Das Ziel dieser Arbeit war zunächst in der Methodenoptimierung eines bereits grundlegend etablierten Protokolls zur Isolierung und Kultur equiner endometrialer Epithel (EEZ) und Stromazellen (ESZ) (BUSCHATZ 2007) zu sehen. Zudem wurde die Entwicklung weiterer Möglichkeiten des Handlings angestrebt (Passagierung, Kryokonservierung). So sollten den Zellen optimierte Rahmenbedingungen in vitro geboten werden, welche den Verhältnissen im Organismus weitgehend nahe kommen. Im Anschluss daran wurden die Zellen in vitro hinsichtlich ihrer morphologisch-funktionellen Charakteristika untersucht und die Befunde vergleichend zu den Gegebenheiten in situ betrachtet. Besonderes Augenmerk galt dabei der Expression von Progesteron- (PR) und Östrogenrezeptor-α (ERα) und von Inhibin-α. Wären vergleichbare Konstellationen in vitro und in vivo anzutreffen, könnte ein solches Kultursystem als Modell zum Studium interzellulärer Wechselwirkungen oder pathogenetischer Abläufe am Endometrium dienen. Voraussetzung hierfür wäre jedoch eine fortgeschrittene zelluläre Differenzierung, wie sie beispielsweise durch die Expression von Inhibin-α und der Steroidhormonrezeptoren angezeigt wird. Es wurden transzervikale Uterusbioptate und vollständige Uteri euthanasierter Stuten für die Zellaufreinigung sowie die vergleichende histologische Untersuchung gewonnen. Einer mechanischen und enzymatischen Dissoziation des Gewebes folgte die Separation beider Zellarten durch Filtration, Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz. Die Kultur erfolgte in wasserdampfgesättigter Raumluft bei 37 °C in 5 % CO2-Atmosphäre. Als Kulturmedium diente DMEM/Ham´s F-12 unter Zusatz von 2,5 % fötalem Kälberserums und diverser Additive. Es wurde eine morphologische Charakterisierung der Zellen während der Kultur vorgenommen und zudem ERα, PR und Inhibin-α an allen Kulturen und Gewebeproben immunhistologisch bestimmt. Das Ablösen der Zellen zur Passagierung erfolgte mit Trypsin-EDTA (ESZ) bzw. Alfazyme® (EEZ). Entsprechend abgelöste Zellen wurden zudem in DMSO-haltigem Nährmedium kryokonserviert. Die Kultivierung von EEZ und ESZ gelang sowohl bei Verwendung transzervikaler Uterusbioptate als auch bei Uteri euthanasierter Pferde. Zudem konnten alle physiologischerweise bei der Stute auftretenden Zyklusstände (Anöstrus, Interöstrus, Östrus) sowie ein gravider Uterus kultiviert werden. Die Konfluenz wird von EEZ nach 4 bis 16 d und von ESZ innerhalb von 7 bis 18 d erreicht, wobei Zellen aus ursprünglich proliferativen endometrialen Funktionszuständen tendenziell eher konfluent sind als sekretorisch aktive. Während der Kultur kann eine eindeutige morphologische Unterscheidung beider Zellarten voneinander erfolgen. ESZ besitzen eine spindelige, teils sternförmige, insgesamt „fibroblastenartige“ Gestalt. EEZ sind in zwei morphologischen Subtypen anzutreffen. Der monomorphe Zelltyp „A“ stellt kleine, polygonale Zellen mit regulären und regelmäßigen Zellgrenzen dar. Zelltyp „B“ ist größer, pleomorph, ebenfalls polygonal, mehrkernig und besitzt unregelmäßige, schlecht erkennbare Zellgrenzen. Subkultivierungen waren bis zu 20 (ESZ) bzw. 24 mal (EEZ) möglich. Zudem konnten beide Zellarten in flüssigem Stickstoff gelagert (kryokonserviert) und danach erfolgreich kultiviert werden. Weiterhin gelang der Nachweis von Inhibin-α im Uterus des Pferdes. Hierbei wurde eine zyklische Dynamik in der Expression festgestellt (stärkere Expression während der sekretorischen Phase), welche als Hinweis für eine sekretorische Differenzierung der EEZ anzusehen ist. Ebenfalls konnte dieses Protein in kultivierten EEZ und in viel geringerem Maße auch in den ESZ gefunden werden. Darüber hinaus war erstmalig der Nachweis von PR und ERα in beiden Zellarten in vitro möglich. Insgesamt ist die Expression dieser drei für uterines Gewebe essentiellen Rezeptoren/Proteine in kultivierten EEZ und ESZ als Hinweis für eine fortgeschrittene Differenzierung anzusehen, welche mit der vorgestellten Methode der Isolierung und Kultur auch erreicht werden konnte. Im Hinblick auf die Wachstumsgeschwindigkeit in vitro fanden sich zudem Hinweise auf eine Beibehaltung der ursprünglich im Gewebeverband erlangten zellulären Differenzierung, welche sich bei der Expression von ERα, PR bzw. Inhibin-α allerdings nicht nachvollziehen ließ. Abschließend betrachtet, deuten die vorliegenden Ergebnisse somit auf eine partielle Beibehaltung in situ erlangter endometrialer Funktionen und Spezifika hin, welche als Grundlage für weitere Arbeiten an endometrialen Zellkulturen des Pferdes anzusehen sind.

Cytokines play an important regulatory role during immune responses against pathogens. The outcome of an induced cytokine pattern is determined by many factors. It strongly depends on the nature of the pathogen and the host’s ability to control the quality and strength of cytokine signals. In pulmonary infection with Cryptococcus neoformans T helper (Th) 1 and Th17 cell subsets and their associated cytokines confer protection, whereas a Th2-biased response with production of interleukin (IL) -4 confers susceptibility. Since inappropriate Th responses often lead to death in immunosuppressed human patients, especially HIV-1 infected patients, this work aimed to elucidate mechanisms of Th2 induction and regulation by assessing the Th2 hallmark cytokine IL-4 in an experimental model of cryptococcosis. Therefore, a kinetic study of IL-4 expression during 70 days after intranasal infection was performed in susceptible mice. The analyses included characterization of pulmonary leukocytes and Th cell cytokine profiling. IL-4 profiling revealed Cryptococcus-specific IL-4 production not before six weeks after infection. This unexpected finding was further validated by equal results observed in a kinetic study done in IL-4 reporter mice. These mice express a green fluorescent protein simultaneously to IL-4 expression in the same cell and this protein can be detected by flow cytometry. Two cellular sources of IL-4 were identified: Th2 cells were found as expected, but also, as shown for the first time, eosinophilic granulocytes could be demonstrated to secrete IL-4. Next, the influence of eosinophils on pulmonary inflammation and disease development was investigated using ΔdblGATA-1 mice constitutively devoid of eosinophilic granulocytes. Experiments with infected ΔdblGATA-1 mice revealed novel regulatory functions of eosinophils in cryptococcosis. In the absence of eosinophils pulmonary Th cell recruitment was significantly diminished. In addition, Th2 polarization was reduced in ΔdblGATA-1 mice as shown by reduced numbers of Th2 cells expressing the Th2-related surface marker T1/ST2 and reduced albeit not absent IL-4 production by Th cells. In addition to reduced IL-4 production, in the absence of eosinophils Th cells with enhanced interferon-γ and IL-17 production were observed. However, control of pulmonary fungal growth was only slightly enhanced in the absence of eosinophils and dissemination of cryptococci to the brain was unaltered. This may be related to the shared IL-4 production by not only eosinophils but also Th2 cells. Blocking more than one cellular source of IL-4 could be required to prevent immunopathology. To test the hypothesis of gradual IL-4-dependent immunopathology, experiments were conducted using mice expressing only one allele of the IL-4receptor (R) alpha (α) chain (+/-) instead of two (+/+). Indeed, mono-allelic expression of the IL-4Rα resulted in an intermediate expression of the IL-4R on the surface of myeloid and lymphoid cells indicating a gene-dosage effect for IL-4R expression. Infected IL-4Rα+/- mice displayed reduced susceptibility as compared with IL-4Rα+/+ mice, and IL-4Rα-/- mice completely lacking IL-4R expression were found to be protected with survival for the complete time period of the experiment (i.e. up to 275 days). Reduced susceptibility found in infected IL-4Rα+/- mice was associated with decreased serum levels of immunoglobulin E, reduced mucus production by airway epithelia, attenuation of airway hyper-reactivity, and reduced formation of alternatively activated macrophages in lung parenchyma – pathophysiological features, which are typically found in experimental models of asthma but also in asthma of humans and animals. Since no up-regulation of IL-4R by the infection with Cryptococcus neoformans was found, the experimental pulmonary infection model used appears to be a very sensitive low-level IL-4 system. This work highlights the outstanding role of IL-4 and its different cellular sources as well as its receptor in cryptococcosis and provides novel insights into pathogenesis. Moreover, a cellular (i.e. eosinophils) and a molecular (i.e. IL-4R) target for treatment of this mycosis and possibly of asthma is provided.

