Einleitung: Zu den konventionellen αβ T-Zellen zählen die klassischen CD4+ einfach-positiven T-Helfer (Th) bzw. regulatorischen T-Zellen (Treg) sowie CD8αβ+ einfach-positive zytotoxische T-Zellen. Säugetiere besitzen jedoch noch weitere T-Zell-Subpopulationen, die entweder den T-Zell-Rezeptor αβ (TCRαβ) oder γδ (TCRγδ) exprimieren. Bei Hunden wurde bisher nur die hoch aktivierte CD4+CD8α+ doppelt-positive (dp) T-Zellpopulation des peripheren Blutes detailliert charakterisiert. Über ihre Verteilung in lymphatischem und nicht lymphatischem Gewebe ist jedoch wenig bekannt. Darüber hinaus besitzen Hunde αβ T-Zellen, die weder CD4 noch CD8α (CD4-CD8α- doppelt-negative (dn) T-Zellen) exprimieren, sowie γδ T-Zellen, deren Phänotyp bisher noch nicht untersucht wurde. Ziele der Studie: Ziel dieser Studie war es, einen Überblick über das Vorkommen und den Phänotyp von nichtkonventionellen T-Zellen im peripheren Blut und Geweben des Hundes zu bieten. Zu diesem Zweck wurden CD4+CD8α+ dp, TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen hinsichtlich der Expression von Oberflächenmarkern, wichtigen Transkriptionsfaktoren und Zytokinen charakterisiert. Tiere, Material und Methoden: Canine T-Zellen Zellen aus dem Blut (Stichprobenumfang: n = 10) sowie aus den Peyerschen Platten (PP; n = 10), dem Dünndarmepithel (IEL; n = 6), den mesenterialen Lymphknoten (mLN; n = 10), tracheobronchialen Lymphknoten (tLN; n = 9), der Lunge (n = 10), Milz (n = 10) und dem Thymus (n = 10) wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das Studiendesign erforderte, dass die Gewebeproben von einer anderen Gruppe gesunder Beagle-Hunde (n = 12) entnommen wurden als das periphere Blut. CD4+CD8α+ dp T-Zellen wurden auf ihre Gewebeverteilung, die Expression des T-Zell-Rezeptortyps und die Zusammensetzung des CD8-Dimers (d.h. CD8αα Homodimer vs. CD8αβ Heterodimer) sowie die Expression des Aktivierungsmarkers CD25 untersucht. Um Hinweise auf die potenzielle(n) Funktion(en) von CD4+CD8α+ dp T-Zellen in Geweben zu erhalten, wurde die Expression des Transkriptionsfaktors Forkhead Box P3 (FoxP3) und des zytotoxischen Moleküls Granzym B analysiert. Darüber hinaus wurden Gewebe und Blut auf die Verteilung von TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen untersucht. Eine umfassende Charakterisierung von TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen des peripheren Blutes erfolgte durch die Untersuchung der folgenden Marker: CD25 und CD5, FoxP3, GATA-3, T-Box-Transkriptionsfaktor TBX21 (T-bet) und Granzym B. Im Rahmen funktioneller Analysen wurde die Zytokinproduktion (Interferon-γ (IFN-γ) und Interleukin-17A, IL-17A) nach Stimulation der Zellen mit Phorbol-Myristat-Acetat (PMA)/Ionomycin durchgeführt. Normalverteilte Datensätze wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni-Post-Hoc-Test (Vergleich mehrerer Gruppen) oder ungepaartem t-Test (zweiseitig; Vergleich zweier Gruppen) analysiert. Bei nichtparametrischen Daten wurde entweder der Kruskal-Wallis H-Test mit Dunn's Post-Test (Ver-gleich mehrerer Gruppen) oder der Mann-Whitney U-Test (zweiseitig; Vergleich zweier Gruppen) angewandt. Ergebnisse: Canine CD4+CD8α+ dp T-Zellen der Gewebe sind hauptsächlich TCRαβ+CD4+CD8αα+CD25+ und akkumulieren in den PP (durchschnittlich 1.6 %). Obwohl CD4+CD8α+ dp T-Zellen der LN CD4 und CD8α nicht gleich stark exprimieren und zahlenmäßig gering (durchschnittlich 0,2 %) sind, sind sie teilweise FoxP3+. Dies weist auf ein regulatorisches Potential dieser Untergruppe hin. Einige CD4+CD8α+ dp T-Zellen der IEL exprimieren TCRγδ und/oder Granzym B, was die Einzigartigkeit der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten unterstreicht. TCRαβ+CD4-CD8α- dn T-Zellen machen einen wesentlichen Anteil aller αβ T-Zellen in Blut (Median 14,4 %) und Gewebe (Median 15 % (Lunge) - 7,5% (PP)) aus und besitzen ein bemerkenswert hohes Expressionsniveau an CD25. CD25 wird entweder mit FoxP3 (hinweisend auf einen regulatorischen Phänotyp) oder ohne FoxP3 (hinweisend auf einen Effektorphänotyp) exprimiert. Zusätzlich weisen IFN-γ, GATA-3 oder IL-17A-exprimierende Subpopulationen Eigenschaften von konventio-nellen Typ 1 T-Helferzellen (Th1), Th2 bzw. Th17 auf. Interessanterweise wurden auch FoxP3+GATA-3+-Hybridzellen gefunden. Canine γδ T-Zellen hingegen sind entweder CD8α+ einfach-positiv oder CD4 CD8α- dn. Während TCRγδ+CD8α+ einfach-positive T-Zellen ihren zytotoxischen TCRαβ+CD8αβ+ T-Zell-Pendants ähneln (T-bet+, IFN-γ+, Granzym B+), exprimieren TCRγδ+CD4 CD8α- dn T-Zellen GATA-3 und nur geringe Mengen an T-bet und Granzym B. Schlussfolgerungen: Dies ist die erste Studie, die einen umfassenden Überblick über nichtkonventionelle T-Zell-Populationen des Hundes bietet. Hinsichtlich ihrer Gewebeverteilung, ihrer Anzahl und ihres funktionellen Potentials ist es wahrscheinlich, dass diese Zellen an wichtigen Immunreaktionen sowie an der Pathogenese von Erkrankungen des Hundes beteiligt sind. Hierzu werden weitere Studien erforderlich sein. Es ist anzumerken, dass das klassische Schema der CD4+ und CD8αβ+ einfach-positiven T-Zellen als canine Haupteffektor- bzw. regulatorische T-Zellen neu überdacht werden sollte. :1 Introduction 1 1.1 The innate and adaptive immune system of mammals 1 1.2 Conventional αβ T cells 1 1.2.1 Cytotoxic CD8αβ+ T cells 2 1.2.2 CD4+ T cells 3 1.2.2.1 CD4+ T helper cells 3 1.2.2.2 CD4+ regulatory T cells 4 1.3 Non-conventional T cells 5 1.3.1 CD4+CD8α+ double-positive T cells 5 1.3.2 γδ T cells 7 1.3.3 CD4-CD8α- double-negative αβ T cells 8 1.4 Aims of this study 8 2 Results 10 2.1 1st publication 10 2.2 2nd publication 32 3 Discussion 55 3.1 Canine non-conventional CD4+CD8α+ double-positive T cells are a homogeneous population enriched at mucosal sites 55 3.2 Canine non-conventional CD4-CD8α- double-negative T cells are unique in abundance and phenotype 57 3.3 Concluding remarks 60 4 Summary 61 5 Zusammenfassung 63 6 Literature Cited 65 / Introduction: Conventional αβ T cells comprise the classical CD4+ single-positive (sp) T helper (Th) resp. T regulatory (Treg) and CD8αβ+ sp cytotoxic T cell subsets. However, further T cell subpopulations either expressing T cell receptor αβ (TCRαβ) or γδ (TCRγδ) occur in mammals. In dogs, only the highly activated CD4+CD8α+ double-positive (dp) T cell population of peripheral blood has been characterized in detail. Yet, little is known about its distribution in lymphoid and non-lymphoid tissues. Furthermore, dogs possess αβ T cells neither expressing CD4 nor CD8α (CD4-CD8α- double-negative (dn) T cells) and γδ T cells, whose phenotype was still undefined. Aims of study: The objective of this study was to provide an overview on the occurrence and phenotype of non-conventional T cells in canine peripheral blood and tissues. To this end, CD4+CD8α+ dp, TCRαβ+CD4-CD8α- dn, and γδ T cells were characterized regarding expression of surface markers, key transcription factors, and cytokines. Animals, material