Einleitung: Klauenerkrankungen und Lahmheiten stellen ein großes ökonomisches sowie tierschutzrelevantes Problem in der modernen Milchviehhaltung dar. Diese werden wesentlich durch die Haltung auf harten Böden wie Beton oder Gussasphalt begünstigt. Daher werden in Rinderställen vermehrt Gummi-Laufflächenbeläge eingebaut, welche die mechanischen Belastungen und somit potentielle Schädigungen der Klauen reduzieren sollen. Die Einwirkung von Kräften in Abhängigkeit unterschiedlicher Böden auf die Klauenfußungsfläche kann mittels Druckmessung untersucht werden. Um dabei den direkten kinetischen Einfluss des Bodens auf die Fußungsfläche ermitteln zu können, sind dünne Sensorfolien nötig. Ziele der Untersuchung: Ziel der Arbeit war es, zunächst ein Ex-vivo-Belastungsmodell für isolierte Rindergliedmaßen zu etablieren, um mit einem folienbasierten Druckmesssystem den direkten kinetischen Einfluss verschiedener Untergründe auf die Fußungsfläche der Klauen zu ermitteln. Anschließend sollte dieses Messsystem erstmals unter lebenden Rindern angewendet werden. Tiere, Material und Methoden: Insgesamt wurden drei Versuche durchgeführt, in denen die kinetischen Einflüsse von Betonboden sowie mindestens einem Gummiboden der Firma Gummiwerk KRAIBURG Elastik GmbH & Co. KG anhand folgender Parameter untersucht wurden: Kraftverteilung, Belastungsfläche sowie durchschnittlicher und maximaler Druck. Die Datenerfassung erfolgte mit dem Hoof™System (Tekscan®). Zunächst wurde ein Ex-vivo-Versuch mit einem speziell für diese Messung angefertigten Belastungsgerät durchgeführt. Damit wurden zwölf linke isolierte distale Hintergliedmaßen auf Betonboden sowie drei Laufgang-Gummimatten (KARERA P, KURA P und profiKURA P) belastet. Außerdem wurde in diesem Versuch neben den oben aufgeführten Parametern zusätzlich die Kraft- und Druckverteilung innerhalb definierter Bereiche unter der Klaue analysiert. Diese Versuchsanordnung wurde anschließend in einen statischen In-vivo-Versuch mit elf auf Beton und KURA P Gummiboden stehenden, adulten Milchkühen überführt. Außerdem wurden die Sensorfolien in einem zweiten In-vivo-Versuch unter den Klauen der linken Hintergliedmaße von zehn adulten Milchkühen angebracht und die kinetischen Einflüsse von Beton und KURA P Gummiboden im Stand und beim Laufen ermittelt. Die statistischen Vergleiche zwischen den Böden wurden gepaart für die Klauen bzw. Kühe sowie zwischen den Versuchen mittels Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test mit anschließender Post-Hoc-Korrektur nach Bonferroni-Holm berechnet. Für alle Resultate mit einer Wahrscheinlichkeit von p < 0,05 wurde eine statistische Signifikanz angenommen. Zusätzlich wurden im Laufen die Kraft-Zeit-Kurven einzeln für die laterale und mediale Klaue aufgezeichnet. Ergebnisse: In allen Versuchen sowie auf allen untersuchten Böden lastete die Kraft signifikant mehr auf den lateralen als auf den medialen Klauen. Die belastete Fläche war auf allen Gummiböden signifikant größer als auf Betonboden. Dadurch zeigten sich auf allen Gummiböden signifikant geringere Druckbelastungen als auf Betonboden: Der durchschnittliche Druck fiel im Ex-vivo-Versuch auf allen untersuchten Gummiböden im Mittel 34 - 44 % geringer aus als auf Betonboden (44,69 ± 5,39 N/cm²), während die Durchschnittsdruckwerte in den In-vivo-Versuchen auf KURA P-Gummiboden im Mittel um 16 - 21 % geringer waren als auf Beton (statisch: 32,05 ± 4,56 N/cm² bis 35,74 ± 7,66 N/cm², dynamisch: 46,60 ± 13,94 N/cm² bis 55,60 ± 9,78 N/cm²). Der auf die Klauen wirkende Maximaldruck war im Ex-vivo-Versuch auf den getesteten Gummiböden im Mittel 33 - 45 % geringer als auf Beton (130,31 ± 23,29 N/cm²) und in den In-vivo-Versuchen auf KURA P-Gummiboden im Mittel 28 - 32 % geringer als auf dem Betonboden (statisch: 92,12 ± 8,83 N/cm² bis 104,79 ± 20,40 N/cm², dynamisch: 158,47 ± 37,66 N/cm²). Die Kraft-Zeit-Kurven des dynamischen In-vivo-Versuchs zeigten weitgehend biphasische Verläufe mit lokalen Maxima bei 29 % und 79 % der Stützphase. Es traten jedoch interindividuell sowie jeweils zwischen lateralen und medialen Klauen deutliche Unterschiede im Kurvenverlauf auf. Schlussfolgerungen: Das Hoof™System konnte erfolgreich bei Rindern eingesetzt werden. Mit dem Belastungsgerät konnten standardisierte Messwiederholungen auf verschiedenen Untergründen durchgeführt werden. Künftig können damit weitere Untergründe sowie neue Klauenpflegetechniken zunächst ex vivo evaluiert werden, bevor sie an lebenden Rindern Anwendung finden. In allen Versuchen war auf Gummiboden eine mechanische Entlastung der Klauenfußungsfläche zu verzeichnen, was die Vermutung nahelegt, dass diese Böden einen Beitrag zur nachhaltigen Verbesserung der Klauengesundheit in der konventionellen Milchviehhaltung leisten können. / Introduction: Claw lesions and lameness are amongst the major problems in modern dairy husbandry. They are mainly caused by keeping the cows on hard, unyielding floors like concrete or mastic asphalt. Therefore preventively, an increasing number of farmers install rubber floorings in the walking alleys to minimize the mechanical stress to the sole and consequently reduce damage of the claws. The kinetic effect of different flooring types to the sole can be analyzed by means of pressure measurement. In order to detect the direct kinetic impact of the tested flooring, thin sensor foils capturing the interactions between claw and floor are required. Aims of the study: In the present study, an ex vivo load applicator was to be developed in order to use a foil-based pressure measurement system to determine the direct kinetic effect of different flooring types on the claws’ soles. Furthermore, this system was to be applied to live dairy cows for the first time. Materials and Methods: Three trials were conducted in which the kinetic effects of concrete and at least one rubber flooring (Gummiwerk KRAIBURG Elastik GmbH & Co. KG) were analyzed considering the following parameters: force balance, contact area, mean pressure and maximum pressure. Data acquisition was performed with the Tekscan® Hoof™System. Initially, an ex vivo trial was carried out with a purpose-built load applicator. Using this method, twelve left isolated distal hind limbs were loaded on concrete and three rubber floorings (KARERA P, KURA P and profiKURA P). Beside the parameters mentioned above, force and pressure distribution were analyzed within the separate areas of the claw’s sole. Afterwards, this test setting was transposed into a static in vivo trial with eleven adult dairy cows standing on concrete and KURA P rubber mats, respectively. Subsequently, the sensor foils were attached under the left hind limbs of ten adult dairy cows and the kinetic impacts of concrete and KURA P rubber flooring were determined during standing and walking. Statistical analysis was conducted using the Wilcoxon signed-rank test in combination with Holm-Bonferroni post hoc correction. Differences were considered to be significant at p < 0.05. In addition to the parameters mentioned above, force-time-curves of the walking cows were captured separately for the lateral and medial claw. Results: In all trials and on all tested floorings load was distributed unevenly between the claws at the expense of the lateral claw. The contact area was larger on all rubber floorings than on concrete. Therefore, the mean and maximum pressure loads were lower on all rubber floorings compared to concrete: In the ex vivo trial the mean pressure was, on average, 34 - 44 % lower on all rubber floorings than on concrete (44.69 ± 5.39 N/cm²), while in the in vivo measures the mean pressure was, on average, 16 - 21 % lower on KURA P rubber flooring compared to concrete (static: between 32.05 ± 4.56 N/cm² and 35.74 ± 7.66 N/cm², dynamic: between 46.60 ± 13.94 N/cm² and 55.60 ± 9.78 N/cm²). The maximum pressure loads in the ex vivo measures were, on average, 33 - 45 % lower on the tested rubber floorings than on concrete (130.31 ± 23.29 N/cm²) and in the in vivo trials, on average, 28 - 32 % lower on KURA P rubber flooring compared to concrete (static: between 92.12 ± 8.83 N/cm² and 104.79 ± 20.40 N/cm², dynamic: 158.47 ± 37.66 N/cm²). The force-time-curves of the dynamic in vivo study essentially showed biphasic curve progression with local peaks at 29 and 79 % of the stance phase. However, considerable differences in the curve progression between individuals as well as between the respective lateral and medial claw were found. Conclusions: The Hoof™System was applied successfully in dairy cattle claws for the first time. With the load applicator standardized repeated measurements on different floorings were conducted. In the future, more flooring systems as well as novel claw trimming methods can be evaluated using this setup before they are applied on live cattle. In all trials, a mechanical relief for the sole on the rubber floorings was determined. This leads to the conclusion that these floorings may contribute to a sustainable improvement of claw health in conventional dairy husbandry.

