Einleitung: Risiken für Honigbienen stellen heutzutage schwindende natürliche Flächen und der Einsatz von Pestiziden in der Landwirtschaft dar. Flupyradifuron ist der Wirkstoff eines neuen Pflanzenschutzmittels der Bayer AG, das unter dem Namen „Sivanto“ vermarktet wird. Flupyradifuron an den nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor im Gehirn der Honigbiene. Zielstellung: Ziel dieser Arbeit ist es, subletale Effekte von Flupyradifuron auf Verhalten und Gehirnstrukturen der Honigbiene zu untersuchen. Material und Methoden: Der Effekt einer chronischen Flupyradifuron-Applikation in unterschiedlichen Konzentrationen über zehn Tage auf die Mortalität, wurde in frisch geschlüpften Sommerbienen und langlebigen Winterbienen untersucht (N = 30 pro Behandlung, jeweils vier Replikate). Die statistische Auswertung erfolgte mit der Kaplan-Meier-Methode mit log-Rank Test. Nachdem Flupyradifuron einmalig an Honigbienen (N = 46, 47, 48 bzw. 55 pro Behandlung bei Nektar-sammelnden; N = 54, 68, 56 bzw. 62 pro Behandlung bei Pollen-sammelnden Bienen) verfüttert wurde, wurde deren Geschmackswahrnehmung getestet Im Folgenden wurden die Bienen mittels klassischer olfaktorischer Konditionierung auf einen Duft konditioniert. Das Gedächtnis wurde am nächsten Tag getestet. Zur statistischen Auswertung wurde die logistische Regression mit Post-Hoc Least Significant Difference Test angewendet. Es wurde eine Videoanalyse durchgeführt, um den Einfluss von Flupyradifuron auf die motorischen Fähigkeiten von Sommer- und Winterbienen zu untersuchen. Dazu wurde Flupyradifuron einmalig (N = 19 pro Behandlung im Sommer; N = 17 bzw. 16 pro Behandlung im Winter) oder über 24 h (N = 15 pro Behandlung im Sommer; N = 18 pro Behandlung im Winter) verabreicht. Zum Vergleich wurde das Experiment mit dem Neonikotinoid Imidacloprid bei Winterbienen wiederholt (N = 17 bzw. 16 pro Behandlung bei einmaliger Gabe; N = 16 pro Behandlung bei 24 h Gabe). Die statistische Auswertung erfolgte mittels einer nicht-parametrischen Varianzanalyse (Kruskal-Wallis H Test) und dem Pearson Chi-Quadrat Test. Um die Effekte von Flupyradifuron auf das Sammelverhalten der Bienen zu untersuchen, wurde die RFID („radio frequency identification“) Technik angewandt. Frisch geschlüpfte Arbeiterinnen (N = 100) wurden in einem separaten Käfig im Bienenstock gehalten und mit Flupyradifuron behandelt. Nach sieben Tagen wurden die Bienen in die Kolonie entlassen und ihr Flugverhalten für 40 Tage verfolgt. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt. Die Kaplan-Meier Methode mit log-Rank Test wurde angewandt um Sammelbeginn und -ende zwischen den Behandlungen zu vergleichen. Anzahl und Dauer der Sammelflüge zwischen den Behandlungsgruppen wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test verglichen. Um den Einfluss von Flupyradifuron auf Gehirnstrukturen zu untersuchen, wurden die Bienen über zehn Tage oral mit Flupyradifuron behandelt. Gehirne (N =10 pro Behandlung) wurden präpariert, Schnitte von 5 µm wurden hergestellt und mit Hämatoxylin/Eosin (H/E) gefärbt. Bei allen Versuchen wurde ein Signifikanzniveau von P < 0,05 festgelegt. Ergebnisse: In einer mittleren Konzentration von 1,0 µg pro Biene pro Tag war die Mortalität von Sommer- und Winterbienen in drei bzw. zwei von vier Replikaten signifikant erhöht. Eine zehnfach höhere Konzentration führte zu 100 % Mortalität, eine zehnfach niedrigere Konzentration war subletal. Flupyradifuron reduzierte die Geschmackswahrnehmung und das appetitive Lernen. Dabei hatte nur die höchste verwendete Konzentration (8,3 *10 4 mol/l) einen signifikanten Einfluss, zwei zehnfach niedrigere Konzentrationen hatten keinen Effekt. Eine einmalige Flupyradifuron-Gabe störte das normale motorische Verhalten von Bienen und führte zu motorischen Ausfallerscheinungen. Dies war bei Winterbienen stärker ausgeprägt als bei Sommerbienen und wurde durch eine hohe Dosis (8.3 *10 4 mol/l) hervorgerufen. Nach einer chronischen Gabe über 24 h waren die Veränderungen weniger stark ausgeprägt. Imidacloprid führte nicht zu motorischen Ausfallerscheinungen. Insektizid-behandelte Bienen zeigten signifikant früheres Sammelverhalten. Dies galt für beide Replikate. Im zweiten Replikat zeigten die behandelten Bienen zudem mehr Sammelflüge und diese dauerten länger. Die Analyse von Gehirnstrukturen nach der Behandlung mit Flupyradifuron mit Hilfe von Lichtmikroskopier brachte keine Veränderungen zu Tage. Schlussfolgerungen: In hohen Konzentrationen beeinflusst das neue Insektizid Flupyradifuron Kognition und Motorik der Honigbiene in ähnlicher Weise wie die teilweise verbotenen Neonikotinoide. In niedrigeren Konzentrationen sind die Effekte weniger stark ausgeprägt. Zukünftige Studien sollten mögliche synergistische Effekte von Flupyradifuron in Kombination mit Pflanzenschutzmitteln, wie Fungiziden, aber auch in Kombination mit Parasiten und anderen Krankheitserregern untersuchen. / Introduction: Changing landscapes and pesticides resulting from intensified agriculture are two of the main threats for honeybees. Flupyradifurone is the active ingredient of a new pesticide released by Bayer AG under the name of “Sivanto”. It binds to the nicotinic acetylcholine receptor (nAchR) in the honeybee brain, similar to neonicotinoids. Aim: The aim of this study is to investigate effects of flupyradifurone on honeybee behavior und brain structure. Material and methods: The effect of a chronic application of flupyradifurone in different concentrations on mortality was studied in newly emerged summer bees and long lived winter bees (N = 30 per treatment, four replicates) over a period of ten days. Survival was analyzed using Kaplan-Meier –Method with log-rank Test. After feeding foraging honeybees (N = 46, 47, 48 respectively 55 per treatment in nectar foragers; N = 54, 68, 56 respectively 62 per treatment in pollen foragers) a single dose of flupyradifurone, gustatory responsiveness was quantified. Afterwards the bees were trained to an odor using classical olfactory conditioning. Memory was tested the next day. Statistical analysis was conducted using Logistic Regression. For post-hoc multiple comparisons we used the Least Significant Difference Test. Video analysis was conducted to test the effects of flupyradifurone on honeybee motor abilities in young summer bees and long lived winter bees. Flupyradifurone was administered once (N = 19 per treatment in summer; N = 17 respectively 16 per treatment in winter) or over the period of 24 h (N = 15 per treatment in summer; N = 18 per treatment in winter). For comparisons this experiment was repeated with the neonicotinoid imidacloprid (N = 17 respectively 16 per treatment for single administration; N = 16 per treatment for 24 h application). Non-parametric analysis of variance (Kruskal-Wallis H Test) and Pearson Chi-Square Test were applied to determine the effect of the insecticides on motor behavior between the different treatment groups. To test effects of flupyradifurone on honeybee foraging, RFID (radio frequency identification) technology was applied. Newly emerged worker bees (N = 100) were taken in a separated cage on top of the bee hive and treated with flupyradifurone. After one week the bees were released into the colony and their flight behavior was tracked for 40 days. The experiment was repeated twice. Kaplan-Meier-Method with log-rank Test was applied for comparing onset and end of foraging between the two treatment groups. Trips per active day and duration per trip between the different treatment groups were compared using Mann-Whitney U-Tests. Effects of flupyradifurone on honeybee brain structure were analyzed. Bees were treated with flupyradifurone for ten days. Brains (N = 10) were dissected and 5 µm sections were produced and stained with hematoxylin and eosin (H/E). For all experiments a significance level p < 0.05 was determined. Results: The mortality experiment revealed comparable results in newly emerged summer bees and long lived winter bees. The mortality of an intermediate concentration of approximately 1.0 µg flupyradifurone per bee per day was in three respectively two out of four replicates significantly increased. A tenfold higher concentration led to 100 % mortality, whereas a tenfold lower concentration was sublethal. Flupyradifurone reduced taste and appetitive learning performance in honeybees foraging for pollen and nectar. Only the highest concentration (8.3 *10 4 mol/l) had significant effects, whereas two tenfold lower concentrations had no effects. Flupyradifurone disturbed normal motor behavior and evoked motor disabilities after a single administration. The observed effects were stronger in long lived winter bees than in young summer bees. However, only a high dose (8.3 *10 4 mol/l) had these strong effects. After a continuous administration over 24 h the observed effects were less severe. Imidacloprid did not lead to motor disabilities. Pesticide-treated bees initiated foraging significantly earlier than control bees. This was true for both replicates. In the second replicate flupyradifurone treated bees furthermore showed more and longer foraging trips. Analyzing honeybee brains using light microscopy, no altered brain structures were observed after treating honeybees with flupyradifurone. Conclusion: High concentrations of flupyradifurone influence honeybee cognition and motor abilities in a similar way as the partly banned neonicotinoids. In lower concentrations, the observed effects are less severe. Future studies should examine possible synergistic effects of flupyradifurone between in combination with other pesticides, such as fungicides, but also in combination with parasites and other stressors, such as diseases.

Introduction Hepatitis E is a worldwide distributed disease, which is caused by the hepatitis E virus (HEV). In addition to humans, domestic pigs, wild boars, rabbits and dromedaries can be subclinically infected as reservoir animals with the zoonotic HEV genotypes 3, 4 and 7. In addition, HEV and HEV-like viruses have been described sporadically in other mammals, as well as in birds and fish, although their distinct role as reservoirs or carriers of the virus is still unclear. Aims The aim of the study was therefore to analyse in more detail the importance of different mammalian species, which do not belong to the known HEV reservoirs, for the epidemiology of HEV infections, thus enabling a better assessment of the risk of virus transmission by these animal species. Material and Methods Fourteen non-human primate species and 66 other mammal species, as well as Norway rats (Rattus norvegicus) and feeder rats (Rattus norvegicus forma domestica) from German zoos were selected for the investigations. In total 259 individual non-human primate sera and 244 individual mammalian sera of clinically healthy zoo animals were analysed for the presence of HEV-specific antibodies (ab) using a species-independent double-antigen sandwich ELISA. The non-human primate sera were additionally examined using a commercial human ELISA. Real-time reverse-transcription (RT)-PCR, nested broad-spectrum RT-PCR and a rat HEV-specific RT-PCR were used to detect the HEV genome in sera of mammals and rat liver samples. A commercial and an in-house method were used for the DNA sequencing. Results HEV-specific ab were detected in 3.9% (10/259) of the non-human primate sera (4 species) and 11.5% (28/244) of the mammalian sera (16 species). The highest detection rates were recorded with 33.3% (9/27) in porcines and with 27.0% (10/37) in carnivores. HEV-RNA was detected in a clinically healthy female Syrian brown bear (Ursus arctos syriacus) and in 8 of the investigated Norway rats. Sequence analysis identified the virus as rat HEV; the viruses from the bear and the free-ranging rats from the same zoo showed a high nucleotide sequence identity (94.6%–97.8%). Because of the small number of samples due to the small populations within the individual zoos, further statistical evaluations were not carried out. Conclusions The results show that non-human primates in zoos may be infected with HEV or HEV-like viruses; however, the low ab detection rates together with the negative genome detection argue against a high risk of virus transmission to humans. The study in other zoo-housed mammalian species was able to significantly increase the number of animal species with indications of HEV infections. In most animal species, only rare evidence and low detection rates were available, which can best be explained by “spillover-infections”. In addition to the expected high detection rate in porcine species, the high percentage of HEV antibody-positive carnivores is remarkable. Their role as possible HEV reservoir animals should therefore be clarified in further investigations. The detection of rat HEV in the serum of the bear and its high nucleotide sequence identity with the HEVs of the pest rodents provides first evidence of transmission of this virus species between rodents and carnivores.:List of content List of figures List of tables List of abbreviations 1 General introduction 1.1 Discovery of HEV 1.2 Taxonomy 1.3 Morphology 1.4 Genomic organisation 1.5 Viral replication 1.6 Hepatitis E in humans 1.7 Tools for HEV diagnosis 1.8 Therapy 1.9 Animal infections with HEV and HEV-like viruses 1.10 Experimental infections of animals 1.11 Geographical distribution 1.12 Transmission pathways 1.13 Epidemiology 1.14 Prevention 2 Aims of the study 3 Publications 3.1 Publication I 3.1.1 Summary of Publication I 3.1.2 Key messages of Publication I 3.1.3 Own contribution to Publication I 3.2 Publication II 3.2.1 Summary of Publication II 3.2.2 Key messages of Publication II 3.2.3 Own contribution to Publication II 3.3 Publication III 3.3.1 Summary of Publication III 3.3.2 Key messages of Publication III 3.3.3 Own contribution to Publication III 4 General discussion 4.1 HEV infections in various animal species 4.2 Prevalence of natural HEV infections in non-human primates 4.3 Prevalence of natural HEV infections in other zoo-housed mammals 4.4 Transmission pathways of HEV in a zoo-setting 4.5 Risk of virus transmission from zoo animals to humans 5 Conclusion and perspectives 6 Summary 7 Zusammenfassung 8 References List of animals investigated in the study List of publications Acknowledgements / Einleitung Hepatitis E ist eine durch das Hepatitis E-Virus (HEV) verursachte, weltweit verbreitete Erkrankung. Neben dem Menschen können Hausschwein, Wildschwein, Kaninchen und Dromedar als Reservoirtiere subklinisch mit den zoonotischen HEV-Genotypen 3, 4 und 7 infiziert werden. Darüber hinaus wurden HEV und HEV-ähnliche Viren vereinzelt bei weiteren Säugetieren, sowie Vögeln und Fischen beschrieben, wobei deren genaue Rolle als Reservoir oder Überträger des Virus bislang unklar ist. Ziele Ziel der Arbeit war es deshalb, die Bedeutung verschiedener Säugetierarten, die nicht zu den bekannten HEV-Reservoiren gehören, für die Epidemiologie der HEV-Infektionen besser zu erfassen und dadurch das Risiko einer Virusübertragung durch diese Tierarten besser abzuschätzen. Material und Methoden Vierzehn Affenarten und 66 weitere Säugetierarten, sowie Wanderratten (Rattus norvegicus) und Futterratten (Rattus norvegicus forma domestica) aus deutschen Zoos wurden für die Untersuchungen ausgewählt. Insgesamt wurden 259 individuelle Affenseren und 244 individuelle Säugerseren klinisch gesunder Zootiere mittels eines Spezies-unabhängigen Doppel-Antigen-Sandwich-ELISAs auf das Vorhandensein von HEV-spezifischen Antikörpern (AK) untersucht. Die Affenseren wurden zusätzlich mittels eines kommerziellen humanen ELISAs untersucht. Real-time reverse-transcription (RT)-PCR, nested broad-spectrum RT-PCR sowie eine Ratten-HEV-spezifische RT-PCR wurden für den HEV-Genomnachweis in Seren der Säuger und in Ratten-Lebern verwendet. Für die DNA-Sequenzierungen wurden