensanalysen: 8 3. Material 11 4. Methoden 11 5. Ergebnisse 14 5.1 Elefanten (Elphantidae) 14 5.2 Herrentiere (Primates) 19 5.2.1 Menschenaffen (Hominidae) 19 5.2.2 Krallenaffen & Totenkopfaffen (Cebidae) 24 5.2.3 Paviane & Rhesusaffen (Cercopithecidae) 27 5.3 Raubtiere (Carnivora) 32 5.3.1 Felidae: Großkatzen (Pantherinae) und Kleinkatzen (Felinae) 32 5.3.2 Hyänen (Hyaenidae) 39 5.3.3 Hunde (Canidae) 40 5.3.4 Bären (Ursidae) 45 5.4 Unpaarhufer (Perissodytyla) 51 5.4.1 Pferde (Equidae) 51 5.4.2 Tapire (Tapiridae) 55 5.4.3 Nashörner (Rhinocerotidae) 59 5.5 Paarhufer (Artiodactyla) 63 5.5.1 Schweine (Suidae) und Pekaris (Tayassuidae) 63 5.5.2 Hirsche (Cervidae) 70 5.5.3 Hornträger (Bovidae) 75 5.5.4 Giraffen und Okapis (Giraffidae). 81 6. Diskussion 84 7. Zusammenfassung 91 8. Summary 93 9. Literatur 95 10. Danksagung 123

Tüpfelbeutelmarder gehören zu den Beuteltieren Australiens und Tasmaniens. Die Populationen in der Wildbahn sind rückläufig und werden in der International Union for Conservation of Nature (IUCN) Red List of Threatened Species™ seit dem Jahr 2016 als „endangered“ gelistet. In Zoos sind die bedrohten, nachtaktiven Tiere auch aufgrund ihrer anspruchsvollen Haltungs- und Zuchtbedingungen bisher selten zu sehen. Ziel dieser Arbeit war es relevante veterinärmedizinische Aspekte für die Haltung von Tüpfelbeutelmardern in menschlicher Obhut zusammenzutragen. Damit sollte ein besseres Verständnis zu den Haltungsansprüchen und dem medizinischen Umgang geschaffen werden, das zum Schutz dieser bedrohten Spezies beiträgt. Im Rahmen einer ausführlichen Recherche und Sichtung des durch 12 Zoologische Einrichtungen zur Verfügung gestellten Materials zwischen 2011 und 2019 und eigens durchgeführter Untersuchungen im Leipziger Zoo im Zeitraum von 2013 bis 2019 konnten wichtige Daten über die Tüpfelbeutelmarder zusammengetragen und ausgewertet werden. Hauptaugenmerk wurde dabei auf das Vorkommen bestimmter Erkrankungen und oder Neoplasien, labordiagnostische Parameter wie Hämatologie und klinische Chemie, die Häufigkeit bestimmter bakterieller und parasitärer Infektionserreger sowie Immobilisationsmethoden gelegt. Insgesamt wurden 88 pathologisch-anatomische und-histologische Befunde, 42 Blutproben, 53 bakteriologisch und 107 parasitologisch untersuchte Kotproben in die Studie einbezogen. Die deskriptive Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm GNU PSPP. Im Anschluss erfolgten Signifikanzprüfungen der einzelnen Variablen anhand des Tests nach Fisher, dem T-Test für unabhängige Stichproben und mit Hilfe der Berechnung einzelner Konfidenzintervalle bestimmter Neoplasie- und Erkrankungsentitäten. Das Signifikanzniveau wurde auf p<0,05 festgelegt. Zusammenfassend ließen sich bei 59% der untersuchten Tüpfelbeutelmarder eine oder mehrere Neoplasien nachweisen. Es bestand eine signifikante Korrelation zwischen dem Alter und dem Auftreten der Tumoren. Eine tierartspezifische Neoplasie konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Darüber hinaus wiesen 71% der Tiere eine oder mehrere Erkrankungen zum Todeszeitpunkt auf. Die Hepatitis, Nephritis und die Steatosis Hepatis waren dabei die am häufigsten dokumentierten Krankheiten. Keine der Entitäten lag allerdings als signifikante Häufung vor. Weiterhin ließ sich in Übereinstimmung mit der Literatur die Leukenzephalopathie als degenerativer Erkrankungskomplex bei 35%, der zumeist älteren Tüpfelbeutelmarder bestätigen. Die Inhalationsanästhesie erwies sich insgesamt als die zuverlässigste und sicherste Narkoseform für diese Tierart. Die mikrobiologischen Kotuntersuchungen ergaben den Verdacht einer einrichtungsspezifischen Erregerbesiedlung der Quolls, mit Clostridium perfringens, Proteus mirabilis und Escherichia coli. Wobei E. coli möglicherweise sogar als enterale Normalflora bezeichnet werden könnte. Eine ebenso einrichtungsspezifische Erregerbesiedlung ergaben die parasitologischen Kotuntersuchungen. Hier konnten vornehmlich Nematoden und Zestoden vermutlich als Darmpassanten bedingt durch die Futtertiere detektiert werden. Darüber hinaus wurden labordiagnostische Parameter etabliert, die als Orientierungshilfe zur Beurteilung des Gesundheitsstatus der Tüpfelbeutelmarder dienen können. Im Durchschnitt kann von einer Lebenserwartung der Tüpfelbeutelmarder in menschlicher Obhut von 3-4 Jahren ausgegangen werden. Die Haltungsansprüche der Tiere umfassen hauptsächlich das passende Lichtregime, vielseitig gestaltete Gehege und eine saisonal angepasste, täglich wechselnde Fütterung von Ganzkörpern. Regelmäßige Beutelkontrollen, sowie das richtige Handling durch geschulte Pfleger können darüber hinaus zur erfolgreichen Reproduktion der Eastern Quolls beitragen. Die größte veterinärmedizinische Bedeutung der Tüpfelbeutelmarderhaltung sollte der zumeist altersbedingten Ausbildung von Neoplasien und dem degenerativen Erkrankungskomplex der Leukenzephalopathie beigemessen werden. Bisher sind keine erfolgversprechenden Therapien bekannt, so dass eine engmaschige Überwachung des Allgemeinzustandes der Tiere im Sinne des Tierschutzes unbedingt anzuraten ist.