Legeleistungseinbußen – vor allem mit verminderter Eischalenqualität – stellen in einem Legehennenbetrieb hohe wirtschaftliche Verluste dar. Impfungen gegen entsprechende Erreger, u.a. gegen das aviäre Metapneumovirus (aMPV), sind daher weit verbreitet. AMPV ist seit den 70er Jahren als Auslöser der Rhinotracheitis der Puten (Turkey Rhinotracheitis; TRT) und des sogenannten Swollen Head Syndroms (SHS) der Hühner bekannt. Jedoch liegen nur wenige epidemiologische Studien zu der Verbreitung des Virus und dessen Subtypen in Legehennenbetrieben vor. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Verbreitung des aMPV, vor allem der Subtypen A und B, zu unterschiedlichen Zeiten der Legeperiode zu untersuchen, um ein besseres Verständnis über den Zeitpunkt der Erstinfektionen sowie evtl. Re- oder Neuinfektionen zu erhalten. Dafür wurden erstmals 18 Legehennenherden in Sachsen alle drei Monate über die gesamte Legeperiode auf das Vorkommen von aMPV-RNA und aMPV-spezifischer Antikörper untersucht. Verschiedene Haltungssysteme wurden berücksichtigt, um ein unterschiedliches seuchenhygienisches Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können. Pro Herde wurden von je zehn Hühnern Trachealtupfer und Serumproben entnommen. Die Tupferproben wurden mittels duplex nested RT-PCR untersucht, die Serumproben mittels zweier kommerzieller ELISA-Tests. In jeder Herde gelang der aMPV-RNA-Nachweis mindestens einmal zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Bereits bei der Einstallung konnten in 17 Herden aMPV-spezifische Antikörper und/oder aMPV-RNA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen die hohe Verbreitungsrate des aMPV in Legehennenbetrieben. Bereits in der Aufzucht fand in der Mehrzahl der Herden eine aMPV-Infektion statt; während der Legeperiode kam es zu häufigen Re- oder Neuinfektionen bzw. zu einer langen Persistenz des Virus. Subtyp A kam alleine (51%) mehr als doppelt so häufig vor wie ausschließlich Subtyp B (22%). Doppelinfektionen mit den Subtypen A und B (27%) wurden ungefähr so häufig gefunden wie eine Infektion ausschließlich mit Subtyp B. Ein Wechsel der Subtypen A und B während einer Legeperiode wurde am häufigsten beobachtet: zehn der 18 Herden (56%) zeigten diesen Verlauf. Ausschließlich Subtyp A in allen positiven Entnahmen pro Betrieb wurde in vier von 18 Herden gefunden, ausschließlich Subtyp B in drei von 18 Herden, Subtyp A gemeinsam mit Subtyp B in einer von 18 Herden. Dies verdeutlicht die Dominanz des Subtyps A in Legehennenbetrieben. Obwohl drei Herden während der Aufzucht mit einer Subtyp B-Vakzine geimpft wurden, gelang der aMPV-RNA Nachweis in bis zu vier Probenentnahmen. Der Subtyp A dominierte auch in den geimpften Herden. Neben dem Subtyp B Feldvirus wurde in einer Herde zum Zeitpunkt der Einstallung auch ein Subtyp B ähnlich dem Impfstamm nachgewiesen. Es ist daher davon auszugehen, dass trotz bekannter Kreuzimmunität eine Impfung nicht vor Infektionen schützt, aber die Persistenz von Subtyp B vermindert. Die Analyse der Serumproben mit zwei kommerziellen ELISA-Tests ergab zum Teil konträre Ergebnisse. Da die Diagnose einer aMPV-Infektion häufig nur über diese Methode gestellt wird, ist dies von praktischer Relevanz. Eine Evaluierung des ELISA-Tests mit der höchsten Spezifität und Sensitivität sollte daher folgen.