eine kommerzielle und eine In-house-Methode verwendet. Ergebnisse In 3,9% (10/259) der Affenseren (4 Arten) und 11,5% (28/244) der Säugerseren (16 Arten) wurden HEV-spezifische AK nachgewiesen. Die höchsten Nachweisraten wurden mit 33,3% (9/27) in Schweineartigen und 27,0% (10/37) in Fleischfressern ermittelt. HEV-RNA wurde in einer klinisch gesunden Syrischen Braunbärin (Ursus arctos syriacus), sowie in 8 der untersuchten Wanderratten nachgewiesen. Die Sequenzanalyse identifizierte das Virus als Ratten-HEV; die Viren aus der Bärin und aus den wildlebenden Ratten desselben Zoos zeigten eine hohe Nukleotidsequenz-Identität (94,6%–97,8%). Weitergehende statistische Auswertungen wurden wegen der geringen Probenzahlen aufgrund der kleinen Populationen innerhalb der einzelnen Zoos nicht durchgeführt. Schlussfolgerungen Die Ergebnisse zeigen, dass Affen in Zoos mit HEV oder HEV-ähnlichen Viren infiziert sein können, jedoch sprechen die geringen AK-Nachweisraten zusammen mit den negativen Genomnachweisen gegen ein hohes Übertragungsrisiko auf den Menschen. Die Studie an anderen Säugetierarten in Zoos konnte die Zahl der Tierarten mit Hinweisen auf HEV-Infektionen deutlich erhöhen. Bei den meisten Tierarten lagen nur seltene Nachweise und niedrige Detektionsraten vor, die am besten durch „Spillover-Infektionen“ erklärt werden können. Neben der erwarteten hohen Nachweisrate bei Schweineartigen ist der hohe Prozentsatz an HEV AK-positiven Fleischfressern bemerkenswert, weshalb deren Rolle als mögliche HEV-Reservoirtiere in weiteren Untersuchungen geklärt werden sollte. Der Ratten-HEV-Nachweis im Serum der Bärin, sowie dessen hohe Nukleotidsequenz-Identität zu den HEVs der Schadnager geben erstmals Hinweise auf eine Übertragung dieser Virusart zwischen Nagern und Fleischfressern.:List of content List of figures List of tables List of abbreviations 1 General introduction 1.1 Discovery of HEV 1.2 Taxonomy 1.3 Morphology 1.4 Genomic organisation 1.5 Viral replication 1.6 Hepatitis E in humans 1.7 Tools for HEV diagnosis 1.8 Therapy 1.9 Animal infections with HEV and HEV-like viruses 1.10 Experimental infections of animals 1.11 Geographical distribution 1.12 Transmission pathways 1.13 Epidemiology 1.14 Prevention 2 Aims of the study 3 Publications 3.1 Publication I 3.1.1 Summary of Publication I 3.1.2 Key messages of Publication I 3.1.3 Own contribution to Publication I 3.2 Publication II 3.2.1 Summary of Publication II 3.2.2 Key messages of Publication II 3.2.3 Own contribution to Publication II 3.3 Publication III 3.3.1 Summary of Publication III 3.3.2 Key messages of Publication III 3.3.3 Own contribution to Publication III 4 General discussion 4.1 HEV infections in various animal species 4.2 Prevalence of natural HEV infections in non-human primates 4.3 Prevalence of natural HEV infections in other zoo-housed mammals 4.4 Transmission pathways of HEV in a zoo-setting 4.5 Risk of virus transmission from zoo animals to humans 5 Conclusion and perspectives 6 Summary 7 Zusammenfassung 8 References List of animals investigated in the study List of publications Acknowledgements

Einleitung: Für die Nottötung von Ferkeln am landwirtschaftlichen Betrieb steht bisher kein praktikables und kostengünstiges einstufiges Verfahren zur Verfügung. Derzeit wird am häufigsten der stumpfe Schlag auf den Kopf für nicht lebensfähige Ferkel bis fünf Kilogramm Körpergewicht zur Betäubung angewendet. Anschließend müssen die Tiere entblutet werden, um den Todeseintritt sicherzustellen. Während die Effektivität des Kopfschlages stark von den Fähigkeiten der ausführenden Person abhängt und schlecht standardisierbar ist, wird das Entbluten häufig vom Personal aus hygienischen sowie emotionalen Gründen abgelehnt. Ziele der Untersuchung: In der vorliegenden Arbeit sollte die Wirksamkeit des modifizierten penetrierenden Bolzenschusses zur kombinierten Betäubung und Tötung von Saugferkeln und Ferkeln bis 30 Kilogramm Körpergewicht untersucht werden. Zudem sollte eine geeignete Fixierung entwickelt werden und die Gründe für eine Nottötung sollten weitestmöglich erhoben werden. Tiere, Material und Methoden: Vor- und Hauptuntersuchung fanden zwischen Februar 2016 und Mai 2017 an zwei landwirtschaftlichen Betrieben statt. Im Rahmen der Voruntersuchung wurden die Modifikationen an den verwendeten Schussapparaten festgelegt sowie die Apparate an 20 toten Ferkeln mit einem Gewicht von 0,55 bis 27,00 Kilogramm erprobt. Dabei wurde der optimale Ansatz des Schussapparates durch eine anschließende pathologische Untersuchung aller geschossenen Tiere bestimmt. Es wurden außerdem zwei unterschiedliche Fixierungseinrichtungen (Kopfstütze und Netz) zur sicheren Durchführung der Betäubung und Tötung per penetrierendem Bolzenschuss entwickelt. Im Rahmen der Hauptuntersuchung wurden 198 Ferkel in sechs Versuchsgruppen (VG) mit einem Gewicht von 0,48 bis 39,00 Kilogramm getötet (VG 1: <1,30 kg; VG 2: 1,30-1,99 kg; VG 3: 2,00-4,99 kg; VG 4: 5,00-9,99 kg; VG 5: 10,00-19,99 kg; VG 6: 20,00->30,00 kg). Dafür wurden zwei penetrierende Bolzenschussapparate (turbocut Jopp GmbH, Bad Neustadt a. d. Saale) verwendet, wobei ein Apparat für Ferkel mit einem Gewicht bis fünf Kilogramm zum Einsatz kam (Gerät „Drei Puffer“, Bolzenaustrittslänge: 5,3 cm) und der andere für die schwereren Tiere (Gerät „Blitz Kerner“, Bolzenaustrittslänge: 8,3 cm). Neben einer Allgemeinuntersuchung vor der Tötung wurde direkt nach dem Schuss das klinische Bild erhoben sowie anhand von Reflexprüfungen, Zeit bis zur letzten Bewegung, bis zur finalen Pupillendilatation bzw. bis zum Sistieren des Herzschlages die Effektivität der Betäubung und der anschließende lückenlose Übergang in den Tod bestimmt. Der Tötungsvorgang wurde dazu jeweils per Videokamera (Digitale HD-Videokamera, Sony® HDR-PJ 260 VE, Tokio, Japan) dokumentiert. 16 der während der Hauptuntersuchung getöteten Ferkel mit einem Gewicht von 0,66 bis 39,00 Kilogramm wurden außerdem pathologisch untersucht. Um den Einfluss der untersuchten Variablen Gewicht, Allgemeinbefinden und Genauigkeit des Ansatzes des Schussapparates auf die Gesamtkrampfdauer sowie auf die Zeitintervalle bis zur letzten Bewegung und bis zur finalen Pupillendilatation zu bestimmen, wurde jeweils eine Kovarianzanalyse durchgeführt. Der Kruskal- Wallis-Test wurde verwendet, um die Abhängigkeit der Variablen Gesamtkrampfdauer und Zeitintervall bis zur letzten Bewegung sowie bis zur finalen Pupillendilatation von den Versuchsgruppen zu überprüfen. Ergebnisse: Die häufigsten Gründe für eine Nottötung waren Gelenkschwellungen und –entzündungen (35,4 % der Tiere). Die angestrebte Schussposition (bei Saugferkeln ca. 1-2 cm und bei größeren Ferkeln ca. 3-3,5 cm über der Augenhöhe in der Medianen; Schussrichtung dabei möglichst parallel zur Körperlängsachse in Richtung Schwanz) wurde bei knapp einem Viertel (24 %) der geschossenen Tiere nicht ganz genau erreicht, sondern es ergaben sich leichte Abweichungen. Dennoch war die erzielte Effektivität der Betäubung und Tötung mit 98,5 % sehr gut und wurde nur bei einem Tier aufgrund von Atembewegungen als nicht ausreichend bewertet. Dieses und eines der beiden Tiere mit fraglicher Betäubungseffektivität wurden nachgeschossen. Die nur bei wenigen Ferkeln zunächst tonischen und ansonsten überwiegend klonischen Krämpfe endeten bei fast allen Ferkeln (94 %) innerhalb von zwei Minuten nach dem Schuss. Sie waren bei Tieren mit stark beeinträchtigtem Allgemeinbefinden signifikant kürzer als bei solchen mit einer nur mäßigen Beeinträchtigung (p < 0,0001). Die untersuchten Einflussfaktoren erklärten jedoch nur 13 % der Variabilität der Krampfdauer. Bei den meisten Ferkeln endeten die Bewegungen und trat die finale Pupillendilatation innerhalb von vier Minuten nach dem Schuss ein. Fünf Ferkel bewegten sich länger als zehn Minuten. Bei Ansatz des Schussapparates mit Abweichungen endeten die Bewegungen später (p = 0,041) und auch die finale Pupillendilatation trat später ein (p = 0,016). Die untersuchten Einflussfaktoren erklärten jedoch nur 2 % der Variabilität der Bewegungsdauer bzw. 6 % der Variabilität der Dauer bis zur finalen Pupillendilatation. Der Herzschlag war in 63 % der Fälle bereits vier Minuten nach dem Schuss nicht mehr auskultierbar, in 2,2 % der Fälle jedoch noch länger als zehn Minuten. Das Elektrokardiogramm zeigte noch länger eine Herzaktivität an. Diese hielt bei 56 % der Ferkel mehr als zehn Minuten nach dem Schuss an. Die pathologischen Untersuchungen belegten, dass bei allen untersuchten Tieren das Stammhirn in unterschiedlichem Umfang zerstört worden war. Schlussfolgerungen: Die Untersuchung hat gezeigt, dass der modifizierte penetrierende Bolzenschuss ein praktikables und gut standardisierbares einstufiges Betäubungs- und Tötungsverfahren und damit ein sicheres Verfahren zur Nottötung von Ferkeln bis 30 Kilogramm Körpergewicht ist. Eine entsprechende Änderung der Tierschutz-Schlachtverordnung wird empfohlen. Der Schussbolzen verursacht zum einen eine Betäubung und wirkt des Weiteren tödlich durch eine Zerstörung des Stammhirns entsprechend der Wirkungsweise eines Gehirn-/Rückenmarkzerstörers. Nachteilig auf die Durchführbarkeit der Methode könnte sich die starke Krampfaktivität nach dem Schuss auswirken. Auch aufgrund des Blutverlustes aus dem Schussloch kann sie von Anwendern und Zuschauern aus ästhetischen Gründen abgelehnt werden. Im Anschluss an die Untersuchung konnte ein praxistauglicher Leitfaden für die Durchführung der Nottötung von Ferkeln bis 30 Kilogramm Lebendgewicht am landwirtschaftlichen Betrieb per Bolzenschuss als Ein-Schritt-Methode erstellt werden. / Introduction: There is currently no practical and cost-effective one-stage procedure available for the emergency killing of piglets on farm. At the moment, the percussive blow to the head is most commonly used for non-viable piglets up to five kilograms for stunning. The stunning must be followed by the bleeding of the animals to ensure their death. The effectiveness of the percussive blow to the head is heavily depending on the skills of the operator and difficult to standardize. Bleeding is often rejected by the staff for hygienic and emotional reasons. Objective: The aim of this work was to investigate the effectiveness of the modified penetrating captive bolt as a procedure for the combined stunning and killing of suckling piglets and piglets up to 30 kilograms of body weight. In addition, an appropriate fixation device should have been developed and the reasons for an emergency killing should have been investigated as far as possible. Animals, material and methods: The preliminary as well as the main investigation took place between February 2016 and May 2017 on two farms. In the course of the preliminary investigation, the modifications to the captive bolt devices were determined and the devices were tested on 20 dead piglets weighing between 0.55 and 27.00 kilograms. The optimal position for the application of the captive bolt device was determined by a subsequent pathological examination of all the animals shot. Additionally, two different fixation devices (headrest and net) were developed for the safe execution of the stunning and killing by penetrating captive bolt. As part of the main investigation, a total of 198 piglets in six groups (VG) weighing between 0.48 and 39.00 kilograms were killed (VG 1: <1.30 kg; VG 2: 1.30-1.99 kg; VG 3: 2.00-4.99 kg; VG 4: 5.00-9.99 kg; VG 5: 10.00-19.99 kg; VG 6: 20.00->30.00 kg). For this purpose, two penetrating captive bolt devices (turbocut Jopp GmbH, Bad Neustadt a. d. Saale, Germany) were used, one for piglets weighing up to five kilograms (device 'Drei Puffer', bolt exit length: 5.3 cm) and the other one for the heavier animals (device 'Blitz Kerner', bolt exit length: 8.3 cm). In addition to a general examination before killing, the clinical presentation was recorded immediately after the shot and the effectiveness of the stunning and the subsequent complete transition to death were determined on the basis of reflex tests, time until the last movement, until the final dilatation of the pupil and until the cessation of cardiac activity. The killing process was documented by a video camera (digital HD-video camera, Sony® HDR-PJ 260 VE, Tokyo, Japan). 16 of the piglets killed during the main investigation, weighing from 0.66 to 39.00 kilograms, were also examined pathologically. In order to determine the influence of the variables weight, general condition - 95 - and accuracy of the shooting position on the total convulsion duration as well as on the time intervals to the last movement and up to the final pupil dilation, analysis of covariance was performed. The Kruskal-Wallis-test was used to check the dependence of the variables total convulsion duration and time interval to the last movement as well as to the final pupil dilation on the experimental groups. Results: The swelling and the inflammation of the joints were the most frequent causes for an emergency killing (34.5% of the animals). The desired position for the application of the captive bolt gun (approx. 1-2 cm above eye level in the median for suckling piglets and approx. 3-3.5 cm above eye level in the median for larger piglets; the direction of the shot should be parallel to the body's longitudinal axis in the direction of the tail) was not exactly achieved in almost a quarter of the animals shot (24%), but slight deviations occurred. Nevertheless, the effectiveness of the stunning and killing was very good with 98.5% and only one animal was evaluated as insufficient due to breathing movements. This and one of the two animals with questionable stunning effectiveness were reshot. The initially tonic cramps in only a few piglets and otherwise predominantly clonic cramps ended in almost all piglets (94%) within two minutes after the shot. They were significantly shorter in animals with severely impaired general condition than in those with only moderate impairment (p < 0.0001). However, the factors investigated explained only 13% of the variability of the total convulsion duration. For most piglets, the movements ended and the final dilatation of the pupil occurred within four minutes after the shot. Five piglets moved for more than ten minutes. When the captive bolt device was attached with deviations, the movements ended later (p = 0.041) and the final dilatation of the pupil also occurred later (p = 0.016). However, the factors investigated explained only 2% of the variability of the movement duration and 6 % of the variability of the duration until the final dilatation of the pupil. In 63% of the cases, the heartbeat could no longer be detected by stethoscope four minutes after the shot, but in 2.2% of the cases it was still longer than ten minutes. The electrocardiogram showed even longer heart activity. In 56% of the piglets this activity lasted more than ten minutes after the shot. The pathological examinations showed that the brain stem had been destroyed to varying degrees in all the animals examined. Conclusions: The investigation has shown that the modified penetrating captive bolt is a practicable and well standardizable single-stage stunning and killing procedure and thus a safe method for the emergency killing of piglets up to 30 kilograms of body weight. A corresponding amendment to the national Animal Welfare Slaughter Ordinance is recommended. The bolt leads to stunning and it also acts fatally by destroying the brainstem according to the mode of action of pithing. The strong convulsive activity after the shot could have a negative effect on the feasibility of the method. It can also be rejected by users and spectators for aesthetic reasons due to the loss of blood from the shot hole. Following the study, a practical guide for carrying out the emergency killing of piglets up to 30 kg of live weight on farm by captive bolt as a one-step method could be drawn up.