and methods: Canine T lymphocytes from peripheral blood (sample size: n = 10), Peyer’s patches (PP; n = 10), epithelium of the small intestine (IEL; n = 6), mesenteric lymph nodes (mLN; n = 10), tracheobronchial lymph nodes (tLN; n = 9), lung (n = 10), spleen (n = 10), and thymus (n = 10) were analyzed by flow cytometry. Due to the study design tissue samples had to be taken from a different group of healthy Beagle dogs (n = 12) than peripheral blood. CD4+CD8α+ dp T cells were studied for their tissue distribution, expression of T cell receptor type and composition of the CD8 dimer (i.e. CD8αα homodimer vs. CD8αβ heterodimer), as well as expression of the activation marker CD25. To define the potential function(s) of CD4+CD8α+ dp T cells in tissues, expression of the transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) and the cytotoxic molecule granzyme B were analyzed. Furthermore, tissues and blood were studied for distribution of TCRαβ+CD4-CD8α- dn and γδ T cells. A comprehensive characterization of blood TCRαβ+CD4-CD8α- dn and γδ T cells was made by investigation of the following markers: CD25 and CD5, FoxP3, GATA-3, T-box transcription factor TBX21 (T-bet), and granzyme B. Functional analyses were performed by examination of cytokine production (interferon γ (IFN-γ) and interleukin 17A, IL-17A) following stimulation of cells with phorbol-myristate-acetate (PMA)/ionomycin. Normally distributed data sets were analyzed using One-way analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc test (multiple groups) or unpaired Student’s t-test (two-tailed; two groups). For nonparametric data, either Kruskal-Wallis H test with Dunn’s post-test (multiple groups) or Mann-Whitney U test (two-tailed; two groups) was applied. Results: Canine CD4+CD8α+ dp T cells of tissues can be mainly described as TCRαβ+CD4+CD8αα+CD25+ accumulating in PP (1.6% on average). Although not homogeneous in expression levels of CD4 and CD8α and low in number (0.2% on average), CD4+CD8α+ dp T cells of LN are partly FoxP3+. This indicates regulatory potential of this subset. Some CD4+CD8α+ dp T cells of IEL express TCRγδ and/or granzyme B, underlining the uniqueness of intestinal intraepithelial lymphocytes. TCRαβ+CD4-CD8α- dn T cells make up a substantial portion of all αβ T cells in blood (median 14.4%) and tissues (median 15% (lung) – 7.5% (PP)) with a remarkably high expression level of CD25. CD25 is either co-expressed with FoxP3 (reminiscent of a regulatory phenotype), or without FoxP3 (reminiscent of an effector phenotype). In addition, subsets expressing IFN-γ, GATA-3, or IL-17A suggest properties of conventional type 1 T helper cells (Th1), Th2, and Th17, respectively. Interestingly, FoxP3+GATA-3+ hybrid cells were found, too. Canine γδ T cells, on the other hand, are either CD8α+ sp or CD4-CD8α- dn. While TCRγδ+CD8α+ sp T cells resemble their TCRαβ+CD8αβ+ cytotoxic T cell counterparts (T-bet+, IFN-γ+, granzyme B+), TCRγδ+CD4-CD8α- dn T cells express GATA-3, and only low levels of T-bet and granzyme B. Conclusions: This is the first study providing a comprehensive overview on canine non-conventional T cell subsets. Regarding tissue distribution, abundance and functions resp. functional potential of these T cells, it is conceivable that they play a major role in health and diseases of dogs. Further studies examining this topic will be needed. Of note, the classical scheme of CD4+ sp Th/Treg and CD8αβ+ cytotoxic T cells as main effector/regulatory T cells in dogs should be reconsidered.:1 Introduction 1 1.1 The innate and adaptive immune system of mammals 1 1.2 Conventional αβ T cells 1 1.2.1 Cytotoxic CD8αβ+ T cells 2 1.2.2 CD4+ T cells 3 1.2.2.1 CD4+ T helper cells 3 1.2.2.2 CD4+ regulatory T cells 4 1.3 Non-conventional T cells 5 1.3.1 CD4+CD8α+ double-positive T cells 5 1.3.2 γδ T cells 7 1.3.3 CD4-CD8α- double-negative αβ T cells 8 1.4 Aims of this study 8 2 Results 10 2.1 1st publication 10 2.2 2nd publication 32 3 Discussion 55 3.1 Canine non-conventional CD4+CD8α+ double-positive T cells are a homogeneous population enriched at mucosal sites 55 3.2 Canine non-conventional CD4-CD8α- double-negative T cells are unique in abundance and phenotype 57 3.3 Concluding remarks 60 4 Summary 61 5 Zusammenfassung 63 6 Literature Cited 65

In order to investigate the effect of food restriction on fat mobilization in horses with impaction in left ventral colon during treatment, serum triglycerides, NEFA and total bilirubine (TB) were measured before and after treatment. On another side, the determination of alcohol dehydrogenase (ADH) activity in serum could facilitate the distinguishing of the non-strangulating intestinal obstruction from the potential fatal strangulation obstruction and could submit a new prognostic biochemical parameter for intestinal strangulation. With the intention of giving a highlight over the analgesic effect of Buscopan® compositum in horses with colic, it was attempted to investigate the effect of Buscopan® compositum on the intestinal motility of healthy conscious horses in different regions of intestine. A significant elevation of NEFA and TB was observed in horses with impaction in left ventral colon at admission. By relieving the impaction, there was a significant elevation of triglycerides in comparison to its level at admission. There was a significant increase in ADH activity in all horses with acute intestinal obstruction. ADH activity was significantly higher in horses with strangulation in comparison to non-strangulation obstruction. There was only a significant correlation between ADH and lactate in horses with non-strangulation obstruction and colon torsion. Only AST and GLDH were significantly increased in horses with colon torsion. ADH activity > 20 U/l had 80.56% specificity and 80.49% sensitivity for discriminating horses with intestinal strangulation from non-strangulation obstruction. ADH activity < 80 U/l had 94.44% specificity and 66.67% sensitivity for survival. Buscopan® compositum had an immediate, rapid and significant (p< 0.05) reduction of duodenal, cecal and left ventral colon contractions after application. Cecal and left ventral colon contractions restored rapidly their normal contractions after 30 min, while duodenal contractions returned to the normal rate after 120 min of Buscopan® compositum administration. The horses with impaction in left ventral colon are susceptible to fat mobilization during the period of treatment as a result of food restriction. It was characterized by a revisable hypertri-glyceridemia and hyperbililrubinemia. Serum ADH activity could have a useful clinical value in detecting the intestinal strangulation and predicting the prognosis in horses with intestinal strangulation. Buscopan® compositum at its therapeutic dosage has an immediate, potent, short-lived reductive effect on cecum and left ventral colon contractions but a minor, longer effect on the duodenal