Die derzeit angewendete Formalinbegasung von Bruteiern zur Keimreduktion stellt ein wichtiges Mittel zum Schutz des Verbrauchers vor dem Eintrag der Salmonellose aus der Geflügelindustrie in die Lebensmittelkette dar. Jedoch verlangt sein kanzerogenes Potenzial die Suche nach einer ebenso effektiven und einfach zu praktizierenden, aber weniger gesundheitlich bedenklichen alternativen Methode. In dieser Arbeit wurde die Eignung einer in ovo-Ozonbegasung zur Bruteidesinfektion hinsichtlich ihrer Auswirkung auf die Embryonalentwicklung untersucht. Dafür wurden befruchtete Eier vor ihrem Einsatz in den Brüter mit unterschiedlichen Ozonkonzentrationen zwischen 0,5% bis >5,0% (wt/ wt O3 in O2) bei einer relativen Luftfeuchte von 70% in einer Laborkammer begast. Die verwendeten Ozonkonzentrationen wurden dabei in drei Konzentrationsgruppen eingeteilt: hoch (2,8% bis 5,0%), mittel (1,1% bis 2,5%) und niedrig (0,5% bis 1,0%). Nach Erreichen der Zielkonzentration blieben die Eier für eine definierte Einwirkzeit (EWZ) zwischen 0 bis 24 h in der Kammer. Am Bruttag (BT) 18, 19 oder 20 wurden die Überlebensrate (ÜLR), Gewicht und Länge erhoben sowie histologische Untersuchungen der Organe Herz, Leber, Milz und Niere vorgenommen. Bei vier Versuchen erfolgte zusätzlich die Untersuchung am BT 6 und BT 12. Insgesamt wurden 13 Versuchsreihen mit Begasungen in der Laborkammer in den drei genannten Konzentrationsgruppen durchgeführt. Des Weiteren sollte die Übertragbarkeit der ermittelten Ergebnisse auf eine großtechnische Lösung, durch die Anwendung in einer projektintern entwickelten Prototyp-Kammer überprüft werden. Die Konzipierung dieses Prototyps folgte den technischen Gegebenheiten unter Einbeziehung der ermittelten Ergebnisse zur Embryotoxizität, zur Effektivität der Keimreduktion sowie der Veränderung der Eiinhaltsstoffe. Im Prototyp wurde daher die Begasungskonzentration von 0,7% Ozon bei einer EWZ von 2 h angewendet und in 2 Versuchsreihen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit und die morphologische Entwicklung getestet. Um zusätzlich eine Aussage treffen zu können, welche Wirkung eine hohe Ozonkonzentration bei der Applikation während der Bebrütung zur Folge hat, wurde in zwei weiteren Versuchsreihen jeweils am BT 3, 4 und 5 eine Ozondosis von 5,0% in Kombination mit 1 h EWZ appliziert. Nach der Entnahme der Embryonen am BT 6 bzw. BT 8 erfolgte die morphologische Untersuchung. Aus der vorliegenden Arbeit wird zusammenfassend geschlussfolgert:  Ozon besitzt einen dosisabhängigen Effekt auf die ÜLR: je höher die Dosis, desto geringer die Überlebensrate. Bei niedrigen Ozonkonzentrationen zwischen 0,5% und 1,0% kommt es zu ÜLR von 90% und 100%.  Die Einwirkzeit stellt einen wichtigen Einflussfaktor auf die Überlebensrate dar. Eine Kombination einer hohen Ozondosis mit langer EWZ hat eine höhere Embryomortalität zur Folge, als eine hohe Ozondosis ohne EWZ. Eine erhöhte Mortalitätsrate zeigt sich auch bei der Kombination einer mittleren Ozondosis mit einer langen EWZ. Keinen Einfluss zeigt sie bei der Kombination mit einer niedrigen Ozonkonzentration.  Ozonierte Embryonen zeigen dosisabhängig eine geringere Längen- oder Gewichtsentwicklung im Vergleich zur Kontrollgruppe. Signifikante Gewichts- und Längenunterschiede lagen nur vereinzelt bei der Begasung mit hoher Ozonkonzentration vor.  Pathohistologische Befunde an Organen, die mit einer Ozonbegasung in Zusammenhang gebracht werden können, konnten nicht erhoben werden.  Die Versuche zur Begasung während der Organogenese wiesen nicht auf ein teratogenes Potenzial von Ozon hin. Korrespondierend mit den Ergebnissen der Begasung am BT 0 zeigte sich ebenfalls eine deutliche Embryotoxizität.  Die Wirkung von Ozon folgt einem Alles-oder-Nichts-Prinzip: entweder die Schädigung ist so stark, dass es zu keiner Entwicklung mehr kommt, oder aber der überlebende Embryo bzw. Fetus zeigt ein phänotypisch normales Aussehen.  Mit den vorgestellten Untersuchungen konnte bewiesen werden, dass bei einer in ovo-Begasung von befruchteten Hühnereiern am Bruttag 0 mit einer niedrigen Ozonkonzentration von 0,5% bis 1,0% in Kombination mit einer mittleren und geringen EWZ keine teratogenen oder embryotoxischen Veränderungen zu erwarten sind.  Aus diesen Befunden ergibt sich ein unbedenklicher Einsatze von Ozon als alternative Methode zur Bruteidesinfektion. Die Voraussetzung dafür ist, dass die großtechnische Lösung die Anwendung von 1,0% Ozonkonzentration in Kombination mit 2 h EWZ ermöglicht, um eine sehr gute ÜLR, Entwicklung und eine 100%ige Inaktivierung des in Legehennenbeständen vorherrschenden Serovars Salmonella Enteritidis zu gewährleisten.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) werden bereits in klinischen Studien zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt. Über deren Wirkmechanismus und Verbleib nach Applikation ist jedoch noch wenig bekannt. Die in vivo-Nachverfolgung markierter MSC mittels Magnetresonanztomographie stellt eine mögliche Methode zur Erlangung weiterer Erkenntnisse dar. Zu diesem Zweck können die MSC mittels superparamagnetischen Eisenoxid (SPIO)-Partikeln markiert werden. In dieser Arbeit wurden 3 verschiedene SPIO-Produkte zur Markierung oviner und equiner MSC verwendet: Endorem™, Resovist® und Molday ION Rhodamine B™. Die Produkte wurden hinsichtlich ihrer Einflüsse auf die biologischen Eigenschaften der MSC, ihrer Markierungseffizienz und –selektivität verglichen. Desweiteren wurde die produktspezifische magnetresonanztomographische Nachverfolgbarkeit der SPIO-markierten MSC untersucht. Weiterführendes Ziel war die Selektion des am besten geeigneten SPIO-Produktes für die Verwendung in einem in vivo-Großtierversuch zur magnetresonanztomographischen Nachverfolgung SPIO-markierter MSC nach Applikation in arthrotische Gelenke. Die MSC wurden dazu aus dem Knochenmark von je 5 gesunden Schafen und Pferden isoliert, bis zur Passage 4 (P4) expandiert und schließlich mit den verschiedenen SPIO-Produkten markiert. Unmarkierte MSC der gleichen Tiere dienten zur Kontrolle. Proliferationsvermögen sowie tripotentes Differenzierungspotential wurden in vitro untersucht. Zur Evaluierung von Markierungsselektivität und -effizienz der SPIO-Produkte wurden die MSC ab der P4 bis zur P7 wöchentlich passagiert. Ein semiquantitatives histologisches