Einleitung Erkrankungen des Bewegungsapparates haben bei Milchkühen eine hohe wirtschaftliche Bedeutung sowie enorme Auswirkungen auf das Tierwohl. Etwa 90 % der Lahmheiten beim Rind werden durch Klauenerkrankungen hervorgerufen. Die Ursachen dieser Klauenerkrankungen sind multifaktoriell und umfassen tier- und umweltassoziierte Faktoren. Die Pododermatitis aseptica diffusa ist eine der wichtigsten Ursachen für die Entstehung von umschriebenen Klauenlederhautentzündungen. In ihrer Pathogenese spielen Veränderungen der Zehendurchblutung eine zentrale Rolle. Die Pulsed-Wave (PW)-Dopplersonographie ist eine nicht invasive Technik zur Beurteilung des Blutflusses an Gefäßen und zur Untersuchung der Durchblutung von Organen. Jedoch liegen keine PW-Dopplersonographischen Untersuchungen an der Zehe des Rindes in der Literatur vor. Ziele der Untersuchungen Ziel der Untersuchungen war es, die Zehendurchblutung bei Rindern, die an einer Pododermatitis circumscripta solearis oder parietalis litten, im Milchviehbetrieb zu erfassen. Dazu wurde in einem ersten Schritt die Methodik der PW-Dopplersonographie an der Zehe der Hintergliedmaßen von gesunden Kühen etabliert. In einem zweiten Schritt wurden Blutflussmerkmale an den Hintergliedmaßen lahmer Kühe, die an einer Pododermatitis circumscripta solearis oder parietalis litten, erfasst, um Auswirkungen der Entzündung sowie weiterer als relevant erscheinender Einflussfaktoren für die Zehendurchblutung zu untersuchen. Material und Methoden In der Publikation 1 wurden 22 gesunde Deutsch Holstein Kühe einbezogen. Die Versuchstiere wurden im Betrieb einer klinischen Untersuchung inklusive einer Lahmheitsbeurteilung sowie einer Klauenpflege aller Gliedmaßen unterzogen. Am zweiten Versuchstag wurde eine sonographische Untersuchung beider Hintergliedmaßen am stehenden Tier durchgeführt. Zur sonographischen Untersuchung wurde das MyLab One (Esaote Deutschland GmbH) mit einem Linearschallkopf (10 MHz) ohne Vorlaufstrecke verwendet. Mittels Brightness(B)-Mode wurden Weichteilgewebe, synoviale Einrichtungen und Blutgefäße distal des Tarsus untersucht. In der Arteria (A.) interdigitalis wurde der Blutfluss mittels PW-Dopplersonographie beurteilt. Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm MyLap Desk auf einem Laptop. In die Publikation 2 wurden 33 lahme und 11 gesunde Deutsch Holstein Kühe einbezogen. Die lahmen Kühe litten an einer superfiziellen bis profunden Pododermatitis an der Außenklaue einer Hintergliedmaße. Die klinische und sonographische Untersuchung erfolgte wie in der Publikation 1 beschrieben. Für die statistische Bearbeitung der Daten wurde die procedure mixed (SAS, Version 9.4) verwendet. Ergebnisse In den Publikationen 1 und 2 konnte an 112 von 132 Hintergliedmaßen bei 66 Kühen ein auswertbares PW-Doppler-Signal gemessen werden. Bei 17 der 20 nicht auswertbaren Hintergliedmaßen lag nur eine mäßige B-Mode-Bildqualität vor. Die lahmen Kühe trippelten bei der sonographischen Untersuchung mehr als die gesunden Kühe. Blutflusskurventypen mit einem niedrigen peripheren Gefäßwiderstand liegen vor allem an den Hintergliedmaßen lahmer Kühe und Kurventypen mit einem hohen Widerstand am häufigsten bei gesunden Kühen vor. Lahme Kühe haben im Vergleich zu nicht-lahmen Kühen einen erhöhten Gefäßdurchmesser (D) und eine gesteigerte Blutflussrate (BF) sowie enddiastolische Blutflussgeschwindigkeit. Es bestehen keine Unterschiede zwischen der betroffenen Gliedmaße und der Gegengliedmaße lahmer Kühe. Ein numerisch höherer D, eine höhere BF sowie maximale systolische und maximale mittlere Blutflussgeschwindigkeit liegen bei Kühen mit einer mittelgradigen Lahmheit vor. Schlussfolgerungen Die PW-Dopplersonographie in Kombination mit dem in der Studie verwendeten Untersuchungsgang ist für die Messung des Blutflusses in der A. interdigitalis an den Hintergliedmaßen des Rindes sehr gut geeignet. Sowohl die bei den Kühen gefundenen Blutflusskurvenprofile als auch die quantitativen Blutflussmerkmale sind mit Werten von Pferden vergleichbar. Es liegt eine gesteigerte Durchblutung an den betroffenen Zehen und denen der Gegengliedmaße von lahmen Kühen im Vergleich zu gesunden Kühen vor. Nicht nur das Vorliegen einer umschriebenen Klauenlederhautentzündung, sondern auch ihr zeitlicher Verlauf, die Auswirkungen einer aktivierten Entzündungskaskade, das Vorliegen einer chronischen Klauenrehe und vor allem die Gewichtsbelastung und die Gewichtsverschiebung zwischen den Hintergliedmaßen müssen in die Beurteilung des digitalen Blutflusses einbezogen werden. Die erstmalig an der Rinderzehe ermittelten Blutflussdaten stellen eine gute Grundlage für weitere Forschungen auf dem Gebiet der Klauenrehe-Pathogenese dar.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Pododermatitis aseptica diffusa beim Rind 3 2.1.1 Definition 3 2.1.2 Symptomatik 3 2.1.2.1 Klinisches Stadium 3 2.1.2.1.1 Akute Form 3 2.1.2.1.2 Subakute Form 4 2.1.2.1.3 Chronische Form 4 2.1.2.2 Subklinisches Stadium 5 2.1.3 Ätiologie 5 2.1.3.1 Fütterung 5 2.1.3.1.1 Zusammenhang zwischen Fütterung und Dysfunktion des Blutgefäßsystems der Zehe 5 2.1.3.1.2 Kohlenhydrate 7 2.1.3.1.3 Proteine und Aminosäuren 9 2.1.3.1.4 Lipide 10 2.1.3.1.5 Spurenelemente 10 2.1.3.1.5.1 Kupfer 10 2.1.3.1.5.2 Zink 10 2.1.3.1.5.3 Mangan 11 2.1.3.1.5.4 Selen 11 2.1.3.1.6 Vitamine 11 2.1.3.1.6.1 Biotin 11 2.1.3.1.6.2 Vitamine A, D, E 12 2.1.3.1.7 Toxine 12 2.1.3.1.8 Bewertung der Versorgung mit Mineralstoffen, Spurenelementen und Vitaminen für die Klauengesundheit 12 2.1.3.2 Mechanische Faktoren 13 2.1.3.2.1 Digitales Fettpolster 13 2.1.3.2.2 Hypertrophie der Außenklaue an den Hintergliedmaßen 14 2.1.3.2.3 Dünne Sohlen 14 2.1.3.3 Hormonelle Veränderungen während der Transitphase 15 2.1.3.4 Haltung 17 2.1.4 Pathogenese 18 2.1.5 Reheassoziierte Klauenlederhautentzündungen 19 2.2 Anatomie des Blutgefäßsystems beim Rind 20 2.2.1 Arterien der Hintergliedmaße 20 2.2.1.1 Arterien am Ober- und Unterschenkel 20 2.2.1.2 Arterien an Mittelfuß und Zehen 21 2.2.1.2.1 Plantares System 21 2.2.1.2.2 Dorsales System 21 2.2.2 Venen der Hintergliedmaße 21 2.2.2.1 Venen am Ober- und Unterschenkel 21 2.2.2.2 Venen an Mittelfuß und Zehen 22 2.2.2.2.1 Plantares System 22 2.2.2.2.2 Dorsales System 22 2.2.3 Blutgefäßsystem der Klauen 23 2.2.3.1 Arterien 23 2.2.3.2 Venen 23 2.2.3.3 Arterio-venöse Anastomosen 24 2.3 Bildgebende Verfahren zur Darstellung des Gefäßsystems 24 2.3.1 Allgemein 24 2.3.2 Brightness Mode Sonographie 25 2.3.2.1 Prinzip 25 2.3.2.2 Allgemeine Anwendung an der Gliedmaße 25 2.3.2.3 Spezielle Anwendung zur Untersuchung des Blutgefäßsystems an der Gliedmaße distal des Tarsus 26 2.3.3 Pulsed-Wave-Dopplersonographie 27 2.3.3.1 Prinzip 27 2.3.3.2 Merkmale 29 2.3.3.3 Allgemeine Anwendung 30 2.3.3.4 Anwendung an der Gliedmaße 30 2.3.4 Weitere bildgebende Verfahren 33 2.3.4.1 Angiographie 33 2.3.4.1.1 Prinzip 33 2.3.4.1.2 Anwendung an der Gliedmaße 34 2.3.4.2 Szintigraphie 34 2.4 Zusammenfassende Schlussfolgerungen aus dem Literaturstudium 35 3 Publikation 1 37 4 Publikation 2 47 5 Diskussion 59 5.1 Auswahl des Messpunktes und Messbarkeit des Blutflusses 59 5.2 Verhalten 60 5.3 Gliedmaßenstellung 60 5.4 Qualitative Blutflussmerkmale 61 5.5 Quantitative Blutflussmerkmale 62 6 Zusammenfassung 66 7 Summary 68 8 Literaturverzeichnis 70 9 Danksagung 96 / Introduction Diseases of the locomotor system in dairy cattle have a huge economic and welfare importance. Nearly 90 % of lameness in cattle is caused by claw disease. The reasons are multifactorial and include animal as well as environmental factors. Claw horn disruption is the main cause for the development of claw horn lesions. Changes in the blood circulation of the toes play an essential role in their pathogenesis. Pulsed-Wave (PW)-Doppler ultrasonography is a non-invasive technique to evaluate the flow in blood vessels and to examine the blood circulation of an organ. However, there have not been any PW-Doppler ultrasonographical investigations for the bovine limb in the literature yet. Aims The objective of this investigation is to measure the blood flow of the toes in dairy cattle suffering from sole ulcer or white line disease in dairy farms. In a first step the PW-Doppler ultrasonography was established at the toe of hindlimbs in healthy dairy cattle. In a second step blood flow variables in the hindlimbs of lame cows affected by a sole ulcer or white line disease were recorded to evaluate the consequence of inflammation as well as to examine further factors seem to influence the blood flow of the toes. Material and Methods Twenty-two German Holstein cows were included in the first publication. The cows were examined clinically in the farm including an evaluation of the lameness score as well as a claw trimming of all limbs. One day after an ultrasonography was performed in standing position in both hind limbs. For the examination a MyLabOne (Esaote Deutschland GmbH) with a linear transducer without a standoff pad was used. Soft tissue, synovial structures and blood vessels distal of the tarsal region were examined by using a Brightness (B)-mode ultrasonography. In the interdigital arteria the blood flow was measured by PW-Doppler ultrasonography. The analysis of the data was carried out by the program MyLabDesk on a laptop. The second publication included 33 lame and 11 healthy German Holstein cows. The lame cows suffered from a superficial too profound sole ulcer or white line disease at the outer claw of one hind limb. The clinical and ultrasonographical examination took place analogically to the first publication. For the statistical analyses the MIXED procedure (SAS, version 9.4) was used. Results Combining both publications in 112 of 132 hindlimbs a usable PW-Doppler signal was generated. Seventeen of the 20 not usable signals the B-mode quality was moderate. During the ultrasonography lame cows pattered their limbs more often than healthy cows. Blood flow profiles with a low peripheral resistance are more common in the hindlimbs of lame cows and profiles with a high peripheral resistance are most frequent in healthy cows. Lame cows have a higher vessel diameter (D), blood flow rate (BF) and end-diastolic blood flow velocity compared to healthy cows. There was no difference in the affected compared to the opposite limbs of lame cows. A numerical higher D, BF as well as maximum systolic and maximum time-averaged mean blood flow velocity occurred in moderate lame cows compared to mild lame cows. Conclusions The PW-Doppler ultrasonography is well suited for the evaluation of the blood flow in the bovine interdigital artery at the hindlimbs. The observed blood flow profiles as well as quantitative blood flow parameters are comparable to data in horses. There is an increased blood circulation in the affected and the opposite limb of lame cows compared to healthy cows. Not only the existence of the claw horn lesions but also their chronological progress, the influence of the inflammatory cascade, the availability of chronic claw horn disruption and especially weight bearing and weight shifting between hindlimbs have to be considered in the assessment of the blood flow of toes. The for the first-time generated blood flow parameters provide a good basis for further investigations in the topic of claw horn disruption pathogenesis.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Pododermatitis aseptica diffusa beim Rind 3 2.1.1 Definition 3 2.1.2 Symptomatik 3 2.1.2.1 Klinisches Stadium 3 2.1.2.1.1 Akute Form 3 2.1.2.1.2 Subakute Form 4 2.1.2.1.3 Chronische Form 4 2.1.2.2 Subklinisches Stadium 5 2.1.3 Ätiologie 5 2.1.3.1 Fütterung 5 2.1.3.1.1 Zusammenhang zwischen Fütterung und Dysfunktion des Blutgefäßsystems der Zehe 5 2.1.3.1.2 Kohlenhydrate 7 2.1.3.1.3 Proteine und Aminosäuren 9 2.1.3.1.4 Lipide 10 2.1.3.1.5 Spurenelemente 10 2.1.3.1.5.1 Kupfer 10 2.1.3.1.5.2 Zink 10 2.1.3.1.5.3 Mangan 11 2.1.3.1.5.4 Selen 11 2.1.3.1.6 Vitamine 11 2.1.3.1.6.1 Biotin 11 2.1.3.1.6.2 Vitamine A, D, E 12 2.1.3.1.7 Toxine 12 2.1.3.1.8 Bewertung der Versorgung mit Mineralstoffen, Spurenelementen und Vitaminen für die Klauengesundheit 12 2.1.3.2 Mechanische Faktoren 13 2.1.3.2.1 Digitales Fettpolster 13 2.1.3.2.2 Hypertrophie der Außenklaue an den Hintergliedmaßen 14 2.1.3.2.3 Dünne Sohlen 14 2.1.3.3 Hormonelle Veränderungen während der Transitphase 15 2.1.3.4 Haltung 17 2.1.4 Pathogenese 18 2.1.5 Reheassoziierte Klauenlederhautentzündungen 19 2.2 Anatomie des Blutgefäßsystems beim Rind 20 2.2.1 Arterien der Hintergliedmaße 20 2.2.1.1 Arterien am Ober- und Unterschenkel 20 2.2.1.2 Arterien an Mittelfuß und Zehen 21 2.2.1.2.1 Plantares System 21 2.2.1.2.2 Dorsales System 21 2.2.2 Venen der Hintergliedmaße 21 2.2.2.1 Venen am Ober- und Unterschenkel 21 2.2.2.2 Venen an Mittelfuß und Zehen 22 2.2.2.2.1 Plantares System 22 2.2.2.2.2 Dorsales System 22 2.2.3 Blutgefäßsystem der Klauen 23 2.2.3.1 Arterien 23 2.2.3.2 Venen 23 2.2.3.3 Arterio-venöse Anastomosen 24 2.3 Bildgebende Verfahren zur Darstellung des Gefäßsystems 24 2.3.1 Allgemein 24 2.3.2 Brightness Mode Sonographie 25 2.3.2.1 Prinzip 25 2.3.2.2 Allgemeine Anwendung an der Gliedmaße 25 2.3.2.3 Spezielle Anwendung zur Untersuchung des Blutgefäßsystems an der Gliedmaße distal des Tarsus 26 2.3.3 Pulsed-Wave-Dopplersonographie 27 2.3.3.1 Prinzip 27 2.3.3.2 Merkmale 29 2.3.3.3 Allgemeine Anwendung 30 2.3.3.4 Anwendung an der Gliedmaße 30 2.3.4 Weitere bildgebende Verfahren 33 2.3.4.1 Angiographie 33 2.3.4.1.1 Prinzip 33 2.3.4.1.2 Anwendung an der Gliedmaße 34 2.3.4.2 Szintigraphie 34 2.4 Zusammenfassende Schlussfolgerungen aus dem Literaturstudium 35 3 Publikation 1 37 4 Publikation 2 47 5 Diskussion 59 5.1 Auswahl des Messpunktes und Messbarkeit des Blutflusses 59 5.2 Verhalten 60 5.3 Gliedmaßenstellung 60 5.4 Qualitative Blutflussmerkmale 61 5.5 Quantitative Blutflussmerkmale 62 6 Zusammenfassung 66 7 Summary 68 8 Literaturverzeichnis 70 9 Danksagung 96