contractions. Therefore, it is thought to be more effective in treatment of spasmodic colic than in large colon impaction.:Contents I List of Abbreviations II 1 Introduction and Literature 1 2 Results 4 2.1 Publication 1: Triglyceride, free fatty acids and total bilirubin in horses with left ventral large colon impaction 4 2.2 Publication 2: Clinical evaluation of serum alcohol dehydrogenase activity in horses with acute intestinal obstruction 9 2.3 Publication 3: Effect of Buscopan® compositum on the motility of the duodenum, cecum and left ventral colon in healthy conscious horses 43 3 Discussion 60 4 Summary 68 5 Zusammenfassung 70 6 References 72 7 Acknowledgement 81 / Um den Effekt der Nahrungskarenz auf die Fettmobilisation bei Pferden mit Verstopfung der linken ventralen Längslagen des Kolons während der Behandlung zu untersuchen, wurden Triglyceride (TG), freie Fettsäuren (FFS) und Gesamtbilirubin (GB) bestimmt. Andererseits ermöglicht die Bestimmung der Aktivität der Alkoholdehydrogenase (ADH) im Serum die Unterscheidung zwischen einer nichtstrangulierenden intestinalen Obstruktion und einer potentiell tödlichen Strangulation. ADH kann somit als ein neuer prognostischer biochemischer Parameter für die intestinale Strangulation eingesetzt werden. Um den spasmolytischen Effekt von Buscopan compositum bei Pferden mit Kolik zu untersuchen, wurde der Effekt von Buscopan compositum auf die intestinale Kontraktion von gesunden Pferden in verschiedenen Regionen des Darmes getestet. Eine signifikante Erhöhung der FFS und des GB wurde bei Aufnahme von Pferden mit einer Verstopfung in der linken ventralen Längslagen festgestellt. Nach der Behandlung der Verstopfung konnte eine signifikante Erhöhung der Konzentration von TG, bezogen auf die TG Konzentration bei Aufnahme in die Klinik, festgestellt werden. Bei Pferden mit akuter intestinaler Obstruktion wurde eine signifikante Erhöhung der Aktivität der ADH beobachtet. Die Aktivität der ADH war bei Pferden mit einer Strangulation signifikant höher als bei Pferden, die eine nichtstrangulierende Obstruktion des Darmes hatten. Bei Pferden mit einer nichtstrangulierenden Obstruktion oder einer Kolontorsion wurde eine positive Korrelation zwischen der ADH-Aktivität und der Laktatkonzentration im Serum festgestellt. Nur bei Pferden mit Kolontorsion waren die Aktivitäten von AST und GLDH signifikant erhöht. Für die Unterscheidung zwischen Pferden mit einer intestinalen Strangulation oder einer nichtstrangulierenden Obstruktion wurde für die ADH- Aktivität größer als 20 U/l eine Spezifität von 80,56% und eine Sensitivität von 80,49% ermittelt. Eine ADH-Aktivität kleiner 80 U/l zeigt, mit einer Spezifität von 94,44% und einer Sensitivität von 66,67%, eine günstige Prognose für das Überleben des Pferdes an. Nach Gabe von Buscopan® compositum trat eine sofortige schnelle und signifikante (p<0,05) Reduktion der Kontraktionen im Duodenum, Zäkum und den linken ventralen Längslagen ein. Die Kontraktionen des Zäkums und der linken ventralen Längslagen normalisierten sich schnell innerhalb von 30 min, wogegen die Kontraktionen des Duodenums erst 120 min nach der Applikation von Buscopan® compositum den Normalzustand erreichten. Pferde mit einer Verstopfung in der linken ventralen Längslagen des Kolons sind während der medizinischen Behandlung anfällig für Fettmobilisation aufgrund der reduzierten Futter-aufnahme. Dies ist gekennzeichnet durch eine reversible Hypertriglyceridämie und eine Hyperbilirubinämie. Die Aktivität von ADH im Serum kann ein nützlicher klinischer Parameter sein, um eine intestinale Strangulation zu identifizieren und bietet sich auch als prognostischer Marker bei intestinaler Strangulation an. Die Applikation von Buscopan® compositum in der therapeutischen Dosierung hat eine sofortige, potente und kurzzeitige Reduktion der Kontraktionen des Zäkums und der linken ventralen Längslage aber einen geringen und länger anhaltenden Effekt auf die duodenalen Kontraktionen zur Folge. Daraus folgt, dass Buscopan® compositum bei der Behandlung von Krampfkoliken effektiver ist als bei Verstopfungen des großen Kolons.:Contents I List of Abbreviations II 1 Introduction and Literature 1 2 Results 4 2.1 Publication 1: Triglyceride, free fatty acids and total bilirubin in horses with left ventral large colon impaction 4 2.2 Publication 2: Clinical evaluation of serum alcohol dehydrogenase activity in horses with acute intestinal obstruction 9 2.3 Publication 3: Effect of Buscopan® compositum on the motility of the duodenum, cecum and left ventral colon in healthy conscious horses 43 3 Discussion 60 4 Summary 68 5 Zusammenfassung 70 6 References 72 7 Acknowledgement 81

Alle laktierenden Ziegen aus 12 hessischen Milchziegen-Betriebe wurden über einen Zeitraum von 2 Jahren beprobt. 83,6 % der 2038 Hälftegemelksproben waren kulturell negativ. 10,7 % der bakteriologisch positiven Proben waren Koagulase-negative Staphylokokken. Zur KNS-Differenzierung wurden Kulturmorphologie, ID32 Staph-Test, in-vitro-Sensitivität gegenüber Antibiotika und die t-DNA-PCR angewandt. Keines dieser Verfahren konnte alleinig zur Identifizierung der KNS-Isolate erfolgreich angewandt werden, nur die Kombination der Verfahren war zielführend. Nachgewiesen wurden die Spezies S. caprae, S. epidermidis, S. simulans, S. hyicus, S. saprophyticus, S. chromogenes, S. lentus, S. xylosus und S. hominis. Weiterhin wurde nach Methoden gesucht, um die subklinische Mastitis der Ziege diagnostizieren zu können. Hier erscheint der Vergleich der Zellzahl beider Euterhälften einer Ziege geeignet, um eine subklinische Mastitis abgrenzen zu können. Aufgrund der erhöhten Zellzahl, der Erregernachweis in Reinkultur sowie des Vergleichs mit der kultur-bakteriologisch negativen Euterhälfte erscheint die ätiologische Bedeutung der nachgewiesenen KNS-Isolate als Mastitiserreger der Ziege wahrscheinlich. / All lactating goats out of 12 hessian Dairy-goat-farms were being tested over a period of 2 years. 83,6 % of 2038 half-milk-samples were bacteriological negative. 10,7 % of the bacteriological positive samples were Coagulase-negative staphylococci. For KNS-differentiation morphology of culture, ID 32 Staph Test, in-vitro-sensitivity against antibiotics and t-DNA-PCR were evaluated. None of these methods could be used alone to identify the CNS isolates, the combination of the methods led to results. The species S. caprae, S. epidermidis, S. simulans, S. hyicus, S. saprophyticus, S. chromogenes, S. lentus, S. xylosus and S. hominis were found. Further it was searched for methods to diagnose subclinical mastitis of goats. The comparison of cell amount of both udder halfs of a goat seems to be adequate to diagnose subclinical mastitis. Because of increased cell amount, proof of agent in pure culture and comparison with the bacteriological negative udder half the etiological impact of the detected CNS-Isolates as causative agents of goat-mastitis is likely.