Zusammenfassung Ulrike Jörn Untersuchung des Glukose-, Harnstoff- und Kreatiningehalts in der Tränenflüssigkeit bei Katzen mit normalen und erhöhten Blutplasmawerten Klinik für Kleintiere der Veterinärmedizinischen Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Februar 2018, verteidigt im Oktober 2018 73 Seiten, 13 Abbildungen, 20 Tabellen, 208 Literaturangaben Die Entnahme von Tränenflüssigkeit und Untersuchung von klinisch relevanten Metaboliten ist derzeit ein hochinteressantes Forschungsthema in der Diabetesforschung beim Menschen. Auch für die Tiermedizin ist dieses schnelle und einfache Verfahren relevant und könnte Blutuntersuchungen ergänzen, reduzieren oder sogar ersetzen. Aufgrund der Minimalinvasivität eignet sich die Tränenanalyse insbesondere bei der stressempfindlichen Katze und trägt so zum Tierwohl bei. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt gibt es keine Untersuchungen der Glukosekonzentration bei der Katze. Die derzeit vorliegenden Untersuchungen beinhalten die semiquantitative Untersuchung der Harnstoffkonzentration bei Hunden und Katzen und die quantitative Untersuchung der Harnstoff- und Kreatininkonzentration beim Pferd. Ziele dieser Arbeit waren (1) die Bestimmung eines geeignetes Material für eine praktikable Tränenentnahme und (2) die quantitative Analyse der Metaboliten Glukose, Harnstoff und Kreatinin in der Tränenflüssigkeit von Katzen mit normalen und erhöhten Blutplasmakonzentrationen. Dazu wurden zunächst an einer kleineren Anzahl an Tieren (n=13) die Materialien Kapillare, Filterpapierstreifen und Polyurethanschwamm auf die Kriterien Handhabung, Verletzungsgefahr, Flüssigkeitsaufnahme und -abgabe und Entnahmezeit getestet. Im Anschluss wurde aufgrund der Praktikabilität der Polyurethanschwämme die quantitative Analyse bei 60, 72 und 48 Katzen durchgeführt. In der statistischen Untersuchung wurde kein signifikanter Unterschied für Glukose und Harnstoff zwischen beiden Augen bestimmt. Die lakrimale Glukosekonzentration konnte bei 60 Katzen erfasst werden und lag mit 16 % deutlich unter der Glukosekonzentration des Blutplasmas. Es wurde eine moderate Korrelation zwischen Tränenflüssigkeit und Blutplasma gefunden (r=0,743; p<0,001). Bei einem Cut-Off-Wert von 1,6 mmol/l waren Sensitivität und Spezifität 90 % und 81%. Harnstoff konnte bei 72 Katzen in der Tränenflüssigkeit bestimmt werden und lag mit 7 % etwas über der Glukosekonzentration des Blutplasmas. Es wurde eine starke Korrelation zwischen Tränenflüssigkeit und Blutplasma nachgewiesen (r=0,971; p<0,0001). Bei einem Cut-Off-Wert von 14,35 mmol/l lagen Sensitivität und Spezifität bei 100 %. Die Ergebnisse der lakrimalen Kreatininbestimmung (n=48) konnten nur deskriptiv beschrieben werden, da viele Tiere Konzentrationen unter der gerätespezifischen Nachweisgrenze von 18 µmol hatten. Die Konzentrationen in der Tränenflüssigkeit bei Katzen mit normalen und erhöhten Blutplasmawerten lagen dabei deutlich unter der Konzentration des Blutplasmas. Diese Arbeit zeigt, dass die Entnahme, Verarbeitung und Analyse von den Metaboliten Glukose, Harnstoff und Kreatinin in der Tränenflüssigkeit möglich ist. Die vorliegenden Ergebnisse der quantitativen Studie sind trotz Limitationen ein wichtiger Beitrag für die Etablierung neuer minimalinvasiver Verfahren durch Nutzung der Tränenflüssigkeit zur Diagnostik bei der Katze.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 4 2.1 Aufbau und Funktion des Tränenfilmes 4 2.2 Übertritt von Metaboliten in die Tränenflüssigkeit 5 2.2.1 Permeabilität von Kornea und Konjunktiva 5 2.2.1.1 Aufbau und Funktion der Kornea 6 2.2.1.2 Aufbau und Funktion der Konjunktiva 6 2.2.1.3 Zusätzliche Permeabilitätsfaktoren 7 2.2.2 Übertritt von Glukose in die Tränenflüssigkeit 8 2.2.2.1 Untersuchung der lakrimalen Glukosekonzentration 8 2.2.2.2 Transportsysteme für Glukose 10 2.2.2.3 Veränderungen von Kornea und Konjunktiva bei Diabetes mellitus 11 2.2.2.4 Anwendung der lakrimalen Glukosemessung in Human- und Tiermedizin 13 2.2.3 Übertritt von Harnstoff in die Tränenflüssigkeit 14 2.2.3.1 Untersuchung der lakrimalen Harnstoffkonzentration 14 2.2.3.2 Transportsysteme für Harnstoff 15 2.2.4 Übertritt von Kreatinin in die Tränenflüssigkeit 17 2.2.4.1 Untersuchung der lakrimalen Kreatininkonzentration 17 2.2.4.2 Metabolismus des Kreatinins 18 2.2.4.3 Sekretion von Kreatinin durch Transportsysteme (OCTS, MATE, MDR1) 19 2.2.5 Veränderungen der Kornea und Konjunktiva bei Niereninsuffizienz 20 2.2.6 Vergleich der Metabolitkonzentrationen in beiden Augen 21 2.3 Methodische Verfahren zur Entnahme von Tränenflüssigkeit 21 2.3.1 Tränenentnahme mit Kapillaren 21 2.3.2 Tränenentnahme mit Filterpapierstreifen 22 2.3.3 Tränenentnahme mit Polyurethantupfer, Zelluloseacetat und Polyesterkegel 23 2.3.4 Experimentelle Materialuntersuchungen zum Aufnahme- und Abgabeverhalten 24 3 Material und Methoden 26 3.1 Testmaterialien zur Tränenentnahme 26 3.2 In-vitro-Vorversuche 26 3.2.1 Untersuchung der Flüssigkeitsaufnahme der Materialien 26 3.2.2 Untersuchung der Flüssigkeitsabgabe der Materialien 27 3.3 In-vivo-Studien 29 3.3.1 Untersuchte Katzen 29 3.3.2 Durchführung der In-vivo-Versuche 30 3.4 Statistische Analysen 35 4 Ergebnisse 37 4.1 In-vitro-Versuche 37 4.1.1 Untersuchung der Flüssigkeitsaufnahme der Materialien 37 4.1.2 Untersuchung der Flüssigkeitsabgabe der Materialien 37 4.2 In-vivo-Studien 39 4.2.1 Vergleich der verschiedenen Materialien an der Katze 39 4.2.2 Quantitative Bestimmung der Glukosekonzentration 40 4.2.2.1 Vergleich der Tränenkonzentrationen untereinander 41 4.2.2.2 Vergleich der Tränenkonzentration mit dem Blutplasma 44 4.2.3 Quantitative Bestimmung der Harnstoffkonzentration 47 4.2.3.1 Vergleich der Tränenkonzentrationen untereinander 48 4.2.3.2 Vergleich der Tränenkonzentrationen mit dem Blutplasma 50 4.2.4 Quantitative Bestimmung der Kreatininkonzentration 53 5 Diskussion 56 5.1 In-vitro-Versuche 56 5.2 In-vivo-Versuche 56 5.2.1 Anwendung der verschiedenen Testmaterialien an der Katze 56 5.2.1.1 Handhabung der Probenentnahme 57 5.2.1.2 Entnahmezeit und Volumen 58 5.2.2 Quantitative Bestimmung der Glukosekonzentration 59 5.2.3 Quantitative Bestimmung der Harnstoffkonzentration 63 5.2.4 Quantitative Bestimmung der Kreatininkonzentration 65 5.3 Klinische Relevanz dieser Untersuchungen 67 6 Zusammenfassung 70 7 Summary 72 8 Literaturverzeichnis 74

Der Riss des vorderen Kreuzbandes ist die häufigste Lahmheitsursache der Hintergliedmaße beim Hund. In der Literatur werden verschiedene Operations-methoden zur Therapie des Kreuzbandrisses beschrieben. Ein dynamisches Verfah-ren stellt hierbei die TTA (Tibial Tuberosity Advancement) dar. Bei dieser Operation wird die Crista tibiae kranial verlagert, um einen Patellarsehnenwinkel (PTA) von 90° zum Tibiaplateau zu erreichen. In in vitro Untersuchungen konnte damit eine Aufhebung der kranio-kaudalen Scherkräfte, welche bei einem kreuzbandinsuffizienten Kniegelenk vorliegen, erreicht und die Stabilität des Kniegelenkes nach TTA wieder hergestellt werden. Ungeachtet dessen bestehen Hinweise auf eine persistierende Instabilität in vivo. Anhand der fluoroskopischen Kinematografie erfolgte eine Bewegungsanalyse der Kniegelenke von Hunden in vivo nach klassischer TTA sowie TTA-2. Zudem wurden mögliche Einflussfaktoren hinsichtlich des Erfolges der TTA-Technik untersucht. Die Arbeit ist in zwei Studien unterteilt. In der 1. Studie erfolgte die retrospektive Untersuchung von 10 Hundekniegelenken nach traditioneller TTA. Im Gegensatz dazu bezog sich die prospektive Studie 2 auf Kniegelenke nach einer TTA-2 Operation (n = 15). Die Hunde wurden orthopädisch untersucht und wiesen praeoperativ einen kompletten kranialen Kreuzbandriss auf. In der Arthroskopie bestätigte sich der komplette Riss und es erfolgte eine Untersuchung der Menisken, gegebenenfalls mit anschließender Meniskuschirurgie. In beiden Studien wurden die Hunde unilateral und uniplanar fluoroskopisch-kinematografisch untersucht, während sie im Schritt auf einem Laufband geführt wurden. Je Patient erfolgte eine Ganganalyse prae- und eine weitere 6-8 Wochen post operationem. Die Röntgenvideoaufnahmen wurden visuell von drei verschiedenen Untersuchern auf das Vorliegen einer kranio-kaudalen Translation beurteilt. Weiterhin wurden von allen Tieren der prae- und postoperative PTA sowie der Extensionswinkel bestimmt. Da ein aus der Literatur bekannter möglicher Einflussfaktor eine Unterkorrektur (PTA > 90°, zu kleine Cage-Größe) ist, wurde in der Studie 2 bei der Operationsplanung auf das Erreichen eines PTA ≤ 90° geachtet. In Studie 1 lag das mittlere Alter der Patienten bei 4,7 Jahren und das Gewicht bei 27,3 kg. Bei der arthroskopischen Untersuchung wiesen vier Gelenke Meniskusläsionen auf. Die postoperative Ganganalyse zeigte bei 90 % (9 von 10) eine persistierende Instabilität nach TTA, wobei der mittlere PTA 92,4° betrug. In der Studie 2 hatten die Tiere ein mittleres Alter von 7,0 Jahren und ein Gewicht von 31,2 kg. Bei der Mehrzahl der Patienten (n = 11) konnte ein Meniskusschaden diagnostiziert werden, wobei hauptsächlich mediale Korbhenkelrisse eine Rolle spielten. Die fluoroskopische Kinematografie zeigte bei 73,3 % der Patienten eine bestehende Instabilität nach TTA-2. Der mittlere PTA lag bei 88,5°. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der in vitro Untersuchungen ist die überwiegende Anzahl der Kniegelenke nach Versorgung eines kranialen Kreuzbandrisses mit TTA bzw. TTA-2 persistierend instabil. Ungeachtet dessen wiesen alle Patienten eine klinische Verbesserung der Lahmheit auf. Während die Er-gebnisse der Studie 1 noch eine Unterkorrektur (postoperativer PTA > 90°) als mögliche Ursache für die Kniegelenksinstabilität nahelegen, konnte dies im Rahmen der Studie 2 wiederlegt werden. Inwieweit die Menisken als stabilisierender Faktor eine Rolle spielen, kann anhand der vorliegenden Arbeit nicht eindeutig geklärt werden. / Cranial cruciate ligament ruptures are the most common cause of hind limb lameness in dogs. Various surgical therapeutical methods are described in the literature to successful cure the cranial cruciate ligament rupture. Amongst those the dynamic technique TTA (tibial tuberosity advancement) is described. During this procedure, the Crista tibiae is shifted cranially to produce a patellar tendon angle (PTA) of 90°. It has been shown during in vitro studies that cranio-caudal shear forces that occur after cranial cruciate ligament rupture are clearly neutralized. This results in a completely stable stifle after TTA. However, evidence for persistent instabilities after TTA exist in vivo. Fluoroscopic gait analysis of the canine stifle in vivo after treatment with classical TTA and TTA-2 was performed. Furthermore, potential factors influencing a successful outcome of the TTA-technique were examined. This study is subdivided in two parts. During the 1st study a retrospective analysis of 10 canine stifles after classical TTA was undertaken, while the 2nd study was performed prospectively on stifles treated with a TTA-2 (n = 15). The dogs were examined orthopedically prior to surgery and suffered from a complete cranial cruciate ligament rupture. This was confirmed by arthroscopy which was further used to evaluate the meniscal status and to perform a meniscal surgery, if necessary. Fluoroscopic-kinematographic gait analyses were carried out prior to and 6-8 weeks after TTA by unilateral and uniplanar recording on all dogs while they were walking on a treadmill. The video sequences were analysed regarding the presence or absence of cranio-caudal movement by three independent investigators. Moreover, the pre- and post-surgical PTA and stifle angle were recorded. According to the literature undercorrected stifles (PTA > 90°, inappropriate small cage size) were identified as a possible cause of post-surgical instability. Therefore, special emphasis paid on surgical planning during study 2 to achieve a PTA ≤ 90° by TTA-2. The mean age of the patients in the 1st study was 4.7 years and their mean body weight 27.3 kg. Four joints showed meniscal lesions during the arthroscopic examination. During fluoroscopic gait analysis a persistent instability after TTA was present in 90 % (9 of 10) of the stifles. The median PTA was 92.4°. In the 2nd study the mean body weight was 31.2 kg and the mean age 7.0 years. Meniscal injuries were diagnosed in the majority of the patients (n = 11). Most of them were suffering from medial bucket handle tears. After performing TTA-2 73.3 % of the stifles showed a persistent instability during the fluoroscopic gait analysis. The mean PTA was 88.5°. Contrary to the results of in vitro studies, the majority of stifles after treatment of a cranial cruciate ligament rupture with a TTA or TTA-2 remain to be persistently instable. Nevertheless, all dogs clinically improved regarding the degree of lameness. While the results of the 1st study suggest an undercorrection (post-surgical PTA > 90°) as a possible cause of stifle instability, this could not be proven during the 2nd study. The role of the menisci as a stabilizer of the canine stifle could not be finally elucidated by the present work.