Einleitung Die Kuhpockenvirusinfektion (CPXV-Infektion) ist eine sporadisch auftretende, meldepflichtige Erkrankung mit zoonotischem Potenzial. Sie wurde in den letzten sechs Jahrzehnten in vielen Säugetierspezies inkl. des Menschen beschrieben und erforscht. Sie äußert sich in zwei Verlaufsformen: mild, lokalisiert, selbstlimitierend oder generalisiert, dramatisch bis letal. Als Erregerreservoir dienen dem Virus wildlebende Nager (Wühlmäuse). Aktuell ist für diese Infektion keine kausale Therapie zugelassen, Prävention kann mittels prophylaktischer Impfung mit dem Modifizierten Vaccinia Virus Ankara (MVA)-Impfstoff erzielt werden. Für Neuweltkameliden wurde die CPXV-Infektion bisher nur dreimal beschrieben. Detaillierte Erkenntnisse zur Epidemiologie, klinischem Erscheinungsbild und Prävention dieser Infektion bei Neuweltkameliden fehlen. Vier unabhängige Cluster von CPXV-Infektion in ostdeutschen Alpakabeständen in nur fünf Jahren, bekannt geworden durch fünf Alpakas mit generalisierter CPXV-Infektion mit jeweils letalem Ausgang als Patienten der Klinik für Klauentiere Leipzig, gaben Anlass, die Infektion bei dieser Spezies genauer zu untersuchen. Ziele der Untersuchungen Ziel der Studie war, auf Basis einer Literaturrecherche einen Überblick über das Wesen der CPXV-Infektion und ihre Relevanz bei Neuweltkameliden zu gewinnen. Anhand von Bestandsuntersuchungen in vier Alpakabeständen sollten Informationen zur Epidemiologie der CPXV-Infektion mit Erregernachweis im Einzeltier, Erregerverbreitung in der Herde und Erregerreservoir gesammelt werden. Ebenso wurde in zwei der vier Alpakabestände eine Bestandsimpfung mit dem MVA-Impfstoff durchgeführt, um die Verträglichkeit und die Immunogenität dieses Impfstoffes beim Alpaka zu überprüfen. Tiere, Material und Methoden Vier Alpakabestände (107 Alpakas) wurden zweimal im Abstand von 19 – 54 Tagen besucht. Anhand der klinischen Untersuchung und verschiedener Proben (Blut, Tupferproben, Krusten von Hautläsionen, Kot) wurden CPXV-infizierte Tiere identifiziert. Wildlebende Nager als potenzielles Erregerreservoir wurden in der Umgebung der Bestände gefangen. Ein indirekter Immunfluoreszenztest (IFA) wurde zum Nachweis CPXV-spezifischer Antikörper aus dem Serum (Alpakas) bzw. Serum/Transsudat (Nager) eingesetzt, eine real-time PCR diente zum Nachweis von CPXV-spezifischer DNA aus Kot/Tupferproben/Krusten (Alpakas) bzw. Organproben (Nager). In zwei Alpakabeständen wurden 94 Tiere mit dem MVA-Impfstoff zweimal im Abstand von vier Wochen geimpft. Eine Ausnahmegenehmigung nach §17c Abs. 4 Nr. 2 Buchstabe a) des Tierseuchengesetzes vom 22. Juni 2004 (BGBl.I S. 1260) lag für beide Bestände vor. Vier Wochen nach jeder Impfung und 6 bzw. 12 Monate nach der 2. Impfung wurden von allen Tieren Serum (für IFA) und Tupferproben (für PCR) entnommen. Etwaige Impfreaktionen wurden vier Wochen nach jeder Impfung aufgezeichnet. Bei 14 Crias wurde 2 – 12 Wochen post partum eine Serumprobe auf spezifische maternale Antikörper untersucht. Ergebnisse Insgesamt wurden 28 von 107 Tieren mittels IFA und/oder PCR als CPXV-infiziert identifiziert. Die Seroprävalenz pro Bestand schwankte zwischen 16,1 % und 81,2 %. Auch beim Alpaka traten zwei klinische Verlaufsformen auf: mild, lokalisiert, selbstlimitierend vs. generalisiert, letal. In zwei Beständen wurden CPXV-spezifische Antikörper in den gefangenen Nagern gefunden. Im dritten Bestand konnte CPXV aus einer Feldmaus (Microtus arvalis) isoliert werden. Vollgenomsequenzierung dieses Isolates und der Vergleich mit dem Genom von CPXV aus einem Alpaka des gleichen Bestandes ergaben 99,997 % Übereinstimmung. In diesem Bestand wurde CPXV an einer Bürste zur Fellpflege nachgewiesen, die Erregerübertragung durch indirekten Tierkontakt und tierbezogene Utensilien erscheint bei Alpakas am wahrscheinlichsten. Die MVA-Impfung war auch bei Alpakas sicher und gut verträglich. Nach zweimaliger Grundimmunisierung konnte eine Antikörper-Seroprävalenz pro Bestand von 81,3 % bzw. 91,7 % nachgewiesen werden. Im Laufe eines Jahres sank diese auf 15,6 % bzw. 45,8 %, Neuerkrankungen wurden nicht detektiert. In 50,0 % der beprobten Crias wurden maternale Antikörper nachgewiesen. Schlussfolgerungen Das ubiquitäre Erregerreservoir Wühlmaus in Verbindung mit an Popularität zunehmenden Alpakas, als vollempfängliche Spezies für CPXV weisen auf ein gesteigertes Risiko für zukünftige zoonotische CPXV-Infektionen hin. Die MVA-Impfung schützt Alpakas erfolgreich vor einer generalisierten CPXV-Infektion. Die Dauer des Impfschutzes und geeignete Auffrischungs-Impfregime gilt es in Langzeitstudien zu erforschen.:Inhalt 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Alpaka 2.1.1 Zoologische Einordnung, Herkunft, Nutzung 2.1.2 Haltung 2.1.3 Viruserkrankungen bei Neuweltkameliden in Europa 2.2 Die Kuhpockenvirusinfektion 2.2.1 Ätiologie 2.2.2 Wirtsspektrum und Erregerreservoir 2.2.3 Diagnostik 2.2.4 Klinisches Erscheinungsbild 2.2.5 Differentialdiagnosen 2.2.6 Therapie/Prophylaxe 2.3 Der MVA-Impfstoff 2.4 Schlussfolgerung aus der Literaturrecherche und Zielstellung 3 Publikation 1 4 Publikation 2 5 Publikation 3 6 Diskussion 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis 10 Danksagung / Introduction Cowpox virus (CPXV) infection is a reportable and potentially zoonotic disease that occurs sporadically in a variety of animals and in humans. It has been extensively researched and described in both domestic and zoo animals as well as in humans. Although infected individuals generally have a mild form of disease, cases of fatal generalized CPXV infection have also been described. Prevention by prophylactic vaccination using modified vaccinia virus Ankara (MVA) vaccine is the only method of protecting animals against disease. CPXV infection has been described in South American camelids, but data on its epidemiology, clinical features and prevention are lacking. Four CPXV outbreaks occurred in unrelated alpaca herds in Eastern Germany in a five-year period. The diagnosis in those herds was based on five cases with severe, generalized and lethal CPXV infection referred to the Department for Ruminants and Swine in Leipzig. The outbreaks provided us with an opportunity to better understand CPXV-infection in this species. Aims of the study The first aim of the study was to conduct a literature review of the clinical features of CPXV infection in South American Camelids and to compare their clinical signs with those of other animal species. The second goal was to evaluate the epidemiology of CPXV infection in four alpaca herds by evaluating the mode of virus transmission and the occurrence of CPXV in individual alpacas and in putative reservoir hosts. The third goal was to determine the safety and immunogenicity of MVA vaccine in alpacas by using in a prime-boost MVA vaccination regimen in two alpaca herds. Material and methods Four alpaca herds (107 animals) were evaluated on two separate occasions, and samples (serum, swab samples, crusts of suspicious pox lesions, feces) were collected to identify CPXV-infected animals. Wild small mammals were trapped on the alpaca farms to investigate the potential source of infection. Serum (alpacas, rodents) and/or transudate (rodents) samples were used to detect CPXV-specific antibodies using an indirect immunofluorescence assay (IFA). Swab samples, crusts and feces (alpacas) or organ tissue (rodents) were used for the detection of CPXV-specific DNA in a real-time PCR. A total of 94 animals from two alpaca herds were vaccinated twice with MVA vaccine. A special exemption was obtained from the relevant Ministries of the Federal States under German law. Blood samples (serum, IFA) and swab samples (PCR) were collected 4 weeks after prime and boost vaccination as well as 6 and 12 months after boost vaccination. In 14 crias, 1 blood sample was collected 2 – 12 weeks after birth to determine the presence of specific maternal antibodies (serum, IFA). Results A total of 28 of 107 animals were diagnosed with CPXV using IFA and/or PCR. Herd seroprevalence ranged from 16.1% to 81.2%. The clinical signs in infected animals were mostly mild, localized and self-limiting, but 5 animals had generalized signs and died. In two herds, CPXV-specific antibodies were found in the local rodent population. In the third herd, CPXV was isolated from a common vole (Microtus arvalis); full genome sequencing and comparison with the genome of CPXV from an alpaca on the same farm revealed a 99.997% match. Virus transmission through indirect contact seems likely because CPXV-specific DNA was detected on a brush used for grooming. MVA vaccine was well tolerated and safe in vaccinated alpacas. Seroprevalence after booster vaccination was 81.3% in one herd and 91.7% in the other. Detectable antibody titers declined to 15.6% and 45.8% over a 12-month period after booster vaccination. New CPXV infections were not detected in this period. Specific maternal antibodies were detected in 50.0% of newborn crias. Conclusions With the recent increase in their popularity, alpacas may pose an increased risk of zoonotic disease spread because of their susceptibility to CPXV infection and their relatively close proximity to reservoir hosts such as rodents. Prevention of generalized CPXV infection in alpacas using MVA vaccine appears feasible. The duration of immunity and appropriate booster vaccination regimens need to be verified in long-term studies.:Inhalt 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Alpaka 2.1.1 Zoologische Einordnung, Herkunft, Nutzung 2.1.2 Haltung 2.1.3 Viruserkrankungen bei Neuweltkameliden in Europa 2.2 Die Kuhpockenvirusinfektion 2.2.1 Ätiologie 2.2.2 Wirtsspektrum und Erregerreservoir 2.2.3 Diagnostik 2.2.4 Klinisches Erscheinungsbild 2.2.5 Differentialdiagnosen 2.2.6 Therapie/Prophylaxe 2.3 Der MVA-Impfstoff 2.4 Schlussfolgerung aus der Literaturrecherche und Zielstellung 3 Publikation 1 4 Publikation 2 5 Publikation 3 6 Diskussion 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis 10 Danksagung

Die Technik der intravitrealen Gentamicin Injektion darzulegen, die Auswirkungen dieser auf die klinischen Symptome von Uveitiden, sowie die möglichen unmittelbaren Komplikationen (innerhalb von 24 Stunden) und längerfristigen Komplikationen (30 bis 780 Tage) die mit dieser Technik verbunden sein können, zu beschreiben. Zusätzlich wurde der okuläre und systemische Leptospiren- Status ermittelt und der Einfluss dieser auf das Behandlungsergebnis untersucht.:Table of Contents 1 INTRODUCTION 1 2 LITERATURE OVERVIEW 2 2.1 Etiology and pathogenesis 2 2.1.1 Proposed etiologies 2 2.1.2 ERU: an immune mediated disease 3 2.2 Leptospirosis and ERU 4 2.2.1 Genetic predisposition for ERU 6 2.3 Definition of ERU 7 2.3.1 Classification and syndromes 7 2.3.2 Clinical symptoms 8 2.4 Diagnostic testing for ERU (Leptospira) 8 2.4.1 Sample collection (aqueous humor, vitreous humor, serum) 8 2.4.2 Methodology 9 2.4.2.1 Microagglutination test (MAT) 9 2.4.2.2 Polymerase chain reaction (PCR) 10 2.4.2.3 Cultures 10 2.5 Treatment of ERU 10 2.5.1 Medical management 10 2.5.2 Intravitreal and suprachoroidal injections 11 2.5.2.1 Intravitreal rapamycin injections 11 2.5.2.2 Intravitreal triamcinolone injections 11 2.5.2.3 Suprachoroidal triamcinolone injections 12 2.5.2.4 Low-dose intravitreal gentamicin injections 12 2.5.3 Surgical procedures 13 2.5.3.1 Suprachoroidal cyclosporine implants 13 2.5.3.2 Pars plana vitrectomy 14 3 PUBLICATIONS 16 3.1 Intravitreal injection of low-dose gentamicin for the treatment of recurrent or persistent uveitis in horses: Preliminary results 16 3.2 Medical and Surgical Management of Equine Recurrent Uveitis 29 4 DISCUSSION 47 5 ZUSAMMENFASSUNG 51 6 SUMMARY 52 7 REFERENCES 53 / To describe the intravitreal gentamicin injection technique, report the effects of the injection on the clinical signs of uveitis and to describe the associated peri-injection (within 24 hours) and post-injection complications (30 to 780 days). Additionally, evaluation of the systemic and ocular Leptospira status and its effects on the treatment outcome was performed.:Table of Contents 1 INTRODUCTION 1 2 LITERATURE OVERVIEW 2 2.1 Etiology and pathogenesis 2 2.1.1 Proposed etiologies 2 2.1.2 ERU: an immune mediated disease 3 2.2 Leptospirosis and ERU 4 2.2.1 Genetic predisposition for ERU 6 2.3 Definition of ERU 7 2.3.1 Classification and syndromes 7 2.3.2 Clinical symptoms 8 2.4 Diagnostic testing for ERU (Leptospira) 8 2.4.1 Sample collection (aqueous humor, vitreous humor, serum) 8 2.4.2 Methodology 9 2.4.2.1 Microagglutination test (MAT) 9 2.4.2.2 Polymerase chain reaction (PCR) 10 2.4.2.3 Cultures 10 2.5 Treatment of ERU 10 2.5.1 Medical management 10 2.5.2 Intravitreal and suprachoroidal injections 11 2.5.2.1 Intravitreal rapamycin injections 11 2.5.2.2 Intravitreal triamcinolone injections 11 2.5.2.3 Suprachoroidal triamcinolone injections 12 2.5.2.4 Low-dose intravitreal gentamicin injections 12 2.5.3 Surgical procedures 13 2.5.3.1 Suprachoroidal cyclosporine implants 13 2.5.3.2 Pars plana vitrectomy 14 3 PUBLICATIONS 16 3.1 Intravitreal injection of low-dose gentamicin for the treatment of recurrent or persistent uveitis in horses: Preliminary results 16 3.2 Medical and Surgical Management of Equine Recurrent Uveitis 29 4 DISCUSSION 47 5 ZUSAMMENFASSUNG 51 6 SUMMARY 52 7 REFERENCES 53

Artikulärer Knorpel weist ein geringes Selbstheilungspotential auf und aktuelle Methoden zur Therapie von Knorpeldefekten resultieren meist im Aufbau fibrösen, mechanisch inferioren Regenerationsgewebes. Deshalb wird stetig versucht neue Therapiemethoden zu entwickeln, die häufig auf Tissue Engineering basieren. Ein Ansatz sind biogedruckte Tissue Engineering Konstrukte, die es ermöglichen durch das „Eindrucken“ vitaler Zellen die komplexen zellulären Strukturen des Knorpelgewebes nachzubilden. Trotz vielsprechender Ergebnisse in vitro, scheitert die langfristige Regeneration von Knorpeldefekten mittels Tissue Engineering jedoch häufig an der mangelnden Fixierung und Integration der Konstrukte in das umliegende Gewebe. Besonders um biogedruckte Hydrogelkonstrukte, für die viele gängigen Fixierungsoptionen ungeeignet sind, für das Knorpel Tissue Engineering nutzbar zu machen, müssen daher neue Fixierungs- und Integrationsmethoden entwickelt werden. Als Ansatz zur Verbesserung der osteochondralen Integration von Knorpelersatzmaterialien wurde im Rahmen dieser Arbeit ein GDF-5 beladener Gewebekleber getestet. GDF-5, ein Knorpelmorphogenetisches Protein, kann die chondrogene Differenzierung sowie die Hypertrophie von Vorläuferzellen fördern. Durch den Einsatz eines GDF-5 beladenen Gewebeklebers sollen in den Defekt einwandernde, wirtseigene Progenitorzellen zur chondrogenen Differenzierung und Mineralisierung angeregt werden, mit dem Ziel eine mineralisierte Knorpelgewebsschicht zwischen der subchondralen Knochen-platte und dem implantierten Tissue Engineering Konstrukt zu generieren und so dessen Integration zu verbessern.