Einleitung Dermanyssus gallinae ist ein weit verbreiteter Ektoparasit bei Hühnern in Europa. Vor allem in den Sommermonaten entwickeln sich in Hühnerställen sehr große Milbenpopulationen. Die Milbenstiche und der damit einhergehende Blutverlust gehen zulasten des Tierwohls und verursachen hohe wirtschaftliche Einbußen. Die Milben befinden sich nur nachts für den Saugakt auf den Tieren und verstecken sich tagsüber in trockener Einstreu oder in dunklen Ritzen und Spalten. Dies macht die Bekämpfung schwierig und aufwendig. Seit September 2017 ist ein Arzneimittel mit dem Wirkstoff Fluralaner auf dem deutschen Markt verfügbar. Dieses soll die Bekämpfung der Roten Vogelmilbe einfacher machen. Ziel der Untersuchungen Ziel dieser Dissertation ist die Bewertung der Milbenreduktion bei Behandlung mit Fluralaner in der Dosierung 0,5 mg/kg Körpergewicht bei zweimaliger Applikation im Abstand von sieben Tagen in natürlich infizierten Geflügelställen. Verglichen wurde jeweils ein behandelter Versuchsstall mit einem unbehandelten Kontrollstall unter Beachtung der Good Clinical Practice (GCP). Tiere, Material und Methoden In der vorliegenden Arbeit wurden die Ergebnisse von zwei Junghennenbetrieben, drei Legehennenbetrieben und einem Elterntierbetrieb betrachtet. Auf jedem Betrieb waren zwei möglichst ähnliche Ställe mit vergleichbaren Tieren vorhanden. Die Ställe durften vor der Studie länger als drei Monate nicht mit Antiparasitika oder Silikatstaub behandelt worden sein. Die Höhe des Milbenbefalls in den Ställen wurde mit Fallen der Firma AviVet B.V. (Niederlande) ermittelt. Diese wurden in regelmäßigen Abständen vor und nach der Behandlung an gleichmäßig im Stall verteilten, festen Plätzen für 24 Stunden im Stall ausgebracht. Anschließend wurden sie tiefgefroren und bei Avivet B.V. in Lunteren, Niederlande ausgezählt. Die Hühner im Behandlungsstall wurden zwei Mal im Abstand von sieben Tagen mit einer Fluralaner-Lösung (10 mg/ml) behandelt. Die Dosierung betrug 0,5 mg/kg Körpergewicht. Die Studie galt nach einer Versuchsdauer von sechs Monaten nach der ersten Applikation, nach Beendigung eines Produktionszyklus, nach einem starken Absinken der Milbenreduktion oder wenn der Kontrollstall aufgrund des Tierwohls gegen D. gallinae behandelt werden musste, als beendet. Außerdem wurden Mortalität, klinische Auffälligkeiten und bei Legehennen die Legeleistung beobachtet. Die Milbenreduktion der Fluralaner-Lösung wurde mit der Henderson-Tilton Formel berechnet. Tests auf signifikante Unterschiede zwischen der behandelten und unbehandelten Gruppe wurden mit dem U-Test nach Mann-Whitney durchgeführt. Ergebnisse Durch die Behandlung mit Fluralaner konnte bei allen Betrieben eine signifikante (P < 0,05) Milbenreduktion erreicht werden. Bei drei Betrieben wurde eine Milbenreduktion von über 99 % erreicht, in den anderen drei Betrieben lag die Milbenreduktion zwischenzeitlich bei 100 %. Die Dauer der Milbenreduktion unterschied sich jedoch von Betrieb zu Betrieb zum Teil stark. In den Aufzuchtbetrieben wurde am Ende des Produktionszyklus (42 Tage nach erster Fluralaner Applikation) noch eine Wirksamkeit von 96 % beziehungsweise 99,6 % und damit ein signifikanter Unterschied (P < 0,05) festgestellt. In zwei Legehennenbetrieben sank die Milbenreduktion 70 Tage nach der ersten Fluralaner Applikation unter 90 % (P > 0,05). In einem Legehennenstall lag die Wirksamkeit 119 Tage nach der ersten Fluralaner Applikation (Produktionsende) noch bei 98,95 % (P < 0,05). Bei den Elterntieren sank die Milbenreduktion 126 Tage nach der ersten Fluralaner Applikation unter 90 % (P > 0,05). Bei der Mortalität konnten keine signifikanten (P > 0,05) Unterschiede zwischen Versuchs- und Behandlungsstall festgestellt werden. Auch klinisch gab es keine Auffälligkeiten. Bei zwei von drei Betrieben war die Legeleistung im Behandlungsstall gegenüber dem Kontrollstall erhöht. In einem dieser Betriebe könnte diese Differenz aber durch ein unterschiedliches Tieralter verursacht worden sein. Schlussfolgerungen Auf allen untersuchten Betrieben konnte eine Milbenreduktion von über 90 % erreicht werden. Eine zweimalige Applikation im Abstand von sieben Tagen mit Fluralaner in der Dosierung 0,5 mg/kg Körpergewicht ist als wirksam gegen D. gallinae einzustufen. Aufgrund der einfachen Applikation über das Trinkwasser bietet die Behandlung mit Fluralaner viele Vorteile gegenüber im Stall auszubringenden Akariziden und Silikatstäuben.

Nutztiere sind aufgrund ihrer Haltungsbedingungen diversen Stressoren ausgesetzt, welche ihre physische und psychische Gesundheit beeinträchtigen können. Im Rahmen von Animal Welfare Monitoring besteht daher ein großes Interesse an der Entwicklung und dem Einsatz minimal-invasiver Methoden und tierbezogener Belastungsindikatoren. Haarcortisol-konzentrationen (HCCs) könnten hierfür ein vielversprechender, retrospektiver Stressindikator sein, da sie die durchschnittlichen systemischen Cortisolkonzentrationen der letzten Wochen bis Monate in nur einer Probe widerspiegeln. Bevor HCCs jedoch als zuverlässiger Indikator eingesetzt werden können, müssen potenzielle Einflussfaktoren darauf ermittelt werden. Das generelle Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung von Einflussfaktoren auf Haarcortisol und seine Eignung für die Beurteilung von Langzeitstress bei Rindern und Schweinen. Daher zielten die vorliegenden Studien darauf ab, (1) Wissenslücken in der Forschung zu identifizieren, (2) die Wirkung potenzieller Einfluss- und Störfaktoren zu evaluieren und (3) zu untersuchen, ob und wann erhöhte systemische Cortisollevel durch HCCs nachweisbar sind. Alle Haarproben wurde von Holstein-Rindern, Landrasse- und Sattelschweinen bzw. Kreuzungstieren entnommen. Aufgrund der Literaturrecherche (Studie 1) wurden potenzielle Einflussfaktoren identifiziert und in den nachfolgenden Studien untersucht. Für die Evaluierung nicht-stressbedingter Faktoren (Studie 2), wurden insgesamt 614 Tiere verwendet. Hierfür wurden Haarproben in verschiedenen Altersstufen (Neugeborene bis Erwachsene), von beiden Geschlechtern und während der Sommer- und Wintersaison entnommen. Außerdem wurden schwarze und weiße Haarproben, unterschiedliche Körperregionen (Nacken/Schulter, Rücken, Schwanzspitze) und verschiedene Haarsegmente untersucht. Der Einfluss von Kontaminationen auf HCCs wurde in einer in-vitro-Studie (Studie 4) mit Haarproben von 12 Kühen und 12 Sauen evaluiert. Diese Proben wurden für vier Wochen täglich mit Urin, Speichel, Kot oder Wasser behandelt oder blieben unbehandelt. Um die Wirkung von Langzeitstress auf HCCs zu untersuchen (Studie 3), wurde bei 34 Rindern und 38 Jungsauen über vier Wochen jeden zweiten Tag ACTH- oder Kochsalzlösung appliziert. Vor, sowie zu drei Zeitpunkten nach Ende der Behandlung, wurden native und neu gewachsene Haare sowie zusätzlich Haarsegmente entnommen. Alle Haarproben wurden zweimal mit Isopropanol gewaschen, mit einer Kugelmühle gemahlen und Cortisol nach Extraktion mit Methanol mittels ELISA nachgewiesen. Die statistische Auswertung erfolgte mittels SAS/STAT-Software unter Anwendung von ANOVA und paarweisen Vergleichen durch Tukey-Kramer Tests. Die Ergebnisse der Studie 2 zeigen signifikant höhere HCCs bei neugeborenen Kälbern im Vergleich zu Jungrindern, Färsen und Kühen (p < 0,001). Ebenso wiesen 2 Wochen alte Ferkel höhere HCCs auf als Schweine im Alter von 10 oder 27 Wochen oder Sauen (p < 0,001). Das Geschlecht hatte keinen Einfluss auf die HCCs beider Tierarten. Jedoch waren bei beiden