Auswertungssystem basierend auf der Preußisch Blau-Färbung sowie T2*w-GRE-Sequenzen an einem 0,5T-MRT-System wurden zur Evaluierung genutzt. Markierungsselektivität bezeichnete die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der SPIO-Partikel. Markierungseffizienz beschrieb die Menge intrazellulär vorhandener SPIO-Partikel. Es wurde gezeigt, dass sich ovine und equine MSC mit allen 3 untersuchten SPIO-Produkten erfolgreich markieren ließen. Die Ergebnisse der in vitro-Untersuchungen ergaben keine Unterschiede zwischen SPIO-markierten und unmarkierten MSC hinsichtlich des Proliferationsvermögens, der adipogenen oder osteogenen Differenzierungsfähigkeit. Jedoch wurde eine deutliche Verminderung des chondrogenen Differenzierungspotentials SPIO-markierter MSC beobachtet, welche von der Menge intrazellulär vorhandener SPIO-Partikel und somit von der Markierungseffizienz abhängig war. Zum Zeitpunkt der initialen Markierung konnte nur Molday ION Rhodamine B™ eine selektive und effiziente Zellmarkierung gewährleisten. Mit Endorem™ konnte eine selektive, jedoch keine ausreichend effiziente Zellmarkierung erreicht werden. Resovist® dagegen bewirkte zwar eine effiziente, aber sehr unselektive initiale Zellmarkierung: Mittels Preußisch Blau-Färbung wurde gezeigt, dass große Mengen von SPIO-Partikeln nur extrazellulär anhefteten. Die 3 verschiedenen SPIO-Produkte führten weiterhin zu unterschiedlich starken hypointensen MRT-Signalen der markierten MSC, welche im Verlauf der 3-wöchigen Versuchsdauer bei allen 3 Produkten stetig abnahmen. Unmarkierte MSC waren isointens, also mittels MRT nicht darstellbar und daher nicht nachverfolgbar. Stets verursachten Resovist®-markierte MSC das stärkste hypointense MRT-Signal, gefolgt von Molday ION Rhodamine B™ und Endorem™. Resovist®-markierte MSC konnten mittels MRT bei beiden Spezies über den längsten Zeitraum nachverfolgt werden (ovine MSC bis 16 Tage, equine MSC bis 23 Tage nach Markierung). Aufgrund der exzellenten initialen Markierungseigenschaften (hohe Markierungsselektivität und –effizienz sowie gute Nachverfolgbarkeit) eignet sich Molday ION Rhodamine B™ besonders gut für die SPIO-Markierung von MSC zur Nachverfolgung mittels MRT. Molday ION Rhodamine B™ verspricht somit eine erfolgreiche Anwendung in einem in vivo-Versuch zur magnetresonsztomographischen Nachverfolgung von MSC nach Applikation in arthrotische Gelenke. / Mesenchymal stem cells (MSC) are already used in clinical studies for treatment of different diseases. However, their mechanism of action and fate after application are still not fully understood. In vivo tracking of labeled MSC via magnetic resonance imaging (MRI) is a possible method to achive further knowledge. For this purpose MSC can be labelled with superparamagnetic iron oxide (SPIO) particles. For this study 3 different SPIO products were employed for labelling of ovine and equine MSC: Endorem™, Resovist®,, and Molday ION Rhodamine B™. The products were compared in terms of their influence on biologic behaviour of the MSC, their labelling efficiency, and selectivity. Furthermore, product specific magnetic resonance traceability of SPIO labelled MSC was evaluated. Final aim was the selection of the most suitable SPIO product to be used in an in vivo large animal study employing MRI tracking of SPIO labelled MSC after application into osteoarthritic joints. MSC therefore, were isolated from bone marrow of each 5 healthy sheep and horses, expanded up to passage 4 (p4), and labelled by the different SPIO products. Unlabelled MSC from the same animals served as control. Proliferation potential and tripotent differentiation capacities were assessed in vitro. For evaluation of labelling selectivity and efficiency of the SPIO products MSC were passaged weekly from p4 up to p7. Semiquantitative histological scoring based on Prussian blue staining and images using T2*w GRE sequences in a 0.5T MRI system were used. Labelling selectivity describes the intra- or extracellular localisation of the SPIO particles. Labelling efficiency describes the amount of intracellular SPIO particles. It was shown that ovine and equine MSC could be successfully labelled by all 3 evaluated SPIO products. The results of the in vitro experiments did not show differences between labelled and unlabelled MSC in terms of proliferation potential, adipogenic or osteogenic differentiation capacities. However, an inhibited chondrogenic differentiation capacity of SPIO labelled MSC was observed, which was dependend on the amount of intracellular SPIO particles and therefore, also on labelling efficiency. At the time of initial labelling, only Molday ION Rhodamine B™ showed selective and efficient cell labelling. With Endorem™ selective, but not efficient cell labelling was achieved. Resovist®, in contrast, caused efficient but very unselective initial cell labelling: By Prussian blue staining it was shown that large amounts of SPIO particles were attached extracellularly. These 3 different SPIO products led to variable hypointense MRI signals of the labelled MSC which decreased in all 3 products during the 3 week study period. Unlabelled MSC were isointense, thus not visible, and therefore, not traceable using MRI. At every point of time, Resovist® labelled MSC resulted in the most hypointense MR signals, followed by Molday ION Rhodamine B™ and Endorem™. Resovist® labelled MSC were traced over the longest time span (ovine MSC until 16 days, equine MSC until 23 days post labelling). Due to excellent initial labelling properties (high labelling efficiency and selectivity, good traceability) Molday ION Rhodamine B™ suits best for SPIO labelling of MSC to be tracked by MRI. Molday ION Rhodamine B™ therefore, promises a successful use in an in vivo study using MRI for MSC tracking after application into osteoarthritic joints.