Zielstellung: Ziel dieser kumulativen Dissertationsarbeit war die vergleichende Untersuchung der Wirtsantwort in verschiedenen Mauslinien nach Infektion mit Streptobacillus (S.) moniliformis und Rodentibacter (R.) pneumotropicus mit Anzeigeparametern für die Klinik, die Pathologie und die Immunantwort. Es sollten neue erregerspezifische enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) evaluiert und durch die Bestimmung der Immunglobulin G (IgG)-Subklassen mausstammspezifische Unterschiede in der Immunantwort aufgezeigt werden. Darüber hinaus waren Sentinelsysteme zu bewerten. Material und Methoden: Es wurden BALB/c und C57BL/6-Mäuse intranasal mit S. moniliformis- oder R. pneumotropicus infiziert und mit Kontaktsentinels vergesellschaftet. Zusätzlich wurde benutzte Einstreu der Infektionskäfige auf Käfige mit nichtinfizierten CD1-Mäusen (Einstreu-Sentinels) übertragen. Die Infektionsgruppen wurden über 4 Wochen, die Sentinels mindestens 7 Wochen alle 12 Stunden klinisch untersucht und die Verläufe dokumentiert. Am Ende der Experimente bzw. bei Erreichen spezifischer Abbruchkriterien wurden die Mäuse tierschutzgerecht euthanasiert und definierte Organproben für pathohistologische und bakteriologische Untersuchungen gewonnen. Die Erreger wurden dabei massenspektrometrisch sowie mittels polymerase chain reaction (PCR) differenziert und in Proben des Respirationstraktes quantitativ erfasst. Erregerspezifische Antikörper wurden in tracheonasaler Spülflüssigkeit und im Serum in eigens etablierten ELISA‘s auf Basis von Ganzzellextrakten bestimmt. Weiterhin erfolgte die Messung des Verhältnisses der IgG-Subtypen IgG1 und IgG2 im ELISA. Ergebnisse: Der Infektionsversuch mit S. moniliformis bestätigte mit einer Mortalität von 75% die bekannte hohe Infektionsanfälligkeit der C57BL/6-Mäuse im Gegensatz zu BALB/c, die keine Krankheitsanzeichen entwickelten. Die wichtigsten pathologischen Manifestationen waren eitrig-nekrotisierende Lymphadenitiden und Pneumonien in Verbindung mit der Reisolation des Infektionsstammes. Mithilfe des etablierten ELISA‘s gelang der Nachweis erregerspezifischer IgG-Antikörper im Serum der Tiere beider Linien. Bei den Kontaktsentinels konnte, bis auf eine Ausnahme, weder kulturell, noch serologisch eine Infektion nachgewiesen werden. Gleiches gilt für alle Einstreu-Sentinels. Molekularbiologisch wurde aber Erreger-DNA in den Lungen der Sentinels festgestellt. Die Infektion mit einem R. pneumotropicus Stamm, welcher genotypisch positiv für alle drei bekannten RTX-Toxine dieses Erregers war, führte zu einer unerwartet hohen Morbidität und Mortalität in beiden Mauslinien. In frühzeitig euthanasierten Tieren beider Linien konnten katarrhalisch-eitrige bis nekrotisierende Bronchopneumonien sowie eine Dissemination des Belastungsstammes in zahlreiche innere Organe nachgewiesen werden. In überlebenden Tieren beider Linien wurde eine deutliche Kolonisation respiratorischer Schleimhäute mit dem Belastungsstamm trotz z.T. hoher mukosaler IgA-Spiegel und Serokonversion im Blut nachgewiesen. Überlebende C57BL/6 Mäuse zeigten eine signifikant niedrigere Bakterienlast in inneren Organen als BALB/c Mäuse. In allen Kontaktsentinels, aber nicht in einem einzigen Einstreu-Sentinel, konnte kulturell und indirekt serologisch eine Infektion mit R. pneumotropicus nachgewiesen werden. Die Bestimmung der IgG-Subklassen in den Seren der C57BL/6-Mäuse beider Infektionsstudien ergab eine Verschiebung des Verhältnisses IgG2/IgG1 von unter 0,8 vor zu über 1,6 nach Infektion. Dies weist auf eine T-Helferzell (Th) 1-dominierte Immunantwort hin. BALB/c-Mäuse behielten dagegen ein Verhältnis unter 0,8 auch nach der Infektion bei, sodass auf eine Th2- Antwort zu schließen war. Schlussfolgerungen: Sowohl für S. moniliformis als auch für R. pneumotropicus konnten Tiermodelle mit diversen Anzeigeparametern etabliert werden, welche für Folgestudien zur Pathogenese oder Immunprophylaxe genutzt werden können. Für beide Erreger wurden neue sensitive und spezifische ELISA-Protokolle in die Diagnostik eingeführt. Kontaktsentinels, aber nicht Einstreu-Sentinels, sind gut geeignet, um R. pneumotropicus-Infektionen nachzuweisen. Die beobachtete stammspezifische Klinik, Pathologie und Immunantwort der C57BL/6-Mäuse nach experimenteller S. moniliformis-Infektion sprach für eine pathologische Th1-Immunantwort. Im Gegensatz dazu war im R. pneumotropicus – Infektionsversuch die Th1-Immunantwort der C57BL/6-Mäuse mit einer effektiveren Reduktion des Erregers in inneren Organen assoziiert. Die unerwartet hohe Morbidität und Mortalität im R. pneumotropicus –Infektionsversuch weist auf eine besonders hohe Virulenz des eingesetzten Stammes hin, sodass in dieser Arbeit erstmalig ein septikämischer Verlauf in Wildtyp-Mäusen nach intranasaler R. pneumotropicus-Infektion nachgewiesen werden konnte.:Inhaltsverzeichnis (I) Abkürzungsverzeichnis (III) 1 Einleitung (1) 2 Literatur (3) 2.1 Streptobacillus moniliformis (3) 2.1.1 Allgemeine Charakteristika (3) 2.1.2 Differenzierung von Streptobacillus spp.(4) 2.1.3 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Streptobacillus moniliformis - Infektion (5) 2.1.4 Epidemiologie der durch Streptobacillus moniliformis hervorgerufenen Zoonose (6) 2.1.5 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion bei Nagetieren (8) 2.1.6 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion in Menschen und anderen Nebenwirten (9) 2.1.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (10) 2.1.8 Prävalenz in Nagern (11) 2.1.9 Sanierung Streptobacillus moniliformis infizierter Nagetierbestände und Prävention (12) 2.2 Rodentibacter (R.) pneumotropicus und heylii (Pasteurella (P.) pneumotropica Biotyp Jawetz und Heyl) (14) 2.2.1 Allgemeine Charakteristika (14) 2.2.2 Ursprüngliche Einteilung in Biotypen und Reklassifikation zu Rodentibacter spp. (14) 2.2.3 Differenzierung von Rodentibacter spp. (15) 2.2.4 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Rodentibacter- Infektion (15) 2.2.5 Übertragung (15) 2.2.6 Klinik und Pathologien der Rodentibacter-Infektion in Nagern (16) 2.2.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (18) 2.2.8 Prävalenz (19) 2.2.9 Sanierung Rodentibacter pneumotropicus infizierter Nagetierbestände und Prävention (20) 2.3 Mäuse als Versuchstiere (22) 2.3.1 Inzucht-Stämme (22) 2.3.1.1 Merkmale, Verwendung und Historie der BALB/c-Wildtypmäuse (22) 2.3.1.2 Merkmale, Verwendung und Historie der C57BL/6-Wildtypmäuse (23) 2.3.1.3 Unterschiede der Immunreaktionen in C57BL/6- und der BALB/c- Mäusen (23) 2.3.2 Auszucht-Stämme (24) 2.3.2.1 Merkmale, Verwendung und Historie der CD1-Wildtypmäuse (24) 2.4 Gesundheitsmonitoring in Labortierhaltungen (25) 2.4.1 Empfehlungen der Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) (25) 2.4.2 Sentinelsysteme für das Gesundheitsmonitoring in Labormausbeständen (26) 3 Publikationen (28) 3.1 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Eisenberg T, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 2018;20(2):101-110 (28) 3.2 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Benga L, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain. BMC Microbiology. 2018;18(1):45 (39) 4 Übergreifende Diskussion (51) 5 Zusammenfassung (59) 6 Summary (61) 7 Literaturverzeichnis (63) 7.1 Fachliteratur (63) 7.2 Internet (76) 7.3 Gesetzestexte (78) Anhang (79) i Ergänzende Abbildungen (79) ii Ergänzendes Material zu 3.1 “Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis” (81) iii Ergänzendes Material zu 3.2 “Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain” (83) Liste mit weiteren Veröffentlichungen Danksagung / Objective: Aim of this cumulative doctoral thesis was the comparative analysis of the host response in different mice strains infected with Streptobacillus (S.) moniliformis and Rodentibacter (R.) pneumotropicus with readout parameters for clinics, pathology and immune response. New pathogen specific enzyme linked immunosorbent assay’s (ELISA) were evaluated. Differentiation of immunoglobulin (Ig) G subclasses was conducted to reveal differences in the immune response between the two mice strains. Furthermore, sentinel systems were assessed. Materials and methods: BALB/c and C57BL/6 mice were infected intranasally with S. moniliformis or R. pneumotropicus and housed together with contact sentinels. Soiled bedding from infection cages was transmitted to cages with uninfected CD1 mice (bedding sentinels). Infection groups were observed for 4 weeks, sentinels for at least 7 weeks and the clinical course was documented. At the end of the experiments or when predefined termination criteria were reached, animals were humanely killed. Predefined organ samples were collected for pathohistological and bacteriological screenings. Pathogens were differentiated via mass spectrometry and via polymerase chain reaction (PCR). The specific bacterial load was quantified in samples of the respiratory tract. Pathogen-specific antibodies were detected in tracheonasal lavages and sera using newly established ELISAs based on whole cell extracts. Determination of the ratios of the IgG subtypes (IgG1 to IgG2) was conducted using ELISAs. Results: The S. moniliformis experiment confirmed the known high susceptibility of C57BL/6 mice with a mortality of 75%. This was in contrast to BALB/c, which developed no signs of illness. The major pathologies were purulent-necrotizing inflammations of the lymph nodes and the lung associated with detection of the challenge strain. Specific IgG-antibodies were detected in sera of both mice strains by the newly established ELISAs. In contact and bedding sentinels the infection was not detected by culture or indirectly by serology, except for one contact sentinel. However, pathogen DNA was detectable in the lungs of these animals via PCR. The infection with the R. pneumotropicus strain, which is genotypically positive for all 3 known RTX toxins of this pathogen, leaded to an unexpected high morbidity and mortality in both mice strains. In early losses a catharal-purulent to necrotizing bronchopneumonia as well as dissemination of the challenge strain in various inner organs was recorded. Efficient colonization of the respiratory mucosa through the challenge strain was detected in survivors of both lines despite high mucosal IgA levels and seroconversion in the blood. Surviving C57BL/6 mice showed a significant lower bacterial burden in inner organs than BALB/c. All contact sentinels were culturally and serologically positive for R. pneumotropicus infection in contrast to all bedding sentinels. Differentiation of IgG subclasses in sera of C57BL/6 mice of both experiments revealed a shift of the IgG2/IgG1 ratio from 0.8 prior to infection to 1.6 post infection suggesting a T helper (Th) 1-prone immune response. BALB/c mice remained under 0.8 after infection indicating a Th2-prone immune response. Conclusions: New animal models with various readout parameters were established for both S. moniliformis and R. pneumotropicus. These models can be used in future studies on pathogenesis and immunoprophylaxis. Sensitive und specific ELISA-protocols were established for both pathogens. Contact sentinels but not bedding sentinels are appropriate for detection of R. pneumotropicus-infections. The observed distinct clinic, pathology and immune response of C57BL/6 mice experimentally infected with S. moniliformis indicated on the one hand a pathological Th1 immune response. On the other hand, the Th1 response of C57BL/6 mice to R. pneumotropicus infection was associated with a more efficient clearance of the challenge strain in internal organs. The unprecedented high morbidity and mortality in the R. pneumotropicus experiment indicates high virulence of this strain. Accordingly, this work revealed for the first time septicaemia in wildtype mice after intranasal R. pneumotropicus-infection.:Inhaltsverzeichnis (I) Abkürzungsverzeichnis (III) 1 Einleitung (1) 2 Literatur (3) 2.1 Streptobacillus moniliformis (3) 2.1.1 Allgemeine Charakteristika (3) 2.1.2 Differenzierung von Streptobacillus spp.