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) have been used with some success in the treatment of canine atopic dermatitis (CAD). Correspondent in vitro studies revealed that PUFA play a crucial role in the exocytosis of mast cells. n3 PUFA such as α-linolenic acid (LNA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), as well as the n6 PUFA linoleic acid (LA) have been shown to arrest the secretion of inflammatory mediators. Contrary, the n-6 PUFA arachidonic acid (AA) has been proven to promote the production of mast cell inflammatory mediators. However, we are still lacking a complete picture of the mode of action. The goal of this work was to further characterize the modulatory effects of PUFA supplementation on the plasma membrane lipid composition of mast cells. Furthermore the consequences of a membrane modulation of mast cells by PUFA on the localization and activity on of the membrane bound enzyme phospholipases D (PLD) were investigated. Canine mastocytoma cells (C2) were supplemented with one of the following PUFA: LNA, EPA, DHA, LA or AA. To investigate the influence of PUFA on the lipid composition of membrane microdomains, lipid rafts were separated from non-raft plasma membranes of mast cells for the first time using a detergent-free isolation technique. Results show that PUFA are significantly increased in rafts as well as in non-rafts microdomains (Publication 1). The incorporation of PUFA into the membrane goes along with an increase of the unsaturation status and the fluidity of the membrane. This rise in membrane fluidity may result in a reorganization of membrane signaling molecules and enzymes such as the PLD. To define the impact of a PUFA supplementation on PLD trafficking, C2 were transfected with green fluorescent protein (GFP) fusion plasmids encoding PLD1 or PLD2. Since the transfection ability of the suspension cell line C2 is limited, a special transfection protocol was established, suitable for non-adherent cell lines. Transfection succeeded using chicken egg white as coating material for the cell culture plates. The transfection efficiency rose to 50% versus 5% in uncoated plates. In addition to the obvious increase in the transfection efficiency, the new technique is simple and economic and might be suitable for a wide range of suspension cell lines (Publication 2). Using this optimized protocol the influence of PUFA on the trafficking of PLD isoforms was studied. LNA, EPA, DHA and LA but not AA prevented the stimulation-induced translocation of PLD1 to the plasma membrane. Since the translocation of PLD1 is important for mast cell exocytosis, LNA, EPA, DHA and LA do have an inhibiting effect on the stimulation-induced release of pro-inflammatory mediators. All PUFA tested boosted the total PLD activity. In order to rule out, which PLD isoform was affected by the PUFA, the mast cells were supplemented with DHA or AA in the presence of specific PLD isoform inhibitors. DHA completely abolished the inhibitiory effect of the PLD1 inhibitor but had no effect on the inhibitory effect of PLD2 inhibitor. On the other hand, AA suppressed the inhibitory effect of both PLD1 and PLD2 inhibitor (Publication 3). Taking together, the studies provide a mechanistic base for the role of PUFA in the exocytosis processes of mast cells. PUFA of the n3 and the n6 families impact the lipid composition of membrane microdomains, which in turn lead to a modulation of the physiochemical properties of the membrane. LNA, EPA, DHA and LA suppress the release of inflammatory mediators through their inhibitory action on the stimulation-induced translocation of the PLD1. Contrariwise, AA permits the stimulation-induced migration of PLD1 to the plasma membrane and increases the activity of both PLD isoforms. Therefore, LNA, EPA, DHA and LA but not AA inhibit the release of mast cell inflammatory mediators upon stimulation. / Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) können mit einigem Erfolg zur Behandlung der caninen atopischen Dermatitis (CAD) eingesetzt werden. In vitro-Studien zeigten, dass PUFA eine entscheidende Rolle in der Exozytose von Mastzellen spielen. N-3-PUFA wie α-Linolensäure (LNA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosahexaensäure (DHA) sowie die n-6-PUFA Linolsäure (LA) können die Sekretion von Entzündungsmediatoren vermindern. Arachidonsäure (AA) als n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure hingegen fördert die Entzündungsmediatoren-Freisetzung aus den Mastzellen. Eine vollständige Aufklärung der Wirkungsweise fehlt aber weiterhin. Das Ziel dieser Arbeit war eine weitergehende Charakterisierung der modulierenden Effekte einer PUFA-Supplementierung auf die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran von Mastzellen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von PUFA auf die Lokalisation und Aktivität des Membran-gebundenen Enzyms Phospholipase D (PLD) untersucht. Canine Mastozytom-Zellen (C2) wurden mit einer der folgenden PUFA kultiviert: LNA, EPA, DHA, LA oder AA. Um den Einfluss von PUFA auf die Lipidzusammensetzung der Membran-Mikrodomänen zu untersuchen, konnten sowohl Lipid Raft als auch Nicht-Raft Plasmamembran-Anteile von Mastzellen zum ersten Mal mittels einer Detergenzien-freien Isolationsmethode getrennt werden. Hervorzuheben ist, dass PUFA signifikant vermehrt in Raft- sowie in Nicht-Raft Membranmikrodomänen eingelagert werden (Publikation 1). Die Integration von PUFA in die Membran geht mit einer Steigerung der Doppelbindungsanzahl und der Fluidität der Membran einher. Diese Erhöhung der Membranfluidität kann zu einer Reorganisation von membranären Signalmolekülen und Enzymen wie der PLD führen. Um die Auswirkungen einer PUFA-Supplementierung auf den intrazellulären Transport der PLD in C2 zu bestimmen, wurden die Zellen mit PLD1- oder PLD2-codierenden grün fluoreszierenden Protein-(GFP-)Fusionsplasmiden transfiziert. Da die Transfektionsfähigkeit der Suspensions-Zelllinie C2 begrenzt ist, wurde ein für nicht-adhärente Zelllinien geeignetes Transfektionsprotokoll etabliert. Mit Hühnereiweiß als Beschichtungsmaterial für die Zellkultur-Platten stieg die Transfektionseffizienz auf 50% im Vergleich zu 5% bei unbeschichteten Platten. Neben der deutlichen Erhöhung der Transfektionseffizienz ist die neu etablierte Technik einfach durchzuführen sowie wirtschaftlich und kann für eine Vielzahl von Suspension-Zelllinien geeignet sein (Publikation 2). Unter Verwendung dieses optimierten Protokolls wurde der Einfluss von PUFA auf die Translokation der PLD-Isoformen untersucht. LNA, EPA, DHA und LA, nicht aber AA verhindern die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1 an die Plasmamembran. Die Translokation der PLD1 ist wichtig für die Mastzell-Exozytose. LNA, EPA, DHA und LA haben hier eine hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren. Alle getesteten PUFA verstärken die Gesamt-PLD-Aktivität. Um zu unterscheiden, welche PLD-Isoform durch PUFA beeinflusst ist, wurden die Mastzellen mit DHA oder AA in Gegenwart von PLD-Isoform-Inhibitoren supplementiert. DHA hebt die inhibitorische Wirkung des PLD1-Inhibitors vollständig auf, zeigte aber keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung des PLD2-Inhibitors. Andererseits unterdrückt AA die hemmende Wirkung des PLD1- als auch des PLD2-Inhibitors (Publikation 3). Zusammenfassend bietet die Studie eine mechanistische Basis für die Rolle von PUFA bei Exozytose-Prozessen von Mastzellen. PUFA der n-3- und n-6-Familie beeinflussen die Lipidzusammensetzung von membranären Mikrodomänen, was wiederum zu einer Modulation der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Membran führt. LNA, EPA, DHA und LA verhindern die Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch ihre hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1. Umgekehrt erlaubt AA eine stimulationsinduzierte Migration der PLD1 zur Plasmamembran und steigert die Aktivität der beiden Isoformen der PLD. Somit hemmen LNA, EPA, DHA und LA, aber nicht AA die Freisetzung von Mastzell-Entzündungsmediatoren nach Stimulation.