Spezies die HCCs in Schwanzhaaren, im Vergleich zu den Schulter-, Nacken- und Rückenhaaren signifikant erhöht (p < 0,001), ebenso in schwarzen Haaren im Vergleich zu weißen Haaren (p < 0,05) und in distalen im Vergleich zu proximalen Haarsegmenten (p < 0,001). Außerdem wiesen Rinder im Winter höhere HCCs als im Sommer auf (p < 0,001). Die Ergebnisse der Studie 4 zeigen, dass die Kontamination mit Urin bei beiden Spezies eine konzentrationsabhängige Zunahme der HCCs bewirkt. Auch die Kontamination mit Speichel und Kot erhöhte die HCCs, jedoch nur bei Rindern (alle p < 0,05). Die Behandlung mit Wasser führte zu einer Auswaschung von Cortisol aus Haaren vom Schwein, jedoch nicht vom Rind. Die Ergebnisse der ACTH-Studie (Studie 3) zeigen signifikant erhöhte HCCs bei ACTH-Tieren zum Ende der Behandlung in nativen Haaren (p < 0,001), nachgewachsenen Haaren (p < 0,01) und in Haarsegmenten (p < 0,05). Die höchsten HCCs wurden innerhalb von vier Wochen nach Behandlungsende gefunden. Bei Schweinen wurde ein Anstieg der HCCs sowohl in ACTH- als auch in Kontrolltieren beobachtet ohne dass Unterschiede zwischen den Behandlungen auftraten. Die Ergebnisse zeigen, dass die Cortisolkonzentrationen im Haar bei Schweinen und Rindern durch Alter, Körperregion, Haarfarbe, Haarsegment und Jahreszeit beeinflusst werden. Es gibt erste Belege, dass die Kontamination von Schweine- und Rinderhaaren mit cortisolhaltigen Körperflüssigkeiten, wie Urin und Speichel, die Aufnahme von externem Cortisol in den Haarschaft verursacht. Bei der Verwendung von HCC als Stressindikator sollten daher diese Einflussfaktoren standardisiert und Kontaminationseffekte vermieden werden, z.B. durch die Verwendung von Aufwuchsproben oder nur proximaler Haarsegmente. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Langzeitstress durch wiederholte Aktivierung der HPA-Achse zu erhöhten Cortisolkonzentrationen im Haar führt. Bei Rindern zeigt sich dies in den HCCs verschiedener Haarprobentypen. Insgesamt erweist sich die Analyse von Cortisol im Haar als eine geeignete Methode zum Nachweis von Langzeitstress bei Rindern und Schweinen und könnte daher eine wichtige Komponente bei der Beurteilung von Animal Welfare sein.:1 General introduction 2 Review of the literature 2.1 The relevance of stress assessment in animal welfare 2.2 Stress response in mammals 2.2.1 Structure and function of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis 2.2.2 Characteristics and effects of cortisol 2.2.3 Conventional biological matrices for cortisol analysis 2.3 Hair as a matrix for cortisol analysis 2.3.1 Hair structure and hair types 2.3.2 Hair growth cycle 2.3.3 Incorporation of cortisol into the hair 2.3.3.1 Passive diffusion 2.3.3.2 Multi-compartment model 2.3.4 Elimination of cortisol from the hair 2.3.5 Specific characteristics and applications of hair cortisol 3 Research focuses and aims 4 Results 4.1 Study 1: Hair cortisol for the assessment of stress (review) 4.2 Study 2: Effects of animal-based, seasonal and hair-specific factors on hair cortisol concentrations 4.3 Study 3: Effects of long-term stress on hair cortisol concentrations 4.4 Study 4: Effects of contamination and elimination on hair cortisol concentrations 5 General discussion 5.1 Influencing factors on hair cortisol concentrations in cattle and pigs 5.1.1 Impact of animal-based, seasonal and hair-specific factors 5.1.2 Impact of contamination and elimination by washout 5.1.3 Implications 5.2 Hair cortisol concentration as an indicator of long-term stress in cattle and pigs 5.2.1 Model for the increased release of systemic cortisol 5.2.2 Models for the time course of cortisol incorporation into the hair shaft 5.2.3 Impact of hair sample type and sampling time 5.2.4 Implications Table of contents 5.3 Future perspectives 5.4 Conclusions 6 Summary 7 Zusammenfassung 8 References 9 Danksagung / Farm animals can be exposed to various stressors due to their husbandry conditions, which can impair their health and welfare. Thus, there is interest in the use of minimally invasive methods and animal-based stress indicators as part of welfare assessment. Cortisol in hair is a promising retrospective stress indicator, as a sample reflects systemic cortisol levels of the past weeks or months. Previous studies have shown that long-term stress with elevated cortisol release can be related to increased cortisol incorporation into the hair shaft. However, potential influencing factors that may affect hair cortisol concentrations (HCCs) must be determined before HCC can be applied as a reliable indicator of stress. The general objectives of this thesis are to investigate influencing factors on HCC, and to examine the potential of hair cortisol concentration as an indicator of long-term stress in cattle and pigs. Thus, the present studies aimed to (1) identify knowledge gaps in hair cortisol research, (2) evaluate the impact of animal-based, seasonal and hair-specific factors as well as contamination and elimination on HCC, and (3) investigate whether and when long-term increased systemic cortisol levels are reflected in elevated HCCs. Hairs were sampled from Holstein Friesian cattle, Landrace or Saddleback pigs and crossbreeds. The findings of the literature review (Study 1) identified potential animal-based, seasonal, hair-specific and stress-related factors on HCCs, which our experimental studies considered. To examine the impact of influencing factors (Study 2), a total of 614 animals were used. Hair samples were taken at different ages (newborn to adult), from different sexes and during both summer and winter. Variations by hair-specific factors were determined by studying black and white hair samples, varying body regions (neck/shoulder, back and tail tip) and different hair segments. In general, female animals were used. The effect of contamination on HCCs was examined in an in vitro study (Study 4) using hair samples from 12 cows and 12 sows. Samples were treated daily with urine, saliva, faeces or water for four weeks or remained untreated. To investigate long-term stress (Study 3), 34 cattle and 38 gilts were injected intramuscularly either with ACTH solution or saline every second day for four weeks. Natural and regrown hair samples were taken before and three times after the end of treatment, and hair segments were collected. All the hair samples were shaved with electric clippers, washed twice with isopropanol and ground with a ball mill. Cortisol was detected by ELISA after extraction with methanol. Statistical analyses were performed using ANOVA and pairwise comparisons of the least square means by Tukey-Kramer tests with the MIXED procedure in SAS/STAT software. The results of Study 2 showed significantly higher HCCs in newborn calves than in young cattle, heifers and cows (p < 0.001). Likewise, 2-week-old piglets had higher HCCs than pigs aged 10 or 27 weeks and sows (p < 0.001). Sex had no effect on HCCs in pigs or cattle. In both species, HCCs were also significantly higher in samples obtained from the tail tip than from the shoulder, neck and back regions (p < 0.001), in black hair than in white hair (p < 0.05) and in distal hair than in proximal hair segments (p < 0.001). Season had an impact on HCC only in cattle, which exhibited higher levels in winter than in summer (p < 0.001). The results of Study 4 showed that contamination with urine caused a considerable concentration-dependent increase in HCCs in both species. Contamination with saliva and faeces also raised HCCs, but