(4) 2.1.3 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Streptobacillus moniliformis - Infektion (5) 2.1.4 Epidemiologie der durch Streptobacillus moniliformis hervorgerufenen Zoonose (6) 2.1.5 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion bei Nagetieren (8) 2.1.6 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion in Menschen und anderen Nebenwirten (9) 2.1.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (10) 2.1.8 Prävalenz in Nagern (11) 2.1.9 Sanierung Streptobacillus moniliformis infizierter Nagetierbestände und Prävention (12) 2.2 Rodentibacter (R.) pneumotropicus und heylii (Pasteurella (P.) pneumotropica Biotyp Jawetz und Heyl) (14) 2.2.1 Allgemeine Charakteristika (14) 2.2.2 Ursprüngliche Einteilung in Biotypen und Reklassifikation zu Rodentibacter spp. (14) 2.2.3 Differenzierung von Rodentibacter spp. (15) 2.2.4 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Rodentibacter- Infektion (15) 2.2.5 Übertragung (15) 2.2.6 Klinik und Pathologien der Rodentibacter-Infektion in Nagern (16) 2.2.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (18) 2.2.8 Prävalenz (19) 2.2.9 Sanierung Rodentibacter pneumotropicus infizierter Nagetierbestände und Prävention (20) 2.3 Mäuse als Versuchstiere (22) 2.3.1 Inzucht-Stämme (22) 2.3.1.1 Merkmale, Verwendung und Historie der BALB/c-Wildtypmäuse (22) 2.3.1.2 Merkmale, Verwendung und Historie der C57BL/6-Wildtypmäuse (23) 2.3.1.3 Unterschiede der Immunreaktionen in C57BL/6- und der BALB/c- Mäusen (23) 2.3.2 Auszucht-Stämme (24) 2.3.2.1 Merkmale, Verwendung und Historie der CD1-Wildtypmäuse (24) 2.4 Gesundheitsmonitoring in Labortierhaltungen (25) 2.4.1 Empfehlungen der Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) (25) 2.4.2 Sentinelsysteme für das Gesundheitsmonitoring in Labormausbeständen (26) 3 Publikationen (28) 3.1 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Eisenberg T, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 2018;20(2):101-110 (28) 3.2 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Benga L, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain. BMC Microbiology. 2018;18(1):45 (39) 4 Übergreifende Diskussion (51) 5 Zusammenfassung (59) 6 Summary (61) 7 Literaturverzeichnis (63) 7.1 Fachliteratur (63) 7.2 Internet (76) 7.3 Gesetzestexte (78) Anhang (79) i Ergänzende Abbildungen (79) ii Ergänzendes Material zu 3.1 “Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis” (81) iii Ergänzendes Material zu 3.2 “Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain” (83) Liste mit weiteren Veröffentlichungen Danksagung

Die equine Regenerationsmedizin versucht nach einer Sehnenverletzung (oberflächliche, tiefe Beugesehne: OBS, TBS) oder Bandverletzung (Fesselträger FT) die konsekutive Narbenbildung mit intraläsional applizierten potenziell regenerativen Therapeutika (prT) zu vermeiden. PrT sind mesenchymale stromale multipotente Progenitorzellen (MSC) aus unterschiedlichen Gewebequellen, sowie blutzellbasierende - meist Platelet Rich Plasma (PRP) - oder azelluläre Blutprodukte. Ein Langzeiterfolg ist noch nicht evident nachgewiesen; die Arbeit möchte dazu beitragen, die bestehende Lücke zu schließen. Die Arbeitsfrage lautet: Wie kann mit einer einzigen quantitativen Effektvariable bei Sportpferden, die nach einer natürlich entstandenen Erkrankung der OBS,TBS oder FT konservativ, mit kontrollierter Bewegung allein (KtrB) oder regenerativ (PrTB) behandelt werden, die ‚langfristige Gebrauchsfähigkeit’ (GF) valide gemessen und bisherige Studienergebnisse verglichen werden? Material: Inkludiert sind 51 in vivo Studien (1983-2016) entsprechend der Arbeitsfrage. Exkludiert sind in vivo Studien mit künstlich induzierten Erkrankungen, mit konventioneller oder chirurgischer Behandlung sowie in vitro Studien Methoden: Da die Studienergebnisse nicht direkt vergleichbar sind, wird ein evidenzbasiertes einfaches Evaluationsmodell mit der neuen quantitativen Effektgröße 'Gebrauchsfähigkeitsrate' GFR entworfen. Die metaanalytische gepoolte Reanalyse kann damit unabhängig von den Ergebnissen der Primärstudien die GF der Sportpferde neu bewerten. Als maßgebliche Einflussfaktoren auf GF werden u.a. definiert: Gewebestruktur, prT, sportliche Disziplin, Läsionsgrad, Altersklasse der Pferde, Prüfzeitdauer nach Rehabilitation zur Kontrolle des ‚Erfolgsmerkmals’ (EM) auf ein Rezidiv. Die Daten werden aus den Studien extrahiert und zu sog. Behandlungsgruppen (BehG) zusammengefasst. Nach Gewebestruktur (OBS-TBS, FT-Ursprung/-Körper/-Schenkel) und Behandlungsform (KtrB, PrTB) geordnete BehG werden soweit vergleichbar zu größeren BehG mit präziserem GFR gepoolt. Der Effektunterschied zwischen prT wird gegebenenfalls statistisch gesichert. Als EM ist definiert: 'Nach Rehabilitation kehren die Sportpferde zur Arbeit auf (mindestens) dem ursprünglichen Leistungsniveau zurück'. Die Erfolgsrate bzgl. EM ist E. In der Prüfzeitdauer nach Rehabilitation wird die Rezidivrate (R) ermittelt. E und R ergeben die Effektgröße GFR = E(1-R). Diese wird mittels 3 ganzzahliger Variablen A, B, C normiert: GFR = (N-A-B-C)/(N-A). A, B, C sind disjunkte Fallgruppen der N Patienten einer BehG. Die standardisierte Studiendauer ergibt sich aus der projektierten Rehabilitationsdauer (proj. Reha) und der ‚standardisierten Prüfzeit’ (P). Im Konsens mit den untersuchten Studien ist sie bei OBS-TBS 3 Jahre (1 Jahr proj. Reha + 2 Jahre P), beim FT 2,25 Jahre (0,75 Jahre proj. Reha + 1,5 Jahre P). Ergebnisse und Schlussfolgerung: Bei der OBS erscheint die Chance (OR, odds ratio) auf die zweijährige GF mit Amnion-MSC (2GFR = 94,1 %, n* = 34) 7-fach größer (OR = 7,2 [1,7-31,4]) sowohl vs. Knochenmark-MSC (2GFR = 68,8 %, n* = 145) als auch 9-fach größer (OR = 9,7 [2,1-45]) vs. PRP (2GFR = 60,4 %, n* = 51) sowie 11-fach größer (OR = 11,4 [2,5-52,1]) vs. KtrB (2GFR = 57,5 %, n* = 60). Erstmals kann bei diesen prT die Effektdifferenz dGFR > 25 % mittels Poweranalyse per Signifikanznachweis (Power >90 %; p < 0,025) durch die erforderliche Fallzahl statistisch gesichert werden. Allerdings stützt sich das Ergebnis für Amnion-MSC noch auf nur eine Studie. Bei TBS und FT fehlen Vergleichsgruppen noch. Da replizierbare wissenschaftliche Ergebnisse mit hoher interner und externer Evidenz nur mit standardisierten Parametern erzielt werden können, erscheint das GFR-Modell für zukünftige Studien von wesentlichem Interesse. / The equine regenerative medicine is seeking to avoid the subsequent scarring after a tendon (superficial and deep digital flexor tendon: SDFT, DDFT) or ligament (suspensory ligament: SL) injury by intralesionally applicated potential regenerative therapeutics (prT). PrT are mesenchymal stromal multipotential progenitor cells (MSC) from different sources of tissue, as well as products of blood, based on blood cells (PRP in most cases, platelet rich plasma) or acellular. Evidence of long-term treatment-success has not yet provided. This study wants to go towards closing the gap on this front. The leading question is: How can the 'long-term fit for use' (FfU) of sport horses, which are treated either conservatively with controlled exercise allone (CtrT) or regeneratively (PrTT) after suffering from naturally occuring tendinopathies of SDFT, DDFT or FT, be quantified in a valid way with a single effect variable? And how can the results of previous research studies be compared? Material: Includet are 51 in vivo studies (1983-2016) relating to the leading question. Excluded are in vivo studies with artificially induced lesions, with conventional or surgical treatment as well as in vitro studies. Methods: Findings of the studies are not directly comparable. As a consequence an evidence-based simple evaluation-model with the new quantitative effect size called ‘rate of fit for use’ (FFU) is developed. Based on this model the meta-analytical pooled re-analysis can re-assess FfU of the sport horses independently from findings of primary studies. The following influencing factors affecting FfU are defined: Structure of tissue, prT, sportive kind-of-use, degree of lesion, age class of horses, duration of monitoring after rehabilitation to controll the outcome (OC) for recurrence. The data are extracted from the studies and configured to so-called treatment groups (TGs). According to structure of tissue (SDFT, DDFT, SL-body, SL-origin, SL-branches) and kind of treatment (CtrT, PrTT) comparable TGs are pooled to bigger TGs with more precise FFU. If possible difference of effect between prTs is statistically assured. OC is defined as: 'After rehabilitation the sport horses return to work at (not less than) the initial level of performance'. Rate of OC is E. During duration of monitoring after rehabilitation the rate of recurrence (R) is checked. E and R are combined to FFU = E(1-R). In addition FFU is standardized in accord with the formula FFU = (N-A-B-C)/(N-A). A, B, C are integer variables representing disjunctive case groups of N, which is the total number of treated patients of a TG. The standardized duration of study results from the 'planned duration of rehabilitation' (planReha) and ‘standardized duration of monitoring’ (DoM). In consence with research studies it adds up to 3 years at SDFT-DDFT (1 year planReha +2 years DoM) and 2.25 years at SL (0.75 year planReha +1.5 years DoM). Results and conclusion: The chance (OR, odds ratio) with AM-MSC for biennial FfU (2FFU = 94.1 %, N-A = 34) appears to be more than at least 7-fold (OR = 7.2 [1.7-31.4]) as high as with BM-MSC (2FFU = 68.8 %, N-A = 145) as well as 9-fold (OR = 9.7 [2.1-45]) high as with PRP (2FFU = 60.4 %, N-A = 51) as well as 11-fold (OR = 11.4 [2.5-52.1]) high as with CtrT (2FFU = 57.5 %, N-A = 60). For the first time, power-analysis can statistically assure the difference of effect 25 % < dFFU (power > 90 %; p < 0.025) between these TGs through significant evidence based on the needed number of cases. However 2FFU with AM-MSC still relies on only 1 study. At DDFT and at LS comparison groups still are lacking. Because replicable scientific results with high internal and external evidence only can be approached based on standardized parameters, FFU-model seems to be essential for future studies.