Derzeit erfolgt in Deutschland lediglich eine Erfassung anzeigepflichtiger Tierseuchen und meldepflichtiger Tierkrankheiten bei Equiden. Folglich besteht ein Bedarf an Informationen aus klinischen und post-mortem-Statistiken, um frühzeitig Hinweise auf Veränderungen im Erkrankungsspektrum dieser Tiere zu erhalten. Im Rahmen entsprechender Auswertungen ist es zudem möglich, Daten zu selten auftretenden Alterationen zu sammeln. Allerdings müssen bei der Interpretation der Ergebnisse Einflussfaktoren, die die Zusammensetzung des Untersuchungsgutes beeinflussen, berücksichtigt werden, da die ausgewerteten Fälle, insbesondere in retrospektiven Arbeiten, in der Regel nicht für eine bestimmte Population repräsentativ sind. Ziel dieser Arbeit war es daher, sich einen Überblick über die Hauptbefunde, welche in Equiden-Sektionen am Institut für Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig und an der Tierärztlichen Hochschule Dresden zwischen 1890 und 2013 erhoben wurden, zu verschaffen. Darüber hinaus sollten Veränderungen im Krankheitsspektrum während des Untersuchungszeitraumes und epizootiologische Einflussfaktoren (Alter, Rasse, Geschlecht) untersucht sowie die Art und Prävalenz der haupt- und nebenbefundlich diagnostizierten Tumoren festgestellt werden. Anschließend sollten die getroffenen Beobachtungen unter Beachtung von zeitgeschichtlichen Aspekten und den Ergebnissen anderer Statistiken aus der Literatur interpretiert werden. Für die Statistik standen die Daten von 4743, zwischen 1890 und 2013 am Institut für Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig bzw. an der Tierärztlichen Hochschule Dresden durchgeführten Equiden-Obduktionen zu Verfügung. Es erfolgte eine Erfassung der Angaben zu Monat und Jahr der Obduktion, Alter, Rasse, Geschlecht, Herkunftsort, weiterführenden Untersuchungen (Bakteriologie, Virologie, Toxikologie, Parasitologie, histologische Spezialfärbungen, Immunhistologie) und den erhobenen Befunden. Sofern vorhanden, wurden Informationen zur Anamnese und intra vitam festgestellten Diagnosen einbezogen. Nur in 79,6 %, 53,2 % bzw. 88,0 % der Fälle waren Angaben zu Alter, Rasse bzw. Geschlecht erhalten. Über den gesamten Untersuchungszeitraum betrachtet, waren die sezierten Equiden am häufigsten von einer Erkrankung der Verdauungsorgane (36,5 %), gefolgt von Alterationen der Atmungsorgane (10,5 %), des Nervensystems (9,6 %), der Kreislauforgane (8,4 %), des Stütz- und Bewegungsapparates (7,7 %) und generalisierten Veränderungen (7,4 %) als Hauptbefund betroffen. Weniger häufig traten Alterationen während der Trächtigkeit (5,2 %) oder im Bereich der großen Körperhöhlen (4,0 %), der Leber (3,1 %), des hämatopoetischen Systems (1,7 %), der Harnorgane und des Nabels (1,5 %), der Geschlechtsorgane (1,3 %), der Haut (0,9 %), des Endokriniums (0,2 %) sowie des Auges (0,0 %) auf. Unter dem Begriff „Sonstige Erkrankungen“ (2,0 %) wurden Fälle mit unklarer Genese, ohne Sektion oder Tiere mit ausgeprägter Autolyse und/oder Fäulnis zusammengefasst. Im Vergleich zum Beginn der Auswertungsperiode, nahm der Anteil der Veränderungen im Bereich des Verdauungstraktes, insbesondere infolge einer Reduktion der Fälle mit einer Quer- oder Längsachsendrehung bzw. der Tiere mit einer Obstipation (84/264 zwischen 1970 und 1989 diagnostiziert), im Verlauf der Jahrzehnte ab (1890-1899: 52,6 %; 1900-1909: 58,2 %; 2000-2009: 35,8 %; 2010-2013: 38,0 %). Demgegenüber traten in den 1990er Jahren die meisten Fälle mit dem Hauptbefund „Erkrankung des Nervensystems“, ausgelöst durch einen hohen Anteil an Equiden mit der Diagnose „Bornasche Krankheit“ (BD; 7,8 %), auf. Die Zunahme dieses Hauptbefundes unter den Obduktionstieren kann durch die deutsche Wiedervereinigung im Jahr 1990 und die damit verbundenen Änderungen im Bereich des Tierseuchenrechts erklärt werden. Seit 2000 ist der Anteil der Equiden mit dem Nachweis einer BD wieder rückläufig (2000-2009: 5,3 %; 2010-2013: 1,3 %). Im Vergleich zum gesamten Untersuchungszeitraum (1890-2013) fanden sich zudem zwischen 1990 und 2013 häufiger Alterationen während der Trächtigkeit (8,8 %) bzw. mehr Veränderungen im Bereich des Stütz- und Bewegungsapparates (10,4 %), der Haut (1,2 %) oder des Endokriniums (0,5 %). Während die Zunahme der Aborte am ehesten mit einer Änderung des Forschungsschwerpunktes des Institutes für Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig erklärt werden kann, lässt sich mit hoher Wahrscheinlichkeit der Anstieg der Fälle mit Läsionen des Stütz- und Bewegungsapparates, zumindest teilweise, auf die wirtschaftlich bessere Situation der Gesamtbevölkerung zum Ende des Untersuchungszeitraumes, und einem damit verbundenen Rückgang an Pferdeschlachtungen, zurückführen. Des Weiteren nahm die Bedeutung von Veränderungen der Atmungsorgane, der großen Körperhöhlen oder von generalisierten Erkrankungen, welche häufig infolge einer bakteriellen Infektion auftreten, seit den 1950er Jahren im Sektionsgut ab. Für diese Entwicklung können Verbesserungen in der Therapie (u.a. der Einsatz von Antibiotika in der Tiermedizin) und der klinischen Diagnostik (z.B. bei der Diagnose der chronisch-obstruktiven Bronchitis oder „Recurrent Airway Obstruction“) sowie der Erfolg tierseuchenhygienischer Maßnahmen (u.a. Bekämpfung von Rotz, Druse und Tuberkulose) verantwortlich gemacht werden. Des Weiteren ergab die Auswertung, dass 5,2 % der obduzierten Einhufer (248/4743) entweder haupt- (3,2 %) oder nebenbefundlich von 285 Tumoren betroffen waren. Bei 78,2 % (223/285) der Läsionen wurde die Diagnose histologisch bestätigt. Meist lag ein einzelner neoplastischer Prozess vor (n=221), vereinzelt fanden sich multiple Neoplasien (zwei unterschiedliche Tumoren pro Tier: n=19; drei Tumoren pro Tier: n=6; vier Tumoren pro Tier: n=2). Das mediane Alter der betroffenen Einhufer mit Altersangabe (n=219) lag bei 14 Jahren, wobei 87,9 % der Fälle älter als 6 Jahre alt waren. Deutlich ausgeprägte Schwankungen zeigten sich im Verlauf des Untersuchungszeitraumes in der Verteilung des Tumorvorkommens. Zwischen 1990 und 2013 wurden drei Viertel (214/285) aller im Untersuchungszeitraum festgestellten Neoplasien diagnostiziert, wobei sich die Läsionen mehrheitlich (180/214) nach 1999 zeigten. Das für die unterschiedlichen Zeitabschnitte der Auswertungsperiode ermittelte mediane Alter scheint bei dieser Entwicklung nicht im Vordergrund zu stehen. Die Läsionen (n=285) fanden sich meist im Bereich der großen Körperhöhlen (24,2 %), des Endokriniums (17,5 %), des hämatopoetischen Systems (14,7 %) und/oder der Haut (12,3 %). Dabei zeigten sich am häufigsten Lipome (23,2 %; n=66), Leukosen (12,6 %; n=36), maligne Melanome (8,4 %; n=24), Adenome der Hypophyse (6,3 %; n=18) und/oder Plattenepithelkarzinome (5,6 %; n=16). Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Studien, Erkrankungen der Verdauungsorgane nach wie vor zu den häufigsten Abgangsursachen bei Equiden zählen. Die Prävalenz von Veränderungen des Nervensystems hingegen schwankt, in Abhängigkeit zum Vorkommen endemischer Erkrankungen, in verschiedenen Statistiken. Die Bedeutung der BD ist im eigenen Sektionsmaterial (Einzugsgebiet der Universität Leipzig und der Tierärztlichen Hochschule Dresden) seit 2000 rückläufig. Demgegenüber nimmt die Anzahl der diagnostizierten Tumoren in der vorliegenden Auswertung in den letzten Jahren (2000-2013) stark zu. Obwohl sich das Spektrum der diagnostizierten Tumorarten erweitert hat, zählen Neoplasien weiterhin zu den selten diagnostizierten Erkrankungen bei Einhufern.:I INHALTSVERZEICHNIS II ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Übersichts-Statistiken zu Equiden-Sektionen 2.1.1 Material und Methoden der Übersichts-Statistiken 2.1.2 Häufige Befunde in Übersichts-Statistiken 2.2 Klinische Übersichts-Statistiken zu Erkrankungen bei Equiden 2.3 Übersichts-Statistiken zu Tumoren bei Equiden 2.3.1 Sektionsstatistiken zu Tumoren bei Equiden 2.3.1.1 Methoden der Sektionsstatistiken 2.3.1.2 Häufig von Tumoren betroffene Organsysteme in Sektionsstatistiken 2.3.1.3 Häufige Tumorarten 2.3.2 Auswertungen von Biopsien bzw. Befunden aus klinischen Einrichtungen 2.3.2.1 Methoden der Tumor-Auswertungen von Biopsien bzw. von Befunden aus klinischen Einrichtungen 2.3.2.2 Häufig von Tumoren betroffene Organsysteme in Auswertungen von Biopsien bzw. von Befunden aus klinischen Einrichtungen 2.3.2.3 Übersicht der häufigsten Tumorarten in Auswertungen von Biopsien bzw. von Befunden aus klinischen Einrichtungen 2.4 Fazit aus der Literatur bezogen auf die initiale Fragestellung dieser Arbeit 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Material 3.2 Methode 4 ERGEBNISSE 4.1 Auswertung der Hauptbefunde 4.1.1 Erkrankungen der Verdauungsorgane 4.1.2 Erkrankungen der Atmungsorgane 4.1.3 Erkrankungen des Nervensystems 4.1.4 Erkrankungen der Kreislauforgane 4.1.5 Erkrankungen des Stütz- und Bewegungsapparates 4.1.6 Generalisierte Erkrankungen 4.1.7 Pathologie der Trächtigkeit 4.1.8 Erkrankungen der großen Körperhöhlen 4.1.9 Erkrankungen der Leber 4.1.10 „Sonstige Erkrankungen“ 4.1.11 Erkrankungen des hämatopoetischen Systems 4.1.12 Erkrankungen der Harnorgane und des Nabels 4.1.13 Erkrankungen der Geschlechtsorgane 4.1.14 Erkrankungen der Haut 4.1.15 Erkrankungen des Endokriniums 4.1.16 Erkrankungen des Auges 4.2 Auswertung von Tumoren unter Berücksichtigung von Haupt- und Nebenbefunden 4.2.1 Häufigkeit und Klassifikation 4.2.2 Multiple Neoplasien 4.2.3 Häufigkeit benigner, semimaligner und maligner Tumoren 4.2.4 Metastasierende bzw. multizentrische Tumoren 5 DISKUSSION 5.1 Ziel der Arbeit 5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials 5.3 Auswertung der Hauptbefunde 5.3.1 Erkrankungen der Verdauungsorgane 5.3.2 Erkrankungen der Atmungsorgane 5.3.3 Erkrankungen des Nervensystems 5.3.4 Erkrankungen der Kreislauforgane 5.3.5 Erkrankungen des Stütz- und Bewegungsapparates 5.3.6 Generalisierte Erkrankungen 5.3.7 Pathologie der Trächtigkeit 5.3.8 Erkrankungen der großen Körperhöhlen 5.3.9 Erkrankungen der Leber 5.3.10 „Sonstige Erkrankungen“ 5.3.11 Erkrankungen des hämatopoetischen Systems 5.3.12 Erkrankungen der Harnorgane und des Nabels 5.3.13 Erkrankungen der Geschlechtsorgane 5.3.14 Erkrankungen der Haut 5.3.15 Erkrankungen des Endokriniums 5.3.16 Erkrankungen des Auges 5.3.17 Fazit 96 5.4 Tumoren als Haupt- und Nebenbefund 5.4.1 Prävalenz von Tumoren bei Equiden 5.4.1.1 Prävalenz einzelner Tumorarten in klinischen Auswertungen 5.4.1.2 Prävalenz einzelner Tumorarten in Sektions- und Schlachthofstatistiken 5.4.2 Multiple Neoplasien 5.4.3 Metastasierende Tumoren 5.4.4 Fazit 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 SUMMARY 8 LITERATUR 9 ANHANG 9.1 Klinische Übersichtsstatistiken zu dem Erkrankungskomplex „Kolik“ 9.2 Übersicht über die ausgewerteten Dokumente 9.2.1 Tabellarische Übersicht 9.2.2 Bilddokumentation zu den erhaltenen Sektions-Journalen bzw. Sektions-Tagebüchern 9.3 Tabellen zur Auswertung der Tumoren im Sektionsgut 9.4 Überblick über Übersichts-Sektionsstatistiken zu Erkrankungen der Verdauungsorgane bei Equiden 10 DANKSAGUNG / Currently only notifiable diseases in Equidae are monitored in Germany. Therefore, information from clinical trials and post-mortem-examinations can be helpful to give early indications of changes in the spectrum of equine diseases. Furthermore, within those evaluations it is possible to collect data of rare illnesses. However, influencing factors, which affect the structure of the test material, must be considered when interpreting the results. Particularly in retrospective studies, the evaluated cases are not necessarily representative for a special population. The aim of this retrospective study was to get an overview of the main findings of 4743 equine autopsies, which were performed at the Institute of Pathology (Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig respectively Dresden). In this context, changes in the spectrum of diseases during the investigated period and the influence of epizootiologic factors (age, race, sex) as well as the type and prevalence of tumours, detected as main or additional finding, were analysed. Moreover, the findings were evaluated in consideration of the actual animal health restrictions as well as historical and epidemiological aspects taking the scientific state-of-the art into account. The reports of 4743 Equidae, which were necropsied at the Institute of Pathology (Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig respectively Dresden from 1890 to 1923) between 1890 and 2013, were available. The month and year of autopsy, age, race, sex, place of origin, further etiological examination procedures (e.g. parasitology, virology, microbiology, toxicology, histology, immunohistology) were taken into consideration. If applicable, information on anamnesis and diagnosis, which have been made intra vitam, was considered. Information on age, race respectively sex was available only in 79.6 %, 53.2 % respectively 88.0 % of the cases. During the investigation period, the necropsied Equidae were mostly affected by disorders (as a main finding) of the digestive tract (36.5 %), followed by alterations of the respiratory tract (10.5 %), the nervous system (9.6 %) or the cardiovascular system (8.4 %), locomotor system (7.7 %) and generalized changes (7.4 %). Less often abortions (5.2 %) or alterations in the area of the big body cavities (4.0 %), the liver (3.1 %), the haemopoietic system (1.7 %), the urinary organs or navel (1.5 %), the female and male genitalia (1.3 %), the skin (0.9 %), the endocrine system (0.2 %) or the eyes (0.0 %) appeared. The term “other diseases” (2.0 %) covers all cases with unknown origin, a distinct autolysis or animals without a necropsy. In comparison to the beginning of the investigation period, the amount of alterations of the alimentary canal, especially due to a reduction of cases with volvulus or torsion respectively animals with obstipation (84/264 diagnosed between 1970 and 1989), decreased over the decades (1890-1899: 52.6 %; 1900-1909: 58.2 %; 2000-2009: 35.8 %; 2010-2013: 38.0 %). In contrast most cases with the main finding ″disease of the nervous system″, characterised by a high percentage of Equidae with the diagnosis ″Borna Disease″ (BD, 7.8 %), arose during the 1990s. The increase of this main finding can be explained by the German reunification in 1990 and the related changes in animal health regulations. Since 2000 the percentage of Equidae with BD is declining again (2000-2009: 5.3 %; 2010-2013: 1.3 %). Compared to the whole investigation period (1890-2013) between 1990 and 2013 more alterations were found during pregnancy (8.8 %) respectively in the field of the musculosceletal system (10.4 %), the integument (1.2 %) or the endocrine system (0.5 %). The increase of abortions most likely can be explained by a change in the research priority of the Institute of Pathology of the Faculty of Veterinary Medicine (University of Leipzig) by the end of the observation period. Furthermore, the rise of cases with musculosceletal disorders is probably caused by the general improvement of the economic situation in Eastern Germany after the German reunification, coinciding with a reduction of equine slaughtering. In addition, a loss of importance in lesions of the respiratory