Nach dem Eintritt in den Wirtsorganismus und initialer Replikation infizieren Alphaherpesviren Neuronen zur weiteren Ausbreitung im Nervensystem und zur Etablierung einer Latenz. Dazu werden die Viruspartikel innerhalb der Axone retrograd von der Peripherie zum neuronalen Zellkörper transportiert. Die umgekehrte Richtung beschreibt den Weg des anterograden Transports vom Zellkörper zur Synapse für weitere Infektionen von Neuronen höherer Ordnung oder zurück zur Peripherie. Der retrograde intraaxonale Transport ist gut untersucht. Dagegen wird über den anterograden Transport kontrovers diskutiert. Zwei verschiedene Transportmodelle werden vermutet. Das „Married Model“ postuliert, dass umhüllte Virionen innerhalb von Vesikeln entlang des Axons transportiert werden. Die Freisetzung der Partikel erfolgt an der jeweiligen Synapse durch Endocytose. Das „Subassembly Model“ geht dagegen davon aus, dass einzelne Virusstrukurkomponenten (Nukleokapsid, Hülle) entlang des Axons transportiert werden. Der Zusammenbau und die Freisetzung erfolgt am Axonterminus bzw. an der Synapse (in vivo) oder am Wachstumskegel (in vitro) oder an speziellen Auftreibungen des Axons, den sogenannten Varicosities. Nach Infektion eines neuronalen Explantatsystems mit dem Pseudorabiesvirus (PrV) konnten ultrastrukturell umhüllte Virionen in Vesikeln detektiert werden und so der Nachweis der Gültigkeit des „Married Model“ als vorherrschendes Transportmodell geführt werden. Dagegen ist die Situation beim prototypischen Alphaherpesvirus, dem Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1), weiterhin ungeklärt. Aufgrund der zahlreichen unterschiedlichen Analysemethoden und -systeme war ein direkter Vergleich der beiden Viren bislang nicht möglich. Daher sollte in dieser Arbeit ein standardisiertes neuronales Kultursystem genutzt werden, um vier verschiedene HSV-1 Stämme im Vergleich zu PrV zu untersuchen. Für die Infektionen wurden sowohl Neuronen aus dem oberen Cervikalganglion als auch aus Spinalganglien genutzt. So konnte gezeigt werden, dass in Neuronen, welche mit den HSV-1 Stämmen HFEM, 17+ und SC16 infiziert waren ca. 75% als umhüllte Virionen in Vesikeln und ca. 25% als nackte Kapside vorlagen. Ingesamt war die Anzahl der Viruspartikel in HSV-1 infizierten Neuronen signifikant geringer als in PrV infizierten Kulturen. Überraschenderweise zeigten mit HSV-1 KOS infizierte Neuronen ein reverses Bild. Hier lagen nur 25% der Viruspartikel als umhüllte Virionen in Vesikeln vor, während 75% als nackte Kapside detektiert wurden. Dieser unerwartete Phänotyp sollte auf molekularbiologischer Ebene genauer untersucht werden. Dabei wurde auf die Genregion von US9 fokussiert. Das von US9 codierte Membranprotein spielt eine wichtige Rolle während des Zusammenbaus der Virionen und bei anschließenden axonalen anterograden Transportvorgängen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das HSV-1 KOS Genom durch verschiedene Basenaustausche an der vorhergesagten TATA-Box von US9 eine Mutation aufweist. Zusätzlich trägt das offene Leseraster durch eine weitere Mutation ein vorzeitiges Stopcodon auf und wird dadurch auf 58 Kodons reduziert, im Gegensatz zu anderen HSV-1 Stämmen, wo es 91 Kodons umfasst. Die Mutation an der TATA-Box verändert auch das ursprüngliche Stopcodon vom US8a Gen, was zur einer Verlängerung von ursprünglich 161 zu 191 Kodons führt. In Northern Blot Analysen konnte eine reduzierte Transkription von US9 in HSV-1 KOS infizierten Zellen detektiert werden. In HSV-1 KOS infizierten Zellen konnten mittels eines spezifischen Antiserums gegen US9 im Western Blot kein Genprodukt nachgewiesen werden. Auch Immunfluoreszenzanalysen zeigten, dass das abgeleitete verkürzte Protein offenbar nicht stabil exprimiert wird. Dagegen konnten Western Blot Analysen die Vergrößerung des pUS8a bestätigen. Der beobachtete auffällige intraaxonale Phänotyp könnte somit durch die Mutation des US9 Protein erklärt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass auch bei HSV-1 vorwiegend das „Married Model“ für den anterograden intraaxonalen Transportweg bevorzugt wird und somit beide Alphaherpesviren, HSV-1 und PrV, denselben Transportweg nutzen.

Einleitung: Hunde mit brachyzephalem Syndrom zeigen multiple obstruktive Fehlbildungen der oberen Atemwege. Im Larynx können evertierte laterale Ventrikel, sogenannte La-ryngozelen die Rima glottidis verengen. In der bisherigen Literatur werden die evertierten Ventrikel in der Regel dem Kehlkopfkollaps zugeordnet und als Grad I Kollaps beschrieben. Die Ausprägung der Laryngozelen zeigt sich endoskopisch in unterschiedlichem Ausmaß. Die Indikation zur operativen Entfernung der evertierten Schleimhaut wird kontrovers diskutiert. Ziele der Untersuchungen: Nach Entwicklung einer standardisierten Untersuchungsmethode zur Beurteilung von Laryngozelen sollen Kriterien definiert werden, die eine Graduierung der Ausprägung erlauben. Anhand einer solchen Graduierung soll die Häufigkeit und die Ausprä-gung von Laryngozelen in einem Patientenkollektiv zwischen den Rassen Französische Bull-dogge und Mops verglichen werden. Anhand dieser Graduierung soll die Indikation zur chi-rurgischen Intervention definiert werden. Als neu entwickelte chirurgische Therapie soll die transorale laser-assistierte videomikroskopische Ablation, die Laryngozelektomie beschrie-ben werden und das Outcome 6 Monate postoperativ im Rahmen einer erneuten standardi-sierten Untersuchung und Graduierung evaluiert werden. Tiere und Methoden: In diese prospektive Studie eingeschlossen wurden in einem Zeitraum von 3 Jahren insgesamt 109 Hunde mit Brachyzephalem Syndrom der Rassen Mops und Französische Bulldogge. Alle Hunde wurden zur Therapie schwerer obstruktiver Malformati-onen der oberen Atemwege zur Multi-Level-Chirurgie vorgestellt. 64 Tiere waren Französi-sche Bulldoggen und 45 gehörten der Rasse Mops an. Nach einer ausführlichen Befunderhe-bung der oberen Atemwege wurden endoskopische Standbilder der Rima glottidis prä- und postoperativ angefertigt, um die Laryngozelen nach einer neuen Graduierung einheitlich zu evaluieren. Die evertierten Ventrikel wurden bei moderater bis starker Ausprägung mit der neuen Methode, der Laryngozelektomie, entfernt. Die erstellten endoskopischen Aufnahmen wurden prä- und postoperativ verglichen. Die erhobenen Befunde wurden zwischen den beiden Hunderassen Französische Bulldogge und Mops verglichen. Der Ausprägungsgrad der Laryngozelen und der Bezug zum Signale-ment der Hunde sowie zu einzelnen Befunden an den oberen Atemwegen der Tiere wurde ermittelt. Beim Vergleich von mehr als zwei unabhängigen, nicht normalverteilten Stichpro-ben wurde der H-Test nach Kruskal und Wallis eingesetzt, während beim Vergleich von mehr als zwei unabhängigen, normalverteilten Stichproben die einfaktorielle ANOVA Anwendung fand. Ordinale Daten wurden mit dem Vorzeichentest ausgewertet. Bei den kategorisierten bzw. nominalen Daten dagegen wurden der Chi-Quadrat-Tests angewendet. Bei allen durch-geführten Tests erfolgte eine zweiseitige Signifikanzüberprüfung, wobei für alle statistischen Tests ein p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant angenommen wurde. Ergebnisse: Über 50% der Hunde beider Rassen (51,6 % Französische Bulldogge, 51,1 % Mops) litten unter einer ausgeprägten Malformation des Larynx mit Laryngozelen der schwersten Ausprägungsform (Grad 2). Nur 2 % der Hunde der Rasse Mops und 14 % der Französischen Bulldoggen zeigen physiologische Larynxventrikel (Grad 0). Nach Ablation der Laryngozelen bestand 6 Monate postoperativ bei keinem der Tiere mehr eine Grad 2 Mal-formation der lateralen Ventrikel, bei 64 der 84 Hunde (76,2 %) war die Obstruktion voll-ständig beseitigt (Grad 0). Schlussfolgerung: Die Hälfte der Hunde der Rassen Französische Bulldogge und Mops sind vom schwersten Grad der Laryngozelen betroffen. Die Eversion der Schleimhaut der latera-len Ventrikel reicht bei Grad 2 über das Niveau der Ligg. Vocalia hinaus, engt die Rima glot-tidis ein und somit den Eingang des Kehlkopfes. Hunde der Rasse Mops sind schwerer betrof-fen als die Französischen Bulldoggen. Die Laryngozelektomie wurde als ein wesentlicher Be-standteil der Multi-Level-Chirurgie durchgeführt und hat sich als praktikable und wirksame Methode erwiesen, um obstruierendes Gewebe der evertierten lateralen Ventrikel komplikationsarm zu entfernen.:INHALT 1 Einleitung 1.1 Allgemeines 1.2 Hypothesen und Zielstellung 2 Allgemeine Grundlagen 2.1 Der Kehlkopf des Hundes 2.1.1 Die Anatomie des Kehlkopfes 2.1.2 Die Funktionen des Kehlkopfes und der Rima glottidis 2.2 Das Problem beim Tier 2.2.1 Das Brachyzephale Syndrom (BZS) 2.2.2 Der Kehlkopfkollaps 2.2.3 Die Laryngozelen (Evertierte laterale