Einleitung: Salmonellen und Yersinien haben als zweit- und dritthäufigste Verursacher bakterieller Gastroenteritiden in Deutschland und Europa im Jahr 2017 eine große Bedeutung als Lebensmittelinfektionserreger. Übertragen werden sie hauptsächlich durch den Verzehr roher, unzureichend gekühlter oder ungenügend erhitzter Schweinefleischerzeugnisse (Schweinemett, Hackepeter, kurz gereifte Rohwürste). Der Eintrag in die Lebensmittelkette erfolgt über symptomlose Trägertiere, die am Schlachthof in der Lebendund Fleischuntersuchung nicht als solche identifizierbar sind. Durch Kreuzkontaminationen kann es zur Verschleppung der Erreger auf die Schlachttierkörperoberflächen eigentlich gesunder Tiere kommen. Die vorherrschenden Hygienemaßnahmen am Schlachthof haben bisher nicht zu einer Verringerung des Auftretens dieser Bakterien geführt. Alternativ könnte gepulstes Licht (GL) als zusätzliches Dekontaminationsverfahren zum Einsatz kommen. Dessen antimikrobielle Wirksamkeit wurde bereits in zahlreichen Studien nachgewiesen. In der Literatur fehlten jedoch bislang Daten zur Inaktivierung von Salmonella ssp. auf Schwarte und Schweinelachs. Bezüglich Yersinia ssp. lagen noch gar keine Studien vor. Ziel der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war es, die Inaktivierung beider Erreger auf oben genannten Matrices zu testen und, unter Berücksichtigung chemischer und sensorischer Attribute der Produkte sowie die Eignung des Verfahrens für die Praxis abzuschätzen. Material und Methoden: Für die Untersuchungen mit künstlich inokulierten Schwarte- und Schweinefleischproben wurden die humanpathogenen Bakterien S. Typhimurium und Y. enterocolitica (Biotyp 4) verwendet. Die antimikrobielle Wirkung von GL wurde bei Fluences zwischen 0,52 und 19,11 J/cm² geprüft. Farb- bzw. Temperaturveränderungen auf der Probenoberfläche wurden mit Hilfe eines Spektrophotometers (CM 600 d, Konica Minolta) respektive eines Infrarotthermometers (104 IR, Testo) ermittelt. Zur Beurteilung der Lipidoxidation wurde die TBARS-Methode angewandt und die Proben maximal 10 Tage bei 4° C gelagert. Veränderungen bezüglich des Geruchs wurden bei Fluences von 0.52, 4.96 und 12.81 J/cm² mittels eines Konsensprofils beurteilt. Ergebnisse: Auf Schwarte konnten innerhalb von Sekunden Reduktionen von 1,73-3,16 log (S.) und von 1,48-4,37 log (Y.), auf Schweinelachs hingegen 1,7 log-Stufen für beide Mikroorganismen erreicht werden. Moderate bis starke Behandlungsregime (≥7,36 J/cm²) führten zu einer deutlich wahrnehmbaren Farbveränderung (E*ab ≥ 3) von Schwarte, ab 9,66 J/cm² zu einem signifikanten Verlust des roten Farbanteils von Schweinelachs. Zur Bewertung einer forcierten Fettoxidation wurde Malondialdehyd (MDA) in den Proben quantitativ bestimmt. Keine der getesteten Einstellungen hatte eine Überschreitung des Grenzwertes von 0,5 μg/g, ab dem Testpersonen die Produkte als ranzig wahrnehmen, zur Folge. Eine Überprüfung des Geruches erfolgte anhand von drei getesteten Fluences, die eine niedrige (0,52 J/cm²), moderate (4,96 J/cm²) und starke (12,81 J/cm²) Behandlung repräsentieren sollten. Mit 0,52 J/cm² bestrahlte Schwarte wurde von den Panel-Mitgliedern als weniger nach Schwein und weniger fettig riechend bewertet und somit als angenehm empfunden, ansonsten wurden chemische Gerüche wahrgenommen. Schlussfolgerungen: Aus den erzielten Daten geht hervor, dass sich gepulstes Licht in niedrigen Dosen (≤0,52 J/cm²) zur Dekontamination von Schwarte eignet. Praktisch umsetzbar wäre dies am Schlachthof als geschlossene Behandlungskammer, unmittelbar nach der Eviszeration. Somit könnte der noch nicht geteilte Schlachtkörper oberflächlich behandelt werden, ohne das unter der Haut befindliche Fleisch zu erreichen und die oben genannten Veränderungen hervorzurufen. Notwendig ist hierbei die Gewährleistung des Arbeitsschutzes. In diesem Zusammenhang muss entstehendes Ozon unschädlich beseitigt werden und das Tragen einer UV-Schutzbrille in der unmittelbaren Umgebung des Gerätes angeordnet werden. Abschließend ist hervorzuheben, dass das GL als zusätzliche, unterstützende Maßnahme zur Bekämpfung von Lebensmittelinfektionserregern zu sehen ist und keine bestehenden Hygienemaßnahmen (gute Hygienepraxis) ersetzen darf. Aufgrund der geringeren Wirksamkeit auf Schweinelachs und den damit verbundenen geruchlichen Veränderungen ist eine Applikation auf Schweinefleisch ohne weiterführende Untersuchungen nicht zielführend.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................III 1 EINLEITUNG ........................................................................................................... 1 2 LITERATURÜBERSICHT ........................................................................................ 3 2.1 Gepulstes Licht und gesetzliche Rahmenbedingungen ............................................. 3 2.2 Wirk- und Reparaturmechanismen, Resistenzbildung und Inaktivierungskinetik ....... 7 2.2.1 Photochemischer Effekt ................................................................................... 7 2.2.2 Photoreaktivierung ........................................................................................... 8 2.2.3 Photothermischer Effekt ................................................................................... 8 2.2.4 Physikalischer Effekt ........................................................................................ 9 2.2.5 Resistenzbildung .............................................................................................. 9 2.2.6 Inaktivierungskinetik ......................................................................................... 9 2.3 Einflussparameter ................................................................................................... 10 2.3.1 Mikroorganismus .............................................................................................10 2.3.2 Zeitpunkt der Bestrahlung ...............................................................................12 2.3.3 Matrix ..............................................................................................................12 2.4 Gepulstes Licht zur Inaktivierung von lebensmittelassoziierten Erregern in Fleischwaren .......................................................................................................... 13 2.5 Zielstellung dieser Arbeit ......................................................................................... 17 3 VERÖFFENTLICHUNG ..........................................................................................18 3.1 Eigenanteil zur Veröffentlichung ............................................................................. 18 3.2 Publikation .............................................................................................................. 18 4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ..........................................................................46 4.1 Eignung des Verfahrens „Gepulstes Licht“ zur Dekontamination von Schwarte und Schweinelachs ................................................................................................. 46 4.2 Vergleich von GL mit anderen Dekontaminationsverfahren .................................... 49 4.2.1 Chemische Dekontamination ...........................................................................49 4.2.2 Physikalische Dekontamination .......................................................................49 4.2.3 Biologische Dekontamination ..........................................................................50 4.3 Alternativer Einsatz von GL..................................................................................... 51 4.4 Schlussfolgerungen ................................................................................................ 51 5 ZUSAMMENFASSUNG ..........................................................................................53 6 SUMMARY .............................................................................................................55 7 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................57 ANHANG ..............................................................................................................................66 DANKSAGUNG ....................................................................................................................72 / Introduction: Since Salmonella ssp. and pathogenic Yersinia ssp. were the second and third most frequent causes for bacterial gastroenteritis in Germany and throughout Europe in 2017 they are of high significance as foodborne infectious agents. They are mainly transmitted by consumption of raw, inadequately cooled or insufficiently heated pork meat products (ground pork, minced pork, shortly ripened raw sausages). Subclinically infected pigs, so-called “carriers”, cannot be detected during ante- and post-mortem inspection in the slaughterhouse. Cross-contamination can lead to bacterial dissemination onto actually S.- or Y.-free carcasses. Prevailing hygienic measures could not reduce bacterial prevalence in the abattoir so far. Thus, pulsed light (PL) may be used as an additional decontamination procedure. Its antimicrobial potential was proven in numerous studies. However, there are no data in the scientific literature about inactivation of Salmonella ssp. on pork skin and loin. Moreover, no experiments with Yersinia in connection with pulsed light have been performed until now. Aim of this study: Hence, the aim of this work was to investigate the inactivation of both microorganisms on above-mentioned matrices and to assess the suitability of the PL treatment for implementation in a slaughterhouse considering chemical and sensory alterations of the products. Materials and Methods: For experiments with artificially inoculated pork skin and loin samples human-pathogenic bacteria S. Typhimurium and Y. enterocolitica (Biotype 4) were used. The antimicrobial effect of PL was tested at fluences between 0.52 and 19.11 J/cm². Color and temperature changes on the sample surface were determined by means of a spectrophotometer (CM 600 d, Konica Minolta) or an infrared thermometer (104 IR, Testo). The TBARS method was used to assess lipid per-oxidation and the samples were stored at 4° C for a maximum of 10 days. Odor changes were appraised at fluences of 0.52, 4.96 and 12.81 J/cm² using consensus profiling. Results: On pork skin reductions of 1.73-3.16 log (S.) and of 1.48-4.37 log (Y.) were achieved within seconds. In contrast, on pork loin only 1.7 log of both microorganisms were maximally inactivated. Moderate to strong treatments (≥7.36 J/cm²) led to distinct color changes (E*ab ≥ 3) in pork skin, fluences above 9.66 J/cm² to a significant loss of red color in pork loin. For evaluation of possible accelerated lipid peroxidation malondialdehyde (MDA) was analyzed quantitatively in samples. None of the tested parameter combinations resulted in threshold value exceedance of 0.5 μg MDA/g which is the point where panel members start to perceive products as rancid. Odor appraisal was carried out using three fluences representing a mild (0.52 J/cm²), moderate (4.96 J/cm²) and strong (12.81 J/cm²) treatment. Pork skin treated with 0.52 J/cm² was assessed as less porky, less fatty and, thus, pleasant by panel members, apart from that chemical odors were perceived. Conclusions: From the available data it appears that pulsed light could be used in mild doses (≤0.52 J/cm²) for pork skin decontamination. Practically, a PL-unit could be designed as a closed chamber, implemented directly after the evisceration in the abattoir. This way, the not yet separated carcass could be treated superficially without reaching the meat surface preventing the above-mentioned alterations. Guarantee of safety at work also plays an important role. Emerging ozone must be evacuated safely and UV-protection glasses should be worn in direct proximity to the PL-system. Finally, one needs to consider, that PL should be regarded as an additional, supportive measure to control foodborne pathogens and not as a replacement for existing hygiene standards (good hygiene practice). An application on pork meat does not seem to be conducive because of its lower effect on pork loin and the associated odor changes.