organs, the big body cavities or generalized diseases, which often occur due to bacterial infections, can be observed in the investigated material since the 1950s. Improvements in treatment (among others the use of antibiotics in veterinary medicine) and in clinical diagnosis (e.g. in the diagnosis of the chronic obstructive pulmonary disease or ″recurrent airway obstruction″) as well as the success of animal health measures (e.g. eradication of glanders or tuberculosis) are responsible for this development. Moreover, the analysis showed that 5.2 % of the necropsied solipeds (248/4743) were affected as a main (3.2 %) or an additional finding by tumours (n=285). In 78.2 % of the lesions (223/285) the diagnosis ″neoplasia″ was confirmed histologically. Usually a single (n=221) tumour and occasionally multiple tumours (2 different tumours per animal: n=19; 3 different tumours per animal: n=6; 4 different tumours per animal: n=2) appeared. The median age of the affected solipeds with indication of age (n=219) was 14 years, whereas 87.9 % of the cases were older than 6 years. The appearance of tumours varied during the investigated period. Between 1990 and 2013 three quarters (214/285) of all diagnosed neoplasia were found, whereas most of them (180/214) are recorded after 1999. The median age, which was evaluated during the investigated period, is very likely not the only reason for this development. The lesions were mostly found in the region of the big body cavities (24.2 %), the endocrine (17.5 %) respectively the haematopoietic system (14.7 %) and/or the integuement (12.3 %). Mostly lipomas (23.2 %; n=66), leucosis (12.6 %; n=36), malignant melanomas (8.4 %; n=24), adenomas of the pituitary gland (6.3 %; n=18) and/or squamous cell carcinoma (5.6 %; n=16) occurred. In accordance with comparable studies, diseases of the digestive organs still are the most common cause of death in Equidae. The prevalence of alterations of the nervous system varies in different statistics, depending on the occurrence of endemic diseases. The importance of the BD in the own material (in the catchment area of the University of Leipzig and Dresden) has declined since 2000. Although, in this evaluation, the number and range of diagnosed tumours has increased considerably during the last years (2000-2013), neoplasia of solipeds rank among the rare diagnosed diseases of Equidae.:I INHALTSVERZEICHNIS II ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Übersichts-Statistiken zu Equiden-Sektionen 2.1.1 Material und Methoden der Übersichts-Statistiken 2.1.2 Häufige Befunde in Übersichts-Statistiken 2.2 Klinische Übersichts-Statistiken zu Erkrankungen bei Equiden 2.3 Übersichts-Statistiken zu Tumoren bei Equiden 2.3.1 Sektionsstatistiken zu Tumoren bei Equiden 2.3.1.1 Methoden der Sektionsstatistiken 2.3.1.2 Häufig von Tumoren betroffene Organsysteme in Sektionsstatistiken 2.3.1.3 Häufige Tumorarten 2.3.2 Auswertungen von Biopsien bzw. Befunden aus klinischen Einrichtungen 2.3.2.1 Methoden der Tumor-Auswertungen von Biopsien bzw. von Befunden aus klinischen Einrichtungen 2.3.2.2 Häufig von Tumoren betroffene Organsysteme in Auswertungen von Biopsien bzw. von Befunden aus klinischen Einrichtungen 2.3.2.3 Übersicht der häufigsten Tumorarten in Auswertungen von Biopsien bzw. von Befunden aus klinischen Einrichtungen 2.4 Fazit aus der Literatur bezogen auf die initiale Fragestellung dieser Arbeit 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Material 3.2 Methode 4 ERGEBNISSE 4.1 Auswertung der Hauptbefunde 4.1.1 Erkrankungen der Verdauungsorgane 4.1.2 Erkrankungen der Atmungsorgane 4.1.3 Erkrankungen des Nervensystems 4.1.4 Erkrankungen der Kreislauforgane 4.1.5 Erkrankungen des Stütz- und Bewegungsapparates 4.1.6 Generalisierte Erkrankungen 4.1.7 Pathologie der Trächtigkeit 4.1.8 Erkrankungen der großen Körperhöhlen 4.1.9 Erkrankungen der Leber 4.1.10 „Sonstige Erkrankungen“ 4.1.11 Erkrankungen des hämatopoetischen Systems 4.1.12 Erkrankungen der Harnorgane und des Nabels 4.1.13 Erkrankungen der Geschlechtsorgane 4.1.14 Erkrankungen der Haut 4.1.15 Erkrankungen des Endokriniums 4.1.16 Erkrankungen des Auges 4.2 Auswertung von Tumoren unter Berücksichtigung von Haupt- und Nebenbefunden 4.2.1 Häufigkeit und Klassifikation 4.2.2 Multiple Neoplasien 4.2.3 Häufigkeit benigner, semimaligner und maligner Tumoren 4.2.4 Metastasierende bzw. multizentrische Tumoren 5 DISKUSSION 5.1 Ziel der Arbeit 5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials 5.3 Auswertung der Hauptbefunde 5.3.1 Erkrankungen der Verdauungsorgane 5.3.2 Erkrankungen der Atmungsorgane 5.3.3 Erkrankungen des Nervensystems 5.3.4 Erkrankungen der Kreislauforgane 5.3.5 Erkrankungen des Stütz- und Bewegungsapparates 5.3.6 Generalisierte Erkrankungen 5.3.7 Pathologie der Trächtigkeit 5.3.8 Erkrankungen der großen Körperhöhlen 5.3.9 Erkrankungen der Leber 5.3.10 „Sonstige Erkrankungen“ 5.3.11 Erkrankungen des hämatopoetischen Systems 5.3.12 Erkrankungen der Harnorgane und des Nabels 5.3.13 Erkrankungen der Geschlechtsorgane 5.3.14 Erkrankungen der Haut 5.3.15 Erkrankungen des Endokriniums 5.3.16 Erkrankungen des Auges 5.3.17 Fazit 96 5.4 Tumoren als Haupt- und Nebenbefund 5.4.1 Prävalenz von Tumoren bei Equiden 5.4.1.1 Prävalenz einzelner Tumorarten in klinischen Auswertungen 5.4.1.2 Prävalenz einzelner Tumorarten in Sektions- und Schlachthofstatistiken 5.4.2 Multiple Neoplasien 5.4.3 Metastasierende Tumoren 5.4.4 Fazit 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 SUMMARY 8 LITERATUR 9 ANHANG 9.1 Klinische Übersichtsstatistiken zu dem Erkrankungskomplex „Kolik“ 9.2 Übersicht über die ausgewerteten Dokumente 9.2.1 Tabellarische Übersicht 9.2.2 Bilddokumentation zu den erhaltenen Sektions-Journalen bzw. Sektions-Tagebüchern 9.3 Tabellen zur Auswertung der Tumoren im Sektionsgut 9.4 Überblick über Übersichts-Sektionsstatistiken zu Erkrankungen der Verdauungsorgane bei Equiden 10 DANKSAGUNG

Hufgelenkerkrankungen zählen zu den häufigsten orthopädischen Verletzungen des Sportpferdes. Im Rahmen bisheriger Studien über die Therapie mit autologen Thrombozytenkonzentraten sowie mit Pentosanpolysulfat konnten positive Effekte dieser Medikamente auf die Knorpelheilung nachgewiesen werden. Allerdings gibt es bis dato keine Arbeiten, die eine vergleichende Betrachtung der Wirksamkeit dieser Substanzen unter gleichen Rahmenbedingungen vornehmen. In der vorliegenden Studie wurde daher untersucht, inwiefern sich die intraartikuläre Behandlung mit autologem konditioniertem Plasma (ACP) von der intraartikulären Therapie mit Natrium-Pentosanpolysulfat (NaPPS) bei Hufgelenkerkrankungen unterscheidet. Die erhaltenen Ergebnisse wurden weiterhin mit der konventionellen intraartikulären Therapie unter Verwendung von Hyaluronsäure und Corticosteroiden verglichen, wofür eine historische Kontrollgruppe herangezogen wurde. Als Bedingung für die Aufnahme in die Studie wurden eine gering- bis mittelgradige Vorderbeinlahmheit sowie eine positive Hufgelenkanästhesie festgelegt. Zwischen Juni 2015 und Februar 2017 wurden insgesamt 40 Pferde an der Tierärztlichen Klinik für Pferde in Brockhagen untersucht. Die Einteilung in die jeweilige Behandlungsgruppe erfolgte per Los, wobei Pferde der Gruppe I intraartikulär mit ACP und Pferde der Gruppe II intraartikulär mit NaPPS behandelt wurden. Therapiebegleitend wurde neben der Korrektur der Hufform und ggf. des Beschlages ein einheitliches Bewegungsprogramm angeordnet. Im Rahmen der Nachuntersuchungen erhielten die Pferde bei Nichterreichen der Lahmfreiheit ein bis zwei weitere Injektionen. Anhand der klinischen Lahmheitsuntersuchung erfolgte die Beurteilung der Parameter „Lahmheitsgrad“, „Ausfall der Zehenbeugeprobe“ und „Gelenkfüllung“. Der Beobachtungszeitraum betrug sechs Monate. Als Therapieziel wurde die Heilung der Patienten im Sinne einer Lahmfreiheit unter Erlangung des ursprünglichen Leistungsniveaus definiert. Dies konnte in der ACP-Gruppe bei 13 Patienten (65 %) erreicht werden. Bei zwei Pferden (10 %) war eine Verbesserung des Lahmheitsgrades feststellbar. Drei Pferde (15 %) zeigten keine Veränderung des Lahmheitsgrades und zwei Pferde (10 %) erlitten ein Rezidiv. Die NaPPS-Therapie führte bei 14 Patienten (70 %) zu einem Therapieerfolg. Bei drei Patienten (15 %) zeigte sich eine Besserung des Lahmheitsgrades, bei zwei Patienten (10 %) blieb der Lahmheitsgrad unverändert und bei einem Patienten (5 %) trat eine rezidivierende Lahmheit auf. In keiner der beiden Behandlungsgruppen traten Nebenwirkungen oder unerwünschten Reaktionen auf. Die statistische Analyse ergab hinsichtlich der Erreichung des Therapieziels keinen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen. Demnach können beide Medikamente als gleichermaßen wirksam betrachtet werden. Allerdings findet sich bei Betrachtung der Nachuntersuchungen eine Tendenz zur besseren kurzfristigen Wirksamkeit von NaPPS mit 70 % lahmfreien Pferden nach vier Wochen gegenüber 50 % lahmfreien Pferden in der ACP-Gruppe. Nach drei Monaten nähern sich diese Werte wieder an (NaPPS: 75 %, ACP: 70 %). Bezüglich der Anzahl der benötigten Injektionen bis zur Erreichung der Lahmfreiheit ließ sich ein Trend zur häufigeren Injektion mit 2,23 ± 0,725 in der ACP-Gruppe gegenüber 1,71 ± 0,611 Injektionen in der NaPPS-Gruppe erkennen. Statistisch war dieser Unterschied jedoch knapp nicht signifikant (p = 0,059). Der Vergleich der Ergebnisse mit dem Therapieerfolg bei einer konventionellen intraartikulären Therapie (historische Kontrollgruppe) erwies sich ebenfalls als nicht signifikant. Die vorliegende Studie bestätigt bisherige positive Erfahrungen zur regenerativen Gelenktherapie mit autologen Thrombozytenkonzentraten und NaPPS und lässt diese Behandlungsmethoden als sinnvolle Alternativen zu konventionellen Therapieformen erscheinen. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass der Therapieerfolg bei der Behandlung mit NaPPS schneller eintritt, wobei eine ein- bis zweimalige Injektion als ausreichend erscheint. Die Anwendung von ACP ist längerfristig gleichermaßen wirksam; jedoch kann nach den Beobachtungen dieser Studie eine zwei- bis dreimalige Applikation notwendig sein. Die wissenschaftliche Forschung sollte sich zukünftig um ein besseres Verständnis der Wirkungsweise von autologen Thrombozytenkonzentraten bemühen. Dabei wären insbesondere neben ACP auch Produkte anderer Herstellungsart und Zusammensetzung auf Wirkungsunterschiede im Gelenk zu untersuchen. Zudem sollten das Behandlungsintervall, die Behandlungsfrequenz und der richtige Therapiezeitpunkt für die jeweiligen Medikamente (ACP und NaPPS) überprüft werden. Besonders im Hufgelenkbereich wäre bei Betrachtung dieser intraartikulären Therapieformen eine genauere Differenzierung der zugrundeliegenden Pathologie durch weiterführende Diagnosemethoden erforderlich. Schließlich sollten sich weitere prospektive, randomisierte, placebokontrollierte Studien mit größeren Patientenzahlen anschließen, um die Ergebnisse der vorliegenden Studie zu überprüfen.:Abkürzungsverzeichnis I Tabellenverzeichnis IV Abbildungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Anatomie des Hufgelenks 3 2.2 Physiologie des Pferdegelenks 5 2.2.1 Gelenkkapsel 5 2.2.2 Synovia 5 2.2.3 Gelenkknorpel 6 2.3 Pathophysiologie des Pferdegelenks 8 2.3.1 Traumatische Arthritis 8 2.3.2 Osteoarthritis 8 2.4 Erkrankungen im Bereich des Hufgelenks 12 2.4.1 Aseptische Podarthritis 12 2.4.2 Podarthrose 14 2.4.3 Podotrochlose-Syndrom 14 2.4.3.1 Podotrochlose im engeren Sinne 15 2.4.3.2 Insertionsdesmopathien 15 2.4.3.3 Strahlbeinerkrankung mit Hufgelenkbeteiligung 16 2.4.4 Hufbeinfraktur 16 2.4.5 Strahlbeinfraktur 17 2.4.6 Subchondrale zystoide Defekte 17 2.4.7 Erkrankungen im Bereich des Processus Extensorius 18 2.5 Lahmheitsdiagnostik der distalen Zehe 19 2.5.1 Klinische Lahmheitsdiagnostik 19 2.5.2 Diagnostische Anästhesien 23 2.5.2.1 Leitungsanästhesien 24 2.5.2.2 Intrasynoviale Anästhesien 25 2.5.3 Direkte Druckmessung im Hufgelenk 27 2.5.4 Synoviaanalyse 27 2.5.5 Röntgenologische Untersuchung 28 2.5.5.1 Röntgenleitfaden 28 2.5.5.2 Röntgenbefunde im Hufgelenkbereich 29 2.5.5.3 Röntgenbefunde am Strahlbein 30 2.5.6 Weiterführende bildgebende Diagnostik 32 2.5.6.1 Endoskopie 32 2.5.6.2 Sonographie 32 2.5.6.3 Szintigraphie 32 2.5.6.4 Computertomographie 33 2.5.6.5 Magnetresonanztomographie 33 2.6 Therapie 34 2.6.1 Begleitende konservative Maßnahmen 34 2.6.1.1 Hufkorrektur und Beschlag 34 2.6.1.2 Bewegungsprogramm 34 2.6.2 Medikamentöse Therapie 34 2.6.2.1 NSAIDs 34 2.6.2.2 Intraartikuläre Corticosteroide 35 2.6.2.3 Hyaluronsäure (HA) 36 2.6.2.4 Kombinierte Anwendung HA/Corticosteroid 37 2.6.2.5 Polysulfatierte Glykosaminoglykane (PSGAG) 37 2.6.2.6 Pentosanpolysulfat (PPS) 38 2.6.2.7 Autologous Conditioned Plasma® (ACP) 41 2.6.2.8 Autologes Conditioniertes Serum (ACS) 44 2.6.2.9 Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSC) 45 2.6.2.10 Polyacrylamid Hydrogel (PAAHG) 47 3 Material und Methoden 48 3.1 Therapieziel 48 3.2 Wissenschaftliche Fragestellung 48 3.3 Studienumfang 48 3.4 Untersuchungsmethodik 51 3.4.1 Einschlusskriterien 51 3.4.2 Anamnese 51 3.4.3 Klinische Untersuchung und Beurteilungskriterien 51 3.4.4 Diagnostische Anästhesien 52 3.4.5 Röntgenologische Untersuchung 53 3.4.6 Therapieplan 53 3.4.7 Nachuntersuchungen 54 3.4.8 Beurteilung des Therapieerfolges 54 3.5 Statistische Methodik 55 4 Ergebnisse 57 4.1 Vergleichbarkeit der Gruppen 57 4.1.1 Geschlechterverteilung 57 4.1.2 Altersverteilung 57 4.1.3 Rassenverteilung 58 4.1.4 Größenverteilung 58 4.1.5 Einsatzschwerpunkt und Beanspruchung 59 4.1.6 Vorerkrankungen 59 4.1.7 Vorbehandlungen 60 4.1.8 Dauer der bestehenden Lahmheit 60 4.1.9 Beginn und Verlauf der bestehenden Lahmheit 62 4.2 Befunde der Erstuntersuchung 62 4.2.1 Betroffene Gliedmaße 62 4.2.2 Art der Lahmheit 63 4.2.3 Ergebnisse der Leitungsanästhesien 63 4.2.4 Verteilung der Röntgenklassen 64 4.2.5 Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt t0 64 4.2.6 Gelenkfüllung zum Zeitpunkt t0 65 4.2.7 Zehenbeugeprobe zum Zeitpunkt t0 65 4.2.8 Overall Clinical Severitiy Score (CSS) zum Zeitpunkt t0 65 4.3 Ergebnisse der Nachuntersuchungen 66 4.3.1 Erste Nachuntersuchung nach 14-21 Tagen (t1) 66 4.3.1.1 Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt t1 66 4.3.1.2 CSS zum Zeitpunkt t1 68 4.3.2 Zweite Nachuntersuchung nach 21-28 Tagen (t2) 69 4.3.2.1 Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt t2 69 4.3.2.2 CSS zum Zeitpunkt t2 70 4.3.3 Dritte Nachuntersuchung nach 3 Monaten (t3) 71 4.3.3.1 Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt t3 71 4.3.3.2 CSS zum Zeitpunkt t3 72 4.3.4 Vierte Nachuntersuchung nach 6 Monaten (t4) 73 4.3.4.1 Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt t4 73 4.3.4.2 CSS zum Zeitpunkt t4 75 4.4 Gesamtergebnis 77 4.4.1 Gesamtergebnis in Abhängigkeit von der Therapiemethode 77 4.4.2 Therapieergebnis in Abhängigkeit vom Erkrankungsstadium 78 4.4.3 Anzahl der benötigten Injektionen 79 4.5 Retrospektiver Vergleich mit konventioneller Therapie 79 4.6 Beurteilung der Gruppengrößen zum Abschluss der Studie 81 5 Diskussion 82 5.1 Studienumfang 82 5.2 Vergleichbarkeit der Gruppen 82 5.3 Untersuchungsmethodik 84 5.4 Nachuntersuchungen 86 5.5 Beurteilungskriterien 87 5.6 Therapieergebnisse 87 5.7 Retrospektiver Vergleich