Ventrikel) 2.3 Diagnostik und Therapie 2.3.1 Diagnostik von Laryngozelen 2.3.2 Funktionelle Larynx-Diagnostik 2.3.3 Chirurgische Therapie von Laryngozelen 2.3.4 Laserchirurgie in der Tiermedizin 3 Tiere und Methoden 3.1 Tiere 3.2 Allgemeiner Ablauf 3.3 Anästhesie 3.4 Endoskopie der oberen Atemwege 3.4.1 Lagerung des Patienten 3.4.2 Equipment für die Endoskopie 3.4.3 Untersuchungsgang 3.5 Graduierung der Laryngozelen 3.5.1 Laryngozelen während der Larynxfunktionsprüfung 3.5.2 Beurteilung der Laryngozelen in der endexspiratorischen Pause 3.6 Graduierung endoskopischer Zusatzbefunde 3.7 Laryngozelektomie – Die transorale laser-assistierte video-mikroskopische Ablation der Laryngozelen 3.7.1 Lagerungstechnik und Zugangswege 3.7.2 Instrumentarium und Geräte 3.7.3 Operationsschritte der laser-assistierten video-mikroskopischen Laryngozelektomie 3.7.4 Multi-Level-Chirurgie 3.8 Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Graduierung der Laryngozelen 4.1.1 Präoperative Ausprägung der Laryngozelen bei Französischer Bulldogge und Mops 4.1.2 Postoperative Ausprägung der Laryngozelen bei Französischer Bulldogge und Mops 4.1.3 Evaluierung der prä- und postoperativen Ausprägung der Laryngozelen 4.1.4 Evaluierung von Hunden ohne Laryngozelektomie 4.2 Weitere Parameter zur Beurteilung evertierter Ventrikel 4.2.1 Kehlkopffunktionsprüfung 4.2.2 Kontaktflächen der Laryngozelen 4.3 Demographische Daten und Befunde und deren Bezug zur Ausprägung der Laryngozelen 4.4 Weitere Befunde in Bezug zur Ausprägung der Laryngozelen 4.4.1 Endoskopie der Atemwege 4.4.2 Vorangegangene Operationen 4.4.3 Zeitpunkt der Kontrolluntersuchung 5 Diskussion 5.1 Diskussion der Kernaussagen 5.2 Diskussion der weiteren Ergebnisse 5.3 Limitationen 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Verzeichnis der Abbildungen 9.2 Verzeichnis der Tabellen / Introduction: Dogs with brachycephalic syndrome show multiple obstructive malformations of the upper airways. In the larynx, everted lateral ventricles called laryngoceles may nar-row the rima glottidis. In previous studies, everted ventricles are usually attributed to la-ryngeal collapse and are described as grade I laryngeal collapse. The prominence of the laryngoceles is seen endoscopically to varying degrees. The indication for surgical removal of the everted mucosa is controversial. Objectives: After proposing a standardized examination technique for the evaluation of laryngoceles, criteria are defined which allow the graduation of the eversion by intensity. Through the classification by intensity, the frequency, and the expression of laryngoceles in a patient collective are compared between the breeds French bulldog and pug. The indication for surgical intervention is then defined based on differentiation criteria mentioned above. Transoral laser-assisted videomicroscopic ablation, laryngocelectomy, is described as a new-ly developed surgical therapy. The outcome is evaluated 6 months postoperatively during a repeat standardized examination and graduation. Animals and Methods: A total of 109 brachycephalic dogs of the French bulldog (n=64) and pug (n=45) breeds were included in this prospective study over a 3-year period. All dogs pre-sented for multi-level upper airway surgery for the treatment of severe obstructive malfor-mations because of brachycephalic syndrome. Moderately to severely everted ventricles were removed through the new method, the laryngocelectomy. After a comprehensive sur-vey of the upper airways, endoscopic still images of the rima glottidis were obtained pre- and postoperatively to consistently evaluate the laryngoceles after the proposed degrees of graduation. The findings were compared between the two dog breeds French bulldog and pug. Relations between the severity of the laryngoceles, the dogs signalment and to individual findings in the upper airways of the animals were determined. The Kruskal and Wallis H-test was used when comparing more than two independent, nonnormally distributed samples, whereas one-factor ANOVA was used when comparing more than two independent, normally distrib-uted samples. Ordinal data were analyzed using the sign test. For categorized or nominal data, the chi-square test was applied. Two-sided significance testing was performed for all tests and a p-value of <0.05 was assumed to be statistically significant for all statistical tests. Results: More than 50% of the dogs of both breeds (51.6% of French bulldogs, 51.1% of pugs) suffered from a pronounced malformation of the larynx with laryngoceles of the most se-vere form (grade 2). Only 2% of the pugs and 14% of the French bulldogs showed physiologi-cal laryngeal ventricles (grade 0). Six months after laryngocelectomy, none of the animals had grade 2 malformation of the lateral ventricles; in 64 of the 84 dogs who underwent sur-gery (76.2%), the obstruction was completely cleared (grade 0). Conclusion: Half of the French bulldogs and pugs were affected by the most severe grade of laryngoceles. The eversion of the mucosa of the ventricles extends within grade 2 above the level of the vocal ligaments, narrowing the rima glottidis, and thus the entrance of the lar-ynx. Dogs of the pug breed are more severely affected than French bulldogs. Laryngocelec-tomy was performed as one essential component of a multi-level surgery. We conclude that laryngocelectomy has proven to be a feasible and effective method of removing obstructing tissue of everted lateral ventricles with few complications.:INHALT 1 Einleitung 1.1 Allgemeines 1.2 Hypothesen und Zielstellung 2 Allgemeine Grundlagen 2.1 Der Kehlkopf des Hundes 2.1.1 Die Anatomie des Kehlkopfes 2.1.2 Die Funktionen des Kehlkopfes und der Rima glottidis 2.2 Das Problem beim Tier 2.2.1 Das Brachyzephale Syndrom (BZS) 2.2.2 Der Kehlkopfkollaps 2.2.3 Die Laryngozelen (Evertierte laterale Ventrikel) 2.3 Diagnostik und Therapie 2.3.1 Diagnostik von Laryngozelen 2.3.2 Funktionelle Larynx-Diagnostik 2.3.3 Chirurgische Therapie von Laryngozelen 2.3.4 Laserchirurgie in der Tiermedizin 3 Tiere und Methoden 3.1 Tiere 3.2 Allgemeiner Ablauf 3.3 Anästhesie 3.4 Endoskopie der oberen Atemwege 3.4.1 Lagerung des Patienten 3.4.2 Equipment für die Endoskopie 3.4.3 Untersuchungsgang 3.5 Graduierung der Laryngozelen 3.5.1 Laryngozelen während der Larynxfunktionsprüfung 3.5.2 Beurteilung der Laryngozelen in der endexspiratorischen Pause 3.6 Graduierung endoskopischer Zusatzbefunde 3.7 Laryngozelektomie – Die transorale laser-assistierte video-mikroskopische Ablation der Laryngozelen 3.7.1 Lagerungstechnik und Zugangswege 3.7.2 Instrumentarium und Geräte 3.7.3 Operationsschritte der laser-assistierten video-mikroskopischen Laryngozelektomie 3.7.4 Multi-Level-Chirurgie 3.8 Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Graduierung der Laryngozelen 4.1.1 Präoperative Ausprägung der Laryngozelen bei Französischer Bulldogge und Mops 4.1.2 Postoperative Ausprägung der Laryngozelen bei Französischer Bulldogge und Mops 4.1.3 Evaluierung der prä- und postoperativen Ausprägung der Laryngozelen 4.1.4 Evaluierung von Hunden ohne Laryngozelektomie 4.2 Weitere Parameter zur Beurteilung evertierter Ventrikel 4.2.1 Kehlkopffunktionsprüfung 4.2.2 Kontaktflächen der Laryngozelen 4.3 Demographische Daten und Befunde und deren Bezug zur Ausprägung der Laryngozelen 4.4 Weitere Befunde in Bezug zur Ausprägung der Laryngozelen 4.4.1 Endoskopie der Atemwege 4.4.2 Vorangegangene Operationen 4.4.3 Zeitpunkt der Kontrolluntersuchung 5 Diskussion 5.1 Diskussion der Kernaussagen 5.2 Diskussion der weiteren Ergebnisse 5.3 Limitationen 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Verzeichnis der Abbildungen 9.2 Verzeichnis der Tabellen