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................III 1 EINLEITUNG ........................................................................................................... 1 2 LITERATURÜBERSICHT ........................................................................................ 3 2.1 Gepulstes Licht und gesetzliche Rahmenbedingungen ............................................. 3 2.2 Wirk- und Reparaturmechanismen, Resistenzbildung und Inaktivierungskinetik ....... 7 2.2.1 Photochemischer Effekt ................................................................................... 7 2.2.2 Photoreaktivierung ........................................................................................... 8 2.2.3 Photothermischer Effekt ................................................................................... 8 2.2.4 Physikalischer Effekt ........................................................................................ 9 2.2.5 Resistenzbildung .............................................................................................. 9 2.2.6 Inaktivierungskinetik ......................................................................................... 9 2.3 Einflussparameter ................................................................................................... 10 2.3.1 Mikroorganismus .............................................................................................10 2.3.2 Zeitpunkt der Bestrahlung ...............................................................................12 2.3.3 Matrix ..............................................................................................................12 2.4 Gepulstes Licht zur Inaktivierung von lebensmittelassoziierten Erregern in Fleischwaren .......................................................................................................... 13 2.5 Zielstellung dieser Arbeit ......................................................................................... 17 3 VERÖFFENTLICHUNG ..........................................................................................18 3.1 Eigenanteil zur Veröffentlichung ............................................................................. 18 3.2 Publikation .............................................................................................................. 18 4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ..........................................................................46 4.1 Eignung des Verfahrens „Gepulstes Licht“ zur Dekontamination von Schwarte und Schweinelachs ................................................................................................. 46 4.2 Vergleich von GL mit anderen Dekontaminationsverfahren .................................... 49 4.2.1 Chemische Dekontamination ...........................................................................49 4.2.2 Physikalische Dekontamination .......................................................................49 4.2.3 Biologische Dekontamination ..........................................................................50 4.3 Alternativer Einsatz von GL..................................................................................... 51 4.4 Schlussfolgerungen ................................................................................................ 51 5 ZUSAMMENFASSUNG ..........................................................................................53 6 SUMMARY .............................................................................................................55 7 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................57 ANHANG ..............................................................................................................................66 DANKSAGUNG ....................................................................................................................72

Einleitung Streptococcus (S.) suis verursacht bei Schweinen unter anderem Meningitis, Arthritis, Serositis und Endokarditis und ist eine der größten Herausforderungen für die Schweineindustrie. Von 29 beschriebenen Serotypen sind die Serotypen 2, 7 und 9 unter invasiven Isolaten weltweit besonders prävalent, vor allem in Europa. Bis heute gibt es keinen zugelassenen Impfstoff zur Prävention von S. suis-Erkrankungen in Europa, daher ist im Feld die Anwendung stallspezifischer Impfstoffe verbreitet. Diese bieten jedoch höchstens homologen Schutz und ihre Wirkung kann durch prädisponierende Faktoren wie eine Infektion mit dem porcine reproductive and respiratory syndrome Virus (PRRSV) beeinträchtigt werden. Daher hat sich die Forschung auf Antigene fokussiert, die potentiell heterologen Schutz vermitteln. Zielstellung Ziele der Studie waren die Charakterisierung vernachlässigter invasiver S. suis Pathotypen der wichtigen Serotypen 7 und 9 und die Etablierung neuer Infektionsmodelle im Schwein. Des Weiteren sollte die immunogene und protektive Wirkung des Immunoglobulin (Ig) M-degradierenden Enzyms von S. suis, IdeSsuis, im Serotyp 9 Infektionsversuch untersucht werden. Material und Methoden In dieser Arbeit wurden in vitro Versuche und experimentelle Infektionen im Schwein durchgeführt. Dazu gehörte die Geno- und Phänotypisierung von 22 S. suis Serotyp 7 Stämmen und vier Serotyp 9 Stämmen. Die Genotypisierung erfolgte mittels multiplex (MP) Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einer PCR zur Differenzierung verschiedener Genvarianten des muramidase-release protein (MRP) sowie mittels multilocus sequence typing (MLST). Zur Phänotypisierung der S. suis Stämme wurden bactericidal assays eingesetzt, die als Bakteriämiemodell fungierten. Auf diese Weise konnten die Empfänglichkeit gegenüber S. suis Stämmen sowie deren Virulenz beurteilt werden. Durch Zugabe von rekombinantem (r) IdeSsuis wurde die Rolle adaptiven IgMs in der Begrenzung der Bakteriämie untersucht. Anhand von Western Blot Analysen erfolgte die Untersuchung der Expression und Funktionalität von IdeSsuis sowie die Expression von MRP in S. suis Serotyp 7 Stämmen. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) kamen zum Einsatz, um die Entwicklung von IgM und IgG Spiegeln in Ferkeln im zeitlichen Verlauf und die IgG Spiegel nach rIdeSsuis Immunisierung zu messen. Durch rIdeSsuis Immunisierung induzierte Antigen-spezifische T-Helferzellen (Th-Zellen) wurden mithilfe der Durchflusszytometrie untersucht. Schließlich erfolgte die Durchführung zweier S. suis Serotyp 7 Etablierungsversuche mit je 18 bzw. 5 Ferkeln sowie zwei S. suis Serotyp 9 Impf- und Infektionsversuche mit je 18 Ferkeln. Sektionsproben wurden histologisch untersucht. In einem Fall wurde eine Endokarditis mittels fluorescence in situ hybridization (FISH) charakterisiert. Ergebnisse Die meisten untersuchten Serotyp 7 Stämme gehörten dem Sequenztyp (ST) 29 an, einem emerging pathotype in Europa. Trotz der engen phylogenetischen Verwandtschaft, war mrp in den Stämmen sehr variabel. Phänotypisch bildeten alle Stämme gleichermaßen eine kleine MRP Variante, MRPs. Für vier ausgewählte Serotyp 7 Stämme wurde die Expression von IdeSsuis gezeigt, jedoch mit Unterschieden in Größe und Funktionalität. Bactericidal assays dieser vier Stämme zeigten starke Proliferation im Blut von Absatzferkeln, aber Abtöten im Blut von Läuferschweinen aus zwei Herden mit unterschiedlichem S. suis Status. Dieses Überlebensmuster unterschied sich deutlich von dem eines Serotyp 9 Stammes. Durch Zugabe von rIdeSsuis, konnte gezeigt werden, dass das Abtöten der Serotyp 7 Stämme im Blut von Läuferschweinen des infizierten Bestandes IgM-vermittelt war. Unabhängig von der Herkunft entwickelten sich die IgM Spiegel in den Ferkeln im zeitlichen Verlauf fast synchron. Schließlich konnte die Virulenz eines Serotyp 7 Stammes in einem intravenösen Infektionsversuch mit 5 Ferkeln gezeigt werden. Alle Tiere entwickelten schwere Symptome einer S. suis Erkrankung. In einem Impf- und Infektionsversuch mit einem hoch virulenten Serotyp 9 Stamm wurde die immunogene und protektive Wirkung einer rIdeSsuis Immunisierung untersucht. Neun Ferkel wurden mit rIdeSsuis oder einem Placebo prime-boost-boost immunisiert und zwei Wochen später infiziert. Neunzig Prozent der Placebotiere entwickelten schwere Symptome einer S. suis Erkrankung und starben oder mussten aus Tierschutzgründen euthanasiert werden. Alle geimpften Tiere überlebten den Versuch, fielen jedoch mit Fieber und Lahmheiten auf. Es konnte also gezeigt werden, dass eine rIdeSsuis Immunisierung vor Mortalität, nicht aber Morbidität durch den Infektionsstamm schützt. Alle immunisierten Ferkel serokonvertierten und Antigen-spezifische Th-Zellen wurden nachgewiesen. Weder die IgG Antwort noch die Th-Zell Antwort wurde jedoch durch die Infektion verstärkt. In einem weiteren Impf- und Infektionsversuch mit einem anderen Serotyp 9 Stamm fiel ein Tier am 11. Tag nach der Infektion mit Zeichen einer akuten Leptomeningitis auf, nachdem es zuvor klinisch völlig unauffällig war. In der Sektion des Tieres wurde eine Endokarditis der Mitralklappe diagnostiziert, die mit Biofilm-Bildung assoziiert war, was mithilfe von Histologie und FISH gezeigt werden konnte. Zusätzlich wurde eine fibrinopurulente Leptomeningitis diagnostiziert. Das Ferkel hatte Antikörper gegen rIdeSsuis und tötete den Infektionsstamm ex vivo im Blut ab. Schlussfolgerungen In dieser Arbeit habe ich zwei wichtige S. suis Pathotypen charakterisiert: S. suis Serotyp 7 Stämme des ST29 und einen hoch virulenten Serotyp 9 Stamm vom ST94. Die Serotyp 7 Stämme stellten einen besonderen Pathotypen dar, bei dessen Bekämpfung IgM eine wichtige Rolle spielt. Bei einer Serotyp 9 Infektion konnten trotz des Abtötens der Bakterien im Blut und opsonisierender Antikörper Biofilmbildung und eine folgende