mit konventioneller Therapie 91 5.8 Schlussfolgerungen 91 5.9 Ausblick 93 6 Zusammenfassung 94 7 Summary 96 8 Literaturverzeichnis 98 9 Anhang 142 10 Danksagung 145 / Diseases related to the distal interphalangeal joint rank among the most frequently occurring orthopedic injuries in sport horses. Previous studies have shown some promising results regarding the positive influence of autologous platelet concentrates and pentosanpolysulfate sodium on cartilage healing. However, to date, there is no published scientific work comparing the efficacy of these substances under the same controlled conditions. Therefore, the present study aims at examining the differences between the intraarticular therapy using autologous conditioned plasma (ACP) and the intraarticular therapy using pentosan polysulfate sodium (PPS) in horses suffering from coffin joint related diseases. These results are further compared to the convential therapy with hyaluronic acid and betamethason by drawing on a historical control group. To be included in this study, clinical forelimb lameness (to be confirmed by a positive intraarticular analgesia of the coffin joint) had to be present in a mild to moderate form. Based on these criteria, 40 horses were selected and treated at the Brockhagen Veterinary Clinic for Horses from June 2015 to February 2017. Determined by the drawing of lots, the horses were assigned to two groups of the same size. Horses from group I received an intraarticular treatment with ACP, horses from group II were treated with PPS. Concomitant treatment included the correction of hoof conformation and, as appropriate, of the horseshoe; besides, all patients underwent a controlled and standardized exercise programm. If follow-up examinations revealed persistent lameness, the patients received one or two more intraarticular treatments. Within the clinical examination, the parameters „degree of lameness “, „response to flexion test “, and „coffin joint effusion” were evaluated (period of observation: six months). The goal of treatment was defined as the healing of the patient in terms of freedom from lameness and full recovery of the original performance. Treatment success in the ACP group was achieved in 13 patients (65 %), two patients (10 %) showed an improvement in the degree of lameness, three patients (15 %) remained unchanged and two patients (10 %) relapsed. The PPS treatment yielded a positive response in 14 patients (70 %), alleviated lameness in three patients (15 %), had no effect in two patients (10 %) and resulted in a recurrent lameness in one patient (5 %). In neither of the two groups adverse reactions or negative side effects occurred. The statistical analysis of the results showed no significant difference between ACP and PPS with regard to the goal of treatment. Accordingly, both medications can be considered as equally effective. However, when looking at the follow-up examinations, a tendency towards a higher short-term efficacy for PPS with 75 % recovered horses after four weeks versus 50 % in the ACP group became apparent. After three months, the results converged to each other (PPS: 75 %, ACP: 70 %). With regard to the number of injections required to achieve freedom of lameness, a tendency towards more frequent injections in the ACP group (2.23 ± 0.725) compared to the PPS group (1.71 ± 0.611) was found. Howevere, statistically, this difference is barely not significant (p = 0,059). Likewise, a comparison of the results with the treatment success of the conventional intraarticular therapy (historical control group) did not prove significant, as well. The present study confirms previously reported positive experience with autologous platelet concentrates and PPS in regenerative joint therapy. Accordingly, these treatment options could provide a viable alternative to conventional therapies. In summary, it can be stated that PPS shows better results in the short term, with one or two injections being sufficient. In the longer term, the application of ACP achieves similar effects; however, here two or three treatments might be necessary according to the observations of this study. Future research should focus on gaining a better understanding of the effects of autologous platelet concentrates. In doing so, other products (especially besides ACP), manufactured in different ways and with different compositions, should be examined with regard to different effects in the joint. Moreover, the treatment period, the frequency of treatment, and the time of therapy should be assessed for the different medications (including ACP and PPS). Especially in the area of the distal interphalangeal joint, a more precise differentiation of the underlying pathology through advanced diagnostic methods would be required when dealing with these intraarticular treatment methods. Finally, further prospective, randomized, and placebo-controlled studies with larger numbers of patients have to be conducted to verify the results of the present study.:Abkürzungsverzeichnis I Tabellenverzeichnis IV Abbildungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Anatomie des Hufgelenks 3 2.2 Physiologie des Pferdegelenks 5 2.2.1 Gelenkkapsel 5 2.2.2 Synovia 5 2.2.3 Gelenkknorpel 6 2.3 Pathophysiologie des Pferdegelenks 8 2.3.1 Traumatische Arthritis 8 2.3.2 Osteoarthritis 8 2.4 Erkrankungen im Bereich des Hufgelenks 12 2.4.1 Aseptische Podarthritis 12 2.4.2 Podarthrose 14 2.4.3 Podotrochlose-Syndrom 14 2.4.3.1 Podotrochlose im engeren Sinne 15 2.4.3.2 Insertionsdesmopathien 15 2.4.3.3 Strahlbeinerkrankung mit Hufgelenkbeteiligung 16 2.4.4 Hufbeinfraktur 16 2.4.5 Strahlbeinfraktur 17 2.4.6 Subchondrale zystoide Defekte 17 2.4.7 Erkrankungen im Bereich des Processus Extensorius 18 2.5 Lahmheitsdiagnostik der distalen Zehe 19 2.5.1 Klinische Lahmheitsdiagnostik 19 2.5.2 Diagnostische Anästhesien 23 2.5.2.1 Leitungsanästhesien 24 2.5.2.2 Intrasynoviale Anästhesien 25 2.5.3 Direkte Druckmessung im Hufgelenk 27 2.5.4 Synoviaanalyse 27 2.5.5 Röntgenologische Untersuchung 28 2.5.5.1 Röntgenleitfaden 28 2.5.5.2 Röntgenbefunde im Hufgelenkbereich 29 2.5.5.3 Röntgenbefunde am Strahlbein 30 2.5.6 Weiterführende bildgebende Diagnostik 32 2.5.6.1 Endoskopie 32 2.5.6.2 Sonographie 32 2.5.6.3 Szintigraphie 32 2.5.6.4 Computertomographie 33 2.5.6.5 Magnetresonanztomographie 33 2.6 Therapie 34 2.6.1 Begleitende konservative Maßnahmen 34 2.6.1.1 Hufkorrektur und Beschlag 34 2.6.1.2 Bewegungsprogramm 34 2.6.2 Medikamentöse Therapie 34 2.6.2.1 NSAIDs 34 2.6.2.2 Intraartikuläre Corticosteroide 35 2.6.2.3 Hyaluronsäure (HA) 36 2.6.2.4 Kombinierte Anwendung HA/Corticosteroid 37 2.6.2.5 Polysulfatierte Glykosaminoglykane (PSGAG) 37 2.6.2.6 Pentosanpolysulfat (PPS) 38 2.6.2.7 Autologous Conditioned Plasma® (ACP) 41 2.6.2.8 Autologes Conditioniertes Serum (ACS) 44 2.6.2.9 Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSC) 45 2.6.2.10 Polyacrylamid Hydrogel (PAAHG) 47 3 Material und Methoden 48 3.1 Therapieziel 48 3.2 Wissenschaftliche Fragestellung 48 3.3 Studienumfang 48 3.4 Untersuchungsmethodik 51 3.4.1 Einschlusskriterien 51 3.4.2 Anamnese 51 3.4.3 Klinische Untersuchung und Beurteilungskriterien 51 3.4.4 Diagnostische Anästhesien 52 3.4.5 Röntgenologische Untersuchung 53 3.4.6 Therapieplan 53 3.4.7 Nachuntersuchungen 54 3.4.8 Beurteilung des Therapieerfolges 54 3.5 Statistische Methodik 55 4 Ergebnisse 57 4.1 Vergleichbarkeit der Gruppen 57 4.1.1 Geschlechterverteilung 57 4.1.2 Altersverteilung 57 4.1.3 Rassenverteilung 58 4.1.4 Größenverteilung 58 4.1.5 Einsatzschwerpunkt und Beanspruchung 59 4.1.6 Vorerkrankungen 59 4.1.7 Vorbehandlungen 60 4.1.8 Dauer der bestehenden Lahmheit 60 4.1.9 Beginn und Verlauf der bestehenden Lahmheit 62 4.2 Befunde der Erstuntersuchung 62 4.2.1 Betroffene Gliedmaße 62 4.2.2 Art der Lahmheit 63 4.2.3 Ergebnisse der Leitungsanästhesien 63 4.2.4 Verteilung der Röntgenklassen 64 4.2.5 Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt t0 64 4.2.6 Gelenkfüllung zum Zeitpunkt t0 65 4.2.7 Zehenbeugeprobe zum Zeitpunkt t0 65 4.2.8 Overall Clinical Severitiy Score (CSS) zum Zeitpunkt t0 65 4.3 Ergebnisse der Nachuntersuchungen 66 4.3.1 Erste Nachuntersuchung nach 14-21 Tagen (t1) 66 4.3.1.1 Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt t1 66 4.3.1.2 CSS zum Zeitpunkt t1 68 4.3.2 Zweite Nachuntersuchung nach 21-28 Tagen (t2) 69 4.3.2.1 Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt t2 69 4.3.2.2 CSS zum Zeitpunkt t2 70 4.3.3 Dritte Nachuntersuchung nach 3 Monaten (t3) 71 4.3.3.1 Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt t3 71 4.3.3.2 CSS zum Zeitpunkt t3 72 4.3.4 Vierte Nachuntersuchung nach 6 Monaten (t4) 73 4.3.4.1 Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt t4 73 4.3.4.2 CSS zum Zeitpunkt t4 75 4.4 Gesamtergebnis 77 4.4.1 Gesamtergebnis in Abhängigkeit von der Therapiemethode 77 4.4.2 Therapieergebnis in Abhängigkeit vom Erkrankungsstadium 78 4.4.3 Anzahl der benötigten Injektionen 79 4.5 Retrospektiver Vergleich mit konventioneller Therapie 79 4.6 Beurteilung der Gruppengrößen zum Abschluss der Studie 81 5 Diskussion 82 5.1 Studienumfang 82 5.2 Vergleichbarkeit der Gruppen 82 5.3 Untersuchungsmethodik 84 5.4 Nachuntersuchungen 86 5.5 Beurteilungskriterien 87 5.6 Therapieergebnisse 87 5.7 Retrospektiver Vergleich mit konventioneller Therapie 91 5.8 Schlussfolgerungen 91 5.9 Ausblick 93 6 Zusammenfassung 94 7 Summary 96 8 Literaturverzeichnis 98 9 Anhang 142 10 Danksagung 145

Bei der Bestrahlung von Kopf-Hals-Tumoren tritt die orale Mukositis als wichtigste und dosislimitierende frühe Nebenwirkung auf. Verschiedene prophylaktische und therapeutische Maßnahmen wurden untersucht, jedoch konnte bisher keine Methode in der klinischen Routine etabliert werden. Ein neuer Ansatz ist die Verwendung des Cholesterinsynthese-hemmers Lovastatin. Für diesen Wirkstoff konnte in vorhergehenden Untersuchungen ein mukoprotektiver Effekt nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen diesem schleimhaut-schützenden Effekt und der Expression von induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), Nitrotyrosin (NT) und CD105 betrachtet. Das Enzym iNOS ist an Entzündungsreaktionen beteiligt; NT stellt ein Folgeprodukt des durch iNOS gebildeten Stickstoffmonoxids dar. CD105 wird von aktivierten Monozyten und Makrophagen exprimiert. Ausgangsmaterial für die vorliegende Studie waren 174 Präparate aus dem vorangegangenen Tierversuch. In diesem wurde bei Mäusen eine fraktionierte Schnauzenbestrahlung zum Teil mit einer Lovastatingabe kombiniert. Zusätzlich wurden Tiere alleinig mit Lovastatin behandelt. Für diesen Versuch wurden Mäuse des Stammes C3H/Neu verwendet. Die Bestrahlung erfolgte mit 5 x 3 Gy über zwei Wochen. Lovastatin wurde in einer Dosis von 16 mg/kg oral verabreicht. Gegenstand der aktuellen Untersuchung war - neben der allgemeinen histologischen Charakterisierung - die immunhistochemische Darstellung von iNOS, NT und CD105 im Epithel der Zungenunterseite sowie im subepithelialen Gewebe. Ausgewertet wurden die Gesamtzellzahl im Epithel, die Zahl iNOS- und NT-positiver Zellkerne in Germinativ- und funktioneller Schicht sowie jeweils die Farbintensität der positiven Epithelzellen. In der L. propria und L. muscularis wurden die CD105-, iNOS-, und NT-positiven Makrophagen sowie die weiteren iNOS- und NT-positiven Immunzellen erfasst und ihre Farbintensität bestimmt. Weiterhin wurde die Homogenität und Intensität der Expression von iNOS im Endothel bewertet. Die Auswertung umfasst die deskriptive Darstellung der Werteverläufe dieser Parameter. Aufgrund der geringen Anzahl von drei Versuchstieren je Tag und Gruppe wurde auf die Berechnung der statistischen Signifikanz der Ergebnisse verzichtet. Die Gesamtzellzahl im Zungenepithel zeigte bei Bestrahlung eine deutliche Reduktion auf 65 % des Ausgangswertes. Mit Beendigung der Behandlung war eine entsprechende Erholung zu sehen. Die alleinige Lovastatinbehandlung bewirkte dagegen eine Steigerung der Gesamtzell-zahl auf ca. 110 %. Während iNOS sowohl im unbehandelten als auch im behandelten Epithelgewebe nachweisbar war, war NT im unbehandelten Epithel kaum vorhanden. Die Ausgangswerte betrugen 22 % iNOS-positive Kerne in der Germinativschicht und 8 % in der funktionellen Schicht, sowie 2 % und 1 % für die NT-Färbung. In der Germinativschicht waren sowohl bei alleiniger Bestrahlung als auch bei alleiniger Lovastatintherapie 30 - 50 % der Zell-kerne iNOS-positiv. Bei zweiwöchiger Kombinationstherapie lagen die Werte teils darunter; bei Lovastatingabe ab Tag 7 lagen sie vornehmlich in dem oberen Bereich. In der funktionellen Schicht spiegelten sich diese Verteilungsmuster wider, allerdings lag die Anzahl positiver Kerne insgesamt überwiegend unter 30 %. Die Zahl NT-positiver Zellkerne stieg in beiden Schichten infolge der Bestrahlung auf ca. 50 - 60 %. Unter alleiniger Lovastatintherapie lag sie unter 30 %. Die zweiwöchige Kombination zeigte ebenfalls eine Tendenz zum niederen Bereich. Bei Lovastatingabe ab Tag 7 lagen die Werte geringgradig vermehrt im höheren Bereich. Die Anfärbung der Makrophagen gegen CD105 verdeutlichte bei allen Gruppen eine Reduktion der Makrophagenzahl auf ca. 50 % des Ausgangswertes. Auch die Zahl iNOS-positiver Makrophagen reduzierte sich in allen Behandlungsgruppen einheitlich auf unter 80 % der Norm. Die Zahl NT-positiver Makrophagen lag näher am Ausgangswert. Im Gegensatz dazu waren die restlichen Immunzellen unter Behandlung vermehrt iNOS-positiv. Die Werte lagen häufig weit oberhalb des Referenzbereichs. Dabei zeigte im Vergleich die alleinige Bestrahlung die niedrigsten Werte mit maximal 136 % der Norm. Bei der Färbung gegen NT konnten nur bei alleiniger Lovastatinverabreichung konstant Werte oberhalb des Ausgangswertes festgestellt werden. Innerhalb der Untersuchungen konnte das Endothel nur mit iNOS-AK auswertbar angefärbt werden. Es zeigte in allen Gruppen eine durchgängig homogene Färbung. Die Farbintensität war mittelmäßig und wurde in allen Behandlungsgruppen zum Ende des Untersuchungszeitraums kräftiger. Als Resultat dieser Arbeit ist festzuhalten, dass bei allen vier Behandlungsvarianten iNOS und NT in hohem Maße in der Germinativschicht des Epithels exprimiert wurden. In der funktionellen Schicht war die Expression von iNOS schwächer, während die NT-expression nahezu gleich blieb. Damit muss NT eine längere Halbwertszeit haben. Des Weiteren waren nicht alle aktivierten (CD105-positiven) Makrophagen iNOS-positiv und wiederum produzierte iNOS nicht in allen Zellen NT. Dies wurde auch durch die deutlich höhere Zahl iNOS-positiver Immunzellen in den Ll. propriae und musculares deutlich. Die biochemischen Abläufe, durch welche Lovastatin zur Reduktion der radiogenen Mucositis enoralis führt, bleiben daher weiterhin zu erforschen. In der durchgeführten Untersuchung zeigte sich kein eindeutiger Hinweis auf einen Zusammenhang mit dem iNOS-NT-Signaltransduktionsweg.