Die Zapfenphotorezeptoren (ZPR) sind verantwortlich für das Scharf- und Farbensehen. Ein totaler Funktionsverlust der ZPR, welcher beim Menschen zur Achromatopsie führt, hat eine Degeneration der ZPR zur Folge. Die pathologischen Vorgänge, die zur Degeneration der ZPR führen sind noch nicht restlos entschlüsselt worden. Zur Analyse der ZPR-Degeneration werden Tiermodelle genutzt, wobei bisher nur wenige Tiermodelle vorhanden sind. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung und Charakterisierung von Mausmodellen, die Mutationen in funktionell bedeutsamen Genen der ZPR tragen. Hierbei handelt es sich entweder um ein weiteres potentielles Kandidatengen für ZPR-Dystrophien, das SLC24A2 Gen, oder um das PDE6C Gen, welches als ursächlich für Achromatopsie identifiziert wurde. Die Tiere der verschiedenen Mauslinien wurden anhand ihrer Ohrkennung genotypisiert und für die verschiedenen molekularbiologischen Verfahren euthanasiert. Von den Augen wurde entweder das gesamte Auge, das eye cup, oder die Netzhaut weiterverarbeitet. Es wurde eine Methode zur Anrei¬cherung der ZPR mit fluorescence activated cell sorting (FACS) erarbeitet. Des Weiteren kamen Techniken auf der DNA-, RNA- und Protein- Ebene (PCR, RT-PCR, Klonieren, Western blot) sowie histologische und immunhistologische Techniken zur Anwendung. Die Tiere wurden in vivo mithilfe von bildgebenden Verfahren (Scanning Laser Ophthalmology (SLO)) untersucht und funktionell durch die Elektroretinographie (ERG) charakterisiert. Für diese Studie wurde die Cone-GFP (die grünes fluoreszierendes Protein in den ZPR produziert) Mauslinie zur Entwicklung der ZPR-Anreicherung eingesetzt und analysiert. Die slc24a2ENU-Maus¬mutante wurde extern hergestellt, wobei durch eine ENU-induzierte Mutagenese eine Punktmutation im slc24a2-Gen, welches für den NCKX2 Austauscher kodiert, an Position 1722 (c.1722g>t) gene¬riert wurde. Als weiteres Mausmodell wird die spontan aufgetretene Mausmutante cpfl1 (cone photo¬receptor function loss 1) untersucht, die zwei unterschiedliche Mutationen im pde6c-Gen besitzt. Durch Kreuzen dieser Mauslinien untereinander und mit der Trα -/- Mauslinie (knock-out Mutation der Stäbchen Transducin α-Untereinheit) wurden die Doppelmutanten Linien slc24a2ENUxCone-GFP, slc24a2ENUxTrα-/- und cpfl1xCone-GFP hergestellt und untersucht. Bei Cone-GFP Mäusen konnten ZPR mittels FACS angereichert und gezielt untersucht werden. In der angereicherten ZPR-Population wurde bei RT-PCR Analysen zum einen nur eine Spleißvariante des NCKX2-Austauschers detektiert, während bei RT-PCR Analysen von ganzen Augen mehrere Spleißvarianten des NCKX2-Austauschers gefunden wurden. Zum Zweiten wurden weitere Mitglie¬der der NCKX-Familie in der angereicherten ZPR-Population (NCKX-1, 4) detektiert. Bei der slc24a2ENU-Mausmutante konnte die Mutation im slc24a2-Gen sowohl auf DNA- als auch auf RNA- Ebene nachgewiesen werden, jedoch nicht auf Proteinebene. Sowohl bei morphologischen (SLO und Histologie) als auch funktionellen (ERG) Untersuchungen wurden keine Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutante in der Retina erkannt. Mithilfe der SLO wurde bei allen Tieren eine verlängerte Persistenz der arteria hyaloidea beobachtet. Das ERG war bei der slc24a2xTrα-/- Dop¬pelmutanten gegenüber der reinen Trα-/- ohne Veränderung. Bei den slc24a2ENUxCone GFP Mäusen und den reinen Cone-GFP Mäusen konnte im Alter von einem Jahr keine Amplitude mehr im ERG gemessen werden. Bei der SLO (bei beiden Doppelmutanten) wurden bei einigen Mäusen autofluo¬reszierende Punkte, so genannte „AF-dots“ beobachtet. Eine Ursache hierfür konnte nicht erbracht werden. Vergleichende genomische DNA-Untersuchungen von Intron 4 des pde6c Gens zwischen der cpfl1-Maus und dem Wildtyp C57Bl/6 zeigten bei der cpfl1-Maus eine im Vorfeld bereits auf RNA-Ebene beschriebene 116bp Insertion als Anteil einer 1522bp großen genomischen Insertion ist. Zusätzlich wurde eine 1bp Deletion im Exon 7 des pde6c Gens bei der cpfl1-Maus detektiert (c.1042delT). Beide Mutationen bedingen eine Verschiebung des Leserasters (frame shift), das wiederum zu einem verfrühten Stopcodon führt (p.E289fsX297 und p.L348fsX362). Vergleichende RT-PCR Untersu¬chungen der pde6c Transkripte zwischen der cpfl1-Maus mit ihrem Parentalstamm BALB/c erbrach¬ten, dass beide die 116bp Insertion tragen. Bei der ERG Untersuchung der cpfl1-Maus (im Alter von drei und sechs Wochen) konnte keine ZPR-Antwort registriert werden. Bei einer vergleichenden SLO-Verlaufsstudie (3., 4., 6. und 8. Lebenswoche) zwischen der Cone-GFP und der Doppelmutanten cpfl1xCone-GFP Maus zeigte sich, dass die Anzahl der ZPR zu Beginn der Studie gleich sind, im weiteren Verlauf bei der Doppelmutante immer stärker abnehmen und mit 8 Wochen nur noch im ventralen Bereich vorhanden sind. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Cone-GFP Maus ein potentiell sehr wichtiges Mausmodell werden kann, um weiterführende Grund-lagenforschung an ZPR zu ermöglichen. Zum einen können ZPR durch FACS angereichert werden und zum anderen ist eine eindeutige und einfache Darstellung der ZPR in vivo durch die SLO-Technik möglich. Jedoch ist es wichtig, den Untersuchungszeitpunkt innerhalb der ersten 2 Monate anzusetzen, da die ZPR der Cone-GFP Maus danach fortschreitend degenerieren. Aufgrund der RT-PCR Untersuchung der NCKX-Familie in der angereicherten ZPR-Population der Cone-GFP Maus konnten weitere Mitglieder der NCKX Austauscher Familie in den ZPR identifiziert werden, wodurch die Aussage, dass der NCKX2-Austauscher die einzige Möglichkeit darstellt, um Ca2+-Ionen aus dem Außensegment der ZPR zu schleusen, relativiert werden muss. Die Slc24a2ENU-Mausmutante zeigt keinen offensichtlichen degenerativen retinalen Phänotyp. Die einzige Besonderheit stellt die sporadisch auftretende persistierende Arteria hyaloidea dar. Der bei einigen doppelmutanten Tieren auftretende retinale Phänotyp, der „AF-dots“-Phänotyp, ist möglich¬erweise auf den Stammhintergrund (C3H) zurückzuführen. Weitere Untersuchungen sind zur Klärung dieser Frage notwendig. Die cpfl1-Maus ist das erste Modell für Achromatopsie, bei dem die Pathologie durch Mutationen im pde6c-Gen ausgelöst wird. Das cpfl1-Allel besitzt zwei unterschiedliche Mutationen, die beide zu einem verfrühten Abbruch der Proteinsynthese führen. Durch RNA-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die cpfl1-Maus sich nur in der 1 bp Deletion von dem Parentalstamm BALB/c unterscheidet. Jedoch scheinen beide Mutationen einen Anteil an der Herausbildung des Phänotyps der cpfl1-Maus zu haben. Im Rahmen der vergleichenden Verlaufsstudie mit Doppelmutanten cpfl1xCone-GFP wurde als pathologischer Vorgang eine Degeneration und keine Aplasie der ZPR nachgewiesen, da im Alter von 3 Wochen noch eine normale Anzahl an ZPR vorhanden ist.