Streptocuccus suis (S. suis) gehört zu den wichtigsten bakteriellen Erregern bei Schweinen, stellt als Zoonoseerreger aber auch eine Gefahr für den Menschen dar. Bis zu 100% aller Schweine sind symptomlos kolonialisiert. Allerdings kommt es auch zu schwerwiegenden invasiven Erkrankungen, gekennzeichnet durch Meningitis, Arthritis, Serositis oder plötzliche Todesfälle, hauptsächlich bei Ferkeln zwischen 4 und 10 Wochen. S. suis exprimiert die Cysteinprotease IdeSsuis, die spezifisch nur porzines IgM spaltet, was zur Komplementevasion beiträgt. Allerdings ist das Vorhandensein von IdeSsuis nicht essenziell für die Eigenschaft eines Stammes, experimentelle invasive Erkrankungen hervorzurufen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der IdeSsuis-abhängigen Interaktion von S. suis mit porzinen B-Zellen. Dabei lag der Fokus auf dem IgM-B-Zellrezeptor (BCR) und der IgM-Sekretion durch IgM+ B-Zellen. Vor dem Hintergrund der Spaltung löslichen IgMs wurde die Arbeitshypothese untersucht, dass IdeSsuis auch in der Lage ist, den IgM-BCR zu spalten, was zu einer Beeinträchtigung der B-Zellfunktion durch gestörte IgM-BCR-Signalwege führt. Verschiedene IdeSsuis-Varianten sowie muramidase-released protein (MRP) als weiteres von S. suis stammendes Protein wurden rekombinant in Escherichia coli exprimiert und aufgereinigt. Die mögliche Spaltung des IgM BCR nach Inkubation porziner B-Zellen mit Medium, rIdeSsuis_homologue oder rIdeSsuis_homologue_C195S sowie aufkonzentriertem Kulturüberstand von S. suis Stamm 10 oder der isogenen Punktmutante 10ΔIdeSsuis∇IdeSsuis_C195S wurde in der Durchflusszytometrie untersucht, genauso wie nach Injektion in regionale Lymphknoten. Die Wiederherstellung der BCR-Expression auf der Zelloberfläche nach Spaltung durch rIdeSsuis_homologue sowie die Auswirkungen der BCR-Spaltung auf die intrazelluläre Signalkaskade verschiedener B-Zell-Subpopulationen (CD21+ und CD21-) wurde ebenfalls mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. Dabei wurden B-Zellen mit intaktem oder gespaltenem BCR mit einem IgM-BCR-spezifischen Antikörper oder intrazellulär und damit BCR-unabhängig durch Pervanadat stimuliert. Um funktionelle Konsequenzen der BCR-Spaltung zu untersuchen, wurden porzine Blutzellen mit den verschiedenen rekombinanten Proteinen inkubiert, für 3 Tage mit R848 und Interleukin-2 stimuliert und dann die Anzahl an IgM-sekretierenden Zellen im Enzyme-linked Immuno Spot Assay (ELISpot) bestimmt. Parallel dazu wurde der Gehalt an löslichem, in den ELISpot-Kulturüberstand sekretierten IgM mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) analysiert. Um eine Aussage über die Bindung der verschiedenen rekombinanten Proteine an IgM+ B-Zellen zu treffen, wurden diese mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, mit Zellen inkubiert und der Anteil an dadurch fluoreszierenden IgM+ B-Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Der IgM-BCR wurde in vitro und ex vivo durch rIdeSsuis sowie aufkonzentrierten Kulturüberstand von S. suis Stamm 10 gespalten, jedoch nicht durch rIdeSsuis_homologue_C195S oder den Kulturüberstand der isogenen Punktmutante. Die Wiederherstellung der Oberflächenexpression des IgM-BCR nach Spaltung benötigte ca. 20 Stunden. BCR-spezifische und -unspezifische Stimulation direkt nach Spaltung durch rIdeSsuis_homologue zeigte, dass die Signalweiterleitung am BCR gestört ist, die intrazellulären Komponenten der Signalkaskade allerdings weiterhin funktionsfähig sind. Die CD21+ und CD21- IgM B-Zell Subpopulationen unterschieden sich weder in der Effektivität der Rezeptorspaltung noch in ihrer Reaktion auf Stimulation. 3 Tage nach Inkubation mit rIdeSsuis_homologue, und in geringerem Umfang auch rIdeSsuis_C-domain, waren sowohl die Anzahl an IgM-sekretierenden Zellen als auch die Level an sekretiertem IgM reduziert, was nicht auf ein verändertes Überleben der Zellen zurückzuführen war. Obwohl rIdeSsuis_homologue_C195S keine Spaltung des BCR bewirkte, führte eine Inkubation ebenfalls zu einer Reduktion der IgM-sekretierenden Zellen. RIdeSsuis_homologue_C195S zeigte eine deutlich stabilere Bindung an IgM+ B-Zellen als die anderen rekombinanten Proteine. Das IgM-degradierende Enzym von S. suis, IdeSsuis, spaltet den IgM-BCR in vitro sowie ex vivo auf B-Zellen aus Blut und Lymphknoten. Diese Spaltung führt in vitro zu einer Störung der intrazellulären Signalweiterleitung und resultiert nach 3 Tagen in einer reduzierten B-Zellfunktion. Dabei scheint die Störung der B-Zellen nicht nur durch IgM-BCR-Spaltung, sondern auch durch starke Bindung allein zustande zu kommen. Zusammenfassend legen diese Ergebnisse einen weiteren Mechanismus der Modulation der porzinen Immunantwort durch S. suis nahe, der v.a. bei der Kolonialisierung und frühen Infektionsphasen eine entscheidende Rolle spielen könnte.:Directory ............................................................................................................................. I Abbreviations ........................................................................................................................... III 1. Introduction .......................................................................................................................... 1 2. Literature ............................................................................................................................ 2 2.1. Streptococcus suis .............................................................................................. 2 2.1.1. General characteristics and epidemiology ........................................................... 2 2.1.2. Disease in pigs .................................................................................................... 3 2.1.3. Disease in humans .............................................................................................. 3 2.1.4. Pathogenesis with focus on colonization ............................................................. 4 2.1.5. IdeSsuis and its comparison to other streptococcal immunoglobulin proteases ...... 5 2.2. The immune system with focus on IgM and B cells ........................................... 18 2.2.1. The complement system and complement evasion strategies ........................... 18 2.2.2. Immunoglobulins/antibodies with focus on IgM .................................................. 20 2.2.2.1. IgM .................................................................................................................... 21 2.2.2.2. Other immunoglobulin classes ........................................................................... 23 2.2.2.2.1. IgG .................................................................................................................... 23 2.2.2.2.2. IgA and immune exclusion ................................................................................ 23 2.2.2.3. Course of IgM and IgG in the piglet after weaning and role of IgM in the protection against S. suis ................................................................................................... 25 2.2.3. B cell populations with focus on IgM+ B cells ..................................................... 26 2.2.3.1. B cell development and B cell populations in the mouse ................................... 26 2.2.3.2. B cell development and B cell populations in the pig ......................................... 30 2.2.4. B cell surface receptors important for the interaction with pathogens ................ 33 2.2.4.1. B cell receptor (BCR) ........................................................................................ 33 2.2.4.2. Other receptors ................................................................................................. 35 3. Publications ....................................................................................................................... 37 3.1. Immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) impairs porcine B cell signaling .................................................................................................................. 37 3.2. The immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) leads to a long-lasting inhibition of activation of porcine IgM-secreting B cells. ...................................... 52 4. Discussion ......................................................................................................................... 69 5. Zusammenfassung ............................................................................................................ 75 6. Summary .......................................................................................................................... 77 7. References ........................................................................................................................ 79 8. Appendix ........................................................................................................................ 109 8.1. Supplementary Material to Breitfelder et al. 2023: Immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) impairs porcine B cell signaling ................................... 109 8.2. Supplementary Material to Breitfelder et al. 2024: The immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) leads to a long-lasting inhibition of activation of porcine IgM-secreting B cells. ...................................................................................... 122 8.3. Table 3: murine B cell populations ............................................................................... 126 8.4. Presentations given during the development of this thesis ........................................... 