akute Leptomeningitis nicht verhindert werden. Letztlich wurde Schutz vor einem hoch virulenten Serotyp 9 Stamm durch rIdeSsuis Immunisierung und damit zum ersten Mal für ein Antigen Protektion vor den wichtigen Serotypen 2 und 9 aufgezeigt. Dies ist ein vielversprechendes Ergebnis hinsichtlich der Entwicklung eines Impfstoffes gegen S. suis. / Introduction Streptococcus (S.) suis causes meningitis, arthritis, serositis and endocarditis and is one of the biggest challenges for the swine industry. Of 29 described serotypes, the serotypes 2, 7 and 9 are highly prevalent amongst invasive S. suis isolates worldwide, especially in European countries. To date, no commercially produced vaccine is available in Europe for prevention of S. suis disease, thus the use of autogenous vaccines in the field is common. However, bacterins may at most confer homologous protection and their efficacy may be influenced by predisposing factors such as an infection with the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Research has therefore focused on subunit vaccines with the potential to elicit cross-protection against various serotypes. Aim of the study The objective of this study was to characterize neglected invasive S. suis pathotypes of the important serotypes 7 and 9 and to establish infection models in the main host of S. suis, the pig. A further aim was to investigate immunogenicities and protective efficacies of the immunoglobulin (Ig) M-degrading enzyme of S. suis, IdeSsuis, in a serotype 9 challenge experiment. Materials and methods In vitro experiments and experimental challenges in swine were conducted as part of this thesis. This included the geno- and phenotyping of 22 S. suis serotype 7 strains and four serotype 9 strains. Genotyping was conducted using a multiplex (MP) polymerase chain reaction (PCR), a PCR for differentiation of variants of the muramidase-released protein (MRP) gene and multilocus sequence typing (MLST). For phenotyping of the S. suis strains, bactericidal assays were carried out which served as a model for bacteraemia. This way, susceptibility to S. suis strains and virulence of different strains was assessed. Further, through addition of recombinant (r) IdeSsuis, the role of adaptive IgM in limiting bacteraemia was elucidated. Western blot analyses were conducted to investigate expression and functionality of IdeSsuis as well as expression of MRP in S. suis serotype 7 strains. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) were used to determine the development of IgM and IgG levels in piglets over time and to assess IgG levels following rIdeSsuis immunization. Antigen-reactive T-helper (h) cells induced by rIdeSsuis immunization were investigated using flow cytometry. Finally, two experiments to establish a serotype 7 infection model with 18 and 5 piglets each and two vaccination and challenge experiments using different S. suis serotype 9 strains (n=18 piglets/ experiment) were conducted. Samples of dissected animals were examined histologically. In one case, an endocarditis was analysed using fluorescence in situ hybridization (FISH). Results Most of the investigated serotype 7 strains belonged to sequence type (ST) 29 which was thus shown to be an emerging pathotype in Europe. Despite the close phylogenetic relation of the strains, mrp was highly variable. Phenotypically, all strains expressed a small variant of MRP, MRPs. Four selected serotype 7 strains were shown to express IdeSsuis with differences in size and functionality. Bactericidal assays of these four strains revealed high proliferation in blood of weaning piglets but killing in blood of growing piglets of two herds which differed in their S. suis infection status. This survival pattern was distinct from a serotype 9 strain. Addition of rIdeSsuis revealed that killing of the serotype 7 strains in blood of growing piglets of the infected herd was IgM-mediated. Independent of the originating herd, IgM levels of the piglets rose almost synchronous over time. Finally, the virulence of a serotype 7 strain was proven in an intravenous challenge experiment with five pigs which all developed severe clinical signs of S. suis disease. In a vaccination and challenge experiment using a highly virulent serotype 9 strain, immunogenicities and protective efficacies of rIdeSsuis immunization were investigated. Nine piglets were prime-boost-boost vaccinated with rIdeSsuis or placebo-treated and challenged two weeks later. Ninety per cent of the placebo-treated piglets developed severe clinical signs of S. suis disease and died or had to be euthanized due to animal welfare reasons. All vaccinated piglets survived the experiment, however elevated body temperatures and lameness were also noted in this group. Accordingly, rIdeSsuis vaccination protected from mortality but not morbidity caused by the challenge strain. Seroconversion of the immunized piglets and antigen-reactive Th cells were detected. Neither the IgG response nor the Th cell response was boosted through the challenge. In a further vaccination and challenge experiment with a different serotype 9 strain, one animal was clinically unobtrusive following infection and then developed an acute leptomeningitis on the 11th day post infection and had to be euthanized. Dissection of the animal revealed an endocarditis on the mitral valve which was proven to be associated with biofilm formation by histology and FISH. In addition, a fibrinosuppurative leptomeningitis was diagnosed. The piglet had specific antibodies against rIdeSsuis and mediated killing of the challenge strain in a bactericidal assay. Conclusions In this thesis, I characterized two important pathotypes: S. suis serotype 7 strains of ST29 and a highly virulent serotype 9 strain of ST94. The serotype 7 strains represent a distinct pathotype and IgM plays a significant role in their control. Following a serotype 9 infection, biofilm formation and a subsequent acute leptomeningitis could not be prevented despite blood bactericidal activity and opsonizing antibodies. Finally, protection against challenge with a highly virulent serotype 9 strain through rIdeSsuis immunization was demonstrated. Thereby, for the first time an antigen was shown to confer cross-protection against the important serotypes 2 and 9, which is highly encouraging regarding the development of a vaccine against S. suis.

Einleitung: In der Tiermedizin sind nahezu 800 erblich bedingte Erkrankungen bekannt. Praktisch alle Hunderassen leiden unter solch einer Erkrankung. Für die Ausprägung der Brachyzephalie gibt es derzeit keinen eindeutigen Hinweis auf eine zugrundeliegende Genveränderung. In der Humanmedizin ist die kongenitale Brachyzephalie Folge einer Kraniosynostose (vorzeitigen Verknöcherung einer oder mehrerer Schädelnähte). Für die verschiedenen syndromalen Kraniosynostosen sind die verantwortlichen Gendefekte bereits definiert. In der Tiermedizin können in Analogie entsprechende Kandidatengene postuliert werden. Ob Veränderungen in diesen Kandidatengenen tatsächlich zu einer vergleichbaren klinischen Ausprägung der kaninen Brachyzephalie führen, wurde für das FGFR2-Gen in dieser Arbeit untersucht. Ziel: Ziel dieser Arbeit war es die Hypothese zu prüfen, dass Veränderungen in Genen, die bekannterweise bereits in der Humanmedizin in Zusammenhang mit genetisch bedingter Brachyzephalie stehen, auch für die kanine Brachyzephalie als Kandidatengene fungieren können. Tiere und Methoden: Für die Untersuchungen wurden EDTA-Blutproben und Maulschleimhautabstriche verwendet. Insgesamt wurde eine Gruppe von 106 Tieren untersucht, davon waren 51 Tiere vom Phänotyp normozephal und umfassten 33 verschiedene Rassen. 55 Tiere entsprachen dem brachyzephalen Phänotyp, gehörten zu den Rassen FB, Mops, EB, BT und OEB und wurden in der Klinik für Kleintiere der Universität Leipzig zur Behandlung eines BAS vorstellig. Die Proben wurden am Institut für angewandte Humangenetik und Onkogenetik durch die Autorin weiterverarbeitet. Die Auswahl eines geeigneten Kandidatengens erfolgte durch den Vergleich des humanen und kaninen Phänotyps und der klinischen Merkmale von an Kraniosynostose-Syndromen erkrankten Menschen mit brachyzephalen Hunden sowie anhand von Literaturrecherche. Die DNA wurde isoliert, amplifiziert und nach Erstellung der für das Kandidatengen spezifischen Primer, sequenziert und analysiert. Ergebnisse: Sowohl der phänotypisch-klinische Vergleich zwischen humaner und kaniner Brachyzephalie als auch die Literaturrecherche ergaben, dass das FGFR2-Gen ein ideales Kandidatengen darstellt. Die Erstellung spezifischer Primer für den proteincodierenden Bereich dieses Gens war erfolgreich. Die Sequenzanalyse identifizierte 3 Lokalisationen auf 2 der 17 sequenzierten Exon-Abschnitte des kaninen FGFR2-Gens, die eine Sequenzabweichung aufwiesen. Sie wurden im Folgenden als Varianten VarE2, VarE7 und VarE7AB bezeichnet. Es gab einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen dem Auftreten aller 3 Varianten und der Gruppe „Rasse Brachyzephal“ (Chi2-Wert > 3,841, p-Wert < 0,05), jedoch keinen Zusammenhang zwischen dem Auftreten der Varianten und der Normozephalen-Gruppe. Ein Zusammenhang der VarE2 und der Patientengruppe (Normo-/Brachyzephal) konnte ebenfalls ausgeschlossen werden, somit auch der Zusammenhang dieser Variante mit dem Auftreten des brachyzephalen Phänotyps. Die VarE7 trat bei 53 % (29/55) der Brachyzephalen-Gruppe auf. Innerhalb der Gruppe wies die FB mit 90 % (19/21) den höchsten Wert auf, diesem stand der Mops mit einem Auftreten der Variante von nur 22 % (4/18) gegenüber. Die Normozephalen-Gruppe wies, bezogen auf VarE7, lediglich einen Anteil von 28 % (14/50) auf, wobei innerhalb der Gruppe das Auftreten von 40 % nicht überschritten wurde. Die VarE7AB trat bei 47 % der Brachyzephalen-Gruppe auf, dabei hielt die Rasse Mops den höchsten Anteil von 78 % (14/18). Im Vergleich dazu tauchte diese Variante innerhalb der Normozephalen-Gruppe mit einem vergleichsweise hohen Anteil von 74 % (37/50) auf, wobei das Auftreten innerhalb dieser Gruppe einen relativ gleichmäßig hohen Anteil von 60 - 88% aufwies. Schlussfolgerungen: Ein klinisch-morphologischer Vergleich zwischen humanen und kaninen Kraniosynostose-Syndromen ist möglich. Ob Mutationen in Kandidatengenen (z.B. FGFR2) des Menschen auch in den analogen Genen beim Hund nachgewiesen werden können, wurde in dieser Arbeit geprüft. Erstmals wurde die Sequenz des kaninen FGFR2-Gens auf Sequenzabweichungen hin analysiert. Die dabei detektierte Variante VarE7 zeigte einen statistisch signifikanten Zusammenhang mit dem Auftreten des Phänotyps 'Brachyzephalie' bei der Französischen Bulldogge. Eine weitere Variante, Var7AB, konnte als statistisch signifikant im Zusammenhang mit dem Auftreten des Phänotyps 'Brachyzephalie' bei der Rasse Mops identifiziert werden. Dieser Zusammenhang war allerdings nicht eindeutig verifizierbar. Weitere Studien, insbesondere Funktionsstudien, sind notwendig, um die Auswirkungen der Varianten im FGFR2-Gen auf den Phänotyp zu prüfen.