In der vorliegenden Studie wurde an 109 Patienten mit einer Erkrankung des Fesselträgers retrospektiv untersucht, ob die intraläsionale Applikation von autologem thrombozyten-reichem Plasma (PRP) Vorteile gegenüber der intraläsionalen Applikation von xenogener azellulärer Matrix aus porziner Harnblasenmukosa (ACell Vet™ UBM Powder) besitzt. Die gesamten Daten zum Patientenmaterial entstammen einer großen, schwerpunktmäßig orthopädisch orientierten Pferdeklinik. In die Gruppe mit Thrombozyten angereichertem Plasma (PRP) wurden 75 Patienten aufgenommen. Es wurden 3 verschieden Methoden zur Herstellung von thrombozytenreichem Plasma verwendet. Als Vergleichsgruppe dienten 34 Patienten, welche mit einer xenogenen Therapieform (ACell™) am Fesselträger behandelt wurden. Initial wurden alle Patienten klinisch und ultrasonographisch untersucht, wobei bei allen Patienten ein frischer oder alter aufgefrischter/chronischer Schaden am Fesselträger dargestellt werden konnte. Die Wahl der Therapieform richtete sich nach der Einschätzung, der Präferenz und den Erfahrungen des jeweiligen behandelnden Tierarztes unter Berücksichtigung des finanziellen Aufwandes für die Patientenbesitzer. Alle Patienten wurden entweder mit PRP oder mit ACell™ behandelt und Boxenruhe in Verbindung mit einem steigernd aufgebauten Schritt- und Aufbautrainingsprogramm verordnet. Die Nachuntersuchungen zur Kontrolle des Heilungserfolges und -fortschrittes beinhalteten eine klinische Lahmheitsuntersuchung sowie eine ultrasonographische Untersuchung. Je nach klinischer und ultrasonographischer Entwicklung wurde das Bewegungsprogramm angepasst. Zum Abschluss der Studie konnte als Resultat festgestellt werden, dass 45 (60 %) Patienten der PRP Gruppe ihr ursprüngliches Leistungsniveau wieder erreicht hatten, 8 (10,7 %) Patienten konnten ihr ursprüngliches Leistungsniveau nicht wieder erreichen, 17 (22,7 %) Patienten erlitten ein Rezidiv und ein (1,3 %) Patient musste euthanasiert werden. Im Vergleich dazu erreichten 20 (58,8 %) Patienten der ACell™ Gruppe wieder ihr ur-sprüngliches Leistungsniveau, 5 (14,7 %) Patienten konnten ihr ursprüngliches Leistungs-niveau nicht wieder erreichen, 7 (20,6 %) erlitten ein Rezidiv und ein (2,9 %) Patient musste euthanasiert werden. Die Unterschiede im Resultat sind statistisch nicht signifikant. Ein statistisch signifikanter Unterschied (p= 0,05) ist allerdings bei der Dauer der Rehabilitationsphase zu beobachten. Im Durchschnitt benötigten erfolgreich therapierte PRP Patienten signifikant weniger Zeit bis zum Erreichen der vollen Belastbarkeit als erfolgreich therapierte ACell™ Patienten. PRP Patienten wurden durchschnittlich 15,6 Wochen im Schritt bewegt und erhielten 13,2 Wochen Aufbautraining, so dass sie im Durchschnitt nach 29,6 Wochen wieder ihre volle Belastbarkeit erreicht hatten. Erfolgreich therapierte ACell™ Patienten wurden durchschnittlich 20,2 Wochen im Schritt bewegt und erhielten im Anschluss im Durchschnitt 19,8 Wochen Aufbautraining, so dass sie im Durchschnitt nach 40,6 Wochen wieder ihre volle Belastbarkeit erreicht hatten. Es konnte gezeigt werden, dass die Rehabilitationsdauer bei mit thrombozytenreichem Plasma behandelten Fesselträgerschäden signifikant kürzer ist als bei mit ACell™ behandelten Fesselträgerschäden, obwohl sich das Resultat der Behandlung statistisch nicht wesentlich unterscheidet (p= 0,88). Die vielversprechenden Ergebnisse einiger ähnlich konzipierten Arbeiten konnten in der vorliegenden Studie mit keiner der angewandten Behandlungsform erreicht werden. Erwähnte Studien umfassten deutlich größere oder deutlich kleinere Patientengruppen und unterschieden sich hinsichtlich Rasse und Nutzung des Patientenmaterials sowie dem meist kürzeren Untersuchungszeitraum. Insofern erscheint einerseits eine derartige Studie aus praktischer Sicht sinnvoll und lohnenswert, andererseits zeigt sich auch der Bedarf an vergleichbaren, klinischen, praxisorientierten Arbeiten zur Evaluierung dieser Behandlungsmethoden.

Zusammenfassung Katja Schwartau Peripartale hämatologische und klinisch-chemische Blutuntersuchungen zur Frühdiagnostik der Dislocatio abomasi, Gebärparese, Retentio secundinarum und Mastitis bei Milchkühen Medizinische Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Mai 2011 Bibliographische Angaben 94 Seiten, 22 Abbildungen, 19 Tabellen, 210 Literaturangaben, Schlüsselwörter: Labmagenverlagerung, Gebärparese, Retentio secundinarum, Mastitis, Kuh Produktionskrankheiten haben in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen. Diese leistungsassoziierten Bestandserkrankungen tragen wesentlich zur kurzen Nutzungsdauer von ca. 2,5 Jahren der Milchkühe bei. Es ist deshalb besonders wichtig, ihre Prophylaxe einschließlich der Früherkennung in den Vordergrund zu stellen. In der vorliegenden Untersuchung wurden deshalb frühdiagnostische Möglichkeiten der LMV (Labmagenverlagerung), GP (Gebärparese), Retentio sec. (Retentio secundinarum) und Mastitis geprüft. Des Weiteren wurden die Kühe in einer Gruppe „krank“ und einer Gruppe „gesund“ gegenübergestellt, um durch Stoffwechselabweichungen generell subklinische Veränderungen zu erkennen, die Hinweise auf bevorstehende Erkrankungen geben. Besondere Beachtung fand für die Bewertung des Erkrankungsrisikos die odds ratio. In die Untersuchung wurden insgesamt 398 Schwarzbunte Kühe einbezogen. 49 Tiere waren an einer LMV, 121 Tiere an einer GP, 131 an einer Retentio sec. und 119 Tiere an einer Mastitis erkrankt. Im Gruppenvergleich gesund/krank wurden 347 erkrankte Kühe mit 51 klinisch gesunden Tieren verglichen. Es wurden bei allen Kühen 14-7 d a.p. (Tage ante partum) und 3 d p.p. (Tage post partum) Blutproben entnommen. Es wurden Parameter des Energie-, Fett- und Leberstoffwechsels (FFS [Freie Fettsäuren], BHB [ß-0H-Butyrat], Cholesterol, Glucose, Insulin, AST [Aspartat-Amino-Transferase], Bilirubin), des Eiweißstoffwechsels (Albumin, Haptoglobin, TP [Gesamt-Eiweiß], Harnstoff, Kreatinin) und der Leukozyten sowie des Mineralstoffwechsels (Na [Natrium], K [Kalium], Cl [Chlorid], Ca [Calcium], Pi [anorganisches Phosphat], AP [Alkalische Phosphatase]) und der CK [Creatinkinase] bestimmt und mit gesunden Kühen verglichen. 92 Auf das Risiko einer LMV weisen a.p. besonders Konzentrationssteigerungen des Haptoglobins hin. Aber auch die Mediane der Glucose und der AP liegen außerhalb des Referenzbereichs bei Tieren, die später an einer LMV erkranken. Drei d p.p. kommen signifikante Konzentrationsanstiege der FFS, des BHB und des Bilirubin sowie signifikante Konzentrationsabnahmen des Insulin (odds ratio 8,43) bis unter den Normbereich hinzu. Die Aktivitäten der AP und auch die Konzentrationen von Cholesterol und Ca bleiben ebenfalls unter dem Normbereich. Die Mediane der AST-Aktivität und der Haptoglobinkonzentration liegen oberhalb des Referenzbereichs. Auf das Risiko einer GP weisen a.p. und p.p die verminderte AP-Aktivität sowie Konzentrationsanstiege der FFS (odds ratio 1,78) hin. Drei d p.p ergänzen die Konzentrationen des BHB, des Bilirubins und des Haptoglobins (odds ratio 4,59) oberhalb der Referenzbereiche die Veränderungen. Der Median der Insulinkonzentration liegt 3 d p.p. unter dem Referenzbereich. Einer Retentio sec. gehen erhöhte Glucosekonzentrationen a.p. voraus. Der Median der AP-Aktivitäten liegt schon a.p. unter dem Normbereich. Drei d p.p. unterscheidet er sich signifikant von Kühen ohne Retentio sec. Hinweise auf Mastitiden liefern p.p. die Konzentrationen des BHB (odds ratio 1,78). Die Mediane der Glucosekonzentrationen liegen a.p. oberhalb und die der AP-Aktivitäten unterhalb der Referenzbereiche. Drei d p.p. kommen Steigerungen der Haptoglobin-, Glucose- und Bilirubinkonzentrationen sowie Aktivitätssteigerungen der AST bis über den Normbereich hinzu. Als Besonderheit liegen die Ca- und Pi-Konzentrationen aufgrund des geringeren Abflusses bei einer verminderten Milchleistung signifikant über denen der gesunden Kühe. Für die Entstehung postpartaler Erkrankungen generell verdienen die signifikanten Konzentrationssteigerungen der Glucose sowie die Abnahme der AP-Aktivität besondere Beachtung. Das BHB (odds ratio 1,92 a.p.) und die CK (odds ratio 2,17 a.p.) weisen auf ein erhöhtes Krankheitsrisiko hin. Drei d p.p. kommen zu den Veränderungen dieser Parameter noch signifikante Konzentrations- bzw. Aktivitätssteigerungen der FFS, des BHB, der CK, des Bilirubins, der AST und des Haptoglobins (odds ratio 4,61) sowie erniedrigte Ca-Konzentrationen hinzu. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass a.p. generell Abweichungen des Energiestoffwechsels und im Besonderen gesteigerte Glucosekonzentrationen sowie erniedrigte AP-Aktivitäten ein erhöhtes Risiko für postpartale Erkrankungen anzeigen. Höhere Aussagekraft besitzen Kontrollen am 3. d p.p. mit den Parametern Insulin (odds ratio 8,4), FFS, BHB und Haptoglobin (odds ratio 4,61), deren Konzentrationen gegenüber gesunden Kühen signifikant abweichen. Ähnlich gute Eignung zeigen, Bilirubin, AST und Ca.