134 / Introduction S. suis is one of the most important bacterial pathogens in pigs, with zoonotic potential. Up to 100% of all pigs are colonized, but S. suis can also cause severe invasive disease manifesting as meningitis, arthritis, serositis or sudden death, mainly in piglets between 4 and 10 weeks of age. S. suis expresses the cysteine protease IdeSsuis, which specifically cleaves porcine IgM. This cleavage contributes to complement evasion, but IdeSsuis expression is not crucial for the ability of a strain to cause signs of invasive disease after experimental infection. Aim The aim of this work was to characterize the IdeSsuis-dependent interaction of S. suis with porcine B cells. In this context, I focused on IgM B cell receptor (BCR) cleavage and IgM secretion by IgM+ B cells. On the background of the previously demonstrated cleavage of soluble IgM, I investigated the working hypothesis that IdeSsuis also cleaves the IgM B cell receptor, which might lead to a disturbed B cell function by inhibiting the BCR signaling. Material and Methods Different IdeSsuis variants as well as muramidase-released protein (MRP) as another streptococcal control protein were recombinantly expressed in Escherichia coli. IgM BCR cleavage after incubation of porcine B cells with medium, rIdeSsuis_homologue, rIdeSsuis_homologue_C195S or concentrated culture supernatant of S. suis strain 10 or the respective point-mutant was investigated in flow cytometry. Putative IgM BCR cleavage was also confirmed after injection of rIdeSsuis_homologue in whole regional lymph nodes. BCR recovery after cleavage as well as the consequences of IgM BCR cleavage on intracellular signaling was investigated in flow cytometry. To address BCR-specific and BCR-independent signaling, B cells were stimulated with a BCR-specific antibody or pervanadate. To assess functional consequences of BCR cleavage, cells were incubated with the different recombinant proteins, followed by 3 days stimulation with porcine IL-2 and R848. The number of IgM-secreting cells was determined using an Enzyme-linked Immuno Spot Assay (ELISpot) and the corresponding levels of soluble IgM were investigated in an Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Finally, the different recombinant proteins were labeled with a fluorescent dye to investigate binding to IgM+ B cells using flow cytometry. Results The IgM BCR was cleaved in vitro and ex vivo by rIdeSsuis_homologue or concentrated culture supernatant of S. suis strain 10, but not by rIdeSsuis_homologue_C195S or the supernatant of the corresponding point mutant. IgM BCR recovery took at least 20 hours. BCR-specific and BCR-independent stimulation directly after cleavage demonstrated a defect in BCR-mediated signaling, while the intracellular signaling cascade was still intact. CD21+ and CD21- B cell subsets did not differ in IgM BCR cleavage efficiency or the reaction to stimulation. Three days after incubation with rIdeSsuis_homologue, rIdeSsuis_homologue_C195S and, to a lesser extent, also rIdeSsuis_C-domain, and subsequent stimulation with IL-2 and R848, the number of IgM-secreting cells as well as total levels of secreted IgM were reduced. This was not due to decreased cell viability. Interestingly, rIdeSsuis_homologue_C195S bound significantly stronger to IgM+ B cells than the other recombinant proteins. Conclusion The IgM-degrading enzyme of S. suis, IdeSsuis, cleaves the IgM BCR in vitro and ex vivo on B cells originating from blood or lymph nodes. This cleavage leads to a disturbed intracellular BCR signaling in vitro and results in an impaired B cell function after 3 days. In this context, also protein binding seems to be sufficient to disturb the B cells. In conclusion, the results suggest a modulation of the porcine immune response by S. suis, which could play a role especially during colonization and early invasion.:Directory ............................................................................................................................. I Abbreviations ........................................................................................................................... III 1. Introduction .......................................................................................................................... 1 2. Literature ............................................................................................................................ 2 2.1. Streptococcus suis .............................................................................................. 2 2.1.1. General characteristics and epidemiology ........................................................... 2 2.1.2. Disease in pigs .................................................................................................... 3 2.1.3. Disease in humans .............................................................................................. 3 2.1.4. Pathogenesis with focus on colonization ............................................................. 4 2.1.5. IdeSsuis and its comparison to other streptococcal immunoglobulin proteases ...... 5 2.2. The immune system with focus on IgM and B cells ........................................... 18 2.2.1. The complement system and complement evasion strategies ........................... 18 2.2.2. Immunoglobulins/antibodies with focus on IgM .................................................. 20 2.2.2.1. IgM .................................................................................................................... 21 2.2.2.2. Other immunoglobulin classes ........................................................................... 23 2.2.2.2.1. IgG .................................................................................................................... 23 2.2.2.2.2. IgA and immune exclusion ................................................................................ 23 2.2.2.3. Course of IgM and IgG in the piglet after weaning and role of IgM in the protection against S. suis ................................................................................................... 25 2.2.3. B cell populations with focus on IgM+ B cells ..................................................... 26 2.2.3.1. B cell development and B cell populations in the mouse ................................... 26 2.2.3.2. B cell development and B cell populations in the pig ......................................... 30 2.2.4. B cell surface receptors important for the interaction with pathogens ................ 33 2.2.4.1. B cell receptor (BCR) ........................................................................................ 33 2.2.4.2. Other receptors ................................................................................................. 35 3. Publications ....................................................................................................................... 37 3.1. Immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) impairs porcine B cell signaling .................................................................................................................. 37 3.2. The immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) leads to a long-lasting inhibition of activation of porcine IgM-secreting B cells. ...................................... 52 4. Discussion ......................................................................................................................... 69 5. Zusammenfassung ............................................................................................................ 75 6. Summary .......................................................................................................................... 77 7. References ........................................................................................................................ 79 8. Appendix ........................................................................................................................ 109 8.1. Supplementary Material to Breitfelder et al. 2023: Immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) impairs porcine B cell signaling ................................... 109 8.2. Supplementary Material to Breitfelder et al. 2024: The immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) leads to a long-lasting inhibition of activation of porcine IgM-secreting B cells. ...................................................................................... 122 8.3. Table 3: murine B cell populations ............................................................................... 126 8.4. Presentations given during the development of this thesis ........................................... 134