Charakterisierung neuraler Vorläuferzellen im pränatalen Neokortex des Nördlichen Spitzhörnchens (Tupaia belangeri) Einleitung: Im Verlauf der Evolution entwickelte sich der Neokortex zum komplexesten Anteil des Säugetiergehirns. Ausdifferenzierungen und eine immense Expansion des Neo-kortex, vor allem in der Primatenabstammungslinie, waren die Folge. Der größte Teil der neokortikalen Neurone wird während der Embryonal- und Fetalphase gebildet und stammt von sogenannten neuralen Stamm- und Progenitorzellen (NPCs) ab. Diese entstehen in zwei unterschiedlichen Keimschichten, der Ventrikulärzone (VZ) und der Subventrikulärzone (SVZ). Vorangegangene Studien zeigten, dass sich die Dicke der SVZ als auch das Vorhan-densein und die Häufigkeit bestimmter NPCs, besonders die der basalen radialen Gliazelle (bRG), zwischen lissenzephalen Nagetieren und gyrenzephalen Primaten erheblich unter-scheidet. Bislang werden überwiegend Nagetiere in Untersuchungen zu gehirnassoziierten Fragestellungen eingesetzt, wohlwissentlich dass es deutliche Unterschiede in der neokorti-kalen Entwicklung (d.h. in der Abundanz und Verteilung der unterschiedlichen NPCs) zwi-schen Mensch und Nagetier gibt. Die Etablierung eines Tiermodells, das eine ähnliche NPC- Ausstattung wie der Mensch besitzt, ist für das bessere Verständnis der humanen Neokorte-xentwicklung sowie neokortikaler Entwicklungsstörungen und Erkrankungen essenziell. Das nördliche Spitzhörnchen (Tupaia belangeri) ist ein rattengroßes Tier mit einem hohen Ge-hirn-Körpermasse-Verhältnis und steht phylogenetisch zwischen den Nagetieren und den Primaten. Ziel der Untersuchung: Ziel dieser Arbeit war es, die Präsenz, die Abundanz und die Ver-teilung der bRGs und anderer NPCs in den Keimzonen (VZ und SVZ) des sich entwickeln-den Neokortex des Tupaia belangeri zu erfassen. Die erhobenen Daten wurden mit vorhan-denen Daten von Makaken, Frettchen, Ratte und Maus verglichen, um zu erfahren, ob Schlüsselmerkmale der Neokortexentwicklung größere Gemeinsamkeiten zu gyrenzepha-len Primaten oder lissenzephalen Nagetieren zeigen. Tiere, Material und Methoden: Die Tupaiagehirne stammen von Tieren aus dem Institut für Biologie der Universität Leipzig, Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psycho-logie und dem Institut für Zoologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Das Alter der Proben bewegte sich von Embryonaltag 32 (n=2), 37 (n=2), 45 (n=2) bis hin zu Postnataltag (P) 1 (n=2). Die exakte Bestimmung des Alters der Tiere erfolgte über eine Scheitel-Steißlängen-Wachstumskurve. Die Gehirne wurden entnommen, fixiert und das gesamte Telenzephalon wurde von rostral nach kaudal in Einzelschnitte von 30 µm Dicke geschnitten und immunhistochemisch gefärbt. Dabei wurden fluoreszenmarkierte sekundäre Antikörper verwendet. Die visuelle Darstellung erfolgte mittels eines konfokalen Lasermikroskops (Leica SP8). Die Aufnahmen wurden mittels Fiji und Adobe Photoshop Software prozessiert. Die Quantifizierung der Zellen erfolgte mittels Fiji Software (Multiclass Cell Counter plug in). Die statistische Auswertung erfolgte durch R Software. Im Rahmen einer Ranganalyse wurden nichttransformierte Werte verschiedener neokortikaler Parameter unterschiedlicher Spezies verglichen und mit dem Kruskal-Wallis-Test mit anschließendem Conover post-hoc-Test auf eine statistische Signifikanz (p <0.05) geprüft. Darüber hinaus wurde nach Standardisierung mittels z-Score eine Hauptkomponentenanalyse, euklidische Distanzberechnung und hierar-chisches Clustern durchgeführt. Ergebnisse: Drei grundlegende Erkenntnisse stellen sich dar. Der sich entwickelnde Neo-kortex des Tupaia belangeri verfügt über (i) eine relativ große SVZ, (ii) eine hohe Abundanz von Pax6+ NPCs in der SVZ sowie über (iii) einen hohen Prozentsatz von bRGs zum Zeit-punkt der Bildung der oberen Kortexschichten. Durch die statistische Auswertung stellte sich heraus, dass bestimmte Schlüsselmerkmale in der Neokortexentstehung des Tupaia (d.h. Entwicklung der Keimzonen, Verteilung und Abundanz von unterschiedlichen NPCs) größe-re Ähnlichkeiten zu denen der gyrenzephalen Primaten als zu denen der lissenzephalen Na-getiere aufweisen. Beim Rangvergleich der untersuchten Parameter wurde eine statistische Signifikanz (siehe Tiere, Material und Methoden mit p <0.05) festgestellt. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass große Ähnlichkeiten zwischen den NPC Populationen im sich entwickelnden Neokortex von gyrenzephalen Primaten und Tupaia belangeri bestehen. Somit wird mit dem Tupaia belangeri der biomedizinischen For-schung und translationalen Medizin für die Untersuchung von entwicklungsbedingten Fehl-bildungen und Erkrankungen des Neokortex ein besonders geeignetes Tiermodell - als Al-ternative zu Maus, Ratte, Frettchen und Primaten - zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus bieten die gewonnenen Ergebnisse weitreichende Einsichten in die Evolution des Gehirns und die Phylogenese der NPCs der Säugetiere und sind somit für die Grundlagenforschung von großer Bedeutung.

Einleitung: Aufgrund der Heuknappheit der letzten Jahre werden zunehmend auch extensiv bewirtschaftete Wiesen für die Heuproduktion genutzt. Teil der artenreichen Wiesen ist jedoch auch das Vorkommen von potentiell toxischen Pflanzen wie die Herbst-Zeitlose. Inwieweit Pferde getrocknete Herbst-Zeitlose im Heu erkennen und meiden, ist unzureichend erforscht. Erfahrungsberichte von Landwirten sowie Fallberichte kommen zu widersprüchlichen Ergebnissen. Ziele der Untersuchungen: Das Ziel der vorliegenden Untersuchung bestand in der Beschreibung des Selektionsverhaltens von Pferden bei Vorlage von Heu, welches mit Herbst-Zeitlosen kontaminiert war. Tiere, Material und Methoden: Die Studie (TVV-Nummer 17/19) wurde mit sechs klinisch gesunden, adulten (Alter: 11 – 17 Jahre) Warmblutwallachen (durchschnittliches Körpergewicht (KGW) ± Standardabweichung (SD): 674 ± 85 kg) durchgeführt. Die Pferde wurden in Einzelboxen auf Stroh mit täglichem Zugang zu einem Paddock gehalten. Heu wurde, mit Ausnahme der Aufenthaltszeit auf dem Paddock, ad libitum zur Verfügung gestellt und durch 50 g eines kommerziellen Mineralfuttermittels (Hoeveler, Reformin Plus©) ergänzt. Leitungswasser war zu jeder Zeit frei verfügbar. Jedes Pferd erhielt zu unterschiedlichen Tageszeiten über eine Stunde Heu, welches mit 1 oder 2 % getrockneten Herbst-Zeitlosen kontaminiert war. Das Selektionsverhalten der Tiere wurde individuell beobachtet, protokolliert und ausgewählte Beobachtungsperioden mittels Videoaufnahmen aufgezeichnet. Um Intoxikationen zu vermeiden, wurden Abbruchkriterien definiert. Nahm ein Pferd zwei Herbst-Zeitlose auf, wurde die Beobachtungsperiode abgebrochen und das kontaminierte Heu entfernt. Die Beobachtungsperiode wurde an einem anderen Tag und zu einer anderen Tageszeit wiederholt. Musste die Beobachtungsperiode erneut abgebrochen werden, wurde das entsprechende Pferd aus dem Versuch ausgeschlossen. Alle Pferde wurden zu Beginn des Versuchs und anschließend alle zwei bis drei Tage allgemein klinisch untersucht (Herz- und Atemfrequenz, Beschaffenheit der Schleimhäute, Darmgeräusche, innere Körpertemperatur, Pulsation der Gliedmaßen). Ein Blutbild sowie biochemische Blutuntersuchungen aller Pferde wurden zu Beginn und am Ende der Studie durchgeführt. Sowohl das gefütterte Heu als auch die Herbst-Zeitlosen wurden auf die Menge ihrer Rohnährstoffe und Anteile der Faserfraktionen untersucht. Eine Messung der Colchicingehalte in den getrockneten Herbst-Zeitlosen wurde durchgeführt (Flüssigkeitschromatographie/Tandem-Massenspektrometrie). Die Ergebnisse der genannten Analysen wurden mithilfe von Microsoft Excel 2016® deskriptiv und mittels SPSS 27® statistisch ausgewertet. Ergebnisse: Keines der Pferde mied die Herbst-Zeitlose im Heu. Vier von sechs Pferden zeigten sogar eine Präferenz für die Pflanze und nahmen sie gezielt ohne umliegendes Heu auf. Lediglich ein Pferd mied die Herbst-Zeitlose während der ersten sechs Beobachtungsperioden. Innerhalb der siebten Beobachtungsperiode nahm es Anteile der Herbst-Zeitlose auf. Die Parameter der klinischen Untersuchung und die Blutwerte lagen zu jeder Zeit im physiologischen Normbereich. Bei der Messung der Rohnährstoffe konnten in der Herbst-Zeitlosen höhere Rohprotein- (CP: 12,5 ± 0,717 %) und Rohfettgehalte (CFAT: 3,86 ± 0,254 %), sowie ein höherer Anteil an stickstofffreien Extraktstoffen (NFE: 52,3 ± 1,24 %) als im Heu (CP: 7,84 ± 1,47 %; CFAT: 0,80 ± 0,237 %; NFE: 41,4 ± 1,99 %) nachgewiesen werden. Die Faserfraktion der Herbst-Zeitlosen (CF: 17,3 ± 0,837 %) stellte sich geringer als im Heu (CF: 34,5 ± 1,85 %) dar. Es wurde ein durchschnittlicher Colchicingehalt von 331 µg/g Trockensubstanz in der getrockneten Herbst-Zeitlosen gemessen. Schlussfolgerungen: Aufgrund der unselektiven, teils gezielten Aufnahme der Herbst-Zeitlosen durch die Pferde der vorliegenden Studie, sowie das stark gehäufte, nestartige Vorkommen der Herbst-Zeitlosen im Heu, können Vergiftungen durch kontaminiertes Heu nicht ausgeschlossen werden. Daher sollten Wiesen, auf welchen Herbst-Zeitlose wachsen, von der Heugewinnung ausgeschlossen werden.