Durch die Einführung der MRT-Untersuchung am stehenden sedierten Pferd ist deren Anzahl deutlich angestiegen. Hierbei stellen sich neue Fragen und Herausforderungen bezüglich der Einschätzung der Vielzahl an auftretenden Signalveränderungen. Es ergeben sich aber auch neue Möglichkeiten bezüglich der statistischen Auswertung von Befunden mit aussagekräftigen Fallzahlen. In dieser Studie sollte daher untersucht werden, wie Signalveränderungen statistisch verwendbar beschrieben und eingestuft werden können. Weiterhin sollte die Verteilung der Befunde insgesamt und bei der bilateralen Untersuchung der Vordergliedmaßen bestimmt werden. Mögliche Rückschlüsse auf deren klinische Bedeutung sollten gezogen werden. Hierzu wurden 120 bilaterale Niederfeld-MRT-Untersuchungen der Hufregion (240 Gliedmaßen) am stehenden Pferd durch zwei Tierärzte gesichtet und eine Befundbeschreibung mit einem Einstufungsschema (Grade 1-4) entsprechend dem vorgefundenen Spektrum an Signalveränderungen erstellt. Durch Anwendung und Zusammenfassung 66 wiederholte Diskussion der verschiedenen Kriterien im 1. Bewertungsdurchgang wurden die Beschreibungen und Grade auf Grundlage bestehender Literatur ausgearbeitet. In einem 2. Bewertungsdurchgang wurden die Strukturen eingestuft und die Ergebnisse statistisch ausgewertet. Hierbei wurden die generellen Häufigkeiten der Signalabweichungen erfasst und deren Zusammenhang zum Auftreten von unilateralen oder bilateralen Lahmheiten beachtet. Signalabweichungen am Strahlbein, der Tiefen Beugesehne und dem Hufgelenk standen deutlich im Vordergrund. Hierbei waren Strahlbeinveränderungen signifikant häufiger bei beidseitig lahmen Pferden zu finden, während Sehnenveränderungen deutlich häufiger bei einseitig lahmen Pferden vorgefunden wurden. Hufgelenkveränderungen wurden hingegen nicht signifikant vermehrt bei bilateralen oder unilateralen Lahmheiten festgestellt. Die Fesselbein-Strahlbein-Hufbeinbänder zeigten eine Häufung von Signalabweichungen bei lahmen Gliedmaßen, wobei diese vermehrt in Zusammenhang mit starken Veränderungen des Strahlbeins zu beobachten waren. Bei den übrigen Strukturen ließ sich kein statistisch aussagekräftiger Zusammenhang feststellen, da die Fallzahlen mit dem deutlichsten Befund an diesen Strukturen zu gering für eine Auswertung waren. Die entstandene Befundbeschreibung mit Einstufungsschema ermöglicht Vergleiche der MRT-Veränderungen z.B. mit klinischen Parametern. Signalabweichungen bestimmter Strukturen konnten statistisch eindeutig mit dem Auftreten und der Art der Lahmheit in Verbindung gebracht werden, während dies bei anderen Strukturen nicht möglich war. Hieraus ergeben sich Hinweise für die Einschätzung der Befunde und ihrer klinischen Relevanz. Insbesondere geringgradige Befunde sollten vorsichtig bewertet werden, da diese auch häufig bei nicht lahmen Gliedmaßen auftraten. Weitere statistische Vergleiche mit klinischen Parametern sind möglich und notwendig um das Krankheitsbild des „Equinen palmaren Fußsyndroms“ weiter zu untersuchen. / As a result of adopting MRI examinations for standing sedated horses their number has increased significantly. In this respect there are new questions and challenges being faced regarding estimating the huge number of occurring signal changes. New possibilities also arise regarding the statistical analysis of findings with convincing number of examined cases. In this study therefore it should be investigated how signal changes can be suitably described and classified statistically. Furthermore, the distribution of the findings as a whole and in the bilateral investigations of the forelimbs should be ascertained. Possible conclusions should be drawn regarding their clinical significance. Concerning this, 120 bilateral low-field-MRI examinations of the foot (240 limbs) on a standing horse were looked at by two veterinarians and a description of the analysis with a classification scheme (grades 1-4) corresponding to the existing spectrum of signal changes was compiled. By applying and repeatedly discussing the various Summary 68 criteria in the first evaluation round the descriptions and grades were worked out on the basis of existing literature. In a second evaluation round the structures were classified and the results statistically evaluated. In this regard the general frequency of signal deviations was recorded and its connection to the occurrence of unilateral or bilateral lameness was observed. Signal deviations at the navicular bone, deep digital flexor tendon and the coffin joint noticeably prevailed. In this respect changes to the navicular bone were found significantly more frequently in bilaterally lame horses while changes in tendons were found significantly more often in unilaterally lame horses. In contrast, changes in the coffin joint were not significantly more in bilateral or unilateral lameness. The collateral sesamoidean ligaments showed an accumulation of signal deviations at lame limbs, whereby this was observed more frequently in connection with pronounced changes of the navicular bone. In the remaining structures no statistically significant connection was found as the number of examined cases with the most significant results at these structures was too low for an evaluation. The related description of the findings with a classification scheme enables comparisons of MRI changes e.g. with clinical parameters. Signal deviations of certain structures were found to be clearly statistically associated with the occurrence and type of lameness, while this was not possible at other structures. This provides useful information for evaluating findings and their clinical relevance. Low-grade findings should be interpreted with caution since these also occurred frequently at non-lame limbs Further statistical comparisons with clinical parameters are possible and necessary in order to further examine the clinical picture of the equine palmar foot syndrome.