only in cattle (all p < 0.05). Treatment with water washed cortisol out from porcine hair but not from bovine hair. In cattle, repeated ACTH application (Study 3) revealed significantly higher HCCs after the end of treatment in natural hair (up to eight weeks, p < 0.001), regrown hair (up to four weeks, p < 0.01) and segmental hair (eight weeks, p < 0.05) than in the control animals. The highest HCCs were found four weeks after the end of treatment. In pigs, elevated HCCs were observed in both ACTH and control animals in all hair sample types after the application period, with no differences between treatments. These results show that hair cortisol concentrations in pigs and cattle are affected by age, body region, hair colour, hair segment and season. There is first evidence that contamination of porcine and bovine hair with cortisol-containing body fluids, such as urine and saliva, may cause the incorporation of external cortisol into the hair shaft. Thus, when using HCC as a potential stress indicator, these influencing factors should be standardised and contamination effects should be avoided, such as by using the shave-reshave procedure, clean sampling regions and only the most proximal hair segments. The results also demonstrated that long-term stress by repeated activation of the HPA axis increases hair cortisol concentrations. In cattle, HCCs in different hair sample types reliably reflected the preceding period with increased systemic cortisol levels. In conclusion, the analysis of HCC appears to be a suitable method to evaluate long-term stress in cattle and pigs and can therefore be an important component in the assessment of animal welfare.:1 General introduction 2 Review of the literature 2.1 The relevance of stress assessment in animal welfare 2.2 Stress response in mammals 2.2.1 Structure and function of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis 2.2.2 Characteristics and effects of cortisol 2.2.3 Conventional biological matrices for cortisol analysis 2.3 Hair as a matrix for cortisol analysis 2.3.1 Hair structure and hair types 2.3.2 Hair growth cycle 2.3.3 Incorporation of cortisol into the hair 2.3.3.1 Passive diffusion 2.3.3.2 Multi-compartment model 2.3.4 Elimination of cortisol from the hair 2.3.5 Specific characteristics and applications of hair cortisol 3 Research focuses and aims 4 Results 4.1 Study 1: Hair cortisol for the assessment of stress (review) 4.2 Study 2: Effects of animal-based, seasonal and hair-specific factors on hair cortisol concentrations 4.3 Study 3: Effects of long-term stress on hair cortisol concentrations 4.4 Study 4: Effects of contamination and elimination on hair cortisol concentrations 5 General discussion 5.1 Influencing factors on hair cortisol concentrations in cattle and pigs 5.1.1 Impact of animal-based, seasonal and hair-specific factors 5.1.2 Impact of contamination and elimination by washout 5.1.3 Implications 5.2 Hair cortisol concentration as an indicator of long-term stress in cattle and pigs 5.2.1 Model for the increased release of systemic cortisol 5.2.2 Models for the time course of cortisol incorporation into the hair shaft 5.2.3 Impact of hair sample type and sampling time 5.2.4 Implications Table of contents 5.3 Future perspectives 5.4 Conclusions 6 Summary 7 Zusammenfassung 8 References 9 Danksagung

Introduction: Cryptosporidium parvum is one of the most common causes of diarrhea worldwide in neonatal calves. This pathogen is also life-threatening in malnourished children and immunodeficient patients. There is no vaccine and a single drug nitazoxanide (NTZ), of only the moderate efficacy has been approved by FDA for cryptosporidiosis treatment in human. Octaarginine is known to facilitate the transport of other molecules across cell membranes and has been use to transfect protozoan organisms. It is also proposed to increase the efficacy of drugs against intracellular pathogens. Aims of the study: The capacity of octaarginine to support transfection of C. parvum as an alternative to electroporation was evaluated. Furthermore, it was studied whether octaarginine covalently bound to NTZ (NTZ-R8) improves efficacy against the parasite. Animals, materials and methods: FAM-octaarginine was added to either intact oocysts, short-time excystation exposed (STE) oocysts, excysted sporozoites, intracellular stages of C. parvum to assess the permeability of the Cryptosporidium membrane to the peptide. The optimal conditions for condensation of plasmid for transfection experiments were evaluated by testing different N/P ratios applying by gel retardation assay. The transfection complex octaarginine/polyethyleneimine (PEI)/DNA was also incubated with intact oocysts, STE oocysts, and excysted sporozoites. Transfected parasites were transferred to HCT-8 cell cultures and further incubated for 24 h. Immunoflourescence assay (IFA) was performed to detect successfully transfected parasites. To evaluate the suitability of octaarginine as a vehicle supporting transport of NTZ across membranes, octaarginine was coupled to NTZ to produce NTZ-R8. Cryptosporidium oocysts were inoculated into HCT-8 cell monolayers in the presence of NTZ and NTZ-R8 at concentrations of 1, 5, 10, 50, 100 or 1000 ng/ml. Parasite growth was monitored by RT- qPCR after RNA extraction from C. parvum exposed HTC-8 cell cultures. RT-qPCR was performed on the target gene 18S rRNA of Cryptosporidium and normalized to the expression of the housekeeping gene 18S rRNA of host cells. To evaluate the efficacy of NTZ-R8 in vivo, IFN-γ knockout mice were orally inoculated with 1000 oocysts each, except for the non-infected controls. Infected mice were treated with NTZ (10 mg/kg BW) or NTZ-R8 (2 mg/kg BW) in 7 days. The efficacy of treatment was evaluated by oocyst excretion, survival rate, clinical symptoms, and histopathological changes in the ileum. Results: Octaarginine easily penetrated into Cryptosporidium sporozoites and STE oocysts, and intracellular stages while the membrane of intact oocysts remained impermeable. The optimal N/P ratio for the full DNA plasmid condensation starts from 10 when octaarginine was also added to the complex. Successful transfection of excysted sporozoites and STE oocysts was observed with only 1µg plasmid in the transfection complex. Transfection was not achieve when intact oocysts were used. The half-maximal inhibition concentration (IC50) of NTZ and NTZ-R8 was 60.54 ng/ml (197 nM) and 4.499 ng/ml (2.9 nM), respectively. Therefore, octaarginine significantly improved inhibition C. parvum growth by NTZ around 68 times (P < 0.05). During in vivo studies, it was observed that infected mice displayed symptoms of cryptosporidiosis such as anorexia, weight loss and ruffled fur. Mice treated with NTZ at 10 mg/kg BW displayed in 40% survival while mice treated with NTZ-R8 at 2 mg/ kg BW showed a distinctly higher survival rate of 80%, albeit non- significant (P > 0.05). Conclusion: DNA condensation by PEI and DNA delivery by octaarginine allows simple and rapid transfection that requires a small amount of plasmid DNA only and does not depend on sophisticated equipment. Best results were obtained using STE oocysts. Octaarginine also successfully transported the anticryptosporidial compound NTZ into extracellular and intracellular stages of C. parvum and is therefore a suitable vehicle for drug delivery, thus being a promising tool for improvement of treatment efficacy.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die immunhistologische Charakterisierung der Expression der profibrotischen Wachstumsfaktoren Transforming growth factor-beta-1, -beta2 und -beta3 und des Enzyms Matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2) im equinen Endometrium während des Zyklus sowie innerhalb der verschiedenen Erscheinungsformen der equinen Endometrose. Zudem wurde der potentielle Einfluss einer gleichzeitig auftretenden Endometritis auf die glanduläre und stromale Wachstumsfaktor- und Enzym-Expression untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie sollten klären, ob und inwieweit den untersuchten Wachstumsfaktoren unter Beteiligung von MMP-2 in der Pathogenese der equinen Endometrose eine mit anderen Organfibrosen vergleichbare Schlüsselrolle zukommt. Zu diesem Zweck standen an definierten Tagen entnommene Endometriumbioptate (n=21) von drei zyklisch aktiven, klinisch und gynäkologisch gesunden Maidenstuten sowie Endometriumbioptate von 60 Stuten mit graduell variabler Endometrose unterschiedlichen Charakters und Endometriumbioptate von 22 Stuten mit mittelgradiger Endometrose und gleichzeitiger mittelgradiger eitriger (n=16) bzw. nichteitriger (n=6) Endometritis aus dem Routineeinsendungsmaterial des Institutes für Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig zur Verfügung. Die Wachstumsfaktoren TGF-beta1, -beta2 und -beta3 sowie das Enzym MMP-2 zeigen im Zyklus ein typisches, zellspezifisches Reaktionsmuster, das unterschiedlichen Regulations-mechanismen zu unterliegen scheint. Ein Maximum der TGF-beta1-Expression in den luminalen Epithelzellen, Stroma- und Drüsenzellen kann in der endometrialen Sekretionsphase mit Anstieg bzw. einem Maximum der Serumprogesteron-Konzentration beobachtet werden. Im Gegensatz dazu tritt eine Expression von MMP-2 in den Stromazellen in der Sekretionsphase mit Abfall der Progesteronkonzentration im Serum auf. Das luminale Epithel und die Stromazellen zeigen eine maximale Expression von TGF-beta2 beim Vorliegen hoher Progesteronspiegel im Serum bzw. mit Abfall der Serumprogesteron-Konzentration in der Sekretionsphase. TGF-beta3 weist im luminalen Epithel ein ähnliches Expressionsmuster auf, eine deutliche Abhängigkeit zu den Serumhormon-Konzentrationen lässt sich jedoch nicht feststellen. Die stromale Expression von TGF-alpha unterliegt im equinen Endometrium keinen zyklusabhängigen Variationen. Die Stromazellen innerhalb der verschiedenen Endometroseherde zeigen, im Vergleich zum unveränderten Endometrium, vor allem eine verminderte Expression von TGF-alpha. Das Expressionsmuster der TGF-beta-Wachstumsfaktoren ist grundsätzlich variabel, es fällt jedoch auf, dass die Stromazellen insbesondere in inaktiven Endometrosen eine geringere Expression der TGF-beta-Isoformen aufweisen. Ursache ist möglicherweise eine gestörte hormonelle Stimulation bzw. eine stromale Synthesestörung in Folge veränderter epithelial/stromaler Wechselwirkungen. Das Enzym MMP-2 wird dagegen in den Stromazellen aller Endometroseherde, unabhängig von deren Differenzierung und dem Auftreten glandulärer Alterationen, deutlich vermehrt nachgewiesen. Dies ist sehr wahrscheinlich Folge der Extra-zellularmatrix-Akkumulation innerhalb der Endometroseherde und für die fortschreitende Zerstörung der glandulären Basalmembranen verantwortlich. Die glanduläre Expression innerhalb der Endometroseherde gleicht weitgehend der der unveränderten Drüsenzellen, lediglich in destruierenden Endometrosen werden TGF-alpha, TGF-beta2 und MMP-2 in den involvierten Drüsenzellen vermehrt nachgewiesen. Mögliche Ursachen wären eine Diffusion durch die geschädigte glanduläre Basalmembran bzw. eine Anregung der Synthese im Rahmen der epithelialen Wundheilung. Eine Anregung der glandulären und stromalen Expression der untersuchten Wachstumsfaktoren und des Enzyms MMP-2 im Rahmen der Endometrose durch die Anwesenheit von Entzündungszellen konnte nicht nachgewiesen werden. Eine der Leber- und Lungenfibrose ähnelnde, überschießende Wundheilungsreaktion durch eine primär epithelial bedingte, vermehrte TGF-Wachstumsfaktorproduktion sowie direkte Zusammenhänge zwischen der MMP-2- und TGF-beta-Wachstumsfaktor-Expression waren in der equinen Endometrose nicht festzustellen. Da vor allem die Stromazellen in der Endometrose eine veränderte Expression der Wachstumsfaktoren aufwiesen, ist möglicherweise eine primäre stromale Fehldifferenzierung der Ausgangspunkt für die Entstehung der Endometrose. Eine mit der Leber- und Lungenfibrose vergleichbare Schlüsselrolle der TGF-Wachstumsfaktoren in der Pathogenese der equinen Endometrose konnte nicht eindeutig belegt werden.

The highly pathogenic Avian Influenza subtype H5N1 can lead to 100 % mortality in chickens. The main issue in prevention of H5N1 is the development of efficient poultry vaccines. Influenza haemagglutinin (HA) derived recombinant polypeptides would not elicit an immune response against internal viral proteins. Thus HA polypeptide use facilitates differentiation between infected and vaccinated animals (DIVA). Serological tests using recombinant immune-dominant proteins devoid of non-specific moieties present in whole cell preparations might have higher sensitivity and specificity. In the present study, four non-overlapping sequences of different functional domains of influenza A virus subtype H5 virus (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) designated P1, P2, P5 and rHA1 were cloned and expressed in Pichia pastoris for vaccination and diagnosis purposes. The four polypeptides were expressed successfully in P. pastoris using peptone methanol (1 % (w/v) yeast extract, 2 % (w/v) peptone, 2 % (v/v) methanol). P1, P2 and rHA1 polypeptides were purified using nickel affinity chromatography, whereas, P5 was purified using lectin affinity chromatography. Correct expression was analysed by SDS-PAGE and western blot, glycosylation analysis and MALDI-TOF.The immune responses of P1, P2 and rHA1 polypeptides were assessed in BALB/C mice. To enhance antibody response, recombinant polypeptides were mixed with the Gerbu adjuvant and injected subcutaneously. Vaccination of mice induced high subtype specific antibody titres in mice as analysed by Elisa (using recombinant antigens or whole H5N1 antigen) and Immunofluorescence assay (IFA) performed on Vero cells infected with H5 (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004). The immunogenicity of P1, P2, P5 and rHA1 polypeptides was determined in commercial layer chickens. Results showed that P1, P2 and rHA1 polypeptides induced high subtype specific antibody titres in chickens as analysed by Elisa (using recombinant antigens or whole H5N1 antigen), IFA (performed on Vero cells infected with H5N1 A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) and microneutralization test (µNT). However, P5 polypeptide was not immunogenic in chickens. Neutralizing antibodies could be detected in chicken sera immunized with P1, P2 and rHA1 polypeptides as analyzed with microneutralization test. IgY was analysed in egg yolk of chickens immunized with recombinant polypeptides. The IgY of chicken immunized with P1 and rHA1, transferred to the egg yolk was proportional to maternal serum IgY. However, IgY could not be detected in egg yolk of chickens immunized with P2 and P5 recombinant polypeptides. The more immunogenic polypeptides P1 and rHA1 were used in an recombinant Elisa (rElisa) for detection of influenza A subtype H5 in chickens and duck sera.The optimal antigen for the concentrations of rHA1, P1 was 50 ng / well, 50 ng / well. Analysis of 25 positive sera and 25 negative sera to H5 antibodies revealed that, the sensitivity of Western blot, whole H5N1 Elisa, agar gel immunodiffusion test (AGID), P1-Elisa and rHA1-Elisa was 100 %, 100 %, 52 %, 80 % and 100 %, respectively, while the specificity was 100 %, 100 %, 100 %, 72 %, and 100 %, respectively. Moreover, duck sera, with haemagglutination inhibiting titer ranged from 4 - 8 log2, were tested positive by rHA1 Elisa compared with negative duck sera. Further analysis of 179 serum samples with rHA1-Elisa in comparison with haemagglutination inhibition (HI) and commercial Elisa proved to be highly sensitive and specific. The agreement ratio between rElisa and HI was 84.9 % and between commercial Elisa (Flock check) and HI was 76.5 %. In conclusion, P. pastoris may allow development of an effective recombinant influenza vaccine based on truncated sequences of HA that might provide broader protection against H5 influenza viruses. The possibilities to use rHA1, P1 and P5 recombinant polypeptides as a vaccine against H5 influenza should be further studied. Also our study demonstrates the potential utility of recombinant Elisa as a tool for improvement of serological diagnosis of influenza A subtype H5 in chickens and ducks. / Die hochpathogene aviäre Influenza des Subtyps H5N1 erreicht beim Ausbruch von Infektionen in Nutzgeflügelbeständen Mortalitätsraten von bis zu 100 %. Effektive und kostengünstige Impfstoffe werden benötigt, die möglichst auch eine Differenzierung zwischen geimpften Tieren und mit Wild-Virus infizierten Tieren zulassen. In diesem Zusammenhang könnten Peptid-Vakzine eine mögliche Alternative zu den herkömmlichen Impfstoffen darstellen, bei denen unter Verwendung des Vollvirus Antikörper gegen mehrere Virusproteine induziert werden. Außerdem, könnten rekombinante Antigene in serologischen Tests zur Diagnose von H5 Virus in Nutzgeflügel eingesetzt werden. Von dem Einsatz spezifischer rekombinanter Antigene ist eine Verbesserung der Serodiagnostik zu erwarten. In dieser Arbeit, wurden vier verkürzte Sequenzen des Hämagglutinins (P1, P2, P5 und rHA1) von Subtyp H5 (A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) rekombinant in Pichia Pastoris exprimiert. Dazu erfolgten zunächst eine Klonierung in der Expressionsvektor pAOX und die Transformation von Pichia Pastoris. Die Expression wurde durch Methanol induziert. Der Nachweis der rekombinanten Fusionspeptiden mit C-terminalen Histidin-Tag erfolgte durch SDS-PAGE, Western Blot, Glycolysierungsanalyse, und MALDI-TOF. Der Histidin-Tag ermöglichte die Reinigung von P1, P2 und rHA1 mit Metall-Affinitätschromatographie. Polypeptid P5 hingegen wurde mittels Lectin-Affinitäts- chromatographie gereinigt. Balb/c Mäuse wurden mit Polypeptid P1, P2 bzw. rHA1, versetzt mit Gerbu Adjuvans, immunisiert. Zur Untersuchung der Immunantwort wurden die murinen Seren mittels Elisa (unter Verwendung rekombinanter Antigene oder Voll-H5N1 Antigen) sowie IFA (durchgeführt in Vero- Zellen infiziert mit A / Thailand / 1 (Kan-1) / 2004) analysiert. Dabei wurde die präferentielle Induktion von H5-spezifischen Antikörpern detektiert. Die Immunogenität der P1, P2, P5 und rHA1-Polypeptide wurde in kommerziellen Legehennen bestimmt. Seren wurden mit ELISA, IFA, und Mikroneutralizationstest (μNT) analysiert. Die ELISA-Ergebnisse zeigten, dass die Polypeptide P1, P2 und rHA1 hohe Subtyp-spezifische Antikörpertiter in Hühnern induzierten. Im µNT konnte nur ein niedriger neutralisierender Antikörpertiter nachgewiesen werden. Das P5- Polypeptid ist bei Hühnern nicht immunogen. Im Eigelb von Hühnern, die mit den rekombinanten Polypeptiden P1 und rHA1 immunisiert wurden, konnten H5-spezifische IgY Antikörper detektiert werden. Hühner, die mit P2 und P5 immunisiert wurden, zeigten keine IgY im Eigelb. Die rekombinanten Antigene P1 und rHA1 wurden im ELISA auf ihre potenzielle Eignung für die Serodiagnostik untersucht. Die optimale Antigenkonzentration war 50 ng / well. Die serologische Analyse von 25 positiven und 25 negativen Seren auf Antikörper gegen H5 zeigte, dass Sensitivität und Spezifität von Western Blot, Voll-H5N1 ELISA und rHA1-ELISA bei jeweils 100 % lagen. Bei Agargel- Immunodiffusiontest (AGID) lagen Sensitivität und Spezifität bei 52 % und 100 %, während im P1-Elisa lediglich eine Sensitivität von 80 % und eine Spezifität von 72 % erreicht wurden. Somit eignet sich rHA1 für die Anwendung in der Serodiagnostik. Bei der serologischen Untersuchung von 175 Hühnerseren wurde eine Überbestimmung zwischen rHA1-ELISA und Hämagglutinationshemmungstest (HAI) 84.9 % festgestellt, während diese zwischen dem kommerziellen ELISA (Flock Check) und HAI 76.5 % betrug. Die Ergebnisse zeigten, dass das Expressionssystem P. pastoris als Produktionssystem rekombinanter Antigene für die Serodiagnostik von H5 Influenza geeignet ist. Challenge-Versuche sind nötig, um die Eignung von rekombinanten Antigenen als möglichen Impfstoff gegen H5 Influenza zu untersuchen.

Diarrhoe ist eines der häufigsten Probleme beim equinen Neonaten. Nahezu alle Fohlen entwickeln Durchfall innerhalb der ersten Lebenswochen. Unterschiedliche virale, bakterielle und parasitäre Ursachen werden diskutiert. In diesen Zeitraum fällt ebenfalls die erste Rosse der Stute, sodass der Durchfall um den 5. - 15. Lebenstag (LT) bei den Fohlen als „Fohlenrossedurchfall“ bezeichnet wird. Es wird vermutet, dass die Entwicklung der intestinalen Mikroflora und die Reifung der Darmschleimhaut im Wesentlichen für das Durchfallgeschehen verantwortlich sind. Bisher ist jedoch wenig bekannt über die Entwicklung der intestinalen Mikroflora bei Fohlen. Einige Probiotika sind als Darmflorastabilisatoren bei Tieren zugelassen. Studien belegten positive Effekte von Toyocerin® (B. cereus var. toyoi) auf die Darmgesundheit bei anderen Tierarten wie z.B. Kälbern, Ferkeln, Broilern, Puten und Mastkaninchen. Die vorliegende Arbeit sollte klären, ob die Supplementierung von B. cereus var. toyoi zu einer Stabilisierung der sich entwickelnden intestinalen Mikroflora und damit zu einer Verringerung der Durchfälle bei Fohlen führt. Die Untersuchung wurde an 25 Mutterstuten eines Vollblutgestüts und ihren Fohlen durchgeführt. Alle Fohlen wurden von Februar bis Mai 2011 geboren. Von Geburt an wurden die Fohlen randomisiert in drei Behandlungsgruppen eingeteilt: Placebo-Gruppe (10 ml isotone Kochsalzlösung, n=8), 50 mg Toyocerin-Gruppe (5 x 108 KbE B. cereus var. toyoi gelöst in 10 ml isotoner Kochsalzlösung, n=7) und 200 mg Toyocerin-Gruppe (2 x 109 KbE B. cereus var. toyoi gelöst in 10 ml isotoner Kochsalzlösung, n=10). Die Placebo- und Behandlungsgruppen wurden einmal täglich vom 1. – 58. LT supplementiert. Herz- und Atemfrequenz, Körperinnentemperatur und die Körpermasseentwicklung wurden nach einem standardisierten Protokoll erhoben. Kotproben konnten mit Hilfe von Kotsammelbeuteln oder durch rektale Entnahme innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt sowie an LT 9, 16, 23, 30, 44, 58 und am ersten Durchfalltag gewonnen werden. Blutproben wurden aus der Vena jugularis externa am 1., 9., 16., 30., 58. LT sowie am ersten Durchfalltag entnommen. Die bakteriologische Untersuchung erfolgte mit Hilfe des Kulturverfahrens. Die Bestimmung der Gesamt-IgG-Werte wurde mit einem kompetitiven ELISA, die Bestimmung der spezifischen Antikörper IgG-anti-LPS von E. coli J5 und IgG-anti-PLC-von-C. perfringens-1a mit einem indirekten ELISA durchgeführt. 88 % der Fohlen entwickelten Durchfall (Placebo 7/8, 50 mg Toyocerin 5/7, 200 mg Toyocerin 10/10) mit einer hohen Inzidenz zwischen dem 8. und 16. LT. Das Allgemeinbefinden und die Bewegungs- und Sauglust blieben dabei unbeeinflusst. Zum Zeitpunkt des ersten Östrus der Stute zeigten 59 % der Fohlen Diarrhoe. Unter den 41 %, die keinen Durchfall zum Zeitpunkt der Fohlenrosse hatten, waren Fohlen, die nie Durchfall vom 1. – 58. LT zeigten, aber auch welche die Diarrhoe entwickelten, als die Mutterstute sich nicht in Rosse befand. Ein Zusammenhang zwischen der Fohlenrosse der Stute und Durchfall bei ihrem Fohlen konnte nicht hergestellt werden. Es zeigte sich eine Tendenz, dass hohe Spiegel der Gesamt-IgG (>20 mg/ml) und IgG-anti-LPS von E. coli J5 (>120 RE/ml) nach der Kolostrumaufnahme im Zusammenhang mit einer geringeren Anzahl von Durchfalltagen innerhalb der ersten zwei Lebensmonate standen. C. perfringens und Enterobakterien waren gleichermaßen nachweisbar bei Fohlen mit Durchfall als auch bei unauffälligen Fohlen. Aus der Supplementierung von B. cereus var. toyoi ergab sich kein Effekt auf die Kotflora der Fohlen, außer auf die Gesamtkeimzahlen (GKZ) der aeroben Bakterien. Bei den Aerobiern im Fohlenkot konnte ein signifikanter Behandlungseffekt (p=0,012) festgestellt werden. Im ersten Milchkot der Fohlen waren GKZ von 4,5 x 104 KbE/g (200 mg Toyocerin-Gruppe) bis 5,0 x 105 KbE/g (50 mg Toyocerin-Gruppe) bei den aeroben Bakterien und GKZ von 2,4 x 105 KbE/g (200 mg Toyocerin-Gruppe) bis 4,7 x 106 KbE/g (50 mg Toyocerin-Gruppe) median bei den Anaerobiern nachweisbar. Danach stieg der Gehalt der aeroben und anaeroben Bakterien weiter bis zum 3. LT und stagnierte bis zum 16. LT. Während dieser Stagnationsphase trat bei 92 % der Fohlen (23/25) eine Veränderung der Kotkonsistenz bis hin zu Durchfällen auf. Vom 16. bis zum 58. LT sanken die Gehalte moderat bei den Aerobiern median am 58. LT auf 2,7 x 105 KbE/g (Placebo-Gruppe) bis 2,2 x 106 KbE/g (50 mg Toyocerin-Gruppe) und bei den Anaerobiern median am 58. LT auf 3,8 x 105 KbE/g (Placebo-Gruppe) bis 2,9 x 106 KbE/g (200 mg Toyocerin-Gruppe). Bis zum 58. LT näherte sich der Medianwert der aeroben und anaeroben Bakterien im Kot der Placebo-Gruppe dem Wert der Mutterstuten (gemessen am ersten Tag nach der Geburt) an. Innerhalb der ersten Lebenstage war eine hohe aerobe sowie anaerobe Keimzahl im Kot der Fohlen nachzuweisen, die sich oberhalb der Keimzahlen befand, die im Kot der Mutterstuten zum Zeitpunkt der Geburt gemessen wurde. Im Rahmen der Entwicklung und Etablierung der bakteriellen intestinalen Mikroflora wurde das Fohlenrossedurchfallgeschehen bei den Fohlen beobachtet. B. cereus var. toyoi hatte dabei keinen Einfluss auf die Anzahl der Fohlen mit Durchfall und den Gesundheitsstatus der Fohlen. / Diarrhoea is probably one of the most common problems in equine neonates. Almost all foals develop transient diarrhoea within the first weeks of life. Different viral, bacterial and parasitic causes are discussed. Between the 5th and the 15th day of the foal’s life, when their dam’s first post partum (p.p.) oestrus is expected, diarrhoea in foals is observed quite often. That is why it’s called “foal heat diarrhoea”. In literature establishment of intestinal microflora and maturation of the intestinal mucosa is responsible for the occurrence of diarrhoea in this period of life. But little is known about the development of the intestinal microflora in foals. Many probiotics are authorised as gut flora stabilisers in animal nutrition. Some studies proved positive effects of Bacillus (B.) cereus var. toyoi (Toyocerin®) on intestinal health in other species e.g. calves, piglets, broiler chicken, poultry and growing rabbits. The present study deals with the question if a supplementation of B. cereus var. toyoi lead to a stabilisation of the developing intestinal microflora and therefore to a reduction of diarrhoea in foals. A total of 25 mares and foals of a thoroughbred stud were included into the study. Foals were born between February and May 2011. From birth, the foals were randomly assigned to three treatment groups: placebo group (10 ml isotonic saline solution, n=8), 50 mg Toyocerin group (5 x 108 cfu B. cereus var. toyoi solved in 10 ml isotonic saline solution, n=7) and 200 mg Toyocerin group (2 x 109 cfu B. cereus var. toyoi solved in 10 ml isotonic saline solution, n=10). Placebo- and treatment groups were orally supplemented once a day starting on the 1st through to the 58th day of life. Determination of heart and respiratory rate, body temperature, body weight was realised according to a standardised protocol. Within the first day of life, on day 9, 16, 23, 30, 44, 58 and on the first day of diarrhoea faecal samples has been taken from the rectum or by the use of a collection bag. Blood samples were taken via jugular venipuncture on day 1, 9, 16, 30, 58 and on the first day of diarrhoea. Culture-depend methods were used to analyse the bacterial microflora. Serum IgG was analysed by a competitive ELISA, IgG-anti-LPS from E. coli J5 and IgG-anti-PLC-from-C. perfringens-1a by an indirect ELISA. 88 % of the foals developed diarrhoea (placebo 7/8, 50 mg Toyocerin 5/7, 200 mg Toyocerin 10/10) with a high incidence between the 8th and the 16th day of the foal’s life. Meanwhile, foals remained bright and alert and continued to nurse. At the time point of the first p.p. oestrus in the mares, 59 % of their foals showed signs of diarrhoea. Within the remaining 41 % there are foals that had no diarrhoea but there are also foals which had diarrhoea when the mare had not been in heat. Neonatal diarrhoea in foals is not linked to p.p. oestrus in their mares. There was a tendency, that high serum-IgG (> 20 mg/ml) and IgG-anti-LPS from E. coli J5 (> 120 RE/ml) after colostrum uptake were associated with lower diarrhoea severity in the first 58 days of the foal’s life. C. perfringens and enterobacteria can be found equally in foals with diarrhoea and in foals which are not afflicted. B. cereus var. toyoi supplementation had no effect on faecal bacteria in foals, except on aerobic bacteria (p=0,012). In the first milk faeces aerobic bacteria were detected in median from 4,5 x 104 cfu/g (200 mg Toyocerin-group) to 5,0 x 105 cfu/g (50 mg Toyocerin-group) and anaerobic bacteria were detected in median from 2,4 x 105 cfu/g (200 mg Toyocerin-group) to 4,7 x 106 cfu/g (50 mg Toyocerin-group). Afterwards the counts increased towards the 3rd day of life and stayed on a high level till the 16th day of life. During this stagnation in 92 % of the foals a change in faecal consistency and diarrhoea was observed. Afterwards, from the 16th though to the 58th day of life, the bacteria counts in the faeces moderately decreased in median for the aerobic bacteria on the 58th day of life down to 3,8 x 105 cfu/g (placebo-group) till 2,9 x 106 cfu/g (200 mg Toyocerin-group). On the 58th day of life the counts of aerobic and anaerobic bacteria in the faeces of the placebo-group approached the counts in the faeces of the mare (measured at the time point of birth). In the first days of foals’ life detection of aerobic and anaerobic bacteria in the faeces were high, and above the level of the bacteria counts in the faeces of the mare at the time point of birth. Foal heat diarrhoea is observed as a part of the development and establishment of bacterial intestinal microflora. B. cereus var. toyoi had no effect on the percentage of foals with diarrhoea and health status in the foals at that point.