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier 3 2.2 Kopf-Hals-Tumoren 4 2.2.1 Tumorvorkommen beim Menschen 4 2.2.2 Tumorvorkommen bei Hund und Katze 4 2.2.3 Symptome beim Kleintier 5 2.2.4 Behandlungsmethoden 5 2.2.4.1 Chirurgie 5 2.2.4.2 Chemotherapie 5 2.2.4.3 Radiotherapie 6 2.2.4.4 Radiochemotherapie 7 2.2.5 Nebenwirkungen der Tumorbehandlung 7 2.2.5.1 Nebenwirkungen der Chemotherapie 7 2.2.5.2 Nebenwirkungen der Radiotherapie 8 2.3 Mucositis enoralis 8 2.3.1 Aufbau von Zunge und Zungenepithel 8 2.3.2 Pathogenese und zeitlicher Verlauf der radiogenen oralen Mukositis 10 2.3.2.1 Stadien der Mukositis und klinisches Erscheinungsbild 10 2.3.2.2 Reaktionskette der Strahlenwirkung 11 2.3.3 Einteilung des Schweregrades der Mukositis 12 2.3.3.1 Einteilung für die Humanmedizin 12 2.3.3.2 Einteilung für die Veterinärmedizin 13 2.3.4 Aktuelle Herangehensweise an die radiogene orale Mukositis 13 2.4 Lovastatin 14 2.4.1 Struktur und Anwendung 14 2.4.2 Weitere Wirkmechanismen von Statinen 14 2.4.2.1 Die apoptotische Wirkung der Statine 15 2.4.3 Eigenschaften im Tiereinsatz 15 2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Nitrotyrosin 16 2.5.1 Die NOS und Nitrotyrosinbildung 16 2.5.2 Vorkommen von iNOS und Nitrotyrosin 17 3 Zielstellung der Arbeit 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Versuchstiere 20 4.2 Perkutane Schnauzenbestrahlung 20 4.3 Applikation von Lovastatin 22 4.4 Versuchsprotokoll 22 4.5 Histologische Aufbereitung 23 4.5.1 Antikörper 23 4.5.1.1 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) 23 4.5.1.2 Nitrotyrosin 23 4.5.1.3 CD105 ... 23 4.5.1.4 Kontroll-Antikörper 23 4.5.2 Färbeprotokolle 24 4.5.2.1 iNOS und CD105 24 4.5.2.2 Nitrotyrosin 26 4.5.2.3 Optimierung der Konzentration der primären Antikörper 27 4.5.3 Histologische Auswertung 29 4.5.3.1 Epithel .. 29 4.5.3.2 L. propria und L. muscularis 30 4.5.3.3 Endothel 31 4.6 Analyse 31 5 Ergebnisse 32 5.1 Zellzahlen im Epithel 32 5.1.1 Kontrollgruppe 32 5.1.2 Alleinige Bestrahlung 32 5.1.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 33 5.1.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 34 5.1.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 34 5.2 Expression von iNOS 36 5.2.1 Kontrollgruppe 36 5.2.2 Alleinige Bestrahlung 36 5.2.3 Alleinige Lovastatingabe 38 5.2.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 41 5.2.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 43 5.3 Expression von Nitrotyrosin 45 5.3.1 Kontrollgruppe 45 5.3.2 Alleinige Bestrahlung 45 5.3.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 47 5.3.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 49 5.3.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 51 5.4 Expression von CD105 54 5.4.1 Alleinige Bestrahlung 54 5.4.2 Alleinige Lovastatinbehandlung 54 5.4.3 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 55 5.4.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 55 6 Diskussion 57 6.1 Klinischer Hintergrund 57 6.2 Tiermodelle für die radiogene orale Mukositis 58 6.2.1 Maus 58 6.2.2 Ratte 58 6.2.3 Hamster 58 6.3 Eigenschaften des unbehandelten Zungengewebes 59 6.3.1 Epithel der Zungenunterseite 59 6.3.1.1 Zellzahl . .59 6.3.1.2 Nachweis von iNOS 59 6.3.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 60 6.3.2.1 Nachweis von iNOS 60 6.3.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2.3 Nachweis von CD105 60 6.3.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 60 6.4 Veränderungen bei konventioneller fraktionierter Bestrahlung 61 6.4.1 Epithel der Zungenunterseite 61 6.4.1.1 Zellzahl . 61 6.4.1.2 Nachweis von iNOS 61 6.4.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 62 6.4.2.1 Nachweis von iNOS 62 6.4.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2.3 Nachweis von CD105 63 6.4.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 63 6.5 Veränderungen bei alleiniger Lovastatinbehandlung 63 6.5.1 Epithel der Zungenunterseite 63 6.5.1.1 Zellzahl . 63 6.5.1.2 Nachweis von iNOS 63 6.5.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 64 6.5.2.1 Nachweis von iNOS 64 6.5.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2.3 Nachweis von CD105 64 6.5.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 65 6.6 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung über 2 Wochen 65 6.6.1 Epithel der Zungenunterseite 65 6.6.1.1 Zellzahl . 65 6.6.1.2 Nachweis von iNOS 65 6.6.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 66 6.6.2 Immunzellen in den L. propria und L. muscularis 66 6.6.2.1 Nachweis von iNOS 66 6.6.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 67 6.6.2.3 Nachweis von CD105 67 6.6.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 67 6.7 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung ab Tag 7 68 6.7.1 Epithel der Zungenunterseite 68 6.7.1.1 Zellzahl . 68 6.7.1.2 Nachweis von iNOS 68 6.7.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 68 6.7.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 69 6.7.2.1 Nachweis von iNOS 69 6.7.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 69 6.7.2.3 Nachweis von CD105 69 6.7.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 70 6.8 Zusammenfassende Einschätzung der Ergebnisse 70 7 Ausblick 72 8 Zusammenfassung 73 9 Summary 75 10 Abbildungsverzeichnis 77 11 Tabellenverzeichnis 80 12 Literatur 81 13 Anhang 92 14 Danksagung 100 / During radiation of head-and-neck-cancer oral mucositis is the most important and dose-limiting early side effect. Different preventive and theoretical procedures were investigated, but so far there has been no method established in clinical routine. A new approach is the application of the cholesterol synthesis inhibitor lovastatin. Previous investigtions proved a mucoprotective effect of this agent. In this investigation the correlation between this mucoprotective effect and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), nitrotyrosine (NT) and CD105 was observed. The enzyme iNOS takes part in inflammtory reactions; NT is a secondary product of the nitric oxide produced by iNOS. CD105 is expressed by activated monocytes and macrophages. The source material for this study were 174 preparations from previous animal examinations. In this investigation a daily fractionated radiation of the snout was partly combined with lovastatin applications. In addition some mice were treated with lovastatin only. For this research mice of the line C3H/Neu were used. Radiation was performed with 5 x 3Gy over two weeks. Lovastatin was used at an oral dose of 16mg/kg. The matter of the research was - next to general histological characterisation - the immunohistochemical exposure of iNOS, NT and CD105 in the epithelial layer of the undersurface of the tongue and in the subepithelial tissue. The total cell count in the epithelium, the number of iNOS- and NT-positive nuclei in the germinal and the functional layer, as well as the intensity of the staining were evaluated. In the l. propria and l. muscularis CD105-, iNOS-, and NT-positive macrophages and other iNOS- and NT-positive immune cells were identified and the intensity of their staining was determined. Furthermore the homogeneity and intensity of the expression of iNOS in the endothelium were rated. The analysis contains the descriptive presentation of the value patterns of these parameters. Because of the small number of three test animals per day and group the statistical significance of the results was not determined. In consequence of radiotherapy the total cell count in the epithelium decreased to 65% of origin. Recovery was visible after termination of the treatment. With lovastatin medication only, the cell count increased to approximately 110%. While iNOS was present in the untreated as well as in the treated tissue, NT was hardly visible in the untreated one. The basic values were 22% of iNOS-positive nuclei in the germinal layer and 8% in the functional layer, and 2% and 1% for the NT-staining. Both, sole radiation and sole lovastatin therapy, showed 30-50% iNOS-positive nuclei in the germinal layer. With combined therapy for two weeks the values were partially lower, with lovastatin treatment from day 7 they were in the upper range. This group distribution was reflected in the functional layer, although altogether the quantity of positive nuclei was mostly under 30%. Due to radiation the number of NT-positive nuclei increased to 50-60% in both layers. With sole lovastatin therapy it was under 30%. Combined therapy over two weeks showed a tendency to the lower range too. With lovastatin treatment from day 7 the values were situated a little bit more in the upper range. The macrophage staining against CD105 revealed a reduction of macrophage cell count to approximately 50% of origin in all groups. Likewise the number of iNOS-positive macrophages decreased in all groups consistently to less than 80% of normal. The number of NT-positive macrophages was closer to the origin. In contrast to this, the other immunocompetent cells were increasingly iNOS-positive under treatment. Often values were high above the reference range. In comparison sole radiation therapy showed the lowest values with a maximum of 136% of normal. Regarding the staining against NT only sole lovastatin treatment showed values constantly above origin. Within this study the only evaluable staining for the endothelium was with iNOS-antibody. It showed a constant homogeneous staining in all groups. The intensity of the staining was moderate and increased in all treatment groups towards the end of the examination. Therefore it can be concluded that under treatment iNOS and NT were both highly expressed in the germinal layer. In the functional layer the expression of iNOS was reduced whereas the expression of NT remained about the same. So NT must have a longer half-life. In addition not all activated (CD105-positive) macrophages were also iNOS-positive and again iNOS did not produce NT in all cells. This was also proven by the distinct higher number of iNOS-positive immunocompetent cells in the ll. propriae and musculares. Therefore the biochemical processes, because of which lovastatin leads to the reduction of the radiogenic mucositis enoralis, remain to be investigated. During the present investigation there was no distinct hint for a correlation with the iNOS-NT-pathway.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier 3 2.2 Kopf-Hals-Tumoren 4 2.2.1 Tumorvorkommen beim Menschen 4 2.2.2 Tumorvorkommen bei Hund und Katze 4 2.2.3 Symptome beim Kleintier 5 2.2.4 Behandlungsmethoden 5 2.2.4.1 Chirurgie 5 2.2.4.2 Chemotherapie 5 2.2.4.3 Radiotherapie 6 2.2.4.4 Radiochemotherapie 7 2.2.5 Nebenwirkungen der Tumorbehandlung 7 2.2.5.1 Nebenwirkungen der Chemotherapie 7 2.2.5.2 Nebenwirkungen der Radiotherapie 8 2.3 Mucositis enoralis 8 2.3.1 Aufbau von Zunge und Zungenepithel 8 2.3.2 Pathogenese und zeitlicher Verlauf der radiogenen oralen Mukositis 10 2.3.2.1 Stadien der Mukositis und klinisches Erscheinungsbild 10 2.3.2.2 Reaktionskette der Strahlenwirkung 11 2.3.3 Einteilung des Schweregrades der Mukositis 12 2.3.3.1 Einteilung für die Humanmedizin 12 2.3.3.2 Einteilung für die Veterinärmedizin 13 2.3.4 Aktuelle Herangehensweise an die radiogene orale Mukositis 13 2.4 Lovastatin 14 2.4.1 Struktur und Anwendung 14 2.4.2 Weitere Wirkmechanismen von Statinen 14 2.4.2.1 Die apoptotische Wirkung der Statine 15 2.4.3 Eigenschaften im Tiereinsatz 15 2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Nitrotyrosin 16 2.5.1 Die NOS und Nitrotyrosinbildung 16 2.5.2 Vorkommen von iNOS und Nitrotyrosin 17 3 Zielstellung der Arbeit 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Versuchstiere 20 4.2 Perkutane Schnauzenbestrahlung 20 4.3 Applikation von Lovastatin 22 4.4 Versuchsprotokoll 22 4.5 Histologische Aufbereitung 23 4.5.1 Antikörper 23 4.5.1.1 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) 23 4.5.1.2 Nitrotyrosin 23 4.5.1.3 CD105 ... 23 4.5.1.4 Kontroll-Antikörper 23 4.5.2 Färbeprotokolle 24 4.5.2.1 iNOS und CD105 24 4.5.2.2 Nitrotyrosin 26 4.5.2.3 Optimierung der Konzentration der primären Antikörper 27 4.5.3 Histologische Auswertung 29 4.5.3.1 Epithel .. 29 4.5.3.2 L. propria und L. muscularis 30 4.5.3.3 Endothel 31 4.6 Analyse 31 5 Ergebnisse 32 5.1 Zellzahlen im Epithel 32 5.1.1 Kontrollgruppe 32 5.1.2 Alleinige Bestrahlung 32 5.1.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 33 5.1.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 34 5.1.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 34 5.2 Expression von iNOS 36 5.2.1 Kontrollgruppe 36 5.2.2 Alleinige Bestrahlung 36 5.2.3 Alleinige Lovastatingabe 38 5.2.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 41 5.2.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 43 5.3 Expression von Nitrotyrosin 45 5.3.1 Kontrollgruppe 45 5.3.2 Alleinige Bestrahlung 45 5.3.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 47 5.3.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 49 5.3.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 51 5.4 Expression von CD105 54 5.4.1 Alleinige Bestrahlung 54 5.4.2 Alleinige Lovastatinbehandlung 54 5.4.3 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 55 5.4.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 55 6 Diskussion 57 6.1 Klinischer Hintergrund 57 6.2 Tiermodelle für die radiogene orale Mukositis 58 6.2.1 Maus 58 6.2.2 Ratte 58 6.2.3 Hamster 58 6.3 Eigenschaften des unbehandelten Zungengewebes 59 6.3.1 Epithel der Zungenunterseite 59 6.3.1.1 Zellzahl . .59 6.3.1.2 Nachweis von iNOS 59 6.3.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 60 6.3.2.1 Nachweis von iNOS 60 6.3.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2.3 Nachweis von CD105 60 6.3.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 60 6.4 Veränderungen bei konventioneller fraktionierter Bestrahlung 61 6.4.1 Epithel der Zungenunterseite 61 6.4.1.1 Zellzahl . 61 6.4.1.2 Nachweis von iNOS 61 6.4.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 62 6.4.2.1 Nachweis von iNOS 62 6.4.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2.3 Nachweis von CD105 63 6.4.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 63 6.5 Veränderungen bei alleiniger Lovastatinbehandlung 63 6.5.1 Epithel der Zungenunterseite 63 6.5.1.1 Zellzahl . 63 6.5.1.2 Nachweis von iNOS 63 6.5.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 64 6.5.2.1 Nachweis von iNOS 64 6.5.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2.3 Nachweis von CD105 64 6.5.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 65 6.6 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung über 2 Wochen 65 6.6.1 Epithel der Zungenunterseite 65 6.6.1.1 Zellzahl . 65 6.6.1.2 Nachweis von iNOS 65 6.6.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 66 6.6.2 Immunzellen in den L. propria und L. muscularis 66 6.6.2.1 Nachweis von iNOS 66 6.6.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 67 6.6.2.3 Nachweis von CD105 67 6.6.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 67 6.7 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung ab Tag 7 68 6.7.1 Epithel der Zungenunterseite 68 6.7.1.1 Zellzahl . 68 6.7.1.2 Nachweis von iNOS 68 6.7.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 68 6.7.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 69 6.7.2.1 Nachweis von iNOS 69 6.7.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 69 6.7.2.3 Nachweis von CD105 69 6.7.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 70 6.8 Zusammenfassende Einschätzung der Ergebnisse 70 7 Ausblick 72 8 Zusammenfassung 73 9 Summary 75 10 Abbildungsverzeichnis 77 11 Tabellenverzeichnis 80 12 Literatur 81 13 Anhang 92 14 Danksagung 100