Beurteilung von nativen und aufgetauten Spermatozoen fertiler und subfertiler Hengste mit Hilfe der Phasenkontrast- und Transmissionselektronenmikroskopie. Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät, Universität Leipzig Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule Hannover In dieser Arbeit wurde die Ultrastruktur von nativen und tiefgefrorenen Spermien mittels Phasenkontrast- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Für die Beurteilung der Spermienmotilität und der Morphologie von in Formolzitrat fixierten Spermien standen jeweils drei Ejakulate von 50 Hannoveraner Hengsten des Niedersächsischen Landgestüts Celle zur Verfügung. Aus dieser Gruppe wurden drei fertile, drei subfertile Hengste und 6 Hengste mittlerer Fertilität ausgewählt, von denen sowohl die Nativ-Proben als auch eine Tiefgefrierprobe (TG-Probe) für die TEM im Institut für Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig gemäß des Standardprotokolls des Institutes aufbereitet wurden. Die Spermien wurden gewaschen und das Seminalplasma der nativen Proben oder der Verdünner der TG-Proben abpipettiert und durch eine 5%-ige Glutaraldehydlösung in einem 0,1 M Kakodylatpuffer (pH 7,2) ersetzt. Die Fixierungslösung wurde anschließend entfernt und das Pellet gewaschen und danach mit Gelatine gemischt. Die spermienreichen Stellen wurden aus der Gelatine herausgeschnitten und in Glutaraldehyd aufbewahrt. Nach einer Nachfixierung in OsO4 und einer Entwässerung in Ethanollösungen erfolgte eine Einbettung in einer Eponmischung. Nach einer Polymerisation von 5 Tagen wurden die eingebetteten Eponblöckchen angetrimmt und die Semi- und Ultradünnschnitte angefertigt. Die Ultradünnschnitte wurden auf ein Kupfergrid gelegt, mit Uranylazetat und Bleizitrat kontrastiert und mit dem Transmissionselektronenmikroskop (Zeiss EM 900, Oberkochem) bei 80 kV analysiert. In den nativen Proben wurden insgesamt 360 Spermien pro Hengst beurteilt, in den TG-Proben 120 Spermien pro Hengst. Die Qualität der elektronenmikroskopischen Aufnahmen war sehr gut, doch die Plasmamembran zeigte fixierungsbedingte Artefakte. Nach dem Auftauen waren die Bilder heller und der Kontrast etwas geringer. Es gab eine Zunahme an Akrosomdefekten, akrosomreagierten Spermien und Beschädigungen der Plasmamembran, der Mitochondrien, sowie der Mantel- und Ringfasern. Durch die Membranbeschädigungen trat auch eine Verringerung der Anzahl proximaler und distaler Zytoplasmatropfen auf. Sowohl geschwollene Akrosome mit einer niedrigeren Dichte der akrosomalen Matrix als auch Mitochondrien mit einer zu hellen mitochondrialen Matrix waren typische Befunde in den TG-Proben. Die Studie der Ultrastruktur und die wahrgenommenen Defekte führten zur Erstellung eines Standardprotokolls für die transmissionselektronenmikroskopische Beurteilung von Hengstspermien. Die Beurteilung mittels TEM sollte aber nicht zu einer quantitativen, sondern zu einer qualitativen Aussage führen. Sie ermöglicht die Diagnose von Kern- (Kerndeformationen und Taschenbildung im Kern) und Akrosomabweichungen (deformierte Akrosome mit oder ohne Vakuolenbildung, abgehobene Akrosome und akrosomreagierte Spermien), Anomalien der Mitochondrien (Unterbrechung der Mitochondrienscheide, zu viele Mitochondrien, anormale Dichte der mitochondrialen Matrix), Defekten des Axonemas (Ordnung oder Anzahl der Mikrotubuli, Mantel- und Ringfasern) und der Anwesenheit immaturer Spermienvorstufen. Diese Methode eignet sich für die Diagnostik subfertiler Hengste mit normalen Spermienparametern bei der routinemäßige Spermienbeurteilung und kann sowohl in nativen als auch in TG-Proben angewendet werden. Im Vergleich zur Phasenkontrastmikroskopie waren die elektronenmikroskopischen Bilder wegen ihrer stärkeren Vergrößerung und der Darstellung innerer Spermienstrukturen viel aussagekräftiger. Für die Beurteilung von Halsansatzdefekten, abweichende Geißelformen und Mehrfachmißbildungen ist die Phasenkontrastmikroskopie die am besten geeignete Methode. / Evaluation of fresh and frozen-thawed semen samples of fertile and subfertile stallions by light microscopy and transmission electron microscopy. Institut of Pathology of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule Hannover In this study the ultrastructure of fresh and frozen-thawed semen samples of 50 stallions from the National Stud of Lower Saxony (Celle, Germany) were evaluated by light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). Three ejaculates of each stallion were available for the motility analysis and the morphological analysis by lightmicroscopy after fixation in formol citrate. Based on the fertility data, the ejaculates of 12 stallions (3 fertile stallions, 3 subfertile stallions and 6 stallions of average fertility) were selected for the morphological analysis by TEM. The native samples and one frozen-thawed sample from these stallions were prepared for the TEM at the Institute of Pathology of the Faculty of Veterinary Medicine, Uni-versity of Leipzig. The sperm cells were washed and the seminal plasma from the native samples and the diluents of the frozen-thawed samples were replaced by a 5%-glutaraldehyde solution in a 0,1 M cacodylate buffer pH 7,2. The fixative was removed, the pellet was washed again and mixed with gelatin. The sperm rich fraction in the gelatin mass was excised and stored in glutaraldehyde. A second fixation in OsO4 was followed by a dehydratation in ethanol and a polymerization phase in epon. After 5 days of polymerization the starred samples were used for semi- and ultratight cuts. The latter were placed on a copper grid, contrasted with uranyl acetate and lead citrate and analyzed with the transmission electron micro-scope (EM 900) by 80 kV. In the fresh samples, 360 sperm cells were examined per stallion, whereas in the frozen-thawed samples only 120 sperm cells per stallion were evaluated. The microscopic pictures were of a high quality. However, the sperm plasma membrane showed some fixation artifacts. In the thawed samples a lower contrast was noticed than in the fresh samples. The sperm cells in the frozen-thawed samples showed an increase in acrosome defects, acrosome reactions, damage of the cell plasma membrane, mitochondria, fibrous sheet and outer dense fibers. The latter defect was associated with a decrease in proximal and distal cytoplasmatic droplets. Swollen acrosomes with a lower matrix density and a bright mitochondrial matrix were typically present in the cryopreserved samples. The ultrastructural defects in these samples, examined by TEM, have led to the development of a standard evaluation protocol with the most common sperm defects in stallion semen. TEM is an expensive and time consuming technique, which cannot be used to obtain quantitative results, but is considered as an accurate method for the qualitative examination of semen samples in cases of unexplained subfertility. TEM can especially be recommended for the diagnosis of nuclear (nuclear malformations and pouches) and acrosomal defects (acrosome deformations, acrosome vacuoles, detached acrosomes and acrosome reactions), mitochondrial (mitochondrial sheet defects, mitochondrial proliferation, decrease in mitochondrial matrix density) and axonema malformations (anormal position or quantity of microtubules and fibrous sheet or outer dense fibers defects) and the detection of immature sperm cells in ejaculates. The results of this study state that TEM can be useful for the evaluation of both fresh and frozen-thawed semen samples. Compared to the light microscopic evaluation of stallion sperm, the TEM images give more precise information because of their higher magnification rate and the ability to reveal internal sperm structures. However, light microscopy remains the best method to detect sperm neck defects, deformed tailes and sperm cells with multiple heads or tails.