In den vorliegenden Studien wurde der Fragestellung nachgegangen, wie sich unterschiedliche Fütterungsprotokolle während der Aufzuchtperiode auf den peripartalen Energie- und Fettstoffwechsel und die Insulinsensitivität von Färsen auswirken. Besonderes Augenmerk lag dabei auf der Frage, ob der „Revised Quantitative Insulin Sensitivity Check Index“ (RQUICKI) bei Färsen sinnvoll angewendet werden kann, um eine Aussage hinsichtlich der Insulinsensitivität zu treffen. Auch mögliche Auswirkungen auf das Konzeptionsalter, den Kalbeverlauf, die Milchleistung und die postpartale Morbidität wurden untersucht. Aus 46 Kälbern der Rasse Deutsche Holstein wurden drei Fütterungsgruppen gebildet. Gruppe 1 (n = 18) wurde gemäß den Richtlinien der GfE energetisch optimal gefüttert (Kontrollgruppe), Gruppe 2 (n = 14) wurde intensiv und Gruppe 3 (n = 14) restriktiv gefüttert. Im Abstand von zwei Wochen wurden die Tiere jeweils gewogen. Aus den vorliegenden Daten wurde die durchschnittliche tägliche Körpermassezunahme berechnet. Außerdem wurde zehn, sechs, drei und eine Woche vor der Kalbung sowie zwei Wochen nach der Kalbung die Rückenfettdicke (RFD) sonografisch bestimmt. Weiterhin wurden das Alter bei erfolgreicher Konzeption, Kalbeverlauf sowie Daten der Kälber, Milchleistungsprüfungsdaten und Rastzeit erfasst. Vor und nach der Kalbung wurde aus der Vena caudalis mediana Blut entnommen. Aus dem Serum wurden die Konzentrationen der folgenden Parameter bestimmt: Insulin, Insulin-like growth factor 1 (IGF-1), Glukose, freie Fettsäuren (FFS), Bilirubin, Cholesterol, Harnstoff, Betahydroxybutyrat (BHB) sowie Gesamteiweiß. Erkrankungen im postpartalen Zeitraum, wie Endometritis, Mastitis, Stoffwechselstörungen, Erkrankungen des Bewegungsapparates sowie Zyklusstörungen wurden ebenfalls in die Studien miteinbezogen. Zur Bestimmung der Insulinsensitivität wurde das Rechenmodell „Revised Quantitative Insulin Sensitivity Check Index“ (RQUICKI) verwendet. Unter Einbeziehung der Serumkonzentrationen von Glukose, Insulin und FFS lautete die Formel RQUICKI = 1/[log (Glukose) + log (Insulin) + log (FFS)]. Ein niedriger Index-Wert bedeutet eine verminderte Insulinsensitivität. Die intensiv aufgezogenen Tiere der Gruppe 2 zeigten mit 13,3 ± 1,0 Monaten ein signifikant (p = 0,003) früheres Konzeptionsalter im Gegensatz zu den Tieren der beiden anderen Gruppen (Gruppe 1: 16,0 ± 1,5 Monate; Gruppe 3: 17,7 ± 1,4 Monate). Eine Woche ante partum wiesen die Tiere der Gruppe 2 eine signifikant (p = 0,022) höhere RFD auf als die Tiere der beiden anderen Gruppen. Der RQUICKI korrelierte eine Woche ante partum signifikant negativ mit der RFD (r = -0,573; p = 0,003). RQUICKI war bei den Tieren der Gruppe 2 eine Woche ante partum signifikant (p < 0,05) niedriger als bei den Tieren der anderen Gruppen. In allen drei Gruppen konnten am dritten Tag post partum die niedrigsten Index-Werte nachgewiesen werden. Aus den errechneten Index-Werten lässt sich für Färsen für die Zeitpunkte eine Woche ante partum sowie vier Wochen post partum ein Referenzbereich von RQUICKI = 0,40 ± 0,04 ableiten. Um den dritten Laktationstag liegt bei Färsen der Referenzbereich von RQUICKI = 0,34 ± 0,02. Die intensiv aufgezogenen Färsen zeigten insgesamt mit 85,7 % die höchste Anzahl an Komplikationen bei der Kalbung, der Unterschied war statistisch allerdings nicht zu sichern. Die unterschiedliche Fütterung wirkte sich weder auf das Geschlecht der Kälber noch auf deren Geburtsgewicht aus. Signifikante Unterschiede (p < 0,05) ergaben sich bei den Serumkonzentrationen von Insulin, IGF-1, FFS und Cholesterol ante partum sowie den Bilirubin- und FFS-Konzentrationen 28 Tage post partum. Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede bei den Konzentrationen von Glukose, Harnstoff, BHB und Totalprotein ermittelt werden (p > 0,05). Beim Vergleich der 305-Tage-Milchleistung wiesen die Tiere der Gruppe 2 die niedrigste Milchleistung auf. Eine signifikant (p = 0,039) höhere Inzidenz von postpartalen Zyklusstörungen war bei den Tieren der Gruppe 2 erkennbar. Eine Woche ante partum korrelierte RQUICKI signifikant negativ (r = -0,509, p = 0,008) mit dem Auftreten von Zyklusstörungen post partum. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass durch die Fütterungsintensität während der Aufzuchtperiode die Zuchtreife, der peripartale Energie- und Fettstoffwechsel einschließlich der Insulinsensitivität, die Milchleistung sowie die postpartale Fertilität beeinflusst werden. Aus der intensiven Aufzucht resultieren eine frühere Zuchtreife, höhere Rückenfettdicken, eine gesteigerte peripartale Lipolyse einschließlich reduzierter Insulinsensitivität, eine verminderte Milchleistung und eine schlechtere Fertilität. / The aim of these studies was to investigate how different diets during the rearing period influence peripartal energy and fat metabolism as well as insulin sensitivity of heifers. Special attention was paid to the question if the „Revised Quantitative Insulin Sensitivity Check Index“ (RQUICKI) could be used to estimate insulin sensitivity in heifers. Possible influences on age at first breeding, calving, milk yield and postpartal morbidity were analysed as well. Furthermore, the aim of this investigation was to prove, if different diets at rearing influence the peripartal insulin sensitivity of heifers. 46 German Holstein calves were randomly divided in three groups. Group 1 (n = 18) was fed with an optimal diet (control group) based on recommendations of the German Society of Nutrition Physiology, group 2 (n = 14) was fed with a highly-concentrated diet and group 3 (n = 14) got a low-concentrated diet. In intervals of two weeks the heifers were weighed. With the obtained data the averaged daily weight gain was computed. In addition, ten, six, three and one week ante partum as well as two weeks post partum the backfat thickness (BFT) was measured ultrasonographically. Age at first breeding, calving, data of the calves, milk yield and interval to first service post partum were recorded, too. Before and after calving blood samples were taken from the Vena caudalis mediana. The concentrations of the following parameters were measured in blood serum: Insulin, insulin-like growth factor 1 (IGF-1), glucose, free fatty acids (FFA), bilirubin, cholesterol, urea, betahydroxybutyrat (BHB) as well as total protein. Furthermore, postpartal diseases like endometritis, mastitis, metabolic disorders, limb diseases and fertility disorders were included. To determine insulin sensitivity a mathematic model called “Revised Quantitative Insulin Sensitivity Check Index” (RQUICKI) was used. Serum concentrations of glucose, insulin and FFA were included in the formula RQUICKI = 1/[log (glucose) + log (insulin) + log (FFA)]. A low index value represents a decreased insulin sensitivity. Intensive reared heifers of group 2 reached age at first breeding (13.3 ± 1.0 months) significant (p = 0.003) earlier than heifers of the other both groups (group 1: 16.6 ± 1.5 months; group 3: 17.7 ± 1.4 months). One week ante partum heifers of group 2 showed significant (p = 0.022) higher BFT than heifers of the other groups. At the same timepoint, RQUICKI correlated significant negative with the BFT (r = -0.573; p = 0.003). In heifers of group 2, RQUICKI was significant lower (p < 0.05) one week ante partum than in heifers of the other groups. In all groups, the index values were lowest three days post partum. Based on the received index values reference ranges for RQUICKI in heifers can be proposed. One week ante partum as well as four weeks post partum the reference range for RQUICKI can be defined as RQUICKI = 0.40 ± 0.04. Three days after calving the reference range can be defined as RQUICKI = 0.34 ± 0.02. The intensive reared heifers show with an overall of 85.7 % the most difficulties at calving, but this was statistically not different. The different diets didn’t influence neither the sex of the calves nor their birth weight. Ante partum, serum concentrations of Insulin, IGF-1, FFA and cholesterol differed significantly (p < 0.05) as well as serum concentrations of bilirubin and FFA differed on day 28 post partum. No significant differences could be determined in serum concentrations of glucose, urea, BHB and total protein (p > 0.05). Heifers of group 2 showed the lowest 305-day milk yield. The incidence of postpartal ovarian diseases was significantly (p = 0.039) higher in heifers of group 2. A significant negative correlation (r = -0.509, p = 0.008) existed between RQUICKI ante partum and the incidence of postpartal ovarian diseases. In conclusion, different diets during the rearing period influence age at first breeding, peripartal energy and fat metabolism including insulin sensitivity, milk yield as well as postpartal fertility. An intensive rearing results in an earlier age at first breeding, increased BFT, enhanced peripartal lipolysis as well as reduced insulin sensitivity